Post on 21-Nov-2014
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Inmunología…cap6 pate2PabLo Hernández Castillo
Grupo 3-2
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Radioinmunoensayo
1977 Premio Nobel2
Isotopo emisor de partículas gamma y beta4
1960 S.A. Berson y Rosalyn Yalow31
Unión Competitiva 33
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La primera etapa para llevar a cabo un RIA es: Determinar la cantidad de antígeno
necesaria para unir de un 50 a 70 % la cantidad fija de un Ag*.
Para determinar la cantidad de Ag marcado unida, el complejo Ag-Ab se precipita para separarlo del Ag libre…se mide la radiactividad y puede generarse una curva estándar.
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Antisuero Antiisotipo secundario
Proteína A Staphylococus Areus
RIA de fase solida
Ab a cuentas de Sepharose
Inmovilización de Ab (fosos)
MétodosPara
Separar Ag
MétodosPara
Separar Ag
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Ensayo de Inmunosorbente ligado a enzima
ELISA Indirecto
ELISA en Sándwich
ELISA Competitivo
ELISA (EIA)
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Quimioluminiscencia
Ab-HRP + Ag Ab-HRP-Ag Luz
MedicionELISA
SustratoLuxógeno
Limite deDetecciónaumenta
Luminol + H2O2
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Prueba ELISPOT
Modificación de la prueba ELISA,
Placas se recubren con Ag-captura AB-captura.
El revelado Ulterior del ensayo por la adición de un sustrato Cromógeno o Luxógeno
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Prueba ELISPOT
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WesternBlotting
Identificación de una proteína en Una mezcla compleja.
Ab-Radiomarcado/Rayos XAb-ligado a enzima
/sustratos
La mezcla se separa porMedios Electroforéticos
Gel de SDS-policrilamidaComplejos pueden
Visualizarse por variosMétodos.
Membrana nitrocelulosaBandas sumergidas en
Ab-mono, policlonales…
Western Blotting
También se utiliza para detectarAb…prueba de confirmaciónVIH
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InmunoprecipitaciónInmunoprecipitaciónPermite el aislamientoDel Ag para análisis
Mas amplios
Si la concentración deAg es baja
el ensamblajePuede requerir
horas o días
Extracto obtenido por rotura
De células o de un tejido Se mezcla con Ab para
Formar complejoAg-Ab
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Evitar limitaciones:Apoyo solido: cuenta sintética
Anticuerpo especifico secundario
Acoplamiento de cuentas magnéticas
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En conjunto con marcador biosintético con radioisótopo , permite detectar si una célula o tejido esta sintetizando un Ag particular.
Radiomarcado de proteínas…a. a radiomarcados
Complejo se limpia Contador de centelleo Análisis adicional con SDS, CALOR Confirmar identidad de Ag marcado…
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Inmunofluorescencia
En 1944 Albert CoonsLas moléculas absorben luz y emiten a dif. Long de onda
FluorocromoFluoresceina,rodamina y Ficoeritrina
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Citometría de flujo y fluorescencia
Las técnicas de Ab fluorescentes son instrumentos cualitativos extremadamente valiosos…
Citómetro de Flujo Automatizar el análisis y separación de células Rayo laser y detector de luz Forma sencilla y mas complicadas
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Uso Clínico
¿Cuántas células expresan el antígeno blanco como un numero absoluto y también como porcentaje de células que pasan por el haz?
Distribución de las células en la población de una muestra conforme a las densidades por la intensidad de la fluorescencia
Tamaño de las células
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Citometría puede analizar poblaciones celulares con dos o incluso tres anticuerpos fluorescentes
Ocupa una posición fundamental en la inmunología, biología celular, y un recurso clínico indispensable…
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Alternativas de las reacciones de antígeno-anticuerpo
Como defensa contra los anticuerpos de un hospedador las bacterias desarrollan la capacidad de elaborar proteínas que se unen a la región Fc de las moL. IgG:
• Proteína A, de Staphylococcus aureus• Proteína G estreptococos de los grupos C y G
La clonación de los genes para las proteínas G y C generación de un hibrido, proteína recombinante, prot. A/G
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La clara de huevo contiene una
proteína, avidina, la cual se une a
la biotina.Se piensa que la avidina
evoluciono como una defensa
contra los merodeadores en busca
de nido.Una proteína bacteriana,
estreptavidina de Streptomyces
avidinii, tiene especificidad
similar.
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Microscopia Inmunoelectrónica
Observar componentes tisulares intracelulares específicos.
Un marcador electrodenso se conjuga con la porción Fc de un Ab, para tinción directa o con un reactivo antiinmunoglobulina.
Marcadores como Ferritina y oro coloidal .
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BibliografíaInmunología de Kuby 6ta Edición