Post on 31-Jul-2022
Espectroscopía electrónica de biomoléculas en el UV cercano
Siempre subestimada
¿Quiénes absorben en el UV cercano?
• Transiciones electrónicas de baja energía → ”espacio” para los electrones (caja grande)
• Aromáticos!
En biomoléculas tenemos a varios fragmentos aromáticos
En proteínas En ácidos nucleicos
Genial… ¿sirve para algo?
• Todos absorben en el UV cercano (entre 240 y 300 nm)• Los coeficientes de extinción son relativamente altos• ¡Cuantificación!: Proteínas A280; ácidos nucleicos A260
Cuantificación de ácidos nucleicos
• Todos los monómeros absorben →Absorción intensa a 260• RNA con A260 = 0.1 tiene ≈ 3 µg/ml
• Coeficientes de extinción similares• En ácidos nucleicos de composición al azar
estimación precisa
• DNA ≠ RNA (T vs. U)
• ¡Depende de la hibridación! (efecto hipocrómico por apliamiento de bases)
Cuantificación de proteínas
• Solamente aromáticos absorben →absorptividad dependiente de composición
• Se puede calcular con bastante precisión• EXPASY protparam• ε280 ≈ 5500 NTrp + 1400 NTyr
• Por abundancia promedio, 1 mg/ml≈ 1 OD280 (¡mucho menos que NA!)
Cuantificación, de acuerdo. ¿Algo más?
• En ácidos nucleicos, la hibridación cambia la absorptividad
• En proteínas, el entorno de las cadenas laterales aromáticas desplazan el espectro
• Ionización/pte H
• Polaridad
Cuantificación, de acuerdo. ¿Algo más?
• En ácidos nucleicos, la hibridación cambia la absorptividad
• En proteínas, el entorno de las cadenas laterales aromáticas desplazan el espectro• Ionización/pte H• Equilibrio Tyr-OH ⇌ Tyr-
O- (pKa ≈ 10.5)• Polaridad
El espectro UV cercano de proteínas NOes la suma de los espectros de los aminoácidos(!)Hay info… ¿se puede usar?
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0,35
0,4
0,45
0,5
250 260 270 280 290 300 310 320
Ab
s
Long. de onda (nm)
BSA Mezcla equimolar Tyr + Trp
Transiciones en el benceno prohibida por simetría
a2u
b2g
e2u
e1g
→ (e1g)3(e2u)
1h𝜈
La transición de menor energía en el benceno está “prohibida por simetría (!)• La transición
electrónica “pura” tiene muy poca intensidad
• Se magnifican las transiciones vibriónicas(vibracionales + electrónicas)
• La estructura fina de la banda tiene info de vibraciones (!)
Buscando información bajo el espectro
• “Estructura fina” → variaciones rápidas sobre una envolvente suave
• Se pueden magnificar aplicando derivadas
• Las derivadas pares dan máximos en los máximos de las bandas finas
Las derivadas también ayudan a sacarse de encima las líneas de base
• Dispersión
• Ácidos nucleicos(!)
In real life
• Espectros de BSA y de mezcla equimolar
• Se independiza de línea de base
• BSA → Tyr y Trp en ambientes varios
• Corrimiento de los máximos al rojo
• Dispersión de las bandas de estructura fina
In real life• Complejo de proteínas
• Espectro aburrido
• Las fenilalaninas saludan desde la derivada segunda
Para recordar
• Los cromóforos aromáticos de las biomoléculas tienen bandas de absorción en el UV cercano (240 nm - 340 nm)• Ácidos nucleicos → bases nitrogenadas (¡las 5!)• Proteínas → AA aromáticos: Phe, Tyr, Trp (F, Y W)
• La absorción se puede utilizar para cuantificar en forma directa y con precisión la concentración de prots y ácidos nucleicos
• Los espectros tienen info estructural• Hibridación en ácidos nucleicos• Entorno de aromáticos en proteínas
• Si van a usar espectrofotometría UV para cuantificar proteínas o ácidos nucleicos, no se limiten a medir A260 o A280… ¡HAGAN ESPECTROS!• Verifiquen que lo que absorbe a 280 o 260 es proteína o ácido nucleico (forma del espectro) y
no otra cosa (dispersión, contaminantes)• En proteínas, espectros de derivada → huella dactilar