Post on 18-Feb-2018
,' NOMBRE:
I TELEFONO :
MATRICULA:
CLAVE :
CARRERA :
TRIMESTRE:
' HORAS:
1
1 6 74 37 05 109588 81338594
23.3.54.86
ING. BIOQUIMICA INDUSTRIAL
87- I
30 I
LUGAR : PLANTA PILOTO DE FERMENTACIONES, UAM-I
FECHA DE I N I C I O : 20 DE J U L I O DE 1986
: FECHA DE TERMINACION: 20 DE ENERO DE 1987
i TUTOR INTERNO: M. EN C. MARIAN0 GUTIERREZ ROJAS
.
T ITULO:
ALUMNO :
PROFESOR ASOCIADO, DEPARTAMENTO DE
BIOTECNOLOGIA, UAM-I.
TRODUCCION DE ESPORAS DE A. NIGER
EN PLANTA PILOTO".
/
EMMA GABRIELA RIVERA COTA
TUTOR : !
M . EN c. PARIANO GUTIERREZ ROJAS
. .
1
U n reconocirniernntg muy especia l a mi a s e s o r M. en C . Mariano G u - ti6rrez Rojas y a.1 Pr. E m i l i o A.
. Nassocco, p o r t o d o el a p o y o br'in - d a d o en l a - real izac i6n de e s t e - t r a b a j o .
I N D I C E
.
Introducci6n ................................................. 1 Objetivo ..................................................... 3
1 . Materiales y &todos ..................................... 3
1.1. Microrganismo ........................................:... 3 1.2. Producci6n de in6culos .............................. ..: . 3
1.3. Tkcnica de conteo de esporas ............................ 4
!
1.4. Descripci6n de los esporuladores ........................ 4 1.4.1. Esporulador tipo 'botella ............................... 4
I . 4.2. Esporulador de discos rotatorios ....................... 5 1.4.3. Columna empacada .................................... .. 6 1.5. Diseño experimental ..................................... 7
1.6. Reologia del medio de cultivo ........................... 10 2 . Resultados ............................................... 10 2.1. Efecto del gasto de aire .............................. 5 10 2.2. Diseño factorial para optimizaciijn de fatores físicos . . 11 2.3. Adherencia del medio de cultivo ......................... 11 2.4. Diseño factorial para l a optimizaci6n de la conGentra-
ci6n de sales .......................................... 11 2.5. Esporulador de discos ................................... 12 2.6. Cinkticas de producci6n de esporas en columna .......... 12 3 . Discusi6n ................................................. 24 UXCLUSICNES ...............................:................ 28
Figuras: Dibujo de esporulador de discos ............................. 2 2
Dibujo de columna empacada .................................. 23
Tablas: 1.- Efecto del gasto de aire ........................... , ... 14 2.- Diseño fatorial para optimizaci6n de factores f ís icos ... 15 3.- Diseño factorial para optimizaci6n de conc . de sales .... 18
. . . . . .- . . . . . . . . I_ _" ~ . - .". .. . . . . . . . . . . .
Gr&f icas: la. Efecto del gasto de aire ................................. 13
lb. Cin6tica de'producci6n de esporas ........................ 13
IC. Recuperacih de esporas .................................. 13 Id. Esporas recuperadas ...................................... 13
c
, I N T R O D U C C
i . La derdanda dal de alimentos ha con eí crecimiento de la poblacidn
I O N
ammtado proporcicmalmnte y la escasez de &tos se ha-
ce cala dSa nds crftica, sobre todo en los pafses .del tercer - mundo.
Recienkmente, la habilidad de las espas fungales para llevar a cabo reacciones de transformaci6n quhica coauercialmente va- luables ha recibido considerable atencibn, y ahora se sabe que
las esporas poseen un ccmplejo enzimdtico capaz de la transfor- maci6n de sustratos aparenterrmte no relacionados con su metabo - lisno. Se ha desrrostrado que las esporas de -hongos filamentosos poseen un gran potencial cam agentes catalizadores en l a trans - formacidin de canpuestos org&Iicos. (Bihari et al.; 1984).
Tradicionalnaente se ut i l izan espras de hongos filanentosos pa- ra iniciar f m t a c i m e s en cultivos senisblidos; para la pro-
ducci6n de enzimas uxm alfa-galactosidasa e irnrertasa (Silman; 1980), amilasas (Raimbault; 19861, Ac. cftrico (-aya- na et,al.; 1985), Micotoxinas (Hesseltine; 1972) en e l mique- cimiento de diferentes sustratos cum la yuca (Rdinhdt; 1980), , la paja de trigo (Laukwics e t al. : 1984) , pulpa de cafe (Peñalo - za; 1985).
prcduccidn de: esporas se realiza de dos meras: en cultivo sunergid0 y en cultivo semis jolido. Vezina y colaboradores - - (1985) describen una IScnica sencilla para pruducir esporas a dtivo smergido, indicando que es necesario rea l izar estudios
.. con diferentes @os ccmplejos m obtener una buena esporda - ci6n. ~espu6s reprtarm que la @mica por cultivo sds6lido
presenta importantes ventajas sobre los n6tdos de cultivo sunergid0
en r6gimen continuo. En c u l t i v o s d s 6 l i d o se han producido espras , por h d d i f i c a c i 6 n de grm (Salas y Burgos; 1972) , en peques pe-i dams de pan blanco autoclaveados e inoculados hcmedos ( S a n s i n g y - C i e g l e r ; 1973) . Otras -cas mds Sfisticadas, con medio de cultiA
vo y coxliciones bXen dainidas, en I&races o en lecho estStico de
mayor tamaño tambi6n han sido utilizadas (Vezina y Shing; 1975, S i l -
man, 1980; Raimbault, 1981). ~ S O S y Raimbault (1985) han diseñado un reactor de discos rotatorios en los- que se expone una gran super-
ficie de contacto, con aire controlado, logrando altas productivida- des. 1 ;
P
La inaustria de fermentaciones que maneja hongos f i lmtosos en cul - tivo suwrgido y semisblido, u t i l iza in6culos masivos de esporas pa- ra e l inicio de sus procesos. La preferencia por esporas y no por mi - cel io se debe a que con esporas la f&taci6n se inicia con a u l a s
de edad hamghea, se evita. la d m a c i b n de micelio, que en la ma- y o r € a de los casos es frdgil , incidiendo en l a productividad global - del proceso, se minimiza la prbbabilidad de acarrear rrretabolitos no - deseables.
-
A nivel de Planta Piloto, la prcducci6n de esporas presenta serios -
.
problemas, tales cum: los altos niveles de p m d k i b n , la recupera" cidn de. esporas, mantenimiento de cordiciones est&iles y sohre t o d a r
I sostener las productividades obtenidas en laboratorio, por lo que se - I
requiere de un estudio que involucre e l pmblana de escdaniento des- I
de e l punto de vista del equipo, es decir, e l diseño del esparuladar misno, su instrumentaci6n, caracterizacidn y condiciones de aperacidn incluyerdo el uso de reactivos gradp eco, diferentes tamanos - de- @ d a y dist intos niveles de aireacih, entre otros,-
I
e -
. -
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Q B J E T I V O
" D i s e i k y caracterizaci6n del equipo y las condiciones de operacih para la pmducci6n de -ras de Asperqillus .niger en planta piloto"
1.1 Micsoorganisrro: A. niger cepa 10, variedad hmnebeqii, de O f f i
ce de la Recherche Scientifique et Technique Outre M , Paris, Fran - ce. Cortesfa del D r . M. Raimbault. La cepa es conse~~ada en medio - de gelosa con perlodos de resienbra de s e i s mses, (Raimbault; 1981).
l. 2 Pmduccidn de in6culos: Se utilizaron matraces Erlen Meyer de - 250 ml. conteniendo 30 ml. del siguiente medio de cultivo:
Medio de cultivo #1
Harina de yuca 100 g,
Urea 10 g.
Fosfato rJbnapOtdsic0 20 g.
Sulfato de Amonio 40 g.
A v 1000 ml.
LOS matraces conteniendo e l medio de cultivo, fueron esterilizados - en autoclave, 15 minutos a 1 2 l o C , Cada matraz se jnoculd con 10 es- pas y 6e ind durante 7 dfas a tgnperatura ambiente.
6
.
-
- Las esposaS se recuperaron agregando a cada matraz 70 ml. de una s e ! " lucidn est&il de agua con tween 80 a l O. 2%, agitanao durante 15 mi-
nutos con agitador magn6tico. Findlmente la suspensidn de esporas se filtra con gasa es&il.
-
f
1.3 T&nica de con- de espora8 se utili26 e l &todo de menta directa
can &mara de Neubauer.
1.4 Descripcih de los esporuladores: C m el pmp6sito dd escalar l a -L.
producciba? de esporas de lalmratario a planta piloto, se selecciw- ron tres mzdelos carparativos de esporulador cano sustitutos de los matraces en que se produch las esmras en e l laboratorio.. ESMS ,- 1
I
tres mdelos se canpararm en cuanto i a productividad y facilidad de manejo de modo de seleccionar e l mbs -provechoso.
-
as caracterfsticas que se e s s a n del espordador a seleccionar son: que se opere bajo axdiciones bien definidas para poder reproducir re sultados, que sea de manejo prScti&o:; fdcil inoculacidn, mntenjmien-
to y cosecha bajo condiciones esSriles, gran superficie de cor$acto efectiva con e l aire.
-
1.4.1. Esporulador tipo botella: bote1la;rectangular en posici6n horizon- tal, de 35 an. X.14 cm. X 11 an.. A i a botella se l e adapt6 un taph
de algodbn con un tubo de vidrio por !:el cual se airea el medio, que - llega hasta el centro sin tocar e l medio de cultivo. E l aire es suni-
nistrado por una bcmba de & e r a pasando par un rot&netro para cantro_ lar e l flujo y por un filtro de algod6n para conservar las condiciones estSriles. ( D i bu j o I.J
-
El medio usado en &te esporulador es e l sig. :
* Medio de cultivo # 2
H. de yuca Sulfato de Amnio , 20 g.
Urea 5 i
Fosfato Manapotdsico 10 g. A w 500 d. 5
250 g.
I i
i . . .. *. . ."__,*_._ """"ll.".. .. - - . .. II ~ .' .. ". . .
as botellas se cargan con 1000 ml. de ste medio de cultivo y - se esterilizan en autoclave a 121OC dur ate 15 minutos.
una vez enfriadas, se inoc~lan con l o 9 . spras en - te 20 ml. de suspensibn.
m &te modelo el ti- de incubacibn es de siete dfas, am su ministro de aire a p a r t i r del -o &.a c u a n d o ' el micelio ha crecido.
m -pas recuperadas adicionando un litro de una soluci6n
de a- con tween 80 al O. 2%, c m agitacibn manual. vigorosa y -+ f i l e d la suspensi6n a traves de gas:-.
1.4.2 Esprulador de discos: Cilindro de ac3lico de 30 cm. de largo
y 15 cm. de didrmetro, con flecha de nylon que tiene adapta+
dos 19 discos de acrflico poros0 rugoso con didmetso de 13 un. cada uno, separado con tubos de almin5~. La flecha se conecta a
un mtor impulsor que hace girar los discos, y asf, e l sisterna - de aireacih, consistente en un tubo cc: 1 orificios de salida a - todo lo largo del esporulador , es m% eficiente.
En &te modelo, el aire es smiinístradc por una bcmba de pecera que pasa por un filtro de a l w n y f20ntrO~adO con un r- tro. La esterilizaci6n se lleva a cabo con una so!Luci6n de h i p -
clorito de sodio y d d s se lava con agua e s e i l caliente has - ta eliminarlo totalmente. Posteriarmwte, se carga coz 600 d. -
9 - ~ de medio de cultivo previamente esterilizado e inoculado con 10
-ras en 20 d. de suspensibn. Se hacen g i r a r los discos para que se adhiera el medio de cultivo a ellos. El exceso de medio -
- se drena. aire es- sministrado al d e e s del segundo d€a =
"
de incubacibn. -
C
1
El tiempo de incubacih es de siete d f a s l , desp&s de los cuales se procede a suspender las esporas producidas.
I
~a recuperacidn de las esporas se lleva a cabo adicionando al - esporulador un l i t ro de la soluci6n 6 80 a l 0.2%. Posterior mte, se hacen girar los discos para que las esporas se dew- dan de elrlos y queden suspmlidas en la'solucih de tween 80. La
rmspensi6n'de esporas asf obtenida, se drena y se hace pasar a - trm& de gasa e s e i l para liberarla de los resid- de'micelio y medio de-cultivo. ( 8 i b u h 2)
- . ,
L 4 . 3 . COP- enpaczda: Ca-siste t a un cilindro de vidrlo de seis - cm. de dk&tro interno y 45 cm. de altura, provisto de una cha-
queta por dode circula agua y que sirve cano dispositivo de m-
f riamiento. La columna ess gnpacada . c o n anillos rashig de vi- i.
drio de 0;75 un. de d i h t r o por 0.75 an. de altura, respetando l a g m t r z a recanendada (Dcol. /Demp.=8) . El sistepM de airea-
ci6n de la columna consta de esferas de vidrio en e l fondo de l a colmma que funcionan cam difusores. El aire es s a s t r a d o -- por una banba de pecera pasando por un filtro de al-n, desde e l fondo de la colmma y ;eS controlado por un rot&netro.
-
El agua de la chaqueta regula la tanperatma en el Seno de l a co
lunna durante l a incubacih ya gue cuenta con un regulador de - teqeratura "(3J-OFT" que se calibra de manera que esta se man- ga constante durante e l proceso.
-
- - -
La columa se opera de l a siguiente forma: se esteriliza 'haciendo pasar vapor de agua durante media hora a trav15s de ella. Una vez esterilizada, se llena la chqueta hasfa que l a tgoperatura se - non-nad!e. agua de l a chaqueta .~ circula " por comeCdi6n natural -
manteniendo e l seno de la colupllna a tgnperatura constante. cuando "
-
-6 ~
se operan dos oolmmas en serie, e l aire circula de una chaqueta a ,
otra, pero l a comrecci6n natural ya no es suficiente por lo que es
necesario adaptar una n e d t i c a para que aylde a l a circula-.l. I
c ih , con un flujo de aire muy pequeño y en un tramo pequeño del - I
sistana. i
, .
El medio de cultivo s e i 1 se imcüla a 45Oe ;con una suspensidn - de 10 esporas en aprax-te 10 d. de : suspensi6n, despu& - de lo cual, se vacfa por l a parte de arriba de l a colmma y e m - rre hasta &ir todo e l anpaque. El tignpo d e incubaci6n es de -
9 - .
siete dfas. \
as esporas se recuperan haciado pasar una solucidn es-il de a- \ ;
gua con tween 8D al 0.2% can la ayuda de una bmba perisrntica. - Las esporas suspendidas en las burbujas de la soluci6n salen par - una salida lateral en l a parte alta de &a colynm, no es necedio filtrar pues quedan libres de medio de cultivd y rnicelio.
1.5 Diseño experimental.- El todo do utilizado f& el diseño factorial L l I
j de Box y W i l q o n , que es un experbto en e l :.que se estudia simul - theamen- e l efecto de un cierto rdiaero de variables. ~
I El d t d o consiste en probar todas las canbinaciones posibles entre - 1 las variables a optimizar. La experimmtacibn sigue un orden secuen - 1 cial en el cual, los resultados de un experimento deteminan el si- I quiente. La serie de expesimentos enpieza cuando probamos todas las oxnbinaciones posibles entre 'k" variables, lo que hace un nCmer0 - de 2 -+tos. Se f i j a un medio base {m) y URa miidad de va- riacidn ( w ) tal que al variar el medio base en esa unidad, pueda -
b
- -.
k ~.
. . . . . . , . .. . . . . .. . . * "̂ l̂l."-. I
distinguirse un efecstp en e l parSmet~0 de respuesta, en Qste caso, el nCHner0 de esporas a l final de la incubaci6n.
.
!
Las variaciones se h a b amentardo y disninuyd UM unidad de - variacitk, e l valor de cada wariable alrededor del d o base y ha - ciendo todas las canbjnaciaraes posibles.
LOS resultados se tabdm separando en diferentes columnas los re- sultados obtenidos por variaci6n positiva o negativa de cada varia - ble . A continuacidn se calculan los praosdio de nas (cada colunma representa u" variable) asigndndoles el signo correspondiente, con coeficientes de la ecuacidn de la variable e l siguiente experimento.
cada una de las calm"
de resultados obtenidos objeto de calcular los de respuesta y p1,mea.r
~a ecuaci6n de la variable de respuesta es:
Y = b x + b x + . 1 1 2 2 . . . . .
donde 6 variables xi ; i= (1,2, . . . . k) , se expresan en W y Ins -
coeficientes se definen cuno:
donde: + xi = promedio de los resultados de las varia-- ciones.positivas en xi
- -. - - - X1 = promedio de los resultados de las varia-- ciones ~ negativas" en xi. "
-
8
los coeficientes de la variable de respuesta son parSmetms que
indican la rapidez de caanbio de la respuesta con respecto a cada variable, es decir:
a($)= % (b.X. 1 1 + . . . . . + b.X. + . . .+. %S) = bi 1 1
!
por lo tanto, al acercarse a cero fica que la respuesta se acerca a respecto a la i-bsim variable.
Para planear el siguiente experimento, se escogerd un valor ca- tral nuevo para cada variable (nuevo MB) , qe@ado de la mag- nitud de su coeficiente; es decir, el valor central de la i-bsi- ma variable se inmementarpa si SU coeficiente es positivo y d i s
minuirS si es negativo para mer esperar un efecto positivo en la respuesta.
f
-
r:
Cuando e l valor de bi se aproxime a cero, puede considerarse que
la respuesta s i acerca a un mdxim~. ES posible que no se obtenga un valor exad de cero durante la &imentaci6n por lo que p ~ k de fijarse'un rango del cual se mnsidere'que la respuesta SS-- lo suficientmente cerca del valor mbcimo.
I
Puede ser que algunos coeficientes se acerquen a cero mbs rbpicia- m t e que otros, de manera que en los siguientes e x p e r h ~ s m ser& necesario incluir todas las variables, puesto que para a3gu-
nas, ya se habrS alcanzado el mbzh, simplificdndose el trabajo-
I'ambi6n pw=de suceder que el: valor nunkico de la variable de res puesta sea rucho mayor que el valor de lasivariables a optimizar, por lo que al planear e l siguiente.experhen* no se pueden incre - mentar o dihuir las variables en la mediida que lo indique el - coeficiente; por este mtivo en rmxhos casos es necesario n0-i - zar la variable de respuesta de rnodo que adapte valores al -S
del misno oxden de magnitud que las variables a optimizar. h s -
-
9
I
"
ten varios dtcdos para nonnaliiar variables, uno m y sencillo COR
siste en dividir e l valor de l a variable de respuesta entre un mG1
tip10 de 10 (diganros 10 1 de modo que su valor c o n d e con e l va lor de l&.variahles a optimizar.
- 8
-
i
1.6 Fteolog~a del medio de cultivo.- Se realizaron pruebas de adhemn-
cia m e una superficie de vidrio vertical, p-0 diferentes - concentraciones de agar y de harina de yuca con e l fin' de encontrar las concentraciones que =jar adhenmcia y espesor de pelfcula p r e
porcionen a l medio.
2. HEsuLp1DoG ?
2. l. Efecto del gasto de aire. - Experimentos preliminares demstraron que a l -liar la superficie de contacto, la espnhci6n 110 se - produce, acln curdo el :micelio sf crece, a m31zos que se suminis-
tre aire a l esporulador. Este carp?ortmniento se present6 inclusive en e l esprulador tipo botella que es e l de menor area de contacto de los tres modelos seleccionados. Eh experimentos posteriores se encontr6 que si el aire se suministra a partir del segundo dSa de
. incubaci@, cuando el micelio ya ha crecido, los rerdimientos: :au- mentan.
Para encontrar - e l gasto de aire 6pti.m se utili26 e l esporulador - tipo botella, cuya descripcidn y operacih fueran descritos en l a secci6n anterior. & u t i l i 2 6 e l medio de ' C U f t k i m # 2, des
crito anteriormente. se pr~baran diferentes gastos de aire;.desde . O a 150 l/hr.
observar un mbcimo de r-enb en esporas por mililitro cuando se sunhistran 75 1. de a i r e h . 6 0.1380 1. de aire/an 2 -hr. (GRAFICA la),
-
10
I
1
I
El gas- de aire ass enmatrado se mantuvo en los tres modelos SeleCCiOMdOS.
I '
2.2. Diseño faclDrid para aptimiz&i& de factores ffsicos.- Se rea- lizaran una serie de experimn-s factoriales (seccibn l. 5) por - duplicado en matra& de 250 ml., se utili& e l medio de cultivo #I y la mtodologfa descrita en la seccih 1.2. ..
I
m s resultadps de l a secuencia de experimntos se 'inuestran en l a tabla #2 de dande su pueden extraer los siguientes datos corres-- pondientes a los 6gtimos encontrados:
\, -1
-temperatura de- incubacidn 34.5OC I'
-tanperatma de es ter i l izac i6n 121OC -m inicial 5 -ti- de es&ilizacibn 15 min.
2.3. 'Ádherencia del medio de cultiva. - Se enamtr8 que l a r m a y a r adhe
rencia a la superficie resulta cuando la ccmcentracidn de harina de yuca es de. 45 g/l. de agua y l a concentracidn de agar es de - 15 g/l..
2.4 . Di& factorial de l a optimizacidpl de l a co'ncm&rnidn de sales.- l a misma forma gue en la semi& 2.2 se realid e l ais- exp- .
rimntal utilizando m medio base -el medio de 'cultivo #1, incorPo_ rando a l medio cloruro de Calcio, ya que se ha d&strado que
menta l a prodicci6n de esporas (Fbussos; 1986) . Se taMlron en-.cuen-
ta los factores ffsicos ya optimizado asl cam incoxporar agar a l - d o de cultivo y disminuir la concentracidn de harina de yuca.
-1 amcentracibn de Urea 10 g/1 - cancentracidn de Sulfato de Anrani0 4Og/l - cmcmtracibn de Fosfatn bnopot&ia 2Og/l - mncentracibn de Cloruro de Calcio 5 g/1 !
I i
2.5 Espordador de discos.- Se realizaron varias f-tadrknes
&I &te mdelo de -, encantrbdOSe una produccibn - de 1 X 10l1 esporas totales. Se-enmntr6 tambit% que en el es podador se wntamjna con mucha facilidad.
-
?
tes grtificas mestran varias cMticas realizadas en el e- dador tip colmma enpacada. Estas grdficas correspanden a las cin6ticas de producci6n de esporas respecto al tignpo, es - poras recuperables y esporas residuales respecto al ti- y
esporas recuperables a diferentes tignpos de incubacidn con- tra volm de suspensibn.
~e Bstas grsficas deducinros que e l tignpo de incubacibn +ti- mo para la colmma anpaddda es de siete dl=. ' (Ver discusibn) .
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TABLA NUM. 1
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47.61
48
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56 38
75
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115
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O. 0206
i, ; 0.0370
O. 0740
1
O. O881
0.0888
o. o911
0.1044
O. 1380
O . 1570
O. 2129
141 O. 2611
3.4 x lo8 8.3% l o 7
3,95x l o 8
4.72x l o 8
4 . 4 ~ l o 9
7.07X lo7 6.07X lo7
1.15X IO8
4.17X l o 8
6.4W l o 8
5.7% 10 . 7
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TABLA NUM. 2
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- ~frnites de las Variables:
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(+I MB
37 33.5
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- Resultados: I '
1
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2
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5
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7
8
9
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11
12
13
14
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Nh. P d O de Esp./ml.
2.00
2.20
O. 54 1.90
1.40
3.00
2.40
1.80
1.10
1. u0 1.40
1.20
u. 63 1.40
o. 73 O. 75
-
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Ilc;m= &st Test pH0
:+I S. 00
2.20
0.54
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1.40
3.00
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1.80
15.20 -
(- 1 3.10 1.00
1.40
4.20
O: 68
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0.73
0.75
8.25
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2.20
O. 54 1.90
1.10
1.00
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1.20
11.20 -
(-1 1.40
3 .-O0
2.40
1.80
O L68 1.40
O. 73 O. 75 12.16 -
(+I (-1 (+I (-1 2.00 0.54 2.00 2.20
2.20 1.90 0.54 1.90
1.40 2.40 1.40 3.00
3.00 1.80 2.40 1.80
1.10 1.40 1.10 1.00
1.00 1.20 1.40 ,1.20
0.68 0.73 0.68 1.40
1.40 0.75 0.73 '0.75
12.80 10.72 10.40 13.20 "
- Coeficientes:
T..inc.:
15.20 8 8
- - - 8025 = 0.873
O est.:
11.20 12.16 8 8 - - - = -.0.103
T est.:
12.80 10.72 ” - = 8 O. 257 8 -
PHo:
10.40 13.20 8 8
” - = 0.375
.
**Todos los resultados han sido mnnalizados dividi- la variable de respuesta entre 108
- 1.7
'.
- Lfmites de las variables:
U r b 1 15 10 . 5 5
Sulfato de Amnia 50 40 30 10
Fosfato mopotSsic0 25 20 15 5
Clo+ de Calcio 6 4.5 3 1.5
~ - "" O
!
1
2
3 4
5
6
7 ,8
9
10
11
12
13 14 15
16
UREA
+ + + + + + + + -
+ + + + - -
m. P r n . ESPORAS
1.12
1.98
1.30
2.77 1.69 ~
1.06 1
2.02
1.23
2.97
1.13
.l. 51
0.95
2.94 0.78
2.82
2.08
19
I
I
I
1
I
UREA ! m2*4 C a 2 a
(+I (-1 C+) (-1 (+ 1 (-1 (+ 1 (-1 i
1.12 2.97 1.12 1.69 1.12 1.3 1.12 1.98
1.98 1'13 1.98 1.06 1.98 2.77 1.30 2.77
1.30 1.51 1.30 2.02 1.69 2.02 1.69 1.06
2.77 0.95 2.77 1.23 , 1.06 1.23 2.02 1.23
1.69 2.94 2.97 2.94 2.97 1.51 2.97 1.13
1.06 0.78 1.13 O. 78 1.13 0.95
c
. . .
8
- Coefecientes:
Urea :
13.18 15.20 - -0.25 ""
- 8 8
Sulfato de Amonio:
Fosfato Fío~opot8sico:
13.69 14.69 - ~0.12 - r . . .. - a 8
- -. -
Clnruro de Calcio: "
16.39 11.99 - 0,-54 "" "
8 8
**Todos éstos resultados tian sido r--ormal izados 6ividién dolos entre 108.
20
. . . .. . .. , . . . ,. .-. 11" , ~ " - "
'I " U n A I _""" _"" -------
, : :iscos de a c r i l i c o li . j ado
/
- I
! '
I
tubos de aluminio
c
c
* . . . , . ..
3. DISCUSION
En l a Planta Piloto de l a UAM-I, donde se real ize es te t raba jo , , se I
estS desarrollando u n proceso de enriquecimiento proteico de yuca en medio sblido, por l o que el f in de este trabajc consiste en di- señar el reactor que satisfaga l a demanda de esporas necesarias pa ra el inic io de esta fermentacidn. Para inocular cada 'gramo de yu-
ca que va a ser enriquecido proteicamente se requieren 2 X 10 es- pora s.
i I
I - -
7
Aún cuando l o s medios de cultivo y Gastos de a i r e en los esporula- dores utilizados son diferentes, es v d l i d a l'.¡a comparación entre e- l l o s , ya que para los f ines propuestos, 1 0 realmente importante es seleccionar u n reactor sencillo para que pueda ser escalado a mayo - res niveles de producción, que sea de manejo práctico y que ofrez- ca una a l t a productividad.
La influencia del a i r e en l a esporulacidn; no ,se conoce con exacti - t u d ; se cree que puede deberse a requerimientos de O2 de l a cepa o para l a remocidn be coz. LO cierto es Que exisre un gasto Bptimo - de a i r e como se muestra en l a grdfica #1 calculado en el esporula- der tipo botella y extrapolado a los otros dos podelos de reactor-. Esta extrapolacidn se hico con el f in de- simplificar el trabajo, - aunque puede no ser correcta, ya que el gasto de a i r e dptimo varía con l a eficienc.i.a del sistema de aireación, dependiendo de la dis - tribucidn de este en el reactor.
r
Se creía que el uso de reactivos técnicos pudiera a l terar l a espo- rulacidn devido a l a menor pureza de éstos en comparación ton los reactivos de laboratorio; sin embargo, comoise puede ver en l a ta- bla #3 , solo el cloruro de calcio tiene un cambio en su concentra- cidn respecto a l medio base que fué utilizado en laboratorio. A és - t e medio se le adicionó agar ademds de disminuir 1 a concentración - y el tamaño de partícula de l a harina de yuca, con el fin de lo--
-23
grar l a reología adecuada; es decir , que se adhiera a los discos en el reactor de discos rotatorios en caso de l a columna empacada, que ofreciera el grosor adecuado para que no bloqueara 1 os ani1 1 os ra- shig utilizados con@ empaque y permitiera el flujo de aire.
! ’
!
En l a optimizaciSn,de las condiciones de ester i l izaciSn, no solo se trataba de que el medio de cultivo estuviera libre de rnicroorganis- mos contaminantes, sino tambign que el grado de gelatinizaci6n de - l a yuca fuera tal que el sustrato fuera disponible para el mivroor- ganismo y l a reologra del medio fuera l a adecuada. Se encontró que l a temperatura y el tiempo de esteri l izaci6n no cambian respecto a las condiciones de laboratorio.
Como-primer pardmetro en la e lecc ión del esporulador, se hizo una - comparación de las dreas de esporulación y 1 as áreas vol umétricas - en cada reactor.
I
El 8rea volumétrica es importante para fines de escalamiento ya que cualndo es grande indica que el reactor cuenta con una gran superfi - tie de contacto en muy poco volumen de reactor por l o que peste ocu par3 un espacio reducido en l a planta donde se u t i l i ce .
-
-
La siguiente tabla muestra l a comparaci6n de áreas de los diferentes ’ model os de esporul ador:
-
MODELO AREA DE ESP.(cm2) AREA VOLUM. (cm /cm ) 2 3
Matraz Erlen Meyer 250 m1 . 50 o. 22 Esp. tipo botella 504 o. 1 Esp. de discos rcTatorios - 4297 0.9
Columna .. empacada - . 7688 - 10
En la tabla anter ior puede observarse que l a columna empacada, ademds de s e r l a que tiene mayor drea de esporulaci6n, es también l a de ma--
.
1 ’
Otras ventajas dela columna empacada son: es esteri l izable " in s i tu" en comparacih con el esporulador tipo bote1 l a que debe ser trans-- portado a un autoclave y el esporulador de discos que debido a su ma_ t e r i a l , solo puede ser es ter i l izado con reactivos qu!ímicos , que no - es una manera muy e f i c iente , trayendo como consecuencia l a presencia de microorganismos contaminantes; además l a recuperacibR de esporas al f inal rk l a incubac ih , es mas sencil la en l a columna - empacada por no requerir agitacidn manual.
Para s e r mds d.lustrativa l a comparación de produciivjdad de los espo- ruladores, se hizo el cdlculo de l a cantidad de reactores necesaria (T
para imocular 500 kg. de yuca para el proceso de enriquecimiento pro- r
te ico tomando en cuenta l a productividad promedio unitaria para cada tipo de esporulador. C
3
MODELO PRODUCTIVIDAD EFICIENCIA , , U N . NECES. PARA I - (esporas totl/reactor) Y RECUPERAC. NOCULAR 500kg DE -
YUCA.
Matraz EM 250 ml. 3 x 1o1O
Esp. tipo botella 1 x lo1* . (10%;) LOD
Esp. de discos 1 X lo1' (30%) : 33q Col umna empacada 1 x loll ( 75%) Is.\
En la tabla anterior puede observarse que el esporulador t i p o botella es el modelo que requiere de menso unidades. Sin embargo, s i tomamos - en cuenta l o imprbctico.que resulta el manejo de éste t i p o de esporula - dor desde la es ter i l ización hasta 'la recuperación de esporas y tomando en cuenta también el espacio que ocuparían todas ! las unidades, encon- traríamos que difícilmente podría recuperarse ésta opción, aún a una -- capacidad de planta de 500 k g . , mucho menos a niveles mayores.
.. . I . . . ... . . . "_ . . - 1..
g
La dificultad de ,escalar un modelo de esporul ador CON el de tipo bo- t e l l a , a menos que este escalamiento fuese lineal; es decir, a mayor capacidad de produccidn, mayor número de unidades, j u n t o con l o im-e prdctico de su manej.0, nos condujo a pensar que l a columna empacada - podr'ía ser el pronotipo con 116s probabilidades de ser usado.
e
La columna empacada no ha sido totalmente optimizada; fa l tar fa aún en - centrar la a l tura y d i amétro de reactor mdximos, 1 0 cual podr'ía condu - c i r a aumentar de manera considerable l a productividad de &te reac-- tor sin aumentar demasiado el %rea volumetrica de éste.
Las cineticas real izadas en el esporul ador tipo columna empacada mues tran que con el tiempo l a producción de esporas no decrece. Esto se - probd hasta wrun tiempo de incubación de ocho dias. Sin embargo, u n a l t o porcentaje de el la quedaba retenida en el empaque, es decir , no es recuperable el 100% de las esporas que se producen, como se mues-- t ra en l a grdfica número 3. Se observa también que es al 7" día de in cubaci6n cuando un mayor porcentaje de las esporas producidas es tam= bien recuperable. Por éste motivo se tomó como bueno el tiempo de in- cubacidn de 7 días.
-
-
E l hecho de que u n alto porcentaje de esporas sea retenido en la co-- 1 umna empacada después de 1 a recuperación, puede no ser considerado -
, como una desventaja, sino al contrario. Si pensamos que l a columna -- puede convertirse en un reactor de producción de esporas en .regimen - semi-continuo, .$Sta retención de esporas en el empaque se convertir5a en una ventaja ya que solamGnte ser ia necesarioi:añadir mas medio de - cultivo al reactor para in ic iar un nuevo proceso de produccibn, usan- do como indculo las mismas esporas retenidas en el empaque.
Esta opcidn aún no ha sido próbada pero creemos que seria una buena - manera de incrementar l a productividad facilitando aún mas l a opera-- ci6n. -
- -. -
26 ,.- . , . "
I
CONCLUSIONES
Durante l a primera parte de este trabajo, donde se trataron de deter7 minar l a s condiciones Bptimas de esporulacidn de A . niger, se encon-i t r 6 que:
l .
- E l uso de reactivos grado técnico no' afecta considerablemente la es - porulacidn, excepto el 'caso del Cloruro de Calcio del cual se requie- re una concentracih mayor cuando se uti 1 izan reacti vos grado tQnico.
* ,
- Las condiciones de esteri l ización son de 15 minutos a 121°C en auto - clave para el medio de cultivo. i ;
I'
- La temperatura de incubación es de 35°C.
- El pH inicial es de 5 . 2 P
2 - El gasto de a i re óptimo e5 de 0.1380"l. de aire/cm hora.
De los t res modelos comparados, el esporulador tipo columna empacada, es el que cuenta
-
- Presenta mayor I
con mas ventajas , entre el las :
drea vol umétri ca .
- Es de f á c i l operación, mantenimiento y cosecha. "
- Es ester i l izable " in s i tu" , manteniendo las condiciones estériles a 1 0 largo de la esporulacih.
- -.
- Las esporas que se obtienen quedd libres de medio-,de cultivo. ..
- Las condiciones de operacidn son fdcilmente controladas durante l a - incubacidn. -
2J
.. . .I.. . . . . . . . - . . . "
I- Debido a su geometrfa, cuenta con mayores posib i l idades de ser
escalado exitosamente a n i v e l e s mayores de produccibn.
! i
I
I
28
RESUMEN
La produccidn masiva de esporas de hongos t i e n e cada d'ia mayor importancia debido a su , c r e c i e n t e u s o en r e a c c i o - nes c a t a l i z a d a s p o r e s t a s , y p o r l a s v e n t a j a s que presen t a sobre el micel io vegetativo. como in6culo en l a s f e r - i ,
mentaciones industr ia les .
-
Es p o r é s t e motivo que s e diseñaron, construyeron y ensa yaron dos r e a c t o r e s a escala pi lota , cuyas product ivida- des s e compararon con el f in de s e l , e c c i o n a r / e l m b s ade-- cuado. I
-
También se optimizaron: la coaposicidn de medio de c u i t j - v o y las condic iones de e s t e r i l i z a c i d n e incubacidn p o r - medio del diseño factorial de Box-Wilson.
I
. . , . . . .
B I B L I O G R A F I A
1 ' 109507
Aih, K. E., R. Hendry & B. J. B. Wood.! 1982. Solid substrate fermentations. Adv. w. Microbiol. 28 : -201-237. - ,
Alazard, D., Rainbault. 1981. Canparative study of - anylolytic enzymes productions by A.niger in li
Appl. Microbiol. Biotechnol. 12: 113-117. quid and solid-state cultivation. European J. - -
- - Bihari, ???
C. V., 1967. Traditional fermented fooc7s. bioeng. 9: 275-288. -
Kargi, F. & J. A. Curne. 1985. Solia' state f e r m e n t a - tion of sweet sorghun to ethanol i n a rotary - drun fermentor. Biotechnol, Bioeng. 27: 1112- 1125.,
- t f.
Lakshminatayana K., K. Chaudhay, S. Ethira & P. Tau- ro. 7975. A solid state fermentation method for citrlc acid production using sugarcance bagasse. Biotechnol. Bioeng. 17: 291-293. . -
Leukevicks, J. J. , A. F. -@site, U. E. V i e s t u r s ' & R. P. Tengerdy. 1984. Solid substrate fennentation of wheat straw to fungal protein. E%otechnol. - Biceng. 24: 1465-1474. -
-sane, B. K,, N. P.' ~lilayai, s. B u d i a m E, s. v. Rarrrakrishna. 1985. Ehgineerinq aspects of solid ~~
S- states fermentation. Eslzyme Microk. ~echn~l. 2; 258-265.
Martinelli, A. 8 C. V. Hesseltine. 1964. Tesrnpeh fer- mentation, package and try fermentations. Food, Technol. 18: 167-171. -
- W Y o u n g , M. A. R., mreira & R. P. Tengerdy. 1983:.
prhciples of solid substrate fermentation. I n the filamentos fungi. m g a l mology. Vol.: IV; ( m i t h S. E., Berry D.R. & Vris t iunsen B. E ditors) . Arnold, Iondon, p.p. 117-144.- -
-
. . .".
I
,i J
Narahara, H . , Y. -ama, T. Y d d a ; S. Pishankyura,
production in a solid state mlture of Aspergi- llus oryzae. J. Ferment. Tecfu#>l. - 60: 311-319.
R. Ueda & H. T W C h i . 1982. (;nowth and -
Raimbault, M. 1981. F v t a t i o n en mileu solid: croi ssance de champigrxms filamentem s u substrat aylace. ‘Ihese the -rat d”Etat; universite P. - i Sabatier+bülouse. Dcxrunent ORSlKM No 127 .
-
RahhUlt, M. & D. Ala~ard. 1980. Culture method ~ - study fungal grawth in solid fermentation. mpe -
J. Microbiol. - 9 :: 199-209 . Raimbault, M. & S. I~USSOS. 1985. procede de produc-- -!
tion-de spores de champignons fyhnenteux. Brevet \, ; francaise No 85.08555.
F&~.I!~sos, S., L. Hannibal. 1984. V&orisation Biotechno logique de la bagasse. Rapprt C.O.R.D.E.T.
-
Senez, J-C, M. Rajmbault, F. Deschanps. 1980. protein enrichmnt of starchy substrates/ for animal feeds by solid state-femmtktion. World Animal Review. - 35: 36-40.
Silman, R V. 1980. mime formtion-during solid. subs trate fermentation in rotating vessels. Biotech-= bol. Bioeng. - 22: 411-420.
Treybal, R. E. 1968. Mass Tka&fer operations, 2nd m- tion. McGraw Hill, ‘Ikkyo, Jap.