Genética Bacteriana

La genética es el estudio de los mecanismos por los cuales los

caracteres se transmiten de un organismo a otro y como se

expresan.

El genoma bacteriano está formado por el cromosoma y los

plasmidios que pudiera haber. La mayoría de las bacterias tiene

un plasmidio, pero algunas no tiene ninguno. El conjunto de

cromosoma-plasmidio forma el genoma. Cromosoma y

plasmidios se forman de DNA, en bacterias solo DNA (los

virus pueden tener RNA). Se forman de una doble hebra

antiparalela de una molécula helicoidal (DNA).

El cromosoma

bacteriano es

siempre uno

solo. No tienen

ningún tipo de

envoltura como

los eucariotas,

está suelto en el

citoplasma en

una zona

llamada nucleoide. Es siempre DNA de doble hebra y es circular (no lineal como nosotros).

Puede estar en un estado relajado o en un estado sobre-enrollado que es el estado en que

generalmente se encuentran los plasmidios.

El nucleoide es el lugar donde se encuentra el cromosoma bacteriano, y al microscopio

electrónico se observa como una región clara dentro del citoplasma.

El cromosoma bacteriano se encuentra condensado o

empaquetado, si extiendo el DNA de una bacteria me

da como 80 veces el largo de la bacteria. Entonces

está empaquetado de una manera muy condensada, y

en esto colaboran las proteínas y moléculas de RNA.

Entonces el cromosoma se compone de un 60% de

DNA, pero también tiene 30% de RNA y un 10% de

proteínas, que operan para que el empaquetamiento se

encuentre así.

Esas proteínas no son histonas, son histone-like-proteins, que son parecidas a ellas. Están

cargadas positivamente para interactuar con el DNA cargado negativamente y lo que se

forman son loops. Las proteínas sirven de anclajes de esos loops, y estos loops forman un

dominio y a su vez esos loops están súper enrollados y anclados por otras proteínas, y esa

es la manera en que se encuentra el DNA dentro de la bacteria.

Esta es una bacteria de Escherichia coli, a la que le hicieron una lisis parcial, rompieron su

pared y dejaron escapar el DNA, y una lisis parcial proteica también para que se suelten las

proteínas. Ahí está el DNA extendido de la bacteria.

Las distintas especies de bacteria tienen distintos genomas, el largo del genoma puede ser

muy distinto, por ejemplo 4200 kb tiene el Bacillus, pero el Micoplasma genitalium tiene

580 kb. Y la diferencia en esto, la micoplasma es la bacteria que no tiene pared, pequeña y

deficiente metabolitamente; su ahorro en tener enzimas metabólicas completas se traduce

en un genoma mucho más pequeño.

Para comparar los pares de bases respecto a los

seres humanos, 3,4x10^9 pares de bases, una

diferencia bastante grande.

Acá esta el tamaño de algunos genomas solo

para comparar. Acá el de Micoplasma

genitalium con un genoma muy pequeño, igual

que Haemophilus y Helicobacter. Y las

Pseudomonas con un genoma bastante grande de

6,26 Mb, lo mismo que Streptomyeces.

La representación de un cromosoma

bacteriano. Este es el cromosoma de

Haemophilus influenzae, la primera bacteria

que se secuenció. Tomaron esta por tener un

genoma muy chico, y así se representa la

anotación del genoma. No solo hay que

secuenciar, sino que hay que ver a que

corresponde cada secuencia; el asignar un

nombre a cada gen se llama anotar el genoma.

Los distintos colorcitos representan genes

involucrados en distintas funciones. Los

distintos microorganismos tienen un tamaño

distinto de sus genes. Por ejemplo de

Sacharomyces cervisiae que es un eucariota tienen

un tamaño promedio de sus genes de 1,9 kilobases,

mientras que el Micoplasma genitalium tiene 1,2

kb y Escherichia coli 1,1 kb. El tamaño promedio

de los genes es diferente.

Esto es un gen, está formado por su

región promotora (región -35 y -10),

luego de eso viene el inicio de la trascripción (la posición +1), luego la secuencia de unión

al ribosoma (secuencia de Shine-Delgarno o Ribosome Binding Side), luego el inicio y

termino de la traducción marcados por codones específicos: el inicio con ATG que codifica

para metionina y el fin por los codones de termino donde el ribosoma al encontrarse con

ellos los suelta y se termina la trascripción (esto es lo que se llama la región codificante o

marco abierto de lectura, cuando ustedes ven ORF es por Open reading frame); y el

terminador, que es el terminador de la trascripción, donde la RNA polimerasa suelta el

DNA y deja de transcribir.

Así se ven los genes al bajarse de la base de datos universal de los genes. Parece chino,

pero no es chino. Baje este gen porque trabajo con él. Acá esta la secuencia de Shine-

Delgarno, acá el ATG que codifica para metionina, acá está la secuencia codificante que

llega hasta acá y termina con TAA. También hay

otros detalles, la región en verde es el péptido

señal que le dice al ribosoma “secrétame”, con esa

secuencia el péptido va dirigido al citoplasma. Y

esto naranja que está acá es una parte de anclaje al

citoplasma, que cuando se traduce queda inmerso

en la membrana, y lo que está aquí queda hacia la

superficie. Esta es la proteína M de Streptococcus

pyogenes, que es una proteína de membrana que

participa evitando la fagocitosis porque confunde

al sistema inmune.

Con esta tabla, que es el código genético, se lee la secuencia que les mostré. Es degenerado,

tenemos varios codones para un mismo aminoácido.

Los plásmidos o

plasmidios. Son el otro

componente de los

genomas bacterianos y

se replican de manera

independiente al

cromosoma. Es de DNA

circular de doble hebra.

Siempre está súper

enrollado, tiene como

varias torsiones. Tiene

un tamaño variable pero

siempre menor al

cromosoma, y también

tienen un número de

copias variables

dependiendo del

plásmido que sea,

existen miles de plásmidos distintos. Cada plásmido tiene un número de copias que es una

característica propia del plásmido, hay algunos que están en una copia y otros que están en

varias copias dentro de la bacteria, y ellos mismos regulan cuantas copias hay. Los

plasmidios se pueden transferir horizontalmente por conjugación de una bacteria a la otra.

La gracia de los plasmidios es que tienen genes no esenciales para la vida de la bacteria,

pero que le aportan una ventaja, por ejemplo resistencia a antibióticos, capacidad de

metabolizar algunos metales pesados, rutas metabólicas para poder utilizar una fuente de

carbono rara que otras bacterias no podrían utilizar, toxinas para competir o factores de

virulencia.

*En la misma bacteria pueden haber muchos plasmidios, del mismo tipo y de distintos tipos,

que deben se compatibles entre si, hay un sistema de compatibilidad de plasmidios donde

algunos son compatibles entre si y otros no.

Tener un plasmidio es una carga para la bacteria, es como un parásito, hay que replicarlo,

implica consumir nucleótidos en cada ciclo celular, en cada ciclo de replicación y en cada

fisión; entonces la única manera de conservarlo es que tenga algo bueno, si no aporta nada

la bacteria lo elimina por curación (lo expulsa). El plasmidio casi siempre está

independiente del cromosoma, pero también puede integrarse a él, y cuando está integrado

se dice que está en forma integrada, y cuando está afuera se dice que está en forma

episomal. Puede integrarse y salir dependiendo de las condiciones.

Esto es el dogma central de la biología molecular de

la transferencia de información genética, que es

unidireccional y universal; es en todos los organismos

lo mismo, todos tienen replicación, trascripción y

traducción. Ocurre siempre en esta secuencia, la

replicación está a cargo de la DNA polimerasa, la

trascripción de la RNA polimerasa y la traducción es

la lectura de la molécula de RNA por los ribosomas y

la síntesis de la proteína.

La replicación de un cromosoma

bacteriano ocurre de una forma

muy característica, donde existen

secuencias específicas que

participan en la replicación. El Ori

C es el origen de la replicación, allí

comienza a replicarse el

cromosoma, y lo hace de esta

manera, se van formando dos

orquillas de replicación, entonces

la hebra se abre en el origen de

replicación por la helicasa que la

desenrolla, allí se mete la DNA

polimerasa y sintetiza la

complementaria para este lado y la

complementaria del otro lado para el otro. Esto es una orquilla de replicación y esta es la

otra, entonces esto se va separando y esta forma recuerda a la letra griega theta, por eso se

dice que el cromosoma bacteriano se replica en una estructura theta. Muchos plasmidios

también se dividen así.

Después de la replicación viene la

trascripción. Esto es pasar la

información que estaba en el DNA a

un RNA para que pueda ser

traducido. Lo que tiene de particular

la trascripción en procariotas es que

ocurre todo al mismo tiempo. Acá

tenemos el inició de la trascripción

(el +1) que se pega a la RNA

polimerasa y va a empezar a

transcribir la molécula de RNA. Lo

que ocurre una célula procariota que

no ocurre en una eucariota es que

apenas sale la molécula de RNA mensajero viene un ribosoma y empieza a traducir. Eso no

puede ocurrir en un eucariota porque esto ocurre en el núcleo y los ribosomas están en el

citoplasma, entonces tiene que terminarse de formar el mRNA completo, este sale del

núcleo atravesando la membrana nuclear y llegar a los ribosomas que están en el citoplasma;

además antes de salir tienen que sufrir todo el proceso de splicing (eliminar los intrones y

madurar el RNA), todo esto no ocurre aquí. Lo otro es que en un eucarionte 1 mRNA un

gen, en procariontes 1 mRNA varios genes; se forma una proteína grande que después se

corta; en eucariontes 1 mRNA 1 proteína (monosincrónico) mientras que en procariontes un

mRNA varias proteínas (polisincrónico).

El último paso en el flujo

de información es la

traducción, que es la

síntesis de proteínas,

donde la información que

está en el mRNA se

traduce para formar una

proteína, lo que ocurre de

esta manera. El mRNA va

pasando por el ribosoma y

el codon se va a acoplar

con el anticodon del tRNA

que tiene pegados

aminoácidos que se va a

quedar en el sitio E,

después este sale y va a

llegar el que le sigue que

se va a unir a este aminoácido y así se va formando la cadena de proteínas.

Esto es para ilustrar las diferencias que

existen en la transferencia de información en

procariotas y eucariotas. Esto pasa en

procariotas donde 1 un mRNA tiene una

región codificante A y una región

codificante B que se traducen y después se

cortan, mientras que en eucariontes primero

se forma el transcrito primario, luego tiene

que sufrir un procesamiento y empalme

donde se eliminan los intrones y el RNA

maduro que recién después de esto puede

salir al citoplasma unido a proteínas, se

traduce en el citoplasma y este mRNA se traduce para una proteína.

Ahora empezamos con como evolucionan

los microorganismos. Les dije que las

bacterias se dividen por fisión binaria, una

simple división en dos de la bacteria donde

duplica su material y se divide, y las dos

células resultantes son idénticas a la célula

original. Para evolucionar, ya que su

reproducción es asexual, tienen que haber

otros medios para lograr variabilidad.

La variabilidad es importante para poder

vivir en el medio, para adaptarse a los

cambios, y la manera de adaptarse a los

cambios es generando variabilidad. Esa generación de variabilidad es como evolucionan los

genomas bacterianos, esto lo hacen con mecanismos de variación genética: Mutaciones,

recombinación y reordenamiento del cromosoma, y transferencia de material genético.

Una mutación es un cambio hereditario

en la secuencia de bases del genoma de

un microorganismo. Surgen de manera

espontánea, son hechos sumamente

esporádicos que ocurren con muy baja

frecuencia; un error durante la

replicación ocurre como 1:10000, estos

cambios que surgen de manera

espontánea puede ocurrir durante la

replicación de material genético

porque la DNA polimerasa se puede

equivocar o pueden ser inducidos por

agentes químicos mutagenos

(nitrosoguanidina, bromuro de etilio), o también pueden ocurrir por agentes físicos como la

luz UV o radiación ionizante.

Para que una mutación pueda cambiar el fenotipo de una bacteria tiene que establecerse y

debe conseguir una ventaja adaptativa. Si esa mutación no confiere ventaja (o bien le

confiere una desventaja) se va a perder, esa bacteria no va a sobrevivir y nunca más se

sabrá de esa mutación; pero si la mutación es buena y le confiere ventaja adaptativa

entonces esa bacteria va a poder dividirse más que las demás y va a poder propagarse en la

población.

Hay distintos tipos de mutaciones, por ejemplo la mutación missense donde se cambia el

codon de un aminoácido por otro (aquí ocurre un cambio entre la tirosina y la asparagina).

Una mutación nosense es cuando da un codon de término (como cuando da una TAA) y la

proteína termina abruptamente y no es funcional. Una mutación silenciosa es cuando no

pasa nada (por ejemplo se inserta la misma tirosina que en la proteína wild type) y ocurre

cuando una mutación ocurre en la tercera posición del codon, como es degenerado la

tercera posición es la más variable y puede ocurrir que codifique para lo mismo.

También están los tipos de mutación por

inserción o por deleción. Si acá tenemos el

wild type, si sacamos una U va a haber un

“Frameshift” (cambio en el marco de

lectura), se cambia todo porque ahora el

ribosoma no va a leer UUU, va a leer

UUG lo que codifica para otra cosa, y el

que le sigue también (todo se corre). Esta

proteína tampoco va a ser funcional.

Lo mismo cuando se inserta una U. Acá

estamos hablando de mutaciones que

pudieran ser inducidas por luz UV, un

error en la DNA polimerasa que insertó

una U donde no debía. Entonces cuando hay una U de más, lo que corre el marco de

lectura y la proteína tendrá una secuencia totalmente distinta a la original y también va a ser

no funcional. Para que el cambio no sea tan drástico tiene que haber una inserción o una

deleción de un múltiplo de 3 bases, si se insertan 3 bases voy a insertar un aminoácido de

más, pero la proteína será prácticamente igual a la original (lo mismo que si saco un codón).

Otro mecanismo de variación genética

es la recombinación. Es un intercambio

de material genético entre elementos

genéticos diferentes, la más conocida

es la recombinación homologa (como

su nombre lo dice requiere de

secuencias homologas o similares).

Como dice ahí, son idénticas o casi

idénticas para que pueda ocurrir este

tipo de recombinación. Requiere de la

participación de la enzima Rec A. Así

comienza la recombinación, donde

primero hay un corte de simple hebra

en una de las moléculas (un donador),

en ese corte luego vendrá la proteína SSB (Single Stranded DNA Binding Protein) que se

une a cadenas simples y la va a proteger (una cadena simple de DNA es muy susceptible a

la degradación), y luego viene la proteína Rec A que cataliza el intercambio de cadena,

pegando este fragmento de DNA simple hebra a la cadena receptora. Luego continúa el

intercambio, esto se extiende y se va corriendo hasta que ocurre un apareamiento y el

resultado es que esta va a terminar apareada aquí abajo, entonces si acá había una diferencia

de secuencia, ella ahora estará aquí. Depende de donde se corta la diferente estructura que

se forme, si se resuelve en el sitio marcado con amarillo voy a tener parches (pedazos de

intercambio), en cambio si se resuelve en los sitios marcados con azul tendré empalmes

(pedazos más grandes donde hubo intercambio de hebras). El resultado es que ahora el

organismo va a tener una cadena de DNA que viene de otro origen que podría tener una

mutación interesante que le confiere una ventaja adaptativa.

El tercer mecanismo de variabilidad

genética es la transferencia de material

genético entre bacterias, estos son:

transformación, conjugación, transducción

y transposición. El tipo de información que

se transfiere es resistencia a antibióticos,

metabolismo de metales pesados,

capacidades catabólicas de degradar

fuentes de carbono, capacidades

biosintéticas, factores de virulencia,

factores de adhesividad, toxinas, etc.

La transformación es un proceso mediante

el cual una bacteria capta DNA que se encuentra libre en el medioambiente donde está. Ese

material genético para que pueda ocurrir una transformación efectiva tiene que

recombinarse, integrarse al cromosoma, si no se pierde en la primera división. Ese DNA

puede salir de una bacteria muerta que se lisó y dejó su DNA flotando por ahí hasta que

fuese captado por otra bacteria. También es un proceso poco frecuente, de 1 en no se

cuantos miles de millones, pero como las bacterias son millones siempre habrá alguna que

lo capte.

Los requerimientos para que haya una trasformación, tiene que haber un DNA

transformante y una bacteria capaz de captarlo, no cualquier bacteria puede hacerlo ya que

necesita una proteína de membrana, la DNA Binding Protein, y tiene que tener unas

proteínas específicas de unión a simple hebra, ya que el DNA entra como simple hebra, ya

que al entrar esta proteína degrada una de las cadenas (la nucleasa del dibujo), y tiene que

haber proteínas que se unan a esta cadena. Además tiene que estar Rec A para que pueda

ocurrir recombinación del DNA captado con el del cromosoma bacteriano (la misma Rec A

de la que hablamos).

Luego ocurre la recombinación y el DNA quedó integrado al cromosoma bacteriano.

No todas las bacterias pueden hacer esto,

las bacterias que pueden hacerlo se dicen

son competentes. Hay bacterias que son

naturalmente competentes como esos

géneros que están ahí enumerados

(Bacillus, Streptococcus pneunoniae,

Haemophilus influenzae, etc.), porque

tienen esas proteínas de la diapo ante

anterior (la DNA Binding protein, las

proteínas de la recombinación homologa).

Ellas regulan su estado de competencia, se

dicen que son competentes y entran un

estado de competencia que depende de

proteínas que liberan al medioambiente para decirse unas a otras que están en tal estado.

También existen diferencias en el DNA que pueden captar: Strepto pneumonia puede captar

cualquier DNA (es promiscuo), pero Neisseria gonorrea y Haemophilus influenzae captan

DNA con secuencias específicas.

Bacillus subtilis aceptan DNA de una

hebra. Estas bacterias producen y

excretan al medio un péptido pequeño

durante el crecimiento que cuando

alcanza ciertas concentraciones se dice

que la bacteria está competente (lista

para captar DNA). Tienen ComP, una

kinasa sensora que se encuentra en la

membrana y ComA que es una

proteína reguladora de la respuesta, es

una proteína que cuando la kinasa

sensora de ese péptido le pasa la señal

a ComA, este va a activar un montón

de genes que tienen que ver con la

transformación. Si yo tengo un cultivo de Bacillus subtilis en el laboratorio, solo un 20% de

las células de ese cultivo son competentes (pueden captar DNA exógeno).

Haemophilus influenzae también es

otra bacteria que es naturalmente

competente, pero ella acepta DNA de

doble hebra, pero ella no acepta

cualquier DNA, este debe tener una

secuencia específica de 11 pares de

bases, que es muy frecuente en el

cromosoma del mismo Haemophilus,

es decir acepta DNA de su misma

especie solamente.

En el laboratorio las bacterias se

transforman todo el rato sin pertenecer

necesariamente a esos géneros

transformables. Se puede hacer una

bacteria cualquiera se haga competente

por distintos mecanismos. Se puede

transformar casi cualquier bacteria (o

cualquier cosa). Cuando ponemos una

bacteria en contacto con DNA en

solución, solo algunas bacterias van a

resultar transformadas, pero como se

tienen tantas bacterias en ese cultivo,

con que alguna se transforme me

conformo. Los valores normales de

eficiencia de transformación van de 0.1

a 1% que es bastante; hay que poner una concentración mínima de DNA de 0.00001 g/mL

o 10 ng/mL. Se hace una bacteria competente con una solución de cloruro de calcio y frío

(hielo), o con un pulso eléctrico, lo más usado en este momento, ya que aumenta la

permeabilidad de la bacteria y esta se vuelve competente.

Esto es un electroporador y

lo que yo hago en el

laboratorio. Le doy un

pulso eléctrico como de

2000 Volts, pero que dure

unos milisegundos, y en

ese tiempo se hacen poros

en la membrana por donde

se mete el DNA. Así se

hace la transformación

artificial en el laboratorio.

Lo pongo en una celda de

metal, pongo la bacteria

con el DNA, le doy el

pulso y el DNA se mete en

la bacteria en los

milisegundos que duren los

2000 Volts (es regulable, eucariontes soportan un poco más). Luego selecciono en un

medio de cultivo para ver quienes son las que incorporaron el DNA que yo quería, esto se

hace con un marcador de selección (que generalmente es resistencia a antibiótico). Se mete

el gen deseado pegadito a un gen de resistencia a antibiótico (como resistencia a

canamicina), entonces las cultivo en un medio con canamicina, y las que crecen son las

transformadas.