Post on 10-Jul-2015
description
ACTIVIDAD PROTEINASA Y FOSFOLIPASA COMO
FACTORES DE VIRUELENCIA EN ESPECIES DE
CANDIDA AISLADAS DE SANGRE
PROFESORA: Angelica Minaya
Galarreta
CICLO: VI
INTEGRANTES:
Stephany Araujo Zacarías
Arnold Cuya Silva
Jonathan García Puccio
Ilianova Huamán Zacarías
Dante Huamani Zambrano
Delia Morales Aguilar
INTRODUCCION:
El numero de fungemias nosocomiales debidas
a las especies de Cándida se debe a la
infección de patógenos oportunistas que tiene
que evadir el sistema inmunológico, para
sobrevivir, dividirse en los tejidos y diseminarse
a otros órganos.
El trabajo presentado nos informa que la
secreción de fosfolipasas y proteinasas son
factores de virulencia de especies de
Cándida, aisladas de hemocultivos de
pacientes en cuidados intensivos, unidades de
diálisis y unidades de oncología.
Se trabajos con 114 muestras de sangre donde se aisló
Cándida y se identificaron las siguientes especies:
Cándida albicans
Cándida glabrata
Cándida guilliermondii
Cándida kefyr
Cándida krusei
Cándida parapsilosis
Cándida tropicales
Para detectar proteinasa se utilizo el método de Staib.
Para detectar fosfolipasa se utilizo el método de
Samaranayake et al.
CONCEPTOS BASICOS:
Fosfolipasa.-Son una
clase de enzimas que
hidrolizan los enlaces
éster presentes en los
fosfolípidos. Sólo la
PLB1 ha demostrado
ser necesaria para la
virulencia en modelo
animal de candidiasis.
Proteasas.-Son enzimas que rompen
los enlaces peptídicos de las proteínas.
Familia de enzimas de secreción aspártico
proteinasas (SAP), que proporcionan al
hongo un sistema proteolítico La
presencia de los genes de la familia SAP
es única en las especies patógenas de
Candida.
CANDIDA:
Es un hongo diploide asexual. Normalmente se encuentra en la cavidad oral, en el tracto gastrointestinal y en la vagina.
La microfoflora comensal aprovecha la ‘oportunidad’ para provocar infección. 4a causa más frecuente de IS.
GLOSARIO:
Factor de virulencia.-Son moléculas producidas porun patógeno, que influencia específicamentelas funciones del hospedante, para permitiral patógeno crecer.
Fungemias nosocomiales.-Enfermedad en la cual la sangre esta contaminada por hongos, es frecuente en pacientes con inmunosupresión o inmunodeficiencia.
Método de Staib.-Es un método para identificar microorganismos utilizando una serie especial de tintes (colores).
GLOSARIO:
Gonocócica.-Un tipo de enfermedad
clasificada entre las enfermedades
infecciosas y parasitarias.
Candidiasis.-Es una infección
fúngica (micosis) de cualquiera de las
especies Candida (todas
las levaduras), de las cuales
la Candida albicans es la más común.
ESPECIES DE CANDIDA
Especie A: Candida krusei:
colonias rugosas de borde
irregular y de color rosa pálido.
Especie B: Candida albicans:
colonias brillantes de borde
regular y de color verde.
Especie C: Candida glabrata:
colonias brillantes de borde
regular y de color rosa-violeta.
Especie D: especie
indeterminada; no es posible su
identificación, ya que no
produce ningún pigmento.
Especie E: Candida tropicalis:
colonias brillantes de borde
regular y de color azul brillante
Las levaduras del
género Candida son hongos
dimorfos de distribución universal
que forman parte de la flora
residente de la boca, tracto
digestivo y genital femenino de
sujetos sanos. Bajo algunas
condiciones, son responsables de
patologías de alto riesgo y en
ocasiones fatales. Pueden
producir lesiones en
piel, uñas, cavidad
oral, bronquios, pulmones y
alcanzar todos los órganos y
sistemas mediante la
diseminación sanguínea de la
levadura.
Pesenta una forma ovalada y un
tama;o de 5-7 um.
FACTORES DE
VIRULENCIA
La incidencia cada vez mayor de
infecciones intrahospitalarias por
Candida y su asociación en
individuos susceptibles con ciertas
inmunodeficiencias hacen posible
que estos microorganismos
comensales, se vuelvan
patógenos. Conocer los
factores de virulencia hace posible
determinar, cómo se modifica la
relación que establece con su
huésped una vez que los
mecanismos de resistencia se han
deteriorado.
SECRECION ENZIMATICA
MORFOLOGIA CELULAR
EXPRESIÓN DIFERENCIAL DE
GENES EN REACCIÓN AL
MEDIO AMBIENTE
SINTESIS DE ADHESINAS Y SU
CAPACIDAD DE FORMAR
BIOPELICULAS
MORFOGENESIS
Se refiere a la transición entre las
levaduras y la forma de crecimiento
filamentosa que puede convertirse de
forma reversible a células de levadura, con
crecimiento de hifa o Pseudohifa, que es
uno de los atributos que capacitan a
Candida albicans para invadir los
tejidos, aunque la hifa puede ser idónea
para abrir la brecha entre las barreras
tisulares, gracias a que su punta es el sitio
de secreción de enzimas capaces de
degradar proteínas, lípidos y otros
componentes celulares, ésta facilita su
infiltración en sustratos sólidos y tejidos.
ENZIMAS
Las enzimas son
determinantes de
virulencia en
Candida, ya que tienen
la capacidad
de romper polímeros
que proporcionan
nutrientes accesibles
para el crecimiento de
los hongos, así como
de inactivar las
moléculas útiles en la
defensa del
organismo
PROTEASAS
FOSFOLIPASAS
PROTEASAS
En Candida albicans se han
descrito varios miembros de una
gran familia de enzimas de
secreción aspártico proteinasas
(SAP).
Las proteínas SAP tienen funciones
especializadas durante el proceso
infeccioso e incluyen la digestión de
moléculas proteínicas para adquirir
nutrientes,digerir o distorsionar las
membranas del huésped y facilitar
la adhesión, la invasión a tejidos y
la digestión de moléculas del
sistema inmunitario del huésped
para evitar o resistir el ataque
antimicrobiano de éste;
Se han identificado cuatro
fosfolipasas (PLA, PLB,PLC y
PLD), de las cuales sólo la PLB1
ha demostrado
ser necesaria para la virulencia en
modelo animal de candidiasis.
Una cepa con la deleción de este
gen (con
menor producción de esta enzima)
reduce su virulencia hasta en
60%, comparada con la cepa
silvestre. La PLB1A es una
glucoproteína de 84 kDa,que tiene
actividad de hidrolasa
Se secreta y detecta en la punta
de las hifas durante la invasión a
los tejidos.
FOSFOLIPASAS
EXPRESIÓN DIFERENCIAL DE
GENES EN REACCIÓN AL MEDIO
AMBIENTE
Candida albicans es capaz de sobrevivir y proliferar
en
un amplio rango de tejidos, ya sea como comensal o
como patógeno. Durante los diferentes estados y
tipos
de infección las células del hongo necesitan amplia
flexibilidad, ya que cada sitio anatómico tiene sus
propias presiones ambientales. Esta al tener genes
que codifiquen para factores de virulencia puede
reflejar la adaptación a amplio rango de condiciones
ambientales.
La principal función del gen PHR1 se asocia con la
síntesis de la pared celular, cuya expresión es óptima
en pH cercanos a la neutralidad, como en el torrente
circulatorio o en los tejidos, mientras que en el canal
vaginal la función del PHR2, que es similar pero con
pH ácido. Éste es un ejemplo de cómo Candida
albicans se adapta a condiciones fisiológicas
extremas dentro del huésped.
ADHESINA
BIOPELICULA
DIAGNOSTICO
Los métodos de diagnóstico
microbiológico los podemos
clasificar de
la siguiente manera:
1) Observación microscópica
• Examen en fresco con KOH (10-30%).
• Blanco de calco-fluor.
• Tinciones biológicas.
2) Métodos basados en el cultivo
• Identificación mediante criterios morfológicos
• Identificación mediante criterios bioquímicos basados en sistemas enzimáticos
• Identificación rápida de levaduras mediante pruebas bioquímicas y enzimáticas
3) Métodos independientes del cultivo.
• Detección de antígenos o anticuerpos.
• Detección de metabolitos.
• Detección de componentes fúngicos.
Examen en fresco con KOH (10-30%):
Facilita la observación ya que el KOH presenta efector clarificador, disolviendo los
distintos elementos celulares y permaneciendo intacta la pared celular fúngica.
Blanco de calco-flúor:
Se une específicamente a la quitina de las células fúngicas y emite una fluorescencia
que delimita a los elementos fúngicos. Al microscopio de fluorescencia C. albicans y
demás especies muestran una fluorescencia verde brillante; C. glabrata emite una
fluorescencia más débil.
Tinción Biológica:
Aunque las levaduras se tiñen bien con la mayoría de los colorantes bacterianos
(tinción de Gram), también disponemos de tinciones histológicas específicas
como la de plata-metenamina y la del ácido periódico de Scheffer (PAS), que nos
permiten su visión bien diferenciada.
OBSERVACIÓN MICROSCÓPICA
Hifas y blastosporas de
Cándida albicans en
frotis oral. (Tinción de
PAS x 400).
Blastosporas y tubos
germinales de Cándida
albicans teñido con blanco
de calco-flúor, x1.000.
MÉTODOS BASADOS EN EL CULTIVO
La mayoría de los organismos levaduriformes crecen fácilmente en un gran
número de medios de cultivo usados rutinariamente en el laboratorio de
Microbiología (agar harina de maíz, agar Wolin-Bevis, agar arroz o
agar patata-zanahoria) es característica y de utilidad para la identificación de
C. albicans y C. dubliniensis.. Sin embargo, el agar glucosado de Sabouraud
(SDA), con o sin antibióticos añadidos, es el medio de aislamiento por
excelencia para la identificación de levaduras
El tubo germinal es una
extensión filamentosa
de la levadura, sin
estrechamiento en su
origen, cuyo ancho suele ser
la mitad de la célula
progenitora y su longitud tres
o cuatro veces mayor que la
célula madre.
Sólo C. albicans es capaz de producir verdaderos tubos germinales; sin
embargo, otras especies como C. tropicalis pueden producir pseudohifas
precoces de aspecto similar a los tubos germinales pero con una zona de
constricción característica adyacente a la célula madre, por lo que esta prueba
es útil para diferenciar C. albicans del resto de las especies de
Cándida, aunque no está exenta de falsos negativos.
Materiales y Métodos
Las muestras de sangre fueron
recolectadas en las unidades de cuidados
intensivos (UCI), unidades de diálisis, y
las unidades de oncología en los
hospitales y asilos de ancianos en los
alrededores de Bangalore. Un total de 114
cepas de Cándida fue recuperado de las
muestras de sangre. Los aislamientos
fueron identificados por tubo germinativo
de información.
Detección de Proteinasa
La proteinasa Cándida fue detectada
por la ligera modificación del método
Sabouraud Glucosado Agar
Albúmina de suero bovino medio (2%
de dextrosa, KH2PO4 0,1%, MgSO4
0,05%, agar al 2% mezclado después
de enfriar a 50 C con 1% bovino
solución de albúmina de suero)
Candida albicans aislada de cavidad oral
Sabouraud Glucosado Agar
Es un método diferencial para el cultivo de hongos
con un medio de bajo pH y elevada concentración de
azúcar.
Recomendado para el aislamiento y desarrollo de
hongos, particularmente los asociados con
infecciones cutáneas (piel, pelo, etc.).
40 g/L glucosa
10 g/L pluripeptona
15 g/L agar
0,05 g/L [cloranfenicol]
pH 5.6
Detección de Fosfatasa
El método ligeramente
modificada de
Samaranayake et al. Medio
de yema de huevo utilizado
consistió en 13,0 g de agar
de dextrosa Sabouraud
(SDA), 11,7 g de NaCl, 0,111
g de CaCl2, y 10% de huevo
estéril. La yema se
centrifugó y 20 ml del
sobrenadante se añadió al
medio esterilizado.
RESULTADOS:
De las 114 especies aisladas de Candida, en las muestras de sangre se encontraron los siguientes generos C. albicans (37), C. glabrata(7), C. guilliermondii (5), C kefyr (3), C. krusei(45), C . parapsilosis (5) y C. tropiccilis (12).
Todos los aislamientos fueron probados para la proteinasa y la producción de fosfolípasa.
En la actividad de la proteinasa se detectó en 85 (74,56%) aislamientos y la actividad fosfolipasa se detectó en 51 (44,73%) aislamientos (Tablas 1 y 2). Los aislamientos probados demostraron diversos grados de actividad fosfolipasa (valor PZ: 0.23-1.0), con el más importante actividad de la fosfolipasa.
RESULTADOS:
El valor Pz para la actividad de proteinasaoscilaron entre 0,17 y 1,0.
El nivel más alto de la actividad enzimática era para los valores de Pz cercanos a cero. ANOVA se utilizó para comparar la producción de proteinasa y fosfolipasa en diferentes organismos.
No hubo diferencia significativa entre los organismos con respecto a la significancia de produccion de proteinasa y fosfolipasa (p> 0,05).
Candida spp. N Mean Std.
Desviation
Minimum Maximum
C. albicans 37 0.55 0.36 0.20 1.00
C. glabrata 7 0.43 0.26 0.24 1.00
C. guilliermondii 5 0.56 0.40 0.19 1.00
C. kefyr 3 0.59 0.37 0.27 1.00
C. Krusei 45 0.42 0.25 0.20 1.00
C. parapsilosis 5 0.38 0.35 0.20 1.00
C. tropicalis 12 0.52 0.37 0.17 1.00
Tabla 1. actividad de la proteinasa (mm) exhibida por candida. Aislación de
sangre
Candida spp. N Mean Std.
Desviation
Minimum Maximum
C. albicans 37 0.66 0.34 0.23 1.00
C. glabrata 7 0.73 0.35 0.24 1.00
C. guilliermondii 5 0.86 0.31 0.30 1.00
C. kefyr 3 0.59 0.37 0.27 1.00
C. Krusei 45 0.73 0.33 0.24 1.00
C. parapsilosis 5 0.88 0.27 0.40 1.00
C. tropicalis 12 0.68 0.35 0.23 1.00
Tabla 2. actividad de la fosfolipasa (mm) exhibida por candida spp. Aislación
de sangre.
Discusiones
El considerable aumento de
candidiasis se observa en pacientes
de las UCI, que reciben tratamiento
oncológico, los receptores de
trasplante de órganos, y otros
individuos inmunocomprometidos
sometidos a fuertes protocolos
terapéuticos.
Se consideraron como importantes
factores de virulencia de C.albicans a las
fosfolipasas y proteinasas aspartilo.
Dieciocho de C.albicans fueron
productores de fosfolipasa. Sin embargo
pocas cepas de C. tropicalis, C. krusey y
C. galabrata se comportaron de manera
similar.
C. albicans, C. kefyr, C. parapsilosis y C.
tropicalis mostraron que tienen similar
actividad de la proteinasa.
Conclusiones
A pesar de que todas las cepas
aisladas fueron patogenas, no todas
las cepas de candida producen
proteinasa y fosfolipasa como factores
de virulencia.
La ausencia o presencia de estas
secreciones enzimáticas nos puede
indicar la naturaleza menos o mas
virulenta de las especies de
cándida, independientemente de la
especie que haya sido aislada.
La virulencia de las especies de candida
no solo se atribuye a un solo factor, sino a
una combinación de varios factores.
La C. albicans muestra una significativa
actividad de la fosfolipasa frente a las
cepas que no son C. albicans.
Las cepas que no son C. albicans muestra
mayor actividad proteinasa frente a las
cepas que si son C. albicans.