Post on 19-Jan-2016
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El Centro Activo Enzimático
- La evidencia cinética lleva a concluir que las enzimasfuncionan a través de la formación de un complejo ES
- El complejo ES es estequiométrico: existe una relaciónentera entre número de moléculas de enzima y número demoléculas de substrato (1:1, 1:2, etc)
-La fijación de S a E es estereoquímicamente específica, y Spuede ser desplazado de su fijación por análogos estructurales(inhibidores competitivos)
-De todo lo cual se deduce que el substrato se fija a una regiónespecífica de la molécula enzimática, llamada Centro Activo
Pruebas experimentales de la existencia del Centro Activo, 1
1. Formación de complejo ES evidenciable cinéticamente
2. Presencia de grupos prostéticos que participan en la catálisis
3. Fenómeno de la inhibición competitiva y efecto de los análogos de estado de transición
4. Efecto de inhibidores irreversibles:
- Organofosfóricos sólo reaccionan con Serina “activa”- Clorometilcetonas sólo reaccionan con Histidina “activa”
Pruebas experimentales de la existencia del Centro Activo, 2
5. Estudios filogenéticos en secuencias de aminoácidos en enzimas
Tripsina CQGDSGGPVQuimotripsina CMGDSGGPLElastasa CQGDSGGPLTrombina CEGDSGGPFPlasmina CQGDSGGSWPr. Sorangium GRGDSGGSTPr. St.griseus CQGDSGGPV
Pruebas experimentales de la existencia del Centro Activo, 3
6. Estudios de fijación de análogos de substrato marcados
7. Estudios estructurales por cristalografía de rayos X de enzimas cocristalizadas con su substrato (p.e., lisozima)
8. Otras técnicas físicas (RMN, RSE, polarización de fluorescencia)
Lisozima y susubstrato
Número de centros activos
1. Estudios de fijación de ligandos2. Número de grupos prostéticos3. Reactivos específicos de centro activo (Organofosfóricos)4. Titulación directa del centros activos
Estudio de fijación de ligandos
Consisten en incubar la enzima con un análogo del substratodebidamente marcado (radioactivo, fluorescente, etc.), a dife-Rentes concentraciones de ligando.
Ligando libre y ligando unido pueden separarse por:
- Diálisis de equilibrio- Ultrafiltración- Cromatografía de exclusión en gel.
Aminoácidos presentes en el centro activo de enzimas
- Serina: enzimas inhibidas por organofosfóricos- Histidina: enzimas inhibidas por clorometilcetonas- Cisteína: enzimas inhibidas por reactivos –SH- Lisina: enzimas que forman bases de Schiff- Aspartato y Glutamato: dependencia de pH
Mecanismos de acción enzimática, 1
1. Efectos de proximidad y orientación
Las enzimas logran en su centro activo una concentraciónlocal de reactivos mucho mayor que cuando éstos estánen solución (efecto de proximidad)
Además, la fijación al centro activo se hace en la orienta-ción correcta (efecto de orientación)
Colisiónproductiva
Colisionesno productivas
En la superficie de la enzima, los reactivos se encuentranen la orientación correcta y auna concentración local muchomayor que en solución
Mecanismos de acción enzimática, 2
2. Catálisis general ácido-base
3. Formación de intermediarios covalentes
4. Otros efectos (efectos cuánticos, por ejemplo)
O
O
PO CH2
O
O
PO CH2
O
O
PO CH2
OH
OH
OH
B
Py
B
O
O
O
O-
O-
O-
HN NH+
:N NHNH3
+
His 12
His 119
Lys 41
O
O
O
O
PO CH2
OH
O
B
PyOO-
PO
O
O
O
PO CH2
CH2
OH
B
OO-
H
HN N:
HN NHNH3
+
His 12
His 119
Lys 41 +
Mecanismo de la ribonucleasa pancreática, 1
O
O
O
PO CH2
OH
B
PyOO-
O OP-O O
HN N:
HN NHNH3
+
His 12
His 119
Lys 41
O
O
PO CH2
HOCH2
OH
B
OO-
+
HO
H
O
O
O
PO CH2
OH
B
PyOO-
HO O
P O-O
O-
HN NH+
:N NHNH3
+
His 12
His 119
Lys 41
O
O
PO CH2
HOCH2
OH
B
OO-
Mecanismo de la ribonucleasa pancreática, 2
CH2
OH
CH
Ser
:N NH
CH2
CH His
C
-O O
CH
R C NH R'
OAsp
CH2O-
CH
Ser
HN NH
CH2
CH His
C
-O O
CH
R C NH R'
O
+
Asp
1 2
Mecanismo de las serinproteinasas
Ser
HN NH
CH2
CH His
C
-O O
CH
R C NH R'
CH2
O
CH
O-
+
Asp
Ser
:N NH
CH2
CH His
C
-O O
CH
CH2
O
CH
CO
R NH2 R'
Asp
3 4
Mecanismo de las serinproteinasas
Ser
:N NH
CH2
CH His
C
-O O
CH
CH2
O
CH
CO
R
Asp
OHH
Ser
HN NH
CH2
CH His
C
-O O
CH
CH2
O
CH
CO
R
Asp
H-O
+
65
Mecanismo de las serinproteinasas
Ser
HN NH
CH2
CH His
C
-O O
CH
CH2O-
CH
Asp
+
R CO
OH
Ser
:N NH
CH2
CH His
C
-O O
CH
CH2
OH
CH
Asp
87
Mecanismo de las serinproteinasas
His 57Asp 102
Ser 195
Configuración en el centroactivo de la Quimotripsina,con un inhibidor