HEMOGRAMA AUTOMATIZADO

Lic. TM Boris Valdivia Vizarraga

UNMSM

Hospital Nacional “ Guillermo Almenara Irigoyen “

ESSALUD

Introducción • El desarrollo de los Autoanalizadores hematológicos

comenzó en la década de los 50 con los hermanos Wallace y Joseph Coulter, quienes inventaron en 1956 el primer contador automático de células sanguíneas

• Hasta 1973 los hermanos coulter mantuvieron sus diseños en forma exclusiva, desarrollándolos y mejorándolos

• Posteriormente otros fabricantes introducen nuevos modelos basados en el mismo principio

• En 1980 se introduce el diferencial 3 Diff además del estudio de la serie roja con los cómputos de eritocitos, la determinación de la hemoglobina y el cálculo de los índices eritrocitarios

Hermanos Wallace y Joseph

Coulter

Parámetros del Hemograma Automatizado 5 Diff

Parametro Abreviarura Unidades

Recuento total de glóbulos blancos WBC x 103 / ul

Porcentaje de neutrófilos NEUT % %

Porcentaje de linfocitos LYNPH % %

Porcentaje de monocitos MONO % %

Porcentaje de eosinófilos EO % %

Porcentaje de basofilos BASO % %

Valor absoluto de neutrófilos NEUT # x 103 / ul

Valor absoluto de linfocitos LYNPH # x 103 / ul

Valor absoluto de monocitos MONO # x 103 / ul

Valor absoluto de eosinófilos EO # x 103 / ul

Parámetros del Hemograma Automatizado 5 Diff

Parametro Abreviarura Unidades

Valor absoluto de basófilos BASO # x 103 / ul

Recuento total de glóbulos rojos RBC x 106 / ul

Hemoglobina HGB G / dl

Hematocrito HCT %

Volumen Corpuscular Medio MCV fL

Hemoglobina Corpuscular Media HCM pg

Concentración de HGB Corpuscular Media MCHM g / dl

Ancho de Distribución Eritrocitaria RDW - SD fL

Ancho de Distribución Eritrocitaria – CV RDW – CV %

Parámetros del Hemograma Automatizado 5 Diff

Parametro Abreviarura Unidades

Recuento total de Plaquetas PLT x 106 / ul

Volumen Plaquetario Medio MPV fL

Ancho de Distribución Plaquetario PDW %

Principio de Medición

por el Método

de la

Impedancia Eléctrica

El número de pulsos

eléctricos indica la

cantidad de partículas

que pasan a través de la

apertura y el tamaño de

los pulsos es

proporcional al volumen

de las partículas

Un pequeño voltaje aparece

A travez de los electródos

Señal celular

Apertura

Cuando una célula suspendida en una solución electrolítica pasa a través

De la apertura, el cambio de la impedancia eléctrica es detectado como un

Pulso. El número total de pulsos corresponde al conteo total de células y

La altura de cada pulso es proporcional al correspondiente volumen celular

Apertura

Apertura

Célula 1

Célula 2

Cuando 2 o mas células son detectadas en

La apertura, la célula 1 y célula 2 son

Detectadas como un gran pulso, por lo tanto

Una de las células no es contada ( perdida

De coincidencia ). El grado de perdida de

Coincidencia depende de la concentración

Celular .

• Los sistemas

COULTER poseen 2

baños, uno de

eritrocitos y otro de

leucocitos, en el baño

de eritrocitos se

encuentra una

apertura de 50 µm y

en el de los leucocitos

otra de 100 µm.

Ley de Ohm : V=IR

El voltaje generado es directamente proporcional

al tamano de la particula. Por lo tanto para cada

celula se le puede determinar su recuento y

tamaño

Permite la medicion de

parametros objetivos en

estas dos poblaciones

MCV: Tamano eritrocitos

MCH y MCHC: Hb en GR

RDW: Anisocitosis

MPV: Volumen plaquetario

IMPEDANCIA

BUENO PARA PLAQUETAS Y ERITROCITOS

Eritrocitos Dimórficos

Falla renal crónica con

transfusión reciente

Microcitosis

Betatalasemia

VOLUMETRIA

No se puede obtener el recuento celular absoluto a

menos que se conozca el volumen preciso de sangre

total diluida que atraviesa la abertura durante el ciclo

de recuento

Método de Conteo Celular por

Dispersión de la Luz

• Medida a 0º

sirve para medir el tamaño

celular

• Medida a 10º

mide la complejidad celular

• Medida a 90º

mide la superficie celular y la

estructura interna

( granularidad )

• Medida a 90ºD

mide determinados tipos de

granularidad celular

FOCALIZACIÓN HIDRODINÁMICA

• A medida que las células

penetran en el área de

visualización específica,

se produce la interacción

con el rayo láser con

ángulos diferentes, que

suministran información

sobre el tamaño de la

célula, la estructura

interna, la granularidad y

la morfología de la

superficie.

• CITOMETRIA DE FLUJO

“ Una subdisciplina de

la citología analítica,

con orientación

metodológica, que mide

las células en

suspensión, dentro de

un vehículo líquido, a

su paso por una

estación de medida ”

NCCLS

RADIOFRECUENCIA ( Conductividad )

La conductividad de las

ondas de radio

A través de las células, nos

revelan su composición

interna

Una frecuencia alta, generada por

un oscilador de cristal,

sobreimpuesta a la corriente

directa, que incide sobre

las células para medir su

densidad.

TECNOLOGÍA

VCS

• IMPEDANCIA

• SCATTER LIGHT

• RADIOFRECUENCIA

Estudio de la Serie Roja

• Los años y evaluaciones han dado total aprobación a la impedancia eléctrica para el estudio de las serie roja, en la obtención del computo de eritrocitos

• Hematocrito electrónico

• Hemoglobina

• VCM, HCM, CHCM

• Nuevos índices como RDW

• Gráficos de distribución de la población eritroide, histogramas que se obtienen de los parámetros de volumen celular Vs distribución de frecuencia

Recuento de Glóbulos Rojos

Cuando una célula

pasa a través de una

apertura por la cual

fluye una corriente

eléctrica continua y

constante, en un

medio electrolítico que

puede ser isotónico o

no isotónico, generara

una variación en la

velocidad de flujo de

esta corriente eléctrica

( impedancia ) que será

directamente

proporcional al

volumen de la célula e

inversamente

proporcional al

diámetro de la

apertura.

• En el hemograma automatizado por la metodología usada el valor de Hto es menor al método del capilar. Disminuye 5% ( 1 – 2 unidades del Hto )

• La CHCM deja el significado del método manual debido a la menor variabilidad debido a que el Hto se obtiene electrónicamente

• Solo es significativa si presenta variaciones muy importantes ( < 29% ) o elevaciones extremas ( > de 37% ) como se observa en la esferocitosis

• Entonces en un caso de anemia la clasificación inicial se realiza con las cifras de HB, Hto, constantes corpusculares , RDW y el histograma

• Toda esta información muy valiosa para el clínico debe ser corroborada por el examen microscópico de la serie roja, atendiendo a las alarmas que estos equipos mostrarán en sus pantallas .

Para tener en cuenta :

• A pesar del avance tecnológico alcanzado, los autoanalizadores hematológicos presentan limitaciones :

1. No detectan poiquilocitosis

2. No detectan inclusiones eritrocitarias

3. Lo que nos presentan los fabricantes son distintos tipos de alarmas con diversa sensibilidad, que tienen que ver con el tamaño celular, línea celular, error intra-método y/o de proceso.

4. Finalmente, no se debe por ningún motivo, dejar de realizar el examen microscópico de las células

Estudio de la Serie Roja

• Por lo tanto, la observación microscópica nos permite confirmar lo señalado por los índices hemáticos, asi como, establecer la presencia de anormalidades

• Deben considerarse además una serie de interferencias que alteran el hemograma automatizado :

• 1. lipemia

• 2. ictericia severa

• 3. hemólisis

• 4. auto-aglutinación por anticuerpos fríos

• 5. plaquetas gigantes

• 6. leucemias

• 7. otras anormalidades

ANEMIA MCV RDW CV RDW SD

Deficiencia de B12/folato, hemólisis elevado elevado elevado

Causa inmune, aglutinación de GR

Por anticuerpos fríos, anemia aplásica

Insuficiencia severa de fierro bajo elevado elevado

Hemoglobinopatías heterocigóticas normal normal bajo

Hemoglobinopatías homocigótas normal elevado elevado

Mielofibrosis / anemia sideroblástica normal elevado elevado

Anemia hemolítica normal normal elevado

Anemia secundaria normal normal normal

Talasemia y Hemoglobina S combinada bajo elevado elevado

Talasemia bajo normal bajo

Talasemia

Estudio de las Plaquetas

• El computo se hace habitualmente por

impedancia

• La condición de una muestra en

circunstancias de tiempo, temperatura,

homogenización, relación sangre total /

anticoagulante, y la no formación de

hemólisis y espuma. Son indispensables

para un resultado confiable

Recuento de Plaquetas

En los instrumentos

tipo impedancia las

partículas analizadas

son suspendidas en

una solución

electrolítica y la

dilución es pasada a

través de una apertura

que liga dos cámaras,

una que tiene un

electrodo positivo y

otra un electrodo

negativo.

Al pasar por el orificio

las células causan un

incremento

momentáneo en la

resistencia eléctrica,

que es registrado

como un pulso.

La alarma LRI aparece acompañando a la cifra de plaquetas para indicar interferencias en la región baja ( LRI ); se debe a la acumulación de datos en la región de 2 – 3 fl. Se activa por una o varias de las siguientes causas : microplaquetas hemólisis fragmentos celulares residuos en el orificio del transductor crioglobulinas inclusiones intraeritrocitarias

Cell Dyn Series ( ABBOTT )

La alarma URI aparece acompañando a la cifra de plaquetas para indicar interferencias en la región alta ( URI ); se debe a la acumulación de plaquetas y eritrocitos entre los 20 y 40 fl. Esta alarma se activa por las siguientes causas :

Macroplaquetas Eritrocitos Microcíticos Agregados plaquetarios Eritrocitos Fragmentados Satelitósis Plaquetaria

Cell Dyn Series ( ABBOTT )

Histogramas de Plaquetopenias

•COULTER utiliza su tecnología patentada de SWEET FLOW

que consiste en hacer circular una corriente de diluyente en

la parte inmediatamente posterior de la apertura de

eritrocitos, a fin de que las plaquetas como son tan pequeñas

no permanezcan en el área de recuento y por lo tanto no se

cuenten más de una vez

• Ante un recuento plaquetario disminuido, se debe de hacer un examen microscópico de toda la lámina y/o recuento en cámara.

• Las plaquetas se comportan de manera particular, ya que cambian de forma desde el momento de su extracción, para luego estabilizarse, despues de varias horas pierde confiabilidad.

• Los cambios reales dependen de la alteración en la generación medular de plaquetas

• Presenta alteraciones en pacientes con plaquetas gigantes

• El PDW o ancho de distribución plaquetaria, corresponde a la amplitud de distribución o anisocitosis plaquetaria y se encuentra alterado en PTI, Mielodisplasia, Mieloproliferación

• Debe tenerse presente que algunas condiciones con producción defectuosa medular liberan plaquetas muy pequeñas y entonces el PDW, VPM y P-LCR presentan valores muy bajos

• En trombocitopenias es muy útil el histograma, ya que el equipo no realiza los cálculos

• Es definitivo que toda alteración plaquetaria debe realizarse al examen microscópico

• Alteraciones en el recuento automatizado :

• 1. pseudotrombicitopenia

• 2. microcitos

• 3. fragmetos eritrocitarios

• 4. inclusiones eritrocitarias

• 5. microcoagulos

• 6. heparina

Estudio de la Serie Blanca

• Es en el estudio diferencial de leucocitos donde se han desarrollado mas y nuevas tecnologías, con el fin de detectar con mayor precisión : tamaño, forma, morfología nuclear, granularidad y estructuras complejas.

• La cuenta total de leucocitos se da con la impedancia en la mayoría de aparatos

• Algunos aparatos usan la impedancia para medir el volumen nuclear y realizar un diferencial 3 Diff, que muestra linfocitos, granulocitos y células mixtas

• Estos diferenciales se acompañan de histogramas y deben ser tomados en cuenta, pero nunca ser los definitivos. Mas usados en pacientes saludables

Estudio de la Serie Blanca

• Los datos mas confiables para el leucograma

electrónico los ofrecen los diferenciales 5 Diff

• Estos ofrecen análisis por medi de :

• 1. rayo láser ( scatter light )

• 2. radiofrecuencia

• 3. impedancia

• 4. citoquímica

• 5. canales de lobularidad

• La utilización de citoquímica para detectar los granulocitos se encuentra en algunos instrumentos, con el uso de la peroxidasa, en conjunto con un canal de lobularidad, para basófilos

• Análoga a la especificidad de los antígenos, la composición y cantidad relativa de diferentes clases de lípidos en la membrana de los leucocitos, muestra patrones característicos, que son diferentes para cada tipo de célula

• Una reacción cito-química, basada en estas características de la membrana es la mejor forma de estos instrumentos para diferenciar granulocitos maduros de los inmaduros

• Causas de interferencia en serie blanca :

• 1. crioglobulinas

• 2. criofibrinógeno

• 3. proteínas monoclonales

• 4. eritroblastos

• 5. agregados plaquetarios

• 6. eritrocitos no lisados

• 7. microcoagulos

• 8. heparina circulante

Limitaciones del recuento manual de

leucocitos

• Rumke C.L. The statistical expected variability in differential

leucocyte counting en Kopke JA Differential Leucocyte Counting

CAP 1978

• Bacus JW. The observer error in peripheral blood leucocyte

classification Am J Clin Path 1973, 59, 223-230

• Talstad I, Problems in microscopic and automatic differentiation of

blood and cell suspensions Scand J Haematol, 1981, 26, 398-406

• Bentley S.A. Quality control and the differential leucocyte count. Clin

Lab Haemat, 1990, 12 Suppl 1, 101-109

• Kopke JA, Dotson MA, Shifman MA, A critical evaluation of the

manual/visual differential leucocyte counting method Blood Cells,

1985, 11, 173- 186

• Goossens W, Van Hove L, Verwilghen RL, Monocyte counting,

discrepancies in results obtained with differential automated

instruments , J Clin Pathol, 1991, 44, 224-227

HISTOGRAMAS

Histogramas

• De Glóbulos Rojos.

VCM

Histograma Normal

de Distribución de

Globulos rojos.

RDW

Histogramas

• De Glóbulos Rojos.

VCM

Desplazamiento a la Izquierda:

Microcitosis

Histogramas

• De Glóbulos Rojos.

VCM

Desplazamiento a la Derecha:

Macrocitosis

Histogramas

• De Glóbulos Rojos.

RDW

RDW Mayor de 15%:

Anisocitosis

Histogramas

• De Plaquetas.

Zona de Macroplaquetas,

Agregados plaquetarios, microcitos

Todo conteo celular comparte tres pasos básicos :

1. Dilución de la sangre

2. Toma de muestra de una cantidad medida

3. Enumeración de partículas

Ventajas de los métodos electrónicos :

1. Velocidad

2. Precisión

3. Cálculo automatizado del Hematocrito y constantes

4. Impresión de resultados

•

• El MCV es calculado sobre las bases de la sumatoria de la altura de los pulsos de las células rojas y dividido por el conteo de G.R.

• El volumen del paquete celular es calculado del MCV multiplicado por el conteo de células rojas

• El MCH es calculado del valor de la Hemoglobina y el conteo de G.R.

• El MCHC es calculado del valor de Hemoglobina y el Hematocrito

1. La turbidez producida por conteos elevados de células blancas, pueden alterar el valor de la Hemoglobina, MVC, y Hematocrito.

2. En LLC y otras leucemias las células son fácilmente dañadas por la apertura, pudiendo aparecer falsos conteos bajos de leucocitos ( WIC / WOC )

3. Títulos altos de aglutininas frías, que agregan los GR a temperaturaambiente, son responsables de macrocitosis y valores altos de MCHM

Hematocrito :

Se mide en % y representa la proporción total de GR en la sangre.

• No se mide directamente con los citómetros de flujo y se calcula a partir del VCM y en número de GR. Tiene menor presición

• El hematocrito es medido electrónicamente :

“ el pulso que es generado cuando los GR pasan a través de la abertura es proporcional a su volumen “. Se determina comparando el volumen total o acumulado de GR al volumen total de sangre en los 11.7ul de la dilución 1:500

El conteo diferencial manual está

sujeto a varios errores

• Errores en la preparación del frotis

• Errores en la tinción del frotis

• Distribución celular

• Interpretación celular

• Número de células contadas

Un buen diferencial automatizado debe ser capaz de :

1. Identificar células normales y anormales

2. Resultados reproducibles en conteos repetitivos

3. El conteo debe exceder largamente ( 8,000 – 32,000 cel. )

al tradicional conteo manual ( 100 – 200 células )

1. El conteo debe llevarse a cabo en un mínimo lapso

de tiempo

1. Se debe tener capacidad de almacenamiento de datos

ALARMA LRI EN EL HISTOGRAMA DE PLAQUETAS

Interferencias en la región baja “low region

interference”(LRI)

PLT: 94K ul LRI

• Esta alarma se activa por una o varias causas

– Microplaquetas

– Fragmentos celulares

– Crioglobulinas

– Inclusiones eritrocitarias

– Hemólisis

– Residuos en el orificio del transductor

ALARMA URI EN EL HISTOGRAMA DE PLAQUETAS

PLT: 296 K/uL URI

• Esta alarma se activa por una o varias causas

– Acumulación de plaquetas

– Eritrocitos microciticos

– Macroplaquetas

– Eritrocitos fragmentados

– Eritrocitos microcíticos

– Satelitosis plaquetaria

– Agregados plaquetarios

Alarma Interferencias en la región alta

URI “upper region interference”

LOCALIZACIÓN DE LAS ALARMAS REGIONALES EN EL HISTOGRAMA DE LEUCOCITOS

• Los grupos celulares que se encuentran fuera de las regiones consideradas como normales, disparan una alarma. Según la categoría de las células anormales, CELL-DYN utiliza seis alarmas diferentes

– R0,R1,R2,R3,R4 y RM

INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS DEL HISTOGRAMA DE BLANCOS

• Existen diferentes regiones o puntos de control dentro de las tres poblaciones de células blancas

• Cuando no se cumplen los criterios de normalidad se muestran las alarmas R (R0,R1,R2,R3,R4 y RM)

• Las muestra cuyos resultados numéricos estén dentro del rango normal, con histograma normal y que no presenten alarmas ¨R¨, pueden ser informadas directamente sin supervisión posterior

• Las muestras que presentan un resultado o histograma anormal con alarma ¨R¨, requieren posterior supervisión

Histograma Influencia del EDTA y la temperatura

HEMATOLOGÍA NORMAL

Diferencial manual

Linfocitos: 39%

Neutrófilos: 56%

Monocitos: 3%

Bandas:1%

Eosinofilos: 1%

LEUCOCITOSIS CON LINFOPENIA Y NEUTROFILIA, LIGERA TROMBOCITOSIS

Diferencial manual

Linfocitos: 4.5% Neutrófilos:81.5%

Monocitos: 5%

Bandas: 9%

(CD) Diferencial automatizado

Linfocitos: 8.4%

Granulocitos:87.7%

MID: 3.9%

ERITROCITOSIS MICROCÍTICA

Diferencial manual

Linfocitos: 55%

Neutrófilos: 36%

Monocitos: 5

Bandas: 1%

Basófilos: 3%

Anisocitosis: +

Poiquilocitosis: +

Policromasia: +

GR nucleados: 1/1000GR

(CD) Diferencial automatizado Linfocitos: 45.9%

Granulocitos: 49.5%

MID: 4.6 %

Valores serie roja alterados

Alarma URI

LIGERA MONOCITOSIS Y EOSINOFILIA CON NEUTROPENIA

Diferencial manual

Linfocitos: 34%

Basófilos: 2%

Monocitos: 16%

Neutrófilos: 26%

Eosinófilos: 13%

Bandas:7%

Mielocitos: 1%

Metamielocitos: 1%

Poiquilositosis:+

Policromasia: +

Células en diana: +

GRnucleados:1/100G

Reticulocitos:23/1000GR

(CD) Diferencial automatizado Linfocitos: 32.6%

Granulocitos: R3 51.6%

MID: R3 15.8 %

Valores serie roja alterados

DISPLASIA MEDULAR CON FIBRINA. CÉLULAS AFECTADAS POR QUIMIOTERAPIA CITÓXICA

Diferencial manual

Linfocitos: 28%

Bandas: 11%

Monocitos: 24%

Eosinofilos: 3%

Neutrófilos: 34%

Reticulocitos: 13/1000GR

Anisocitosis: ++

Poiquilocitosis: ++

(CD) Diferencial automatizado Linfocitos: RM 54.3 %

Granulocitos: RM 33.1 %

MID: R3 12.6 %

Valores serie roja alterados

Alarma URI

MUCHAS GRACIAS !

SISTEMA MODULAR TOTALMENTE AUTOMATIZADO