Post on 01-Oct-2015
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Separacin de clulasyfraccionamiento subcelular
Mtodos fsicos de SEPARACION DE CELULAS
* Necesarios para estudiar: - Tejidos con diferentes tipos celulares- Clulas con diferente funcionalidad/ actividad biolgica- Subpoblaciones celulares con diferentes marcadores moleculares- Alternativa a la clonacin: + rpidos, + rendimiento, (- pureza)
* Los ms empleados explotan diferencias en: Tamao celular Densidad Carga/Qumica superficial Dispersin de la luz (light scatter) Emisin de Fluorescencia
b
Beckman J2-21M, centrfuga equipada con un rotor y sistema de elutriacin
Rotor de elutriacin (Beckman)
Cmara de separacin del rotor de elutriacin
Apariencia de las clulas aisladas de una fraccion de elutriacin de clulas sanguneas de la mdula sea humana cultivadas durante 8 das (a, b). Las clulas predominantes son de tipo fibroblastoide con un ncleo central, citoplasma difuso y pseudopodos aderentes y clulas grandes, redondas con un estrecho citoplasma y un ncleo central redondo. (tincin con hematoxilina). (a) x200; (b) x400. (c) Apariencia de las clulas aisladas de la misma fraccin de elutriacin y cultivadas en DMEM+20% FCS suplementado con dexametasona, cido ascorbico y b-glicerofosfato durante 8 das. En esas condiciones, las celulas presentan una morfologia redondeada o cuboidal con un ncleo central, x200. Separacion de clulas por elutriacin
Separacin de clulas sanguneas con Ficoll-HypaqueCentrifugacin
Separacin inmunomagntica
SeleccinpositivaSeleccinnegativa
Absorcin de luz por un e- y la subsiguienteemisin de E como calor y fluorescencia
Esquema de un Citmetro de Flujo (FACS)
Funcionamiento de la boquilla vibradora de un citmetro de flujo
Green fluorescenceRepresentacin de los datos en citometra de flujo
Esquema de un Citmetrode Flujo clasificador (sorter)Puede seleccionar 1/1000clulas y clasificar miles/s
Microdiseccin con lserSperm Tail RemovalBiopsy at the Single Cell Level
Fraccionamiento de componentes subcelularesDiseados inicialmente para comprender el papel bioqumico de cada orgnulo en la clula
La lisis (rotura) celular se suele realizar por: Potter, homogeneizador mecnico de tejidos, sonicacin, cavitacin, soluciones hipotnicas
La separacin de los componentes subcelulares se realiza generalmente por centrifugacin
Homogeneizacinde la muestraCentrfuga de alta velocidadPotter
1000 x g, 10 min20.000 x g, 20 min80.000 x g, 1 h (ultracentrfuga)150.000 x g, 3 hFraccionamiento subcelular por centrifugacin diferencialcitosol
Comparacin dela sedimentacinpor velocidad (A)y por equilibriode sedimentacin(isopcnica, B)5-20%
Purificacin de orgnulos por centrifugacin en gradiente de densidad
NcleosMicrosomas (RER)PeroxisomasControl de calidad del fraccionamiento: TEM