Clase 3 Fermentaciones [Autoguardado]

MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL

Claudia Cristina Ortiz López [email protected]

TEMA 3: BIOPROCESOS

mailto:[email protected]

Principales etapas de un proceso biotecnológico industrial:

Selección/ optimización del agente biológico

Propagaciónde loscultivos

Fermentación: producción del compuesto de interés

EsterilizaciónPreparaciónde medios

Separación o recuperación

Purificación

Terminado

Tratamientode efluentes

3

Selección/ optimización del agente biológicoFactores a tener en cuenta:Capacidad productora tan alta como sea posibleCapacidad de utilizar materias primas de bajo

costo (de producción local)Estabilidad del agente biológico: para obtener

procesos reproduciblesQue no sea patógeno

Estos factores pueden incorporarse a un agente biológico mediante el uso de ingeniería genética

4

Producción del compuesto de interés

Se lleva a cabo en bioreactores o fermentadores

Son recipientes que proveen las condiciones ambientales propicias (Temp., pH, aireación, etc. ) para que los agentes biológicos puedan crecer y producir las máximas cantidades del compuesto deseado.

5

A- Inyección de aire

B- Difusor

C- Eje transmisor

D- Motor

E- Agitadores

F- Controladores

G- Salida gases

H- Entrada

I- Deflectores

J- Rompe-espuma

K- Camisa

L- Salida

Fermentador tipo tanque agitado

1)Propagación de cultivos: comienza en un tubo de ensayo o un tubo congelado o liofilizado donde se conserva la cepa de interés, o de una colonia del microorganismo previamente seleccionado. Se propaga en el laboratorio progresivamente aumentando el volumen del medio de cultivo.

2)Fermentación: Se prepara el medio de nutrientes y se esteriliza.

Se siembra un tanque de inóculos cuyo volumen depende de la escala industrial.

Vinóculos ~50-1000 L y Vfermentador industrial ~10-1000 m3

3. Separación y purificación:

operaciones mecánicas de ruptura de células.

separación de insolubles por filtración, centrifugación o sedimentación.

separaciones primarias por extracción, absorción, adsorción, ultrafiltración.

purificación por extracción líquido-líquido, extracción en dos fases acuosas o cromatografía de afinidad.

aislamiento y acondicionamiento del producto.

4) Tratamiento de efluentes: no tiene relación directa con el producto pero es una etapa imprescindible por los volúmenes involucrados y para preservar el medio.

1. Preparación y propagación de inóculos

I. Preservación del inóculo

II. Multiplicación del inóculo

III. Cultivo de prefermentación

IV. Fermentación de producción

El tamaño del inóculo generalmente es del orden del 1-10% del volumen total del medio

Preservación del inóculo

El objetivo de la preservación es mantener las cepas durante tanto tiempo como sea posible sin división celular. Se verifica pureza y capacidad de formar producto.

Multiplicación del inóculo

El cultivo preservado se reactiva inicialmente mediante crecimiento en un cultivo líquido en agitación o en medio sólido si se requiere la formación de esporas.

Cultivo de pre-fermentación

En general se requieren las siguientes concentraciones de inóculo:

Actinomicetos...............5 - 10 %

Otras Bacterias.............0,1 - 3,0 %

Hongos..........................5 - 10 %

Preparación y propagación de inóculosIV. Fermentación de producción

preservación reactivaciónMedio líquido

enriquecidoMedio

de experimentación

CINÉTICA DE PROCESOS BIOQUÍMICOS

PROCESOMATERIA PRIMA

PRODUCTO

Acondicionamiento Transformación Recuperación

Celulares

(microorganismos, células vegetales y animales)

Bioquímicas

(enzimas)

Libres Inmovilizadas Libres Inmovilizadas

Los bioprocesos tienen una función PRODUCTIVA que cumple un rol y tiene asociado el factor COSTO que debe ser el menor posible


VELOCIDAD DE CAMBIO: CINÉTICA DE CAMBIO, que obedece al mecanismo propio del sistema.

Es propia del sistema y depende de muchos factores que se deben conocer para tener control del proceso.

El seguimiento del crecimiento del microorganismo o de la producción de sus metabolitos en términos cinéticos, se puede expresar mediante

La cinética permite modelar el fenómeno en términos de la velocidad e identificar los

parámetros y cómo son afectados

MODELOS MATEMÁTICOS


Aspectos cinéticos

Balances de masa

Diseño

(dimensionamiento de equipos)

Rendimiento

CINÉTICA DE CRECIMIENTO MICROBIANO

Depende de:

•Microorganismo

•Características genéticas

•Condiciones ambientales

Crecimiento: aumento ordenado de todos los componentes químicos de un sistema biológico


BACTERIAS: FISIÓN BINARIA LEVADURA: GEMACIÓN

HONGO (MOHO)

Crecimiento apical

Determinación de la concentración másica de células:

Métodos directos (en ausencia de otros sólidos en suspensión)

Métodos indirectos: se basan en un efecto que inducen, como puede ser la velocidad de consumo de un sustrato o de formación de un producto.

Manejo cuantitativo de los microorganismos

Peso seco Biomasa •Mediciones directas Turbidimetría Recuento en celda Número Recuento en placa (viables)

Consumo de nutriente

•Mediciones indirectas Acumulación de producto

Compuesto celular

Métodos para la cuantificación del crecimiento de poblaciones microbianas

Método Fundamento Observaciones

Recuento de celda Conteo directo de células Requiere células individuales y medio limpioRecuento de placa Conteo de número de

coloniasSupone células individuales. Viables

Nefelometría Dispersión de luz Requiere cultivo homogéneo y traslúcidoNMP Estadístico Requiere células individuales y medio limpioPeso seco Medición directa No admite componentes insolubles en el

medio, dispendiosoTurbidimetría Transmisión de luz Requiere células individuales y medio limpio

Volumen empacado

Centrifugación del cultivo No admite presencia de sólidos

Físicos y químicos Variado, indirecto Cambios de viscosidad, pH, análisis de un componente celular

Balance de masa Conservación de masa Requiere varios análisisInstrumentales Variado Requiere variados análisis. Utilizados solos o

en conjunto con balance de masa en desarrollo


Cinética de crecimiento de un cultivo por lote “batch”Etapas:

1) latencia oinducción

2) crecimientoexponencial

3) dedesaceleración

4) estacionario

5) muerte odeclinaciónCelular

6) Crecimiento críptico

1

2

3 4 5 6

tiempo

CINÉTICA DE CRECIMIENTO MICROBIANOFase Lag, de latencia o de inducción.Es la expresión de un período de adaptación para iniciar el crecimiento.

Su presencia y su extensión depende de: Estado fisiológico Fase de crecimiento Tamaño Tipo de microorganismos Inóculo Composición del medio en el que se inocula Condiciones fisicoquímicas del medio

Fase Lag aparente: con inóculos pequeños

CINÉTICA DE CRECIMIENTO MICROBIANOFase Lag, de latencia o de inducción

Cinética

(dX/dt) = 0

X = Concentración de células

X = X0

t = Tiempo

X0 = Biomasa inicial

Incidencia Industrial

Costo del tiempo de fermentación

Tamaño del fermentador

Riesgo de contaminación

CINÉTICA DE CRECIMIENTO MICROBIANOFase de crecimiento exponencial (aceleración)

Células en plena reproducción a una velocidad que es la máxima

(dX/dt) = µX MODELO DE CRECIMIENTO CELULARLa µ es constante durante la fase de crecimiento exponencial y corresponde con la pendiente en un gráfico semilogarítmico (figura)

µ= 1 dx = d ln x x dt dt

µ= velocidad Específica de crecimiento

X= concentración de biomasa

t: tiempo

Integrando:

ln x = µ t xo

X= Xo e (µt)

X= Xo e (µt)

Relación con el tiempo de duplicación:

To = 0 T=Td

X = Xo X= 2Xo

Ln ( 2Xo / Xo ) = µ . Td

Despejando Td:

O O O O O O O OOOO OOOO…

32 64 128 256 512 1024

ln 2XoXo

µ

ln2

µTd ==

To= 0

T=td

X= Xo

X= 2Xo

Td= 0.693µ

CINÉTICA DE CRECIMIENTO MICROBIANO*El tiempo de duplicación es el período que requieren las células de una población microbiana para crecer, dividirse y dar lugar a dos nuevas células por cada una de las que existían anteriormente.

Td aproximados (h):

Bacterias: 0.3 – 2.5Levaduras: 1 - 4Hongos: 1.5 - 7Protozoos: 6 h.Microalgas: 18-35Cél. Mamíferas: 20-40


Fase exponencial

El cultivo está en estado autocatalítico Es un período relativamente corto Se cumple que:

X = X0 * 2n

Cinética de crecimientoSe caracteriza por ser una fase de crecimiento constante

(dX/dt) = µX

X = Biomasa microbiana µ = Constante especifica del crecimiento microbiano en hr-

1.t = Tiempo en hrs

Cinética de crecimiento

Crecimiento diáuxico


Fase Estacionaria (de declinación o retardo)

Representa el fin del período exponencial. Se detiene el crecimiento

La concentración celular no cambia

Esta dado por: Agotamiento de un sustrato Acumulación de un inhibidor Otras causas ajenas al crecimiento


Fase de crecimiento críptico

En algunos cultivos es posible apreciar una zona de crecimiento lento después de la fase de muerte. El contenido citoplasmático liberado por las células lisadas proporciona los nutrientes requeridos para el crecimiento

CINÉTICA DE CRECIMIENTO MICROBIANO*Constante específica de la velocidad de crecimiento microbiano.

La constante específica de la velocidad de crecimiento microbiano (µ) se utiliza para caracterizar el comportamiento de una población microbiana.

Su valor depende de las condiciones ambientales en que se encuentra el microorganismo.

Existe una gran dependencia de la fuente de carbono y energía tanto en calidad como en cantidad.

Velocidad específica de crecimiento, h-1

dX

dtµX=

Cinética de primer orden


Crecimiento de tipo exponencial que se puede modelar

µmax

lnX

t

µ =1 dX

=X dt

dlnX

dt

Velocidades de crecimiento de algunos microorganismos bajo condiciones óptimas

Efecto de la fuente de carbono sobre el crecimiento

Diseño de medio de cultivo

Inóculo

Nutrientes: H20, C, N, sales inorgánicas, vitaminas, otros

O2

Productos gaseososDe salida:CO2, CH4, etc.

Otros productos: Biomasa, otros

Estequiometría del crecimiento celular y producción

Fuente C + Fuente de N + Fuente de O2 + sales minerales + nutrientes específicos

Masa celular + producto + CO2 + H2O

OBJETIVO: Desarrollo de una fermentación con mínimo costo por unidad de producto

Concepto de fermentaciónProceso de fermentación:

MICROORGANISMOSBacterias, levaduras , hongos

MEDIO DE CULTIVO

CONDICIONES AMBIENTALES

MICROORGANISMO

CO2

PRODUCTOIntra o extra celular

Crecimiento microbiano: Crecimiento microbiano: DescripciDescripcióón qun quíímicamica

ACaHbOc + BO2 + DNH3 MCaHbOc Nd+ PCO2 + QH2O C

donde: A, B, D, P y Q son moles.CaHbOc fuente carbono-energía.M son moles de una unidad celular, CaHbOc Nd

Aproximadamente el 92 % en promedio de biomasa corresponde a los elementos mayores

Datos de composiciDatos de composicióón n celularcelular

BacteriasC0.53 ; N0.12 ; O0.19 ; H0.07

LevadurasC0.47 ; N0.075 ; O0.31 ; H0.065

Requerimientos nutricionalesFUENTE DE ENERGÍA: -C: AUTOTROFO, HETEROTROFOS-FOTOTROFICO-QUIMIOTROFICO

FUENTE DE ELEMENTOS MAYORES: C, H, O, NFUENTE DE ELEMENTOS MENORES: P, K, S, Mg, Ca,

NaFUENTE DE ELEMENTOS TRAZA: Mn, Fe, Co, Cu, Zn, B, Al, Si, Cl, V, Cr, Ni, As, Se, Mo, Sn, Nutrientes esenciales: factores de crecimiento

Clasificación Fuente de carbono Fuente de energía

Autótrofos CO2 -------

Heterótrofos Compuestos orgánicos

--------

Quimiótrofos --------- Compuestos químicos

Quimiolitótrofos _______ Compuestos químicos inorgánicos

Quimiorganótrofos _______ Compuestos químicos orgánicos

Quimioautótrofos CO2 Compuestos químicos

Fotótrofos _______ Luz

Fotoautótrofos CO2 Luz

Fotoheterótrofos Compuestos orgánicos

Luz

Quimioheterótrofos Compuestos orgánicos

Compuestos químicos

Tipos de medio de cultivoMEDIOS COMPLEJOS: Para un determinado

elemento está presente más de una fuente. Composición variable. Ej.

Extracto de levadura, extracto de carne, melaza, subproductos o desechos.

MEDIOS DEFINIDOS: Una fuente definida para cada elemento. Compuestos puros, Composición conocida y reproducible, una fuente por cada elemento.

MEDIO MÍNIMO: fuente de C y E + sales inorgánicas

MEDIO MÍNIMO ENRIQUECIDO: con algún factor de crecimiento (esencial o inductor).

Tipos de medio de cultivoMEDIOS COMPLEJOS INDUSTRIALES

Componente OrigenMelaza Industria azucareraLicor de maceración de maíz

Subproducto del procesamiento de maíz

Licor de sulfito Desecho de la industria de pulpa y papelPermeado de suero

Subproducto del procesamiento del suero de leche

Vinazas Subproducto de la producción de etanol por fermentación

Harinas de soya y pescado

Industrialización de soya y pescado

Hidrolizado y extracto de levadura

Industria productora de levadura forrajera y de panificación

Criterios utilizados en la formulación del medio(I)CARACTERÍSTICAS DE LOS MEDIOS DE CULTIVO:

Contener los elementos para la síntesis celular y para la formación de producto

Medio ambiente favorable para el crecimiento y/o formación del producto.

Económicamente rentable.Máxima producción.Adaptación constante al proceso de fermentación.

Criterios utilizados en la formulación del medio.(II)

Recuperación del producto.Eliminación de la represión catabólica.Materiales de fácil disposición en cantidad

suficiente.Bajos costes de transporte.Impedir que las impurezas dificulten la

recuperación de producto.

Diseño del medio de cultivo

¿Cuánta biomasa vamos a generar?Composición celularFuente de cada elementoRendimientos

A. RANGO DE CONCENTRACIÓN DE BIOMASA

Matraces 0,5 - 2 g/lFermentador de laboratorio 1-10 g/lFermentador industrial 10-50 g/lAlta densidad 120-250 g/l

Compuesto Bacteria (% base seca)

Levaduras (% base seca)

Hongos (% base seca)

Promedio Promedio Promedio Carbono 48 46-52 48 46-52 48 45-55 Nitrógeno 12.5 10-14 7.5 6-8.5 6 4-7 Proteínas 55 50-60 40 35-45 32 25-40 Carbohidratos 9 6-15 38 30-45 49 40-55 Lípidos 7 5-10 8 5-10 8 5-10 Acidos nucleicos 23 15-25 8 5-10 5 2-8 Cenizas 6 4-10 6 4-10 6 4-10

g/100 g en peso seco Elemento Bacteria Hongos Levaduras Fósforo 2-3 0.4-4.5 0.8-2.6 Azufre 0.2-1.0 0.1-0.5 0.01-0.24 Potasio 1-4.5 0.2-2.5 1-4 Magnesio 0.1-0.5 0.1-0.3 0.1-0.5 Sodio 0.5-1 0.02-0.5 0.01-0.1 Calcio 0.01-1.1 0.1-1.4 0.1-0.3 Fierro 0.02-0.2 0.1-0.2 0.01-0.5 Cobre 0.01-0.02 --------- 0.002-0.01 Manganeso 0.001-0.01 --------- 0.0005-0.007 Molibdeno -------- --------- 0.0001-0.0002 Total Cenizas 7-12 2-8 5-10

SustratoSustratossS1S2

Sn

CélulasCélulas

X

ProductosProductos

P1

P2Pn

Producto:Producto:Compuesto químico diferente de material

celular que es liberado al medio.

Sustrato:Sustrato:Compuestos que son consumidos a partir del

medio como resultado de crecimiento celular o formación de producto.

Factores que limitan la formulaciFactores que limitan la formulacióón de n de medios de cultivo:medios de cultivo:

Algunos elementos del sustrato liberados como productos no asimilados a material celular.

Velocidades limitantes y estequiometría, deben considerarse los rendimientos.

Nutrientes específicos que pudieran ser limitantes, o productos específicos que pueden ser inhibitorios.

Factores ambientales.Factores de crecimiento.

c. Fuente de cada elementoMEDIOS INDUSTRIALES

-Fuentes de C y EAlmidón de maíz, glucosa de maíz, melaza, aceites vegetales,

suero

-Fuentes de NLicor de maceración de maíz, harina de soya, amonio (gas), Urea,

extracto de levadura.

-SuplementosSales minerales, vitaminas, aminoácidos

MEDIOS DEFINIDOS

Fuente de Nitrógeno: (NH4)2SO4Fuente de K y P: K2PO3SulfatosCloruros

En un medio definido podemos elegir el sustrato LIMITANTETodos los demás elementos (nutrientes) irán en exceso entre el

30 y el 50 %

Zabriskie, D. W., Armiger, W. B., Philips, D. H. & Albano, P. A. (1980) Traders' Guide to Fermentation Media Formulation.

D. Rendimiento biomasa D. Rendimiento biomasa sustrato (Ysustrato (YX/SX/S))

YX/S Xs

Biomasa producida (Xf – X0)

Sustrato consumido (S0 – Sf)=

Se puede calcular:

• Experimentalmente•Teóricamente

YX/S Xf-Xo

==

=So-SfSo X - Xo

YX/S

Estimación teórica del Yx/s

Y x/S

Ei

% Ei en la célula

% Ei en el nutriente

Ei


% Ei en la célula= =

Y x/S =% Ei en el nutriente

% Ei en la célula* F

F= 0.6 crecimiento aeróbico

F= 0.1 crecimiento anaeróbico

Para otros elementos

F= 1

Para el caso de la fuente de C y E,Una parte del C es excretado como CO2

Elemento Ei Ei %Ei en célula

Nutriente % Ei en el nutriente

C 12 48 glucosa 40N 14 7.5 (NH4)2SO4 21.2P 31 1.7 kH2PO4 22.8K 39 2.5 K2HPO4 28.7

Mg 24 0.3 MgSO4.7H2O

9.7

S 32 0.13 (NH4)2SO4 24.2Fe 56 0.26 FeSO4.7H2

O20

Ca 40 0.20 CaCl2 36.2Na 23 0.06 NaCl 39.3Zn 65 0.02 ZnSO4.7H2

O22.8

Mn 55 0.004 MnCl2.6H2O

27.7

Mo 99 0.0002 MoO3 66.6Co 59 0.003 CoCl2.6H2O 24.8

otros <0.01

Nutriente Y X/S Concentración g/l

glucosa 0.5 18(NH4)2SO4 2.8 2.14 fuente limitante

kH2PO4 (P) 13.4 0.67

MgSO4.7H2O 32 0.28FeSO4.7H2O 77 0.12

CaCl2 181 0.05NaCl 655 0.014ZnSO4.7H2O 1140 0.008MnCl2.6H2O 6925 0.0013CoCl2.6H2O 8267 0.0011MoO3 333000 0.00003

Ejemplo medio para X= 6 g/l de biomasa

Ejemplo:

Calcular la concentración de glucosa que requiere para producir una biomasa final de 6 g/l, en aerobiosis

Peso Glucosa: 180 g% Ei en el nutriente: 40%Y x/S =


% Ei en la célula* F

Y x/S = 40 * 0.6 0.5

48=

=So X - Xo

YX/S

=So 6 g/l - 0

0.5=* 1.5 18 g/l

Productividad volumétrica y Productividad específicaDesde el punto de vista de un proceso

industrial, el solo rendimiento no constituye elemento de juicio suficiente para evaluar el comportamiento de una fermentación.

Es necesario considerar el factor cinético

Productividad volumétrica =Masa de producto

Tiempo X Volumen

Productividad específica =Masa de producto

Tiempo X masa de células

Cinética de crecimiento de la S. cereviceae y del consumo de sustrato (glucosa) en medio definido

Responder:

1.En general, qué se genera durante la fermentación?2.Cuáles son los aspectos importantes para la selección del medio de fermentación?3.Qué es el sustrato limitante?4.Por qué el rendimiento de Carbono en biomasa es menor para la levadura en anaerobiosis que en aerobiosis (0.12 y 0.56 g/g, respectivamente)?5.Por qué la melaza puede resultar un medio adecuado para fermentación. En qué caso se ha utilizado a nivel industrial?6.En qué consiste la reacción de Maillard y cómo afecta el medio de cultivo para la fermentación?

Clase 3 Fermentaciones [Autoguardado]

Documents

Transcript of Clase 3 Fermentaciones [Autoguardado]