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Genética Bacteriana
La genética es el estudio de los mecanismos por los cuales los
caracteres se transmiten de un organismo a otro y como se
expresan.
El genoma bacteriano está formado por el cromosoma y los
plasmidios que pudiera haber. La mayoría de las bacterias tiene
un plasmidio, pero algunas no tiene ninguno. El conjunto de
cromosoma-plasmidio forma el genoma. Cromosoma y
plasmidios se forman de DNA, en bacterias solo DNA (los
virus pueden tener RNA). Se forman de una doble hebra
antiparalela de una molécula helicoidal (DNA).
El cromosoma
bacteriano es
siempre uno
solo. No tienen
ningún tipo de
envoltura como
los eucariotas,
está suelto en el
citoplasma en
una zona
llamada nucleoide. Es siempre DNA de doble hebra y es circular (no lineal como nosotros).
Puede estar en un estado relajado o en un estado sobre-enrollado que es el estado en que
generalmente se encuentran los plasmidios.
El nucleoide es el lugar donde se encuentra el cromosoma bacteriano, y al microscopio
electrónico se observa como una región clara dentro del citoplasma.
El cromosoma bacteriano se encuentra condensado o
empaquetado, si extiendo el DNA de una bacteria me
da como 80 veces el largo de la bacteria. Entonces
está empaquetado de una manera muy condensada, y
en esto colaboran las proteínas y moléculas de RNA.
Entonces el cromosoma se compone de un 60% de
DNA, pero también tiene 30% de RNA y un 10% de
proteínas, que operan para que el empaquetamiento se
encuentre así.
Esas proteínas no son histonas, son histone-like-proteins, que son parecidas a ellas. Están
cargadas positivamente para interactuar con el DNA cargado negativamente y lo que se
forman son loops. Las proteínas sirven de anclajes de esos loops, y estos loops forman un
dominio y a su vez esos loops están súper enrollados y anclados por otras proteínas, y esa
es la manera en que se encuentra el DNA dentro de la bacteria.
Esta es una bacteria de Escherichia coli, a la que le hicieron una lisis parcial, rompieron su
pared y dejaron escapar el DNA, y una lisis parcial proteica también para que se suelten las
proteínas. Ahí está el DNA extendido de la bacteria.
Las distintas especies de bacteria tienen distintos genomas, el largo del genoma puede ser
muy distinto, por ejemplo 4200 kb tiene el Bacillus, pero el Micoplasma genitalium tiene
580 kb. Y la diferencia en esto, la micoplasma es la bacteria que no tiene pared, pequeña y
deficiente metabolitamente; su ahorro en tener enzimas metabólicas completas se traduce
en un genoma mucho más pequeño.
Para comparar los pares de bases respecto a los
seres humanos, 3,4x10^9 pares de bases, una
diferencia bastante grande.
Acá esta el tamaño de algunos genomas solo
para comparar. Acá el de Micoplasma
genitalium con un genoma muy pequeño, igual
que Haemophilus y Helicobacter. Y las
Pseudomonas con un genoma bastante grande de
6,26 Mb, lo mismo que Streptomyeces.
La representación de un cromosoma
bacteriano. Este es el cromosoma de
Haemophilus influenzae, la primera bacteria
que se secuenció. Tomaron esta por tener un
genoma muy chico, y así se representa la
anotación del genoma. No solo hay que
secuenciar, sino que hay que ver a que
corresponde cada secuencia; el asignar un
nombre a cada gen se llama anotar el genoma.
Los distintos colorcitos representan genes
involucrados en distintas funciones. Los
distintos microorganismos tienen un tamaño
distinto de sus genes. Por ejemplo de
Sacharomyces cervisiae que es un eucariota tienen
un tamaño promedio de sus genes de 1,9 kilobases,
mientras que el Micoplasma genitalium tiene 1,2
kb y Escherichia coli 1,1 kb. El tamaño promedio
de los genes es diferente.
Esto es un gen, está formado por su
región promotora (región -35 y -10),
luego de eso viene el inicio de la trascripción (la posición +1), luego la secuencia de unión
al ribosoma (secuencia de Shine-Delgarno o Ribosome Binding Side), luego el inicio y
termino de la traducción marcados por codones específicos: el inicio con ATG que codifica
para metionina y el fin por los codones de termino donde el ribosoma al encontrarse con
ellos los suelta y se termina la trascripción (esto es lo que se llama la región codificante o
marco abierto de lectura, cuando ustedes ven ORF es por Open reading frame); y el
terminador, que es el terminador de la trascripción, donde la RNA polimerasa suelta el
DNA y deja de transcribir.
Así se ven los genes al bajarse de la base de datos universal de los genes. Parece chino,
pero no es chino. Baje este gen porque trabajo con él. Acá esta la secuencia de Shine-
Delgarno, acá el ATG que codifica para metionina, acá está la secuencia codificante que
llega hasta acá y termina con TAA. También hay
otros detalles, la región en verde es el péptido
señal que le dice al ribosoma “secrétame”, con esa
secuencia el péptido va dirigido al citoplasma. Y
esto naranja que está acá es una parte de anclaje al
citoplasma, que cuando se traduce queda inmerso
en la membrana, y lo que está aquí queda hacia la
superficie. Esta es la proteína M de Streptococcus
pyogenes, que es una proteína de membrana que
participa evitando la fagocitosis porque confunde
al sistema inmune.
Con esta tabla, que es el código genético, se lee la secuencia que les mostré. Es degenerado,
tenemos varios codones para un mismo aminoácido.
Los plásmidos o
plasmidios. Son el otro
componente de los
genomas bacterianos y
se replican de manera
independiente al
cromosoma. Es de DNA
circular de doble hebra.
Siempre está súper
enrollado, tiene como
varias torsiones. Tiene
un tamaño variable pero
siempre menor al
cromosoma, y también
tienen un número de
copias variables
dependiendo del
plásmido que sea,
existen miles de plásmidos distintos. Cada plásmido tiene un número de copias que es una
característica propia del plásmido, hay algunos que están en una copia y otros que están en
varias copias dentro de la bacteria, y ellos mismos regulan cuantas copias hay. Los
plasmidios se pueden transferir horizontalmente por conjugación de una bacteria a la otra.
La gracia de los plasmidios es que tienen genes no esenciales para la vida de la bacteria,
pero que le aportan una ventaja, por ejemplo resistencia a antibióticos, capacidad de
metabolizar algunos metales pesados, rutas metabólicas para poder utilizar una fuente de
carbono rara que otras bacterias no podrían utilizar, toxinas para competir o factores de
virulencia.
*En la misma bacteria pueden haber muchos plasmidios, del mismo tipo y de distintos tipos,
que deben se compatibles entre si, hay un sistema de compatibilidad de plasmidios donde
algunos son compatibles entre si y otros no.
Tener un plasmidio es una carga para la bacteria, es como un parásito, hay que replicarlo,
implica consumir nucleótidos en cada ciclo celular, en cada ciclo de replicación y en cada
fisión; entonces la única manera de conservarlo es que tenga algo bueno, si no aporta nada
la bacteria lo elimina por curación (lo expulsa). El plasmidio casi siempre está
independiente del cromosoma, pero también puede integrarse a él, y cuando está integrado
se dice que está en forma integrada, y cuando está afuera se dice que está en forma
episomal. Puede integrarse y salir dependiendo de las condiciones.
Esto es el dogma central de la biología molecular de
la transferencia de información genética, que es
unidireccional y universal; es en todos los organismos
lo mismo, todos tienen replicación, trascripción y
traducción. Ocurre siempre en esta secuencia, la
replicación está a cargo de la DNA polimerasa, la
trascripción de la RNA polimerasa y la traducción es
la lectura de la molécula de RNA por los ribosomas y
la síntesis de la proteína.
La replicación de un cromosoma
bacteriano ocurre de una forma
muy característica, donde existen
secuencias específicas que
participan en la replicación. El Ori
C es el origen de la replicación, allí
comienza a replicarse el
cromosoma, y lo hace de esta
manera, se van formando dos
orquillas de replicación, entonces
la hebra se abre en el origen de
replicación por la helicasa que la
desenrolla, allí se mete la DNA
polimerasa y sintetiza la
complementaria para este lado y la
complementaria del otro lado para el otro. Esto es una orquilla de replicación y esta es la
otra, entonces esto se va separando y esta forma recuerda a la letra griega theta, por eso se
dice que el cromosoma bacteriano se replica en una estructura theta. Muchos plasmidios
también se dividen así.
Después de la replicación viene la
trascripción. Esto es pasar la
información que estaba en el DNA a
un RNA para que pueda ser
traducido. Lo que tiene de particular
la trascripción en procariotas es que
ocurre todo al mismo tiempo. Acá
tenemos el inició de la trascripción
(el +1) que se pega a la RNA
polimerasa y va a empezar a
transcribir la molécula de RNA. Lo
que ocurre una célula procariota que
no ocurre en una eucariota es que
apenas sale la molécula de RNA mensajero viene un ribosoma y empieza a traducir. Eso no
puede ocurrir en un eucariota porque esto ocurre en el núcleo y los ribosomas están en el
citoplasma, entonces tiene que terminarse de formar el mRNA completo, este sale del
núcleo atravesando la membrana nuclear y llegar a los ribosomas que están en el citoplasma;
además antes de salir tienen que sufrir todo el proceso de splicing (eliminar los intrones y
madurar el RNA), todo esto no ocurre aquí. Lo otro es que en un eucarionte 1 mRNA un
gen, en procariontes 1 mRNA varios genes; se forma una proteína grande que después se
corta; en eucariontes 1 mRNA 1 proteína (monosincrónico) mientras que en procariontes un
mRNA varias proteínas (polisincrónico).
El último paso en el flujo
de información es la
traducción, que es la
síntesis de proteínas,
donde la información que
está en el mRNA se
traduce para formar una
proteína, lo que ocurre de
esta manera. El mRNA va
pasando por el ribosoma y
el codon se va a acoplar
con el anticodon del tRNA
que tiene pegados
aminoácidos que se va a
quedar en el sitio E,
después este sale y va a
llegar el que le sigue que
se va a unir a este aminoácido y así se va formando la cadena de proteínas.
Esto es para ilustrar las diferencias que
existen en la transferencia de información en
procariotas y eucariotas. Esto pasa en
procariotas donde 1 un mRNA tiene una
región codificante A y una región
codificante B que se traducen y después se
cortan, mientras que en eucariontes primero
se forma el transcrito primario, luego tiene
que sufrir un procesamiento y empalme
donde se eliminan los intrones y el RNA
maduro que recién después de esto puede
salir al citoplasma unido a proteínas, se
traduce en el citoplasma y este mRNA se traduce para una proteína.
Ahora empezamos con como evolucionan
los microorganismos. Les dije que las
bacterias se dividen por fisión binaria, una
simple división en dos de la bacteria donde
duplica su material y se divide, y las dos
células resultantes son idénticas a la célula
original. Para evolucionar, ya que su
reproducción es asexual, tienen que haber
otros medios para lograr variabilidad.
La variabilidad es importante para poder
vivir en el medio, para adaptarse a los
cambios, y la manera de adaptarse a los
cambios es generando variabilidad. Esa generación de variabilidad es como evolucionan los
genomas bacterianos, esto lo hacen con mecanismos de variación genética: Mutaciones,
recombinación y reordenamiento del cromosoma, y transferencia de material genético.
Una mutación es un cambio hereditario
en la secuencia de bases del genoma de
un microorganismo. Surgen de manera
espontánea, son hechos sumamente
esporádicos que ocurren con muy baja
frecuencia; un error durante la
replicación ocurre como 1:10000, estos
cambios que surgen de manera
espontánea puede ocurrir durante la
replicación de material genético
porque la DNA polimerasa se puede
equivocar o pueden ser inducidos por
agentes químicos mutagenos
(nitrosoguanidina, bromuro de etilio), o también pueden ocurrir por agentes físicos como la
luz UV o radiación ionizante.
Para que una mutación pueda cambiar el fenotipo de una bacteria tiene que establecerse y
debe conseguir una ventaja adaptativa. Si esa mutación no confiere ventaja (o bien le
confiere una desventaja) se va a perder, esa bacteria no va a sobrevivir y nunca más se
sabrá de esa mutación; pero si la mutación es buena y le confiere ventaja adaptativa
entonces esa bacteria va a poder dividirse más que las demás y va a poder propagarse en la
población.
Hay distintos tipos de mutaciones, por ejemplo la mutación missense donde se cambia el
codon de un aminoácido por otro (aquí ocurre un cambio entre la tirosina y la asparagina).
Una mutación nosense es cuando da un codon de término (como cuando da una TAA) y la
proteína termina abruptamente y no es funcional. Una mutación silenciosa es cuando no
pasa nada (por ejemplo se inserta la misma tirosina que en la proteína wild type) y ocurre
cuando una mutación ocurre en la tercera posición del codon, como es degenerado la
tercera posición es la más variable y puede ocurrir que codifique para lo mismo.
También están los tipos de mutación por
inserción o por deleción. Si acá tenemos el
wild type, si sacamos una U va a haber un
“Frameshift” (cambio en el marco de
lectura), se cambia todo porque ahora el
ribosoma no va a leer UUU, va a leer
UUG lo que codifica para otra cosa, y el
que le sigue también (todo se corre). Esta
proteína tampoco va a ser funcional.
Lo mismo cuando se inserta una U. Acá
estamos hablando de mutaciones que
pudieran ser inducidas por luz UV, un
error en la DNA polimerasa que insertó
una U donde no debía. Entonces cuando hay una U de más, lo que corre el marco de
lectura y la proteína tendrá una secuencia totalmente distinta a la original y también va a ser
no funcional. Para que el cambio no sea tan drástico tiene que haber una inserción o una
deleción de un múltiplo de 3 bases, si se insertan 3 bases voy a insertar un aminoácido de
más, pero la proteína será prácticamente igual a la original (lo mismo que si saco un codón).
Otro mecanismo de variación genética
es la recombinación. Es un intercambio
de material genético entre elementos
genéticos diferentes, la más conocida
es la recombinación homologa (como
su nombre lo dice requiere de
secuencias homologas o similares).
Como dice ahí, son idénticas o casi
idénticas para que pueda ocurrir este
tipo de recombinación. Requiere de la
participación de la enzima Rec A. Así
comienza la recombinación, donde
primero hay un corte de simple hebra
en una de las moléculas (un donador),
en ese corte luego vendrá la proteína SSB (Single Stranded DNA Binding Protein) que se
une a cadenas simples y la va a proteger (una cadena simple de DNA es muy susceptible a
la degradación), y luego viene la proteína Rec A que cataliza el intercambio de cadena,
pegando este fragmento de DNA simple hebra a la cadena receptora. Luego continúa el
intercambio, esto se extiende y se va corriendo hasta que ocurre un apareamiento y el
resultado es que esta va a terminar apareada aquí abajo, entonces si acá había una diferencia
de secuencia, ella ahora estará aquí. Depende de donde se corta la diferente estructura que
se forme, si se resuelve en el sitio marcado con amarillo voy a tener parches (pedazos de
intercambio), en cambio si se resuelve en los sitios marcados con azul tendré empalmes
(pedazos más grandes donde hubo intercambio de hebras). El resultado es que ahora el
organismo va a tener una cadena de DNA que viene de otro origen que podría tener una
mutación interesante que le confiere una ventaja adaptativa.
El tercer mecanismo de variabilidad
genética es la transferencia de material
genético entre bacterias, estos son:
transformación, conjugación, transducción
y transposición. El tipo de información que
se transfiere es resistencia a antibióticos,
metabolismo de metales pesados,
capacidades catabólicas de degradar
fuentes de carbono, capacidades
biosintéticas, factores de virulencia,
factores de adhesividad, toxinas, etc.
La transformación es un proceso mediante
el cual una bacteria capta DNA que se encuentra libre en el medioambiente donde está. Ese
material genético para que pueda ocurrir una transformación efectiva tiene que
recombinarse, integrarse al cromosoma, si no se pierde en la primera división. Ese DNA
puede salir de una bacteria muerta que se lisó y dejó su DNA flotando por ahí hasta que
fuese captado por otra bacteria. También es un proceso poco frecuente, de 1 en no se
cuantos miles de millones, pero como las bacterias son millones siempre habrá alguna que
lo capte.
Los requerimientos para que haya una trasformación, tiene que haber un DNA
transformante y una bacteria capaz de captarlo, no cualquier bacteria puede hacerlo ya que
necesita una proteína de membrana, la DNA Binding Protein, y tiene que tener unas
proteínas específicas de unión a simple hebra, ya que el DNA entra como simple hebra, ya
que al entrar esta proteína degrada una de las cadenas (la nucleasa del dibujo), y tiene que
haber proteínas que se unan a esta cadena. Además tiene que estar Rec A para que pueda
ocurrir recombinación del DNA captado con el del cromosoma bacteriano (la misma Rec A
de la que hablamos).
Luego ocurre la recombinación y el DNA quedó integrado al cromosoma bacteriano.
No todas las bacterias pueden hacer esto,
las bacterias que pueden hacerlo se dicen
son competentes. Hay bacterias que son
naturalmente competentes como esos
géneros que están ahí enumerados
(Bacillus, Streptococcus pneunoniae,
Haemophilus influenzae, etc.), porque
tienen esas proteínas de la diapo ante
anterior (la DNA Binding protein, las
proteínas de la recombinación homologa).
Ellas regulan su estado de competencia, se
dicen que son competentes y entran un
estado de competencia que depende de
proteínas que liberan al medioambiente para decirse unas a otras que están en tal estado.
También existen diferencias en el DNA que pueden captar: Strepto pneumonia puede captar
cualquier DNA (es promiscuo), pero Neisseria gonorrea y Haemophilus influenzae captan
DNA con secuencias específicas.
Bacillus subtilis aceptan DNA de una
hebra. Estas bacterias producen y
excretan al medio un péptido pequeño
durante el crecimiento que cuando
alcanza ciertas concentraciones se dice
que la bacteria está competente (lista
para captar DNA). Tienen ComP, una
kinasa sensora que se encuentra en la
membrana y ComA que es una
proteína reguladora de la respuesta, es
una proteína que cuando la kinasa
sensora de ese péptido le pasa la señal
a ComA, este va a activar un montón
de genes que tienen que ver con la
transformación. Si yo tengo un cultivo de Bacillus subtilis en el laboratorio, solo un 20% de
las células de ese cultivo son competentes (pueden captar DNA exógeno).
Haemophilus influenzae también es
otra bacteria que es naturalmente
competente, pero ella acepta DNA de
doble hebra, pero ella no acepta
cualquier DNA, este debe tener una
secuencia específica de 11 pares de
bases, que es muy frecuente en el
cromosoma del mismo Haemophilus,
es decir acepta DNA de su misma
especie solamente.
En el laboratorio las bacterias se
transforman todo el rato sin pertenecer
necesariamente a esos géneros
transformables. Se puede hacer una
bacteria cualquiera se haga competente
por distintos mecanismos. Se puede
transformar casi cualquier bacteria (o
cualquier cosa). Cuando ponemos una
bacteria en contacto con DNA en
solución, solo algunas bacterias van a
resultar transformadas, pero como se
tienen tantas bacterias en ese cultivo,
con que alguna se transforme me
conformo. Los valores normales de
eficiencia de transformación van de 0.1
a 1% que es bastante; hay que poner una concentración mínima de DNA de 0.00001 g/mL
o 10 ng/mL. Se hace una bacteria competente con una solución de cloruro de calcio y frío
(hielo), o con un pulso eléctrico, lo más usado en este momento, ya que aumenta la
permeabilidad de la bacteria y esta se vuelve competente.
Esto es un electroporador y
lo que yo hago en el
laboratorio. Le doy un
pulso eléctrico como de
2000 Volts, pero que dure
unos milisegundos, y en
ese tiempo se hacen poros
en la membrana por donde
se mete el DNA. Así se
hace la transformación
artificial en el laboratorio.
Lo pongo en una celda de
metal, pongo la bacteria
con el DNA, le doy el
pulso y el DNA se mete en
la bacteria en los
milisegundos que duren los
2000 Volts (es regulable, eucariontes soportan un poco más). Luego selecciono en un
medio de cultivo para ver quienes son las que incorporaron el DNA que yo quería, esto se
hace con un marcador de selección (que generalmente es resistencia a antibiótico). Se mete
el gen deseado pegadito a un gen de resistencia a antibiótico (como resistencia a
canamicina), entonces las cultivo en un medio con canamicina, y las que crecen son las
transformadas.