Post on 01-Sep-2018
Características Importantes a Tener en Cuenta en la Producción de proteínas
recombinantes
Complejidad de la molécula: estructura terciaria y cuaternaria, modificaciones postraduccionales
Uso: investigación, diagnóstico, farmacéutico, terapia
Cantidad de producto
Economía
Aspectos regulatorios
Convenientes para crecimiento en grandes fermentadores.
Se obtienen altos rendimientos (0,1-5 g/L).
En general las proteínas tendrán metionina N-terminal.
Es frecuente la producción en forma de cuerpos de inclusión.
No produce eventos postraduccionales.
Endotoxinas
BACTERIAS
Conveniente para el crecimiento en grandes fermentadores.
Buenos rendimientos (0.01-1 g/L).
Introduce modificaciones postraduccionales.
La glicosilación es distinta de la de mamíferos: “high manosas”
La proteólisis suele ser un problema.
LEVADURAS
CÉLULAS DE MAMÍFEROS
Los cultivos en grandes escalas son difíciles de
realizar y muy costosos.
Los rendimientos son generalmente bajos (0,001-0,1
g/L).
Se producen modificaciones postraduccionales.
Para ciertas proteínas puede ser el único sistema de
expresión posible.
PLANTAS
Se producen modificaciones postraduccionales
Expresión localizada en diferentes órganos
Expresión en estadíos específicos del crecimiento
Crecimiento en campo barato
La glicosilación es distinta que la de mamíferos
Eficiencias bajas de transformación y expresión
Seguridad controvertida
Hay tres factores importantes que influencian la expresión de una proteína recombinante
Huésped
Condiciones de crecimiento
Vector
Por lo tanto la solución a los problemas de expresión estará a nivel del vector, de las cepas y de las
condiciones de inducción.
¿POR QUÉ BACTERIAS?
Simplicidad
Cultivo barato y de alta densidad en tiempos cortos
Genética bien conocida
Gran cantidad de herramientas disponibles para biotecnología (plásmidos, cepas mutantes…)
¿POR QUÉ NO BACTERIAS?
No producen modificaciones postraduccionales: glicosilación, puentes disulfuro (sólo en periplasma).
No secretan la proteína al medio de cultivo (E. coli)
Cuerpos de inclusión
Endotoxinas
PRODUCCIÓN DE PROTEÍNAS RECOMBINANTES EN BACTERIAS
2 Estrategias:
sirve para purificar
Proteína de fusión generalmente es más estable
más soluble
Expresión directa
Secuencia Shine DalgarnoSecuencia en el ARNm, complementaria a una secuencia del ARNr 16S de la subunidad pequeña del ribosoma : posiciona el ARNm en el ribosoma
AAGGAGGUUUCCUCCA
AUG5’ 3’ARNm
3’ 5’16S rRNA
Subunidad pequeña ribosomal
Efecto de una estructura secundaria en el extremo 5’ del mRNA
Extremo 5’ del mRNA, en la región del codón de inicio AUG, NO debe ser autocomplementaria, ya que se podría bloquear el movimiento del ribosoma e impedir la traducción del mensaje.
Inicio
Fuertes
simple químicoInducibles: Inductor barato térmico
Regulables: Baja o nula expresión basal
Alolactosa : isómero de lactosa. Isomerizado por β galactosidasa
6-O-β-D-Galactopyranosyl-D-glucose; β-D-Galactopyranosyl (1→6)-D-glucose
galactosa-(β1-4)-glucosa
REGULACIÓN
Mecanismo dual de control 1- Regulación negativa: represor Lac, expresión constitutiva. Es secuestrado por alolactosa e IPTG
2- Regulación positiva: por AMPc que se une a CAP: proteína activadora por catabolito = CRP: proteína aceptora de AMPc, en respuesta a glucosa.
Curva bifásica de crecimiento de Monod: Diauxia
I: crecimiento por glucosa
II: crecimiento por lactosa
IPTGisopropil-β-D-tio-galactósido
No metabolizado por βgal. Y no usa la permeasa
ONPGorto-nitrofenil-β-D-galactopiranósido
Sustrato de βgal produce o nitro fenol (amarillo)
X-gal5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-
galactósido Sustrato de βgal produce indoxil
(azul)
SISTEMA DE EXPRESIÓN pET
• Promotor híbrido T7/lac sólo funciona con ARN polimerasa del fago T7, no con la de E. coli
• Cepa bacteriana BL(DE3): E. coli lisogenizada con un fragmento del fagoDE3 que codifica para la ARN polimerasa T7
• Inductor: IPTG
• Los niveles basales de expresión pueden ser disminuídos con lisozima T7, inhibidor de T7ARN pol. Plásmidos pLysS y pLysE
• La glucosa en el medio aumenta la represión del promotor.
Lisogenizada con un fragmento de fago DE3 que codifica para la T7 RNA polimerasa bajo el control del promotor lacUV5 inducible por IPTG. También posee una copia del gen lacI.
Células huésped para expresión
SISTEMA DE EXPRESIÓN pET (plasmid for expression by T7 RNA pol)
Promotor: T7 RNA polimerasa o promotores híbridos (T7-lac) Gen lacI o lacIq
Sitios de clonadoPéptidos de fusión (cola de poliHis)Sitios de corte para proteasasGen βlactamasa
SISTEMA DE EXPRESIÓN pBAD
Expresión muy regulada Arabinosa: niveles altos de expresiónSin arabinosa + glucosa: no expresión
Inducción dosis dependiente (aumento lineal en la expresión con el incremento del inductor)
Buen rendimiento proteico
Cepas de E. coli con genes ara mutados, alta expresión con
bajos niveles de arabinosa (no metabolizan la arabinosa)
SISTEMA DE EXPRESIÓN pBAD
ArabinosaDímero AraC
Transcripción
Dímero AraCpBAD
Para la máxima activación de la transcripción se requieren dos eventos
Unión de arabinosa a araC
Unión de AMPc a CRP que estimula la unión de araC a O1 (I1)
Otros promotores
• Promotor tac: Promotor híbrido: región -35 del promotor trp + región -10 del promotor/operador lacUV5.La expresión es reprimida por lacI (inactivado por IPTG).Más fuerte que promotor lac (5-10 x) y trp (3x)
• Promotores de fagos: Promotor lambda PL regulado por el represor cI. cI857: temperatura sensible 30ºC 42ºCcI: bajo el control del promotor lac (regulado por IPTG)
Regulación del promotor λpL
La temperatura induce genes de heat shock (proteasas)Desnaturalización térmica de la proteína expresada Desventajas
Los niveles de expresión de un gen son determinados fundamentalmente por:
La eficiencia de transcripción
La estabilidad del ARNm
La frecuencia de la traducción del ARNm
ESTABILIDAD DEL ARNm
RNasa II exonucleasasLos ARNm son degradados por PNPasa
RNasa E endonucleasa (cepa BL21 star)
La protección del ARN de las RNasas depende de:
Plegamiento del ARN
Protección por ribosomas: Imp. iniciación de la traducción eficiente, evitar estructuras 2as inhibitorias en RBS
FRECUENCIA DE TRADUCCIÓN
Diferentes organismos pueden usar los diferentes codones a una frecuencia
distinta.
Uso de codones poco frecuentes
errores traduccionales
Sustitución de aminoácidos Terminación de la traducción prematura
Uso de Codones: Estrategias de Optimización
Uso de cepas que sobreexpresan tRNAs de baja
abundancia (ej cepas Rossetta de Invitrogen).
Co- transformación del huésped con plásmidos que expresen tRNAs de los codones problemáticos
Síntesis química de un nuevo gen. Mutagénesis.
CUERPOS DE INCLUSIÓN
Agregados proteicos amorfos
Se generan como respuesta al estrés debido a la alta expresión de proteínas recombinantes
Figure 2. Transmission electron microscopic photographs of (a) R. sphaeroides ES16; (b) R. sphaeroides N20; and (c) R. sphaeroides U7 in GM medium containing malate as a carbon source at the stationary phase (72 hrs). Bacterial cells packed with poly-β-hydroxybutyrate inclusion bodies. Bar = 2.0 μm.
Mecanismo de generación ¿?
Alta velocidad de síntesis impide el plegamiento apropiado ?.
Ambiente citoplasmático en E. coli más reductor que oxidante, lo que desfavorece la formación de puentes disulfuro apropiados??
LA AGREGACIÓN PUEDE MINIMIZARSE
Temperatura….20-25ºC
Velocidad de expresión
Metabolismo del huésped
Ingeniería de la proteína recombinante………proteínas de fusiónCo- expresión de chaperonas
Uso de cepas huésped deficientes en tioredoxina y/o tioredoxina reductasa para mantener un potencial redox favorable (cepas de E. coli “Origami”).
Ventajas de los cuerpos de inclusión
Se acumulan en el citoplasma en mayor nivel (> del 25%) que la proteína en su forma soluble.
Son purificados por un procedimiento de centrifugación.
No tienen actividad biológica. En la producción de proteínas tóxicas en E. coli, ésta puede ser la única estrategia posible.
Son agregados amorfos resistentes a proteasas de E. coli.
Desnaturalización: 6 M clorhidrato de guanidinio/urea
Remoción de los agentes desnaturalizantes:diálisis, dilución, cromatografía
Separación de restos celulares por Filtración del flujo tangencial o normal
¿Por qué periplasma?
Disminución de proteínas contaminantes en el material a purificar
Mayor probabilidad de tener la PR con N terminal auténtico
Menor proteólisis
Fácil liberación de la proteína por shock osmótico
Disminución de efectos negativos de proteínas tóxicas sobre el crecimiento celular.
Proteínas solubles, activas: por formación de puentes S-S facilitada por ambiente menos reductor.
Secuencia de exportación o secuencia señal de exportación
Secuencia de un péptido Señal en la PR, para ir a la membrana plasmática y pasar a través de ella. Se agrega al extremo NH2 de la proteína (extremo 5’ del gen).
signal protein of interestNH2 COOH
Secuencias señal de genes ompA , pelB, βlactamasa, malE…
Signal sequences Amino acid sequences
PelB (pectate lyase B) from Erwinia carotovora MKYLLPTAAAGLLLLAAQPAMAOmpA (outer-membrane protein A) MKKTAIAIAVALAGFATVAQAStII (heat-stable enterotoxin 2) MKKNIAFLLASMFVFSIATNAYAEndoxylanase from Bacillus sp. MFKFKKKFLVGLTAAFMSISMFSATASAPhoA (alkaline phosphatase) MKQSTIALALLPLLFTPVTKAOmpF (outer-membrane protein F) MMKRNILAVIVPALLVAGTANAPhoE (outer-membrane pore protein E) MKKSTLALVVMGIVASASVQAMalE (maltose-binding protein) MKIKTGARILALSALTTMMFSASALAOmpC (outer-membrane protein C) MKVKVLSLLVPALLVAGAANALpp (murein lipoprotein) MKATKLVLGAVILGSTLLAGLamB (λ receptor protein) MMITLRKLPLAVAVAAGVMSAQAMAOmpT (protease VII) MRAKLLGIVLTTPIAISSFALTB (heat-labile enterotoxin subunit B) MNKVKCYVLFTALLSSLYAHG
Appl Microbiol Biotechnol. 2004 Jun;64(5):625-35. Epub 2004 Feb 14.
Secreción de la proteína al medio extracelular
Post cosecha: shock osmótico congelamieto/descongelamiento lisozima shock con cloroformo
Durante el crecimiento: agregar glicina o tritón X100 al medio fusión a proteína transportadora como hemolisina o de membrana como OmpF uso de cepas defiecientes en pared
Estrés en E coli recombinantes
Causas
•Mantenimiento del plásmido: Nº de copias……..genes constitutivos (R a ATB)
•Expresión elevada de la proteína recombinante gasto E x sint. Proteína rec.
vel. de crecimiento biomasa. Sint. de proteínas de estrés
respiración
RESPUESTA AL ESTRÉS
•“Stringent response”: reprogramación en el patrón de expresión de genes y disminución en la expresión de genes de transcripción, traducción y síntesis de aa. como consecuencia de la disminución en la disponibilidad de nutrientes, fundamentalmente aa.
Adición de aminoácidos
RESPUESTA AL ESTRÉS
•Proteólisis de la proteína recombinante
cepas deficientes en proteasasIngeniería cepas deficientes en proteínas heat shock del huésped coexpresión de chaperonas coexpresión de inhibidores de proteasas
síntesis de proteína de fusiónIngeniería mutagénesis dirigida al sitio de corte de proteasadel producto redireccionamiento por péptido señal
Los sistemas de chaperonas son cooperativos y las estrategias más favorables involucran la co expresión de combinaciones de chaperonas pertenecientes a las familias de GroEl, DnaK, ClpB y del factor disparador asociado a ribosoma (trigger factor)
Reducción de estrés: x adaptación de las células
¿Cómo?
gradual del inductor
lento del Nº de copias del plásmido durante el cultivo
La formación de los puentes disulfuro en E. coli es catalizada activamente en el periplasma por el sistema Dsb
La mutación de los genes trx y gor en E coli permite la formación de puentes disulfuro en citoplama
Cepa trxB - AD494 Novagen
Cepa trxB-/gor- Origami Novagen
Proteínas de Fusión y purificación de PR
Fusión a fragmentos polipeptídicos o “tags” (etiquetas) que confieren a la PR una cierta marca.
La unión incluye el sitio de reconocimiento específico para una proteasa
¿Para qué?
Purificación por afinidad
Protección de proteólisis
Aumento de solubilidad
Detección de expresión
ETIQUETAS = TAGs
Secuencias de antígenos, reconocidas por anticuerpos específicos. Moléculas con afinidad a resinas cromatográficas: His, GST (glutatión transferasa), MBP (maltosa binding protein)
Proteínas que aumentan la solubilidad: MBP, NusA, IF2 (www.biotech.ou.edu)
“Colas” de 6 histidinas, fusionadas a la proteína, ya sea en el extremo amino o carboxilo
H-H-H-H-H-HH2N
IMAC: Immobilized Metal Ion Affinity Chromatography
H-H-H-H-H-H COO-
Elución
ImidazolBajo pHEDTA
MetalNiCoCu
Proteasas
Factor Xa IEGR/X (X cualquier aa menos P o R)
Trombina LVPR/G
Enteroquinasa DDDDK/X (cualquier aa menos P)
HSPP (Amersham) LEVLFQ/GP
TEV ENLYFQ/G
Es la cepa de Escherichia coli más comunmente usada para la producción de proteínas recombinantes
BL21
Produce mayor biomasa que que E.coli K12 con menor producción de acetato
Deficiente en proteasas Lon y OmpT
E. coli B F- dcm ompT lon hsdS(rB- mB-) gal
Estrategias para reducir la formación de acetato en E. coli
Biochemistry, Genetics and Molecular Biology "Advances in Applied Biotechnology", 2012
Genotype Description Benefit
lacIq
This mutated version of LacI gives high levels of lac repressor expression. This allows tighter regulation of gene expression from the lac promoter
Tightly regulated gene expression from lac promoter
DE3
Lysogen that encodes T7 RNA polymerase. Used to induce expression in T7-driven expression systems
Required for expression from the T7 promoter in E.coli
pLysS
pLysS is normally plasmid borne. It harbors T7 lysozyme, which destroys T7 polymerase produced from DE3. Used to reduce basal expression in T7-driven expression systems by inhibiting basal levels of T7 RNA polymerase
Tightly regulated gene expression from T7 promoter
CEPAS BACTERIANAS PARA EXPRESIÓN PROTEICA
lon
Defficiency in the Lon ATPase-dependent protease. Decreases the degradation of recombinant proteins; all B strains carry this mutation
Reduced degradation of recombinant proteins
ompTDefficiency in an outer membrane protease.
Reduced degradation of recombinant proteins
araD/ara-14
Cannot metabolize arabinoseEnhances expression from araB promoter
dnaJ dnaJ encoded chaparonin is inactivated
Improves folding of some heterologous proteins
gorMutation in glutathione reductase, which enhances disulphide bond formation
Improves folding of heterologous proteins requiring disulphide bonds
Bacilli: bacterias Gram positivas
Secretan proteínas directamente al medio
No tienen LPS en la membrana externa no ENDOTOXINAS
No / Low Protein ProductionReason Vector Host Strain Growth Conditions
Toxic protein •Use T7 promoter-based vectors (also arabinose)•Tightly regulate induction with lac operator
•Use BL21AI or BL21(DE3)pLysS/E
•Start induction at higher OD •Shorten induction time•Add Glucose to suppress leaky expression
Initiationproblems
•Re-clone with more A residues at 5’•Shorten distance between RBS and first ATG (2-8 nt(
Rare codons Mutate gene for codon optimization
Use stains supplementing rare codons (Rosetta, Codon +)
Slow translation by reducing temperature or grow in poor media
Your gene induces
rearrangement and loss of the DE3 lysogen
•Tightly suppress gene expression prior to induction•Use low-copy origin of replication plasmid
•Use recA- strains(HMS174; BLR)
•Start from freshly transformed bacteria•Add Glucose to suppress leaky expression
RNA degradation Change vector to structured RNA vector
Use RNAse deficient strain (BL21Star)
Reason Vector Host Strain Growth Conditions
Protein is misfolded due to lack of correct disulfide bond formation
Use thioredoxin, DsbA, DsbC fusion partners Clone in a vector containing secretion signal to the periplasm (pelB, OmpA)
Use Trx(-)/gor(-) strains (e.g. Origami) for creating oxidative conditions in cytosol
Lowaring induction temperature usually helps
Hydrophobic protein
Solubility enhancing fusion proteins (MBP, NusA, GST, etc.)
Membrane rich strains(C41/C43)
Slow expression rate (low temp; low [inducer]; short induction time; poor media)Heat shock with chemical chaperones
No appropriate chaperones
Add vectors for various chaperone co-expression
Screen various expressing strains
Heat shock with chemical chaperones
Sub-cellular localization signals
Replace with bacterial signals (secretion) or omit signals
Membrane rich(C41/C43)
Induce at low temp.
Membrane proteins Use mistic fusion protein.Generate truncated forms of protein (soluble domains)
Membrane rich (C41/C43)
Protein is part of a complex
Transform with a partner: combination of 2-4 vectors for max 8 proteins
Heat shock with chemical chaperones
Aggregation
Truncated protein
Reason Vector Host Strain Growth Conditions
Rare codons Optimize codon usage Use rare codon strains (rosetta , codonPlus)
Slow elongation by low temp.; low inducer; poor media
Faster, uncoordinated-translation of fusion protein
Sub-clone with another fusion partner or avoid N-terminus fusion protein
Slow expression rate with low temp.; low inducer; short harvest; poor media
Degradation Detect and replace specific protease sites
Low protease strains (BL21 derivatives, M15)
Grow and induce at low temp, use protease inhibitors when breaking the cells on ice
Induce at higher OD and reduce induction time