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Métodos de identificación bacteriana
Identificación fenotípica•Tinción de Gram•Morfología celular•Motilidad•Tolerancia al oxígeno•Morfología de colonia•Tipificación bioquímica•Perfiles de proteínas celulares
Identificación genética•Hibridaciones DNA-DNA•PCR•Secuenciación 16S rRNA
Curva de crecimiento bacteriano (in vitro)10
9
8
7
6
5
4
Cuen
tas v
iabl
es/m
l (10
log )
Tiempo (hrs)
Fase exponencial
Fase estacionaria Fase dedeclinación
Fase delatencia
Perio
do d
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n
0 3 6 9 12 15 18 21 24 27 30 33 36 39 42 45 48
Perio
do
de re
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Métodos de identificación bacteriana
Identificación fenotípica
Definición
Secuencia consecutiva de métodos de “microbiología tradicional” que en conjunto llevan a la identificación de especies bacterianas en cultivo; mediante la determinación y posterior seguimiento de sus características fenotípicas y metabólicas a través de diagramas de flujo de identificación aceptados
Aplicación • Identificación y cuantificación de especie cultivable previamente caracterizadas o de microorganismos predeterminados a partir de muestras clínicas o cultivos puros
Ventajas• Permite la realización de pruebas de susceptibilidad antimicrobiana posteriores o
en paralelo a la identificación• Es posible realizar la cuantificación de las especies evaluadas
Desventajas
En comparación a la identificación genética:• Más laborioso• Mayor tiempo y costo• Difícil manejo de muestras bucales y de otros sitios con proporciones elevadas de
especies fastidiosas• Subestimación de especies fastidiosas• No permite la identificación de especies no-cultivables
Identificación fenotípica- Diagrama de flujo
Tinción de Gram
Morfología celular
Motilidad
Tolerancia al O2
Morfología de colonia
Tipificación bioquímica
Perfiles de proteínas celulares
Gram positivo
Gram negativo
Identificación fenotípica- Tinción de Gram
Identificación fenotípica- Morfología celular
Coco
Bacilo
PleomórficoEspirilo
•Sin motilidad•De nado (Swimming)•De deslizamiento (Glidding)•En espasmos (Twitching)
En Agar
Tubo de Punción
Identificación fenotípica- Motilidad
Contraste de Fases
Campo Obscuro
•Anaerobio estricto(en ausencia de O2)
•Microaerofílico(en conc. bajas de O2)
•Capnofílico(en presencia de CO2)
•Anaerobio facultativo(en presencia/ausencia de O2)
•Aerobio estricto(en presencia de O2)
Identificación fenotípica (Tolerancia al oxígeno)
•Color•Tamaño•Forma•Textura•Consistencia
•Periferia•Adherencia al agar•Formación de fosas•Propiedades hemolíticas•Fluorescencia con luz UV
Identificación fenotípica- Morfología de colonia
Identificación fenotípica- Tipificación bioquímica
•Fermentación de carbohidratos•Productos terminales•Catalasa•Oxidasa•Coagulasa•Reacciones de aglutinación
SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate - polyacrylamide gel electrophoresis)
Identificación fenotípica- Perfiles de proteínas celulares
Métodos genéticos- Hibridaciones DNA-DNA
DefiniciónMétodo no-dependiente del cultivo bacteriano para la identificación de especies; mediante la detección de fragmentos cortos de DNA marcados (sondas) tras su enlace a moléculas de DNA complementarias en una muestra (templete)
Aplicación • Identificación y cuantificación de microorganismos predeterminados a partir de muestras clínicas o cultivos puros
Ventajas
En comparación al resto de las pruebas de identificación:• Capacidad para evaluar mayor número de especies y muestras
En comparación a la identificación fenotípica:• Menor tiempo y costo• Fácil manejo de muestras bucales y de otros sitios con proporciones elevadas de
especies fastidiosas• Permite la identificación de especies no-cultivables
En comparación a otras pruebas genéticas:• Es posible cuantificación las especies evaluadas
Desventajas
En comparación a la identificación fenotípica:• No permite la realización de pruebas de susceptibilidad antimicrobiana en paralelo
a la identificaciónEn comparación a otras pruebas genéticas:
• Menor sensibilidad y especificidad
•Sonda: fragmento de DNA marcado con una molécula reportadoraque permite su detección después de la hibridación
•Molécula ReportadoraRadioactiva: Isótopos con emisiones β (generalmente P32)No-Radioactiva: Digoxigenina, Fluorescina, Biotina, etc.
•Especificidad: determinada por el diseño de la sonda•Sensibilidad: determinada por el tipo y concentración de la sonda
Métodos genéticos- Hibridaciones DNA-DNA
•Southern BlotBlanco = DNASonda = DNA
•Northern BlotBlanco = RNASonda = DNA
•Western BlotBlanco = ProteínaSonda = Anticuerpo
“MiniSlot”
Canales abiertos
Membranade nylon
Filtros
Socransky et al. Biotechniques 1994
Métodos genéticos- Hibridaciones DNA-DNA
“MiniBlotter”
Canales de hibridación
Membranade nylon
Métodos genéticos- Hibridaciones DNA-DNA
Socransky et al. Biotechniques 1994
Métodos genéticos- Hibridaciones DNA-DNA
* Serotipos a: 43717 & b: 43718† Subespecies nucleatum: 25586, polymorphum: 10953 & vincentii: 49256
Actinomyces georgiae 49285Actinomyces israelii 12102Actinomyces meyeri 35568Actinomyces naeslundii stp. 1 12104Actinomyces odontolyticus 17929Actinomyces viscosus 43146Aggregatibacter actinomycetemcomitans *Campylobacter gracilis 33236Campylobacter rectus 33238Campylobacter showae 51146Capnocytophaga gingivalis 33624Capnocytophaga ochracea 27872Capnocytophaga sputigena 33612Dialister pneumosintes 33048Eikenella corrodens 23834Eubacterium nodatum 33099Eubacterium saburreum 33271Filifactor alocis 35896Fusobacterium nucleatum †Fusobacterium periodonticum 33693
Especie ATCC
Neisseria mucosa 19696Parvimonas micra 33270Porphyromonas asaccharolytica 25260Porphyromonas gingivalis 33277Prevotella intermedia 25611Prevotella loescheii 15930Prevotella melaninogenica 25845Prevotella nigrescens 33563Propionibacterium acnes 6919Selenomonas noxia 43541Streptococcus anginosus 33397Streptococcus constellatus 27823Streptococcus gordonii 10558Streptococcus intermedius 27335Streptococcus mitis 49456Streptococcus oralis 35037Streptococcus sanguinis 10556Tannerella forsythia 43037Treponema denticola 35405Veillonella parvula 10790
Especie ATCC
Métodos genéticos- PCR
DefiniciónMétodo no-dependiente del cultivo bacteriano para la identificación de especies; mediante la amplificación de porciones específicas de DNA en una muestra (templete)
Aplicación • Identificación de microorganismos predeterminados a partir de muestras clínicas o cultivos puros
Ventajas
En comparación al resto de las pruebas de identificación:• Mayor sensibilidad
En comparación a la identificación fenotípica:• Menor tiempo y costo• Fácil manejo de muestras bucales y de otros sitios con proporciones elevadas de
especies fastidiosas• Permite la identificación de especies no-cultivables
Desventajas
En comparación a la identificación fenotípica:• No permite la realización de pruebas de susceptibilidad antimicrobiana en paralelo
a la identificaciónEn comparación a la identificación fenotípica e hibridaciones DNA-DNA:
• No permite la cuantificación de especies (excepto PCR en tiempo real)En comparación a hibridaciones DNA-DNA:
• Bajo número de especies evaluadas
PCR
Métodos genéticos- PCR
•Ciclos repetitivos de desnaturalización, alineamiento de primers yextensión para producir múltiples copias de una secuenciadeterminada de DNA
•Especificidad: determinada por el diseño de los primers•Sensibilidad: hipotéticamente 1 célula
Métodos genéticos- Secuenciación de la fracción 16S rRNA
DefiniciónMétodo no-dependiente del cultivo bacteriano para la identificación de especies; mediante la determinación de la secuencia en el DNA de la fracción 16S rRNA en una muestra (templete) y su posterior comparación con secuencias publicadas
Aplicación • Identificación de cualquier microorganismo a partir de muestras clínicas o cultivos puros
Ventajas
En comparación al resto de las pruebas de identificación:• Mayor especificidad
En comparación a la identificación fenotípica:• Menor tiempo y costo• Fácil manejo de muestras bucales y de otros sitios con proporciones elevadas de
especies fastidiosas• Permite la identificación de especies no-cultivables
Desventajas
En comparación a la identificación fenotípica:• No permite la realización de pruebas de susceptibilidad antimicrobiana en paralelo
a la identificaciónEn comparación a la identificación fenotípica e hibridaciones DNA-DNA:
• No permite la cuantificación de especiesEn comparación a hibridaciones DNA-DNA:
• Bajo número de especies evaluadas
Secuenciación 16S rRNA
Métodos genéticos- Secuenciación de la fracción 16S rRNA
•Comparación con bancos de secuencias conocidas
•Especificidad: hipotéticamente “absoluta”•Sensibilidad: hipotéticamente 1 célula