La reacción de PCR y sus aplicaciones

Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

nº ciclos

DN

A p

rod

ucto

pri

mers

PCR: cinética

RT

92ºC

55ºC

72ºC 92ºC 92ºC

55ºC 55ºC

72ºC 72ºC

Desnaturalización:

Lo mas corto posible

Evita inactivación

enzima

Anillamiento:Lo mas cerca

posible de las Tm de los primers

Extensión:Lo mas extenso

posible para asegurar

fragmentos completos

PCR: diseñando ciclos

nº ciclos

DN

A p

rod

ucto

pri

mers

En

zym

e a

cti

vit

y

PCR: cinética

DNA polimerasas termoestables

• Procesividad: 5’-3’ actividad de síntesis• Fidelidad: 3’-5’ exonucleasa• Adición de As

5’ 3’3’ 5’

5’ 3’3’ 5’

Tiempo de extensión:Taq polimerasa: 2 Kb/minPfu polimerasa: 0.5 Kb/ minPwo polimerasa: 1 Kb/min

Procesividad

5’ 3’3’ 5’

5’ 3’3’ 5’

5’ 3’3’ 5’

Polimerasa 3’-5’ exo Tasa de error % productos con mutación

Taq polimerasa NO 8.0x10-6 16.0

Pfu polimerasa SI 1.3x10-6 2.6

Pwo polimerasa SI 0.4x10-6 0.7

Fidelidad en la PCR

-A3’

5’3’A- 5’

Adición de As:Taq polimerasa: SIPfu polimerasa: NOPwo polimerasa: NO

-A3’

-T3’ 3’T- -T A

AT

Adición de As

Optimización de PCR• Parametros del ciclo

– Minimo numero de ciclos– Las tres reglas

• Diseño de oligos– Tm’s 55-80ºC– No concentrar GC en el extremo 3’

• Concentración de Mg2+ (0.5-3 mM)– Demasiado da inespecificidad– Poco da poca producción

• Coadyuvantes– BSA: estabiliza la polimerasa y secuestra inhibidores no

especificos– Formamida: Baja la temperatura de desnaturalización (moldes

ricos en GC)– DMSO: Ayuda la elongación en moldes ricos en GC

• Mezcla de polimerasas• Hot start

• Obtener genes– PCR degenerada– PCR reversa

• Modificar genes– Introducir sitios de restricción– Mutagénesis dirigida– Mutagénesis al azar

Algunas aplicaciones

ADRGT YKILP

5’ACNGCYTGNTGRCGN3’ 5’NTTNCAYGARTCYTT3’

PCR degenerada

• PCR en condiciones poco estrictas– Temperatura– Mg++

– Concentracion de oligos• Diseño de los primers:

– Tamaño minimo (21 mer)– Evitar aminoacidos con mas de un tipo

de codon– No mas de tres G o C seguidas en los

ultimos tres nucleotidos• PCR con primers en solitario

PCR reversa

Touch-down PCR

Nested touch-down PCR

PCR reversa

X bp Y bp

X bp Y bp

Fragmento A: Z pb

Fragmento B: Z -(X+Y)pb

Nested PCR

Touch-down PCR

94ºC

60-65ºC

RE1

RE2

RE1RE2 RE1 RE2

RE1 RE2

Introduciendo sitios de restricción

RE1 RE2

RE1 RE2

RE1 RE2

RE1 RE2

RE1 RE2

RE1 RE2

RE1 RE2

RE1 RE2RE1 RE2

RE1 RE2

RE1 RE2

• PCR en condiciones de baja fidelidad

– Desbalance de nucleotidos– Mn ++ en vez de Mg++

– Polimerasas mutantes

Mutagénesis al azar localizada

RE1

RE2MUT1

MUT2

RE1 RE2

RE1+MUT1 RE2+MUT2

RE2RE1

Mutagénesis sitio-específica