IMPACTO DEL ESTRÉS OXIDATIVO EN LA

DINÁMICA DE FRAGMENTACIÓN DEL

ADN ESPERMÁTICOBeatriz Rodríguez Alonso, Carmen López Fernández, Rocío Núñez Calonge, Pedro Caballero, Manuel Martínez Moya, Carolina Alonso, Beatriz Martín, Agustín García Peiró y Jaime Gosálvez.

Infertilidad: Factor masculino

• Estudio básico: Seminograma

• Un 15% de los casos de infertilidad presentan un seminograma normal.

• En estos casos se debe analizar la muestra en mayor profundidad: fragmentación del ADN espermático.

Introducción

Fragmentación del ADN espermático

• Roturas en el ADN (de cadena sencilla y de cadena doble)

• Causas de diferente etiología, siendo el estrés oxidativo una de ellas.

Introducción

Estrés oxidativo

• Radicales libres de oxígeno (ROS: Reactive Oxygen Species). Ceden su electrón desapareado oxidando lípidos de membrana, aminoácidos de proteínas y carbohidratos como los del ADN.

- Anión superóxido

• El estrés oxidativo tiene lugar cuando la producción de ROS sobrepasa la capacidad antioxidante.

Introducción

Estrés oxidativo en el semen

• Origen: Leucocitos y espermatozoides.

• Causan infertilidad principalmente por dos mecanismos:

- Dañando las membranas de los espermatozoides.

- Dañando al ADN del espermatozoide.

Leucocitos

Espermatozoides

Introducción

• Caracterizar el exceso de estrés oxidativo relacionado con la presencia del anión superóxido

• Incidencia en la fragmentación del ADN espermático durante un periodo de 24 horas.

Objetivo

• N= 78 muestras obtenidas en 3 clínicas diferentes. Al tratarse de un estudio prospectivo no se establecieron criterios de selección sobre el tipo de paciente.

• De cada muestra calculamos:- Nivel de estrés oxidativo (N1, N2, N3 o N4)- Índice de fragmentación en las horas t0, t2, t6 y

t24 (dinámica de fragmentación)- Velocidad de fragmentación

Material y métodos

Análisis de la fragmentación de ADN• Técnica SCD Test (Sperm Chromatin Dispersion test):

- Tratamiento ácido inicial que desnaturaliza el ADN.- Desproteinización controlada (retira la mayor parte de las proteínas nucleares)

Índice de fragmentación = % fragmentados + % degradados

Material y métodos

Dinámica de fragmentación• Simulación in Vitro de las condiciones naturales en las que tendría lugar

la fecundación (a 37ºC) para estudiar la variación del índice de fragmentación del ADN espermático a lo largo de 24 horas.

T2 (SCD)

T6 (SCD)

T24 (SCD)

Estufa 37º

T0 (SCD)

Material y métodos

Análisis del estrés oxidativo• Test del estrés oxidativo NBT-test:

El Nitro Blue Tetrazolio (NBT) reacciona con el anión superoxido formando diformazán.

Material y métodos

Tiempo (horas)

Med

ia I

F

El índice de fragmentación aumenta a lo largo de las 24 horas.

Resultados

Resultados

El nivel de estrés oxidativo del anión superóxido no se correlaciona con el índice de fragmentación basal.

Resultados

El nivel de estrés oxidativo del anión superóxido no se correlaciona con el índice de fragmentación basal.

El nivel de estrés oxidativo del anión superóxido no se correlaciona con el índice de fragmentación basal.

Resultados

El nivel de estrés oxidativo del anión superóxido se correlaciona con la velocidad de fragmentación. (Correlación de Pearson de 0,24; Sig. Bilateral = 0,035).

Vel

ocid

ad f

ragm

enta

ción

Estrés oxidativo

Resultados

1. No hemos encontrado una correlación significativa entre el nivel de estrés oxidativo del anión superóxido y el índice de fragmentación del ADN espermático basal.

2. El NBT-t clasifica a las muestras en grupos que varían su fragmentación a una velocidad mayor según aumenta el nivel de estrés oxidativo.

Conclusiones

brodrigueza@clinicatambre.com