Genética bacteriana

Prof. Adj. Ary Fernandes Junior

Departamento de Microbiologia e Imunologia

Instituto de Biociências – UNESP

Tel. 14 3880.0412

ary@ibb.unesp.br

Visão geral da construção de uma célula recombinante e alguns exemplos de sua aplicação

Genes pertencentes a uma determinada célula de um organismo podem ser inseridos e expressos em células de

outro organismo. Células geneticamente modificadas podem ser utilizadas para produzir uma grande variedade

de produtos úteis.

Replicação do DNA

Replicação bidirecional de uma

molécula circular de DNA bacteriano

Replicação bidirecional de uma molécula circular de DNA

bacteriano

Bactérias: Onde encontramos genes?????????

DNA Bacteriano, Plasmídios, DNA Fágico, Transposons

Replicons

Variações Temporárias (Sem alterações no genoma)

(Alterações Fenotípicas)

- Produção de beta galactosidase quando tem lactose no meio

(regulação gênica)

Fisiológicas

-Serratia marcescens: 37º C – sem pigmento 25º C – vermelhas,

-Bacillus sphaericus: 2% peptona (células vegetativas)

0,1% peptona (esporos)

-Gram positivos: Culturas novas – cels. azuis

Cultura velhas – cels. vermelhas,

- Azomonas x sacarose x cápsula

Morfológicas

Variações Permanentes Com alterações no genoma)

(Alterações genotípicas)

Mutação e Recombinação Genética

Ahmed ety al. Nature Reviews Microbiology 6, 387-394 (May 2008)

A absorção de elementos genéticos móveis (fagos, plasmídeos de virulência, ilhas de patogenicidade), e perda de

porções de DNA-cromossômico em linhagens distintas de E. coli, possibilitou surgimento de clones de diferentes

patotipos de E. coli associados a sintomas de doenças específicas.

LEE - locus of enterocyte effacement; PAIs - pathogenicity island; pEAF - enteropathogenic E. coli adhesion factor

plasmid; pENT- enterotoxin-encoding plasmids; Stx - Shiga-toxin-encoding bacteriophage.

(ETEC – Enterotoxigênica E. coli)

(EIEC – Enteroinvasiva E. coli)

(UPEC-Uropatogênica E. coli)

(EPEC – Enteropatogênica E. coli)

(EHEC – Enterohemorrágica E. coli)

(atualmente já se fala em STEC)

E. coli comensal

Plasmídeos Ilhas de patogenicidade

Outras E. coli

-APEC

-NMEC,

-STEC, etc

1. População de uma bactéria

em processo de multiplicação

minutos , horas, dias, meses

tempo

2. Processo de crescimento e divisão

produzem naturalmente células

mutantes

3. População continua multiplicação, e

originando ocasionalmente, mais

células mutantes

Células são expostas a um

composto antimicrobiano

Pressão seletiva

4. Células são mortas ou impedidas de

multiplicação pela antimicrobiano com exceção

dos mutantes resistentes ao antimicrobiano

específico.

5. Os mutantes continuam com o crescimento

na presença do antimicrobiano e iniciam

dispersão pelo ambiente

Variação permanente resultante de Mutação

Mutação cria variação

Mutação desfavorável é

selecionada contra

Ocorre reprodução e mutação

Com a mutação favorável é

provável que o mutante

sobreviva...

....e se reproduza

Variação permanente

resultante de Mutação

Variação permanente resultante de Recombinação Genética

1. Duas populações bacterianas A e B

crescem em um mesmo ambiente. A

espécie B é resistente a droga X.

2. Troca de DNA (elementos genéticos móveis)

ocorre entre células em baixa frequência.

3. Células da espécie A recebem o gen de

resistência a droga X, presente no elemento

genético móvel da espécie B.

Pressão seletiva

Bactérias são expostas a

droga X.4. Na presença da droga X, as células da

espécie A que receberam gen da resistência

da espécie B são capazes de multiplicar-se

enquanto que as células originalmente

sensíveis não multiplicam-se.

MUTAÇÃO

“Alteração brusca no material genético”

“Alteração hereditária em uma seqüência de bases

do DNA” Mutante

Natural (10-6 a 10-10 )

Adquirida ou Induzida (Agentes Físicos e Químicos)

Klebsiella pneumoniae

(Aspecto mucóide

(molhado)

de colônias)

Variação S R

Variação S (Smooth) R (Rough) em K. pneumoniae

por mutação

Resistência à drogas antimicrobianas por mutação

(Tipo Cromossômica)

Mutação

Resistente a 500 g

Bactéria sensível a estreptomicina (1 g)

Modelo de um passo (“one step”)

Bactéria sensível a Penicilina (1 g)

Mutação

Resistente a 10 g

Resistente a 20 g

Mutação

Resistente a 50 g

Mutação

Modelo de vários passos (“multi step”)

Tipos de Resistência Cromossômica

“Moléculas distintas de DNA são combinadas numa

mesma molécula, graças a um processo físico de

quebra e ligação destas moléculas”

RECOMBINAÇÃO GENÉTICA: Doadora Receptora

DNA externo = DNA Exogenoto Destinos

possíveis (? )

TRANSFORMAÇÃO (Griffith-1928)

(Reversão Pneumocócica (RS) (Rough – Smooth)

“Incorporação de DNA solúvel” (Lise ou Liberação Espontânea)

(Plasmídeos são passíveis de transferência também)

Condições para ocorrer a transformação

DNA homólogo,

Dupla fita e PM elevado (105 a 107),

Meio sem DNAase

(DNA solúvel, Qualquer momento, Determinado estágio

do ciclo celular, Condições Especiais)

Bactéria Receptora em Estado de Competência Fisiológica

Transformação

CONJUGAÇÃO (Tatum e Lederberg - 1947 - E.coli)“Transferência através de comunicação entre as duas bactérias” ( Unidirecional)

Pili (Gram negativa) Ponte de conjugação

(Gram positiva)

Conjugação bacteriana

Conjugação de Gram negativa

Enterococcus faecalis pheromone-responsive conjugative system.

Pheromone A released from the potential recipient cell (right) interacts with plasmid A in the potential donor cell (left) to induce synthesis of

aggregation substance. Attachment of aggregation substance to binding substance causes the cells to clump into visible aggregates. Once

the pheromone-responsive plasmid A has transferred from donor to recipient cell, synthesis of pheromone A is shut off.

Doadora Receptora

Conjugação de Gram positiva

Adaptado de Murray, B.E. (1998)

Processo mediado por Plasmídeos (Ex. Plasmídeo

R=Resistência à drogas, F=Fertilidadede,

Virulência, Col, Metabólico, Críptico, etc)

Obs. DNA cromossômico também pode ser

transferido durante a conjugação.

Plasmídeo

conjugativo

Plasmídeo R

TRANSDUÇÃO ( Zinder e Lederberg - 1952)

Transferência (DNA bacteriano e Plasmídios) ocorre por meio de um vírus (Bacteriófago)

Um fago infecta a célula

bacteriana doadora

O DNA e proteínas do fago são produzidos, e o DNA

bacteriano quebrado em fragmentos.

Ocasionalmente, durante a montagem do fago, fragmentos

do DNA bacteriano são empacotados no capsídeo do fago.

Então a célula doadora é lisada e as partículas de fago são

liberados.

Um fago carreando o DNA bacteriano

infecta a nova célula hospedeira, a célula

receptora.

A recombinação pode ocorrer, produzindo

uma célula recombinante com um

genótipo diferente da célula doadora e da

célula receptora.

Ciclo Lítico

(vírus virulento)

Ciclo Lisogênico

(vírus temperado)

Transposon Genes Saltadores, Elementos Móveis

ou “Jumping genes”

Codificam Resistência a

Drogas, Síntese de Toxinas e

Enzimas Degradantes.

Encontrados tanto em DNA

cromossômico como em

Plasmídios

Tem sequência (de Inserção)

que codifica enzima

Transposase (Transposição )

Interfere com sequência

linear do gene

Mutação, Inativação ou

Quebra;

Interação entre DNA e Proteínas Reguladoras

Regulam síntese de RNAm e Atividade de enzimas

específicas

Regulação da Expressão Gênica

Evitar síntese desnecessária de metabólitos,

desperdício energético, acúmulo intracelular de

metabólitos tóxicos.

(Ex. Operon Lac em E.coli ( Operon Indutível);

Operon Trp de E. coli (Operon repressível)

Operon Lac de E. coli (Operon indutível)

Operon Lac de E. coli (Operon indutível)

Operon Lac de E. coli (Operon indutível)

Operon Trp de E. coli (Operon repressível)

Operon Trp de E. coli (Operon repressível)

Operon Trp de E. coli (Operon repressível)