�Pruebas para el diagnóstico microbiológico de las

Enfermedades Infecciosas empleadas en la práctica clínica (I)

Dr. Juan Carlos Rodríguez Díaz

S. Microbiología

Hospital General Universitario de Alicante

E-mail: rodriguez_juadia@gva.es

http://blogmicrobiologiahgue.wordpress.com/

Diagnóstico microbiológico�Pretende detectar e identificar el o los microorganismos responsables del proceso infeccioso y eso es esencial para:• Correcto tratamiento del paciente• Control de la difusión del patógeno

Diagnóstico microbiológico�Métodos directos:

• Detectan al microorganismo de la muestra clínica obtenida del lugar de la infección:• Examen microscópico• Cultivo• Detección de antígenos• Detección de ácidos nucléicos

�Métodos indirectos:• Permiten detectar la presencia de anticuerpos frente al microorganismo en el suero del paciente

� No se aplican simultanéamente sino en función del microorganismo

Toma de muestras

� La toma de muestras se detallará en un seminario monográfico

� Puedes acceder al manual de toma de muestras en el enlace:

http://blogmicrobiologiahgue.wordpress.com/docencia/practicas-diagnostico-microbiologico-enfermedades-infecciosas-dmi/manual-muestras-microbiologia/

Diagnóstico de bacterias: Examen microscópico� La muestra clínica se deposita en un portaobjetos

� Puede visualizarse:• Sin teñir (en fresco)• Tras un proceso de tinción • Gram: Divide a las bacterias en:

• Gram positivos: Color violeta (Staphylococcus)• Gram negativos: Color rojo (Escherichia coli)

• Ziehl Neelsen: Divide a las bacterias en• Acido-alcohol resistentes: Color rosa (Mycobacterium

tuberculosis)

Examen microscópico en fresco

Trichomonas vaginalis Candida albicans

Examen microscópico: tinciones

Ziehl Neelsen positivo

Gram positivo

Gram negativo

Diagnóstico de bacterias: cultivo� Siembra de la muestra en unos medios de cultivo

con los nutrientes necesarios para que se produzca la proliferación bacteriana.

� Sus principales utilidades son:• Más sensibilidad que la tinción• Permite identificar a los microorganismos• Permite estudiar su sensibilidad antibiótica• Permite estudiar la epidemiología de la infección y el control de posibles brotes

Características del cultivo� Se utilizan diferentes tipos de medios:

�Medios básicos: Agar Mueller Hinton�Medios enriquecidos:• AgarSangre: Streptococcus pneumoniae• AgarChocolate(Hemina y NAD) : Haemophilus• BCYEα (L-cisteina): Legionella

• Medios selectivos:• Medio Thayer Martin: Neisseria meningitidis y Neisseria gonorrhoeae

• Mac Conkey: Bacterias Gram negativas

• TCBS: Vibrio cholerae

• Medios diferenciales o cromógenos: CHROMAgar

• Medios de enriquecimiento:• Caldo selenito

Tipos de medios de cultivo

Agar sangre

HemocultivosAgar chocolate

TCBS

Procesamiento de los cultivos� Temperatura de incubación:

• Habitualmente se incuba a 35-37ºC• Campylobacter en heces: 42ºC

� Tiempo de incubación� El tiempo habitual es 24-48 h� Hay bacterias de crecimiento lento: Brucella

� Atmósferas de incubación� Bacterias aerobias o anaerobias facultativas: Escherichia coli,

Staphylococcus aureus.� Bacterias anaerobias: Clostridium, Bacteroides� Bacterias microaerófilas: Campylobacter, Helicobacter� Necesitan 5-10% CO2: Neisseria gonorroheae

Incubación de los medios

Incubador de hemocultivos

Atmósfera de incubación

Identificación bacteriana

� Definición: • Se basa en el estudio de la actividad bioquímica, sensibilidad a determinadas sustancias y crecimiento en presencia o ausencia de oxígeno

�Métodos:• Pruebas bioquímicas clásicas• Pruebas en microplaca

Identificación bacteriana

Detección de antígenos

� Definición: • Permite demostrar la presencia de un microorganismo en una muestra clínica a través de la detección de sus antígenos específicos

� Patógenos en los que se utiliza:• Legionella• Streptococcus pneumoniae• Aspergillus• Cryptococcus

Detección de antígenos

� Definición: • Se basa en la detección mediante métodos inmunológicos (reacción antígeno-anticuerpo) de algunas sustancias segregadas por el patógeno

� Patógenos en los que se utiliza:• Legionella• Streptococcus pneumoniae• Aspergillus• Cryptococcus

Secuenciación del gen 16S rRNA e ITS

� Definición: • Estos dos genes están presentes en todas las bacterias (16S rRNA) y hongos (ITS) pero su secuencia es diferente en función de la especie

� Procedimiento:• Secuenciación de estos genes y comparación con bases de datos internacionales (Gen Bank u otros)

• Útil para identificar microorganismos con identificación clásica compleja

Secuenciación del gen 16S rRNA e ITS

Espectrometría de masas (malditof)

Definición: • Estudia el perfil proteico del microorganismo (proteoma) mediante la comparación del perfil con una base de datos de los microrganismos más frecuentemente aislados

• Un rayo laser ioniza las proteinas cristalizadas y son aceleradas por un campo electromagnético.

• Las proteinas se separan en función del tamaño y la carga

� Utilidad:• Identificación rápida de los microorganismos más habituales

Espectrometría de masas (malditof)

Diagnóstico de la infección urinaria

� Definición: Presencia de microoorganismos en orina• Cistitis: infección de vías bajas• Pielonefritis: Infección de vías altas

� Etiología más frecuente• Bacterias de la flora intestinal: • Escherichia coli• Proteus• Klebsiella• Enterococcus

Diagnóstico de la infección urinaria

�Muestras:

• Muestra: Frasco estéril con orina recién recogida o mantenida a 4ºC

• Adultos: Segunda parte de la micción tras limpieza de los genitales externos

• Pacientes sondados: Pinchar la sonda con jeringa en el lugar establecido para ello

• Niños pequeños: Bolsa colectora que debe retirarse cada 30 minutos

Diagnóstico de la infección urinaria

�Métodos diagnósticos:• Sedimento urinario: Es de gran valor para valorar la calidad de la muestra y la presencia de leucocitos• Leucocitos sin bacterias (Cultivo negativo)• En tratamiento antibiótico• Uretritis por Chlamydia o Micoplasma que no se diagnostican por los métodos habituales• Tuberculosis renal

Diagnóstico de la infección urinaria

�Métodos diagnósticos:

• Sistemas de cribado rápido:• Tiras reactivas• Detección de nitratasa bacteriana• Detección de esterasa leucocitaria

• Recuento de lecucocitos y bacterias por citometría de flujo de forma automatizada

Diagnóstico de la infección urinaria

�Métodos diagnósticos:

• Cultivo: Se inocula de forma cuantitativa la orina en una serie de medios de cultivo:• Agar sangre: Medio enriquecido para el aislamiento de los patógenos más frecuentes• Agar CLED y Agar Mac Conkey: Medio diferencial que ayuda a la identificación preliminar

Diagnóstico de la infección urinaria

� Interpretación del recuento en el cultivo: • Debe hacerse en función de:

• Forma de recogida de la muestra• Clínica del paciente• Presencia de piuria• Microorganismo aislado

• En muestras tras punción suprapúbica o directamente del riñón: Cualquier recuento es significativo• Sondaje vesical: 103 bacterias/mililitro• Bacteriuria con piuria: 103 bacterias/mililitro• Bacteriuria asintomática: 105 bacterias/mililitro

Diagnóstico de la infección urinaria

Medios de cultivo

Diagnóstico de la infección urinaria

Sedimento urinario

Tiras reactivas

Citometría de flujo

Diagnóstico de la neumonía bacteriana

• Definición: Infección del parénquima pulmonar• Tienen etiología muy variada en función de la edad, del estado inmunológicos y de otros factores

• En personas previamente sanas es frecuente:• Streptococcus pneumoniae• Micoplasma pneumoniae

• En personas con factores predisponentes• Pseudomonas aeruginosa• Staphylococcus aureus• Enterobacterias

Diagnóstico de la neumonía bacteriana

•

Diagnóstico de la neumonía bacteriana

•

Diagnóstico de la neumonía bacteriana

� Cultivo: • Muestra de esputo de buena calidad (Tinción de Gram con

presencia de leucocitos) o muestras invasivas (BAS, BAL, cepillado bronquial) • Cultivo en:

• Agar sangre. Aislamiento de Streptococcus pneumoniae, Moraxella catarrhalis

• Agar Mac Conkey: Enterobacterias, Pseudomonas y Acinetobacter

• Agar chocolate:Haemophilus influenzae• Medio BCYEα: Legionella pneumophila.• BAL y Cepillado bronquial se hace cultivo cuantitativo en

Agar chocolate

Diagnóstico de la neumonía� Detección de antígenos:

�Muestra a procesar:

�Muestras respiratorias:

�Virus respiratorio sincitial

�Gripe A, gripe B

�Pneumocystis carinii

�Aspergillus

�Orina:

�Streptococcus pneumoniae

�Legionella pneumophila

Diagnóstico de la neumonía� Detección de anticuerpos:

� Muestra a procesar:�Suero del paciente

� Estudios a realizar:�Detección de IgM�Estudio de seroconversión: Incremento de la cantidad de anticuerpos al estudiar dos sueros del enfermo separados 3-4 semanas�De positivo bajo a positivo alto�De negativo a positivo alto

� Microorganismos: Micoplasma pneumoniae, Legionella pneumophila, Coxiella burnetti, Chlamydophila pneumoniae

Diagnóstico de la neumonía� Reacción en cadena de la polimerasa (PCR):

� Muestra a procesar:�Muestras respiratorias

� Estudios a realizar:�Detección del genoma del microorganismo en la muestra

� Microorganismos: �Hay sistemas de PCR múltiple que detectan muchos patógenos

�Mycobacterium tuberculosis�Gripe�Citomegalovirus

Diagnóstico de la neumonía bacteriana

Streptococcus pneumoniaeLegionella pneumophila Mycoplasma pneumoniae

Diagnóstico de las infecciones del sistema nervioso central

� Procesos más frecuentes:�Meningitis/encefalitis�Abscesos cerebrales

� La etiología de las meningitis/encefalitis puede ser muy variada:�Bacterias: Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae

�Virus: Enterovirus, virus herpes 1 y 2, arbovirus�Hongos: Cryptococcus neoformans�Parásitos: Amebas de vida libre

Diagnóstico de las infecciones del sistema nervioso central

Diagnóstico de las infecciones del sistema nervioso central

Diagnóstico de las infecciones del sistema nervioso central

� Diagnóstico de las infecciones bacterianas:• Tinción de Gram del LCR:

• Método rápido y orientativo de la etiología• Cultivo del LCR:

• Confirmación de la tinción y estudio de la sensibilidad antibiótica

• Agar sangre, chocolate y Thayer Martin • Detección de antígenos en el LCR: Streptococcus pneumoniae

• Reacción en cadena de la polimerasa: S. pneumoniae, Neisseria meningitidis, Listeria monocytogenes, Mycobacterium tuberculosis

• HEMOCULTIVO

Diagnóstico de las infecciones del sistema nervioso central

� Diagnóstico de las infecciones viricas:• Los cultivos celulares son técnicas complicadas y lentas

• Reacción en cadena de la polimerasa: • Enterovirus• Herpes 1 y 2• Varicella• Virus JC• Arbovirus

Diagnóstico de las infecciones del sistema nervioso central

� Diagnóstico de las infecciones fúngicas:

�La etiología más frecuente es Criptococcus neoformans

�Procedimiento diagnóstico:

�Cultivo en agar saboureaud

�Detección de antígeno en LCR y sangre: Criptolatex

� Diagnóstico de las infecciones parasitarias:

� Toxoplasma: Detección del genoma por PCR� Amebas de vida libre:

�Tinción�Cultivo �PCR

Diagnóstico de las infecciones del sistema nervioso central

� Diagnóstico serológico:

�La búsqueda de anticuerpos en LCR es una técnica útil en algunos casos�Neurobrucelosis: Rosa de bengala y aglutinación�Neurosífilis: VDRL�Sarampión: Presencia de Ac de producción intratecal

� Es imprescindible analizar los resultados con un estudio de los mismos marcadores en suero para:�Confirmar la infección por el patógeno�Confirmar la integridad de la barrera hematoencefálica mediante el estudio del cociente entre la albúmina o la IgG entre suero y líquido

Diagnóstico de la meningitis bacteriana

Listeria monocytogenes

Streptococcus pneumoniae Neisseria meningitidis

Diagnóstico de las enfermedades del tracto genital

� Patógenos más importantes:

Diagnóstico de las enfermedades del tracto genital

� Patógenos más importantes:

Diagnóstico de las enfermedades del tracto genital

� Diagnóstico de Treponema pallidum (sífilis)• Sífilis primaria: Observación del Treponema pallidum (chancro):IFD ,tinción con plata ,Campo oscuro

• Diagnóstico serológico:• Pruebas no treponémicas: RPR y VDRL• Pruebas treponómicas: TPHA (aglutinación) , FTA (inmunofluorescencia), ELISA IgG e IgM• Criterios:• Todos los resultados positivos de pruebas no treponémicas deben ser confirmados por pruebas treponémicas

• En caso de sospecha de sífilis primaria o terciaria, hay que hacer siempre una prueba treponémica

Diagnóstico de las enfermedades del tracto genital

� Diagnóstico de Neisseria gonorrhoeae (gonorrea)• Cultivo en agar Thayer Martin • Tinción de Gram: en el hombre la presencia de diplococos gramnegativos es diagnostica (95%)

• Exige transporte rápido al laboratorio e incubación en atmósfera con CO2

• Detección de genoma del microorganismo por PCR

• Diagnóstico de Chlamydia trachomatis (uretritis no gonocócica)

• Sólo puede cultivarse en cultivos celulares y no se hace habitualmente

• Detección de genoma del microorganismo por PCR

Diagnóstico de las enfermedades del tracto genital

� Diagnóstico del protozoo Trichomonas vaginalis• Cultivo en medio Roiron• Visualización en fresco de la muestra recién extraída: Observación de la motilidad del parásito

• Exige transporte rápido al laboratorio

• Diagnóstico del virus herpes genital

• Detección de genoma del microorganismo por PCR• Habitualmente la etiología se asocia a herpes 2

• Diagnóstico del papilomavirus

• Detección de genoma del microorganismo por PCR• Genotipificación ya que hay genotipos con diferente

patogenicidad: verrugas genitales o promotores de procesos cancerosos

Diagnóstico de las enteritis� Etiología más frecuente

Diagnóstico de las enteritis� Etiología más frecuente

Diagnóstico de las enteritis bacterianas

� Salmonella

� Cultivo en medio SS y enriquecimiento en caldo selenito� Identificación fenotípica y serotipificación: Múltiples

serotipos� Campylobacter

� Cultivo en medios especificos (Skirrow): Incuba a 42ºC en atmósfera microaerófila

� Shigella. Cultivo en medios específicos (Mc Conkey y SS)� Yersinia: Cultivo en medios específicos (CIN)� Escherichia coli enteropatógenos: Detección del genoma

de los serotipos patógenos por PCR� Vibrio cholerae (TCBS y enriquecimiento)

Diagnóstico de las enteritis bacterianas

� Clostridium difficile

� Cultivo en medio anaerobio: Sólo se realiza en centros de referencia debido a su complejidad

� Detección de Antígenos del patógeno� Detección de las toxinas producidas por el mismo� Detección del genoma del microorganismo por PCR

� Otros microorganismos productores de toxinas: El diagnóstico se realiza detectando la toxina preformada por métodos serológicos� Staphylococcus aureus� Bacillus cereus� Clostridium perfringens� Clostridium botulinum

Diagnóstico de las enteritis viricas � Virus gastrointestinales

� Rotavirus� Adenovirus� Norovirus� Astrovirus

� Diagnóstico� Microscopía electrónica: Técnica poco usada por su

complejidad� Detección de antígenos� Detección del genoma viral por PCR

Diagnóstico de las enteritis parasitarias

� Protozoos

� Giardia� Entamoeba histolytica� Cryptosporidium

� Helmintos: Ascaris, Taenia, Enterobius vermicularis� Diagnóstico

� Microscopía tras proceso de concentración de las heces� Necesidad de procesar un mínimo de tres muestras� Tinciones especiales: Cryptosporidium� Detección del genoma por PCR: Entamoeba� Técnica de Graham: Enterobius vermicularis (oxiuros)

Protozoos: flagelados

Protozoos flagelados: Amebas

Protozoos ciliados

Protozoos: Apicomplexa

Cryptosporidium spp

Isospora belli

Protozoos: Microspora

Enterocytozoon spp

Platelmintos: cestodos

Platelmintos: tremátodos

Nemátodos

Trichuris trichiura

Nemátodos

Nematodos

Strongyloides stercoralis

Diagnóstico de bacteriemia• Presencia de bacterias en sangre de forma persistente

• Antes del tratamiento antimicrobiano se inoculan, con sangre del paciente sin anticuagulante 2 o 3 parejas de botellas de hemocultivos (aerobias y anaerobias)

• Es muy importante descontaminar la piel ante de las extracciones de sangre para prevenir la contaminación de los frascos con flora bacteriana de la piel

• Los hemocultivos se incuban a 37ºC en sistemas automáticos que detectan crecimiento microbiano.

• En caso de positividad : Tinción Gram (cuyo resultado se informa de inmediato ) y subcultivo a medios sólidos.

Diagnóstico de bacteriemia

Infecciones por microorganismos anaerobios

• Se asocian a las siguientes infecciones:

– Gangrenas

– Peritonitis y otras infecciones intraabdominales

– Neumonías por aspiración

– Abscesos

– Bacteriemias

– Abscesos cerebrales

Infecciones por microorganismos anaerobios

• Los microorganismos se mueren en contacto con el oxígeno, por lo tanto:– El cultivo debe hacerse lo más rápidamente posible, si no es

posible, hay que inocular las muestras en medios de transporte– Se requieren medios de cultivo específicos e incubación en

atmósfera sin oxígeno– Las torundas no son aceptables, es imprescindible que las

muestras se tomen con jeringa o mediante biopsia– Los géneros más importantes son:

• Clostridium• Bacteroides• Prevotella• Fusobacterium

Cultivo de microorganismos anaerobios

• Están presentes en la flora normal de la piel o mucosas de las personas sanas por tanto no tienen interés clínico si se aíslan de estas localizaciones:– Esputos– Exudados vaginales– Heces– Piel

Infecciones sistémicas por hongos filamentosos

• Los hongos más frecuentemente implicados son:– Aspergillus

– Mucor

– Fusarium

• Diagnóstico:– Cultivo de las muestras: Poca sensibilidad y especificidad. Necesidad de confirmación en varias muestras y con datos clínicos

– Detección de antígenos de Aspergillus: galactomanano

Infecciones por Candida

• C. albicans es la más patógena. Otras especies implicadas son:– C. parasilopsis

– C. tropicalis

– C. krusei

• Produce:– Infección de piel y mucosas

– Candidiasis sistémica en inmunodeprimidos

Infecciones por Candida

• En caso de sospecha de infección sistémica: hemocultivos

• En otras infecciones:– Tinción de Gram como método rápido

– Cultivo de las lesiones en medio de Saboureaud. Crecen en 1-2 días. Pueden crecer en agar sangre o agar chocolate

– Identificación de la especie por métodos fenotípicos o genotípicos

Candida spp.

Candida spp.

Candida spp.

Candida spp.

Candida spp.

Infecciones por dermatofitos

Llamadas comunmente tiñas: Tinea corporis

Tinea crucis

Tinea barbae

Onicomicosis

Pie de atleta

Trichophyton, Microsporum, Epidermophytum

Se adquieren a partir de personas enfermas, de animales domésticos o a partir del suelo

Infecciones por dermatofitos

Diagnóstico rápido: Prueba del KOH (visualización directa de las lesiones)

Cultivo en medio de Saboureaud y micosel (Saboureaud y actidiona) durante 30 días a 30/37ºC

Identificación del hongo aislado en cultivo mediante tinción de azul de lactofenol y algunas pruebas bioquímicas (urea)

Dermatofitos

Dermatofitos

Dermatofitos

Dermatofitos

Dermatofitos

Otras infecciones por hongos

Pitiriasis versicolor (Malassezia furfur)Diagnóstico clínico

Esporotricosis (Sporothrix)Por infección de heridas con esporas presentes en el suelo o en vegetales

Hongo dimórfico: Cultivo en saboureaud y BHI durante 30 días a 30/37ºC respectivamente

Identificación mediante microscopía y demostración de dimorfismo(levadura, hongo filamentoso)

Sporothrix

Sporothrix

Infecciones por Leishmania

• Leishmaniasis visceral: Kala azar• Muestra a procesar. Médula osea

• Lesiones cutaneas o mucocutáneas (Botón de oriente, uta, espundia, etc)

• Muestra a procesar: Aspirado o biopsia de la lesión

• Asociado muchas especies del género, en función de la zona geográfica y de la clínica: L. infantum, L. donovani, L. peruviana, L. amazonensis, etc.

• Diagnóstico por:• Visualización del parásito en las lesiones por tinción de Giemsa

• Cultivo en medio NNN

• PCR.

• Serología (útil en L. visceral)

Leishmania

Leishmania

Leishmania

Leishmania

Leishmania

Phebotomus y Lutzomya

Infecciones por Plasmodium

• Produce la malaria o el paludismo

• Enfermedad muy frecuente en el trópico

• Necesidad de diagnóstico rápido– No crece en los medios para bacterias: hemocultivos

– Métodos específicos:• Visualización del parásito en tinción de Giemsa de los hematies de la sangre periférica

• Detección de antígeno

• Detección del genoma del protozoo por PCR

Infecciones por Plasmodium

Infecciones por Toxoplasma

• Se asocia• Inmunocompetentes: Generalmente asintomático o fiebre con adenopatías

• Gestante: Infección congénita

• HIV: Cuadro neurológico por reactivación de quistes cerebrales

• Diagnóstico:• Inmunocompetentes: Estudios serológicos (IgM, seroconversión y avidez de la IgG)

• Gestantes: Serología de la madre y PCR en líquido amniótico

• Inmunodeprimidos: Detección del genoma por PCR

Infecciones por Toxoplasma

Infecciones por Schistosoma

• 2º enfermedad tropical más prevalente (después del paludismo)

• Se transmite por la entrada de larvas a través de la piel cuando se introduce en agua

• Diagnóstico:• Visualización de los huevos en la orina o en las heces del paciente