Post on 23-Jan-2016
Los Vectores de Clonaje
Realizado por Dr. A. Martínez-Conde & Dra P. Mayor Dep. Bioquímica y Biología Molecular Fac. Medicina Universidad Complutense de Madrid
Mapa de Restricción de pUC18 y pUC19 ( se diferencian la secuencia de MCS )
Los pUC son vectores típicos de Clonaje. Vemos que su tamaño es de 2686 bp
Ori C
AmpicilinResistencia
MCSMulti Cloning Site
Realizado por Dr. A. Martínez-Conde & Dra P. Mayor Dep. Bioquímica y Biología Molecular Fac. Medicina Universidad Complutense de Madrid
GCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGAGGATCCCCGGGTACCGAGCTCGAATTC
5´ 396 3´ 455
Hind III Sph I Pst I Sal I Xba I BamH I Sma I Kpn I Sac I EcoR I
pUC18 MCS
Realizado por Dr. A. Martínez-Conde & Dra P. Mayor Dep. Bioquímica y Biología Molecular Fac. Medicina Universidad Complutense de Madrid
Supongamos que preparamos el vector para insertar un fragmento de DNA que tiene extremos Hind III y BamH I
GCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGAGGATCCCCGGGTACCGAGCTCGAATTC
CGGTTCGAACGTACGGACGTCCAGCTGAGATCTCCTAGGGGCCCATGGCTCGAGCTTAAG
GCCA AGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGAGGATCCCCGGGTACCGAGCTCGAATTC
CGGTTCGA ACGTACGGACGTCCAGCTGAGATCTCCTAGGGGCCCATGGCTCGAGCTTAAG
GCCA GATCCCCGGGTACCGAGCTCGAATTC
CGGTTCGA GGGCCCATGGCTCGAGCTTAAG
AGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGAG
ACGTACGGACGTCCAGCTGAGATCTCCTAG
Realizado por Dr. A. Martínez-Conde & Dra P. Mayor Dep. Bioquímica y Biología Molecular Fac. Medicina Universidad Complutense de Madrid
Hind III BamH I
MCSMulti Cloning Site
CCGGG
GGCCCCTAG
AGCTTG
AC
Hind III BamH I
Realizado por Dr. A. Martínez-Conde & Dra P. Mayor Dep. Bioquímica y Biología Molecular Fac. Medicina Universidad Complutense de Madrid
Estamos linearizando el vector
CCGGG
GGCCCCTAG
AGCTTG
AC
Hind III BamH I
VECTOR LINEARIZADO
AGCTTG
AC
CCGGG
GGCCCCTAG
INSERTO DIGERIDO CON Hind III y BamH I
Hind III BamH I
Realizado por Dr. A. Martínez-Conde & Dra P. Mayor Dep. Bioquímica y Biología Molecular Fac. Medicina Universidad Complutense de Madrid
Ahora podemos unir Vector e inserto si ambos fueron digeridos con los mismos enzimas
CCGGG
GGCCCCTAG
AGCTTG
AC
VECTOR LINEARIZADO +AGCTTG
AC
CCGGG
GGCCCCTAG
INSERTO
LIGACIÓN
Ori C
INSERTO
AmpicilinResistencia
Realizado por Dr. A. Martínez-Conde & Dra P. Mayor Dep. Bioquímica y Biología Molecular Fac. Medicina Universidad Complutense de Madrid
Las Bacterias se transforman con el vector conteniendo el inserto
bacteria
Vector con inserto
Realizado por Dr. A. Martínez-Conde & Dra P. Mayor Dep. Bioquímica y Biología Molecular Fac. Medicina Universidad Complutense de Madrid
ampicilina
Al añadir el antibiótico solo resistirán y crecerán las bacterias antibiótico-resistentes, que tienen el vector con el gen de resistencia. A esto se le denomina selección.
Realizado por Dr. A. Martínez-Conde & Dra P. Mayor Dep. Bioquímica y Biología Molecular Fac. Medicina Universidad Complutense de Madrid
Una vez crecidas las bacterias, se lisan y se recoge el vector.
Realizado por Dr. A. Martínez-Conde & Dra P. Mayor Dep. Bioquímica y Biología Molecular Fac. Medicina Universidad Complutense de Madrid
Realizado por Dr. A. Martínez-Conde & Dra P. Mayor Dep. Bioquímica y Biología Molecular Fac. Medicina Universidad Complutense de Madrid
Ahora tenemos “amplificado” el vector con el inserto. Tenemos un gran número de copias del inserto.
Al digerir con los enzimas de restricción adecuados ( Hind III y BamH I ) el vector, se libera un gran número de copias del inserto clonado.
HindIII BamH I
AGCTTG AC
CCGGGGGCCCCTAG
Realizado por Dr. A. Martínez-Conde & Dra P. Mayor Dep. Bioquímica y Biología Molecular Fac. Medicina Universidad Complutense de Madrid
Características de un vector de Clonaje
Realizado por Dr. A. Martínez-Conde & Dra P. Mayor Dep. Bioquímica y Biología Molecular Fac. Medicina Universidad Complutense de Madrid