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Cromatografía postgrado. JAP

TEMA XXIVTEMA XXIV

CROMATOGRAFÍA DE GASES Y DE CROMATOGRAFÍA DE GASES Y DE LÍQUIDOS DE ALTA RESOLUCIÓNLÍQUIDOS DE ALTA RESOLUCIÓN

CURSO DE POSTGRADOCURSO DE POSTGRADO

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TEMA XXIV

Aplicaciones II.

Separación de mezclas complejas: Programación de temperatura y trabajo en gradiente.

Técnica de reciclaje.

Enriquecimiento de trazas.

Confección de metódicas de trabajo y su optimización.

Selección del tipo de cromatografía a emplear.

Ejemplos de aplicación.

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En cromatografía, los problemas analíticos más difíciles de resolver son las matrices de muestra que se pueden tipificar así:

a) pocos analitos y muy similares en propiedades como isómeros cis-trans, o-m-p, homólogos de grupos funcionales iguales, enantiómeros o diastereómeros.

b) muchos analitos y muy dispares en propiedades como aguas de desecho, petróleos, un hidrolizado de péptidos, complejos vitamínicos...

SEPARACIÓN DE MUESTRAS COMPLEJAS

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Caso práctico a.

Separación de enantiómeros.

En las separaciones difíciles que consisten en pocos analitos pero muy semejantes y, por tanto, de difícil separación, se debe manejar preferentemente la naturaleza de la fase estacionaria aunque también el ajuste fino de las condiciones: pH, composición de la fase móvil, fuerza iónica, temperatura, etc, tiene lógicamente su influencia ya que el reconocimiento quiral para conseguir suficiente resolución requiere interacciones altamente específicas.

MUESTRAS DE ALTA DIFICULTAD

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Importancia de la separación quiral :

• 60% de los fármacos son quirales.

• 40% de los fármacos quirales se venden como racémico.

• Normalmente sólo uno de los enantiómeros es biológicamente activo. La interacción con receptores o enzimas también quirales hacen que haya diferencias en la absorción, distribución y metabolismo.

• En algunos casos, incluso, uno de los enantiómeros es tóxico.

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Dificultad de la separación :

• Propiedades iguales dificultan la separación.

• Métodos indirectos como la reacción con un reactivo quiral(resolución del racémico) son laboriosos y a veces pueden ser reversibles.

• Por HPLC especial se puede conseguir la separación en muchas ocasiones, tanto analítica como preparativa.

• No todos los racémicos pueden separarse en una columna quiral dada. Elegir la columna adecuada a un caso no es un problema sencillo. No existe una fase estacionaria universal por lo que deben hacerse aproximaciones manejando como criterios: la interacción electrostática y el factor estérico.

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COMPLEJOS DE AFINIDAD PARA AMINOÁCIDOS

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ENANTIÓMEROS FRENTE A FASES ESTACIONARIAS QUIRALES

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Mecanismo de interacción atribuido al proceso de reconocimiento quiral en las columnas tipo Pirkle

sílica

Geometría

Mapa de potenciales

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O H

ON

HH

CH3

O

NH

OH

HSÍLICA**

OH

NH

O H*

COMPLEJO DE AFINIDAD DE UNA FASE ESTACIONARIA QUIRAL CON UNO DE LOS ENANTIÓMEROS ANALITO S

R

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Diversos tipos de fragmentos quirales activos enlazados a sílica y/o presentando además grupos polares, aromáticos e hidrógenos activos para adaptarse a la geometría y potenciales de un enantiómero mediante las interacciones:

• Dipolo-dipolo

• π/π

• Puentes de hidrógeno

• Impedimento estérico

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Triptofano *

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CICLODEXTRINAS

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Las ciclodextrinas son producidas por la acción de la enzima ciclodextrin-glicosiltransferasa sobre el almidón.

Son oligómeros cíclicos de unidades de glucosa α-(1,4)-enlazadas con una geometría y polaridad definidas. Contienen de 6 a 12 unidades y las de 6(α), 7(β) y 8(γ) son las más comunes.

La cavidad interior resulta ser más hidrofóbica por lo que tiene a retener en ella compuestos no polares mientras que la exterior es compatible con medios acuosos.

8 7 6

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COMPLEJOS DE INCLUSIÓN EN UNA CAVIDAD (CICLODEXTRINAS)

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Caso práctico b.

Muchos analitos de propiedades muy dispares.

Muestras complejas con componentes que difieren en polaridad, constantes físicas, tamaño molecular, geometrías, grupos funcionales y distinta afinidad por la fase estacionaria.

MUESTRAS DE ALTA DIFICULTAD

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Acetonitrilo/agua (90:10)

Acetonitrilo/agua (65:35)

Acetonitrilo/agua (50:50)

Cromatogramas de una mezcla según condiciones cromatográficas:

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MEZCLAS COMPLEJASFU

ERZA D

EL

DIS

OLV

EN

TE O

TEM

PERATU

RA

BAJA

ALTA

INTERMEDIA

PROGRAMADA

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Actuación:

Poder de elución: capacidad impulsora de la fase móvil sobre los solutos de la muestra retenidos por la fase estacionaria.

El poder de elución puede aplicarse con INTENSIDAD:

• CONSTANTE

• VARIABLE.

MUESTRAS DE ALTA DIFICULTAD

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Técnica: incremento gradual y progresivo del poder de elución a lo largo del tiempo de análisis por modulación de la variable adecuada.

Variable de regulación del poder de elución :

• TEMPERATURATEMPERATURA en COMATOGRAFÍA DE GASES

• FUERZA DEL ELUYENTEFUERZA DEL ELUYENTE en CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS

Resultado: adecuación del poder de elución a las características de cada componente de la muestra.

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TIEMPO

TEM

PER

ATU

RA

PERFIL TÍPICO DE UN TRABAJO CON TEMPERATURA PROGRAMADA EN CROMATOGRAFÍA DE GASES

pre

acondic

ionam

iento

inye

cció

nis

ote

rma

infe

rior

gra

die

nte

isote

rma

super

ior

enfr

iam

iento

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CROMATOGRAFÍA DE GASES CAPILAR DE UNA GASOLINA

PROGRAMA:

25

isoterma

100

210

265

CGAR DE ESTEROIDES Tprogramada

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10ºC/min 10,5ºC/min

CROMATOGRAFÍA DE GASES CAPILAR

A TEMPERATURA PROGRAMADA

AROMÁTICOS Y FENOLES

50

130

225

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CROMATOGRAFÍA DE GASES BIDIMENSIONAL

Otras alternativas innovadoras para muestras complejas:

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PODER DE ELUCIÓN LINEAL

PODER DE ELUCIÓN CONVEXO

(mayor poder de elución al principio)

PODER DE ELUCIÓN CÓNCAVO

(mayor poder de elución al final)

% C

OM

PO

NEN

TE M

AY

OR

FU

ER

ZA

DE E

LU

CIÓ

N

TIEMPO

Selección rápida de un perfil de elución

TRABAJO CON GRADIENTE EN CLAR

30

%MeOHSEPARACIÓN DE SEPARACIÓN DE AMINOÁCIDOS AMINOÁCIDOS

CON GRADIENTE CON GRADIENTE DE DE MeOHMeOH/H/H22O O

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isoterma isoterma isotermarampa rampa

31

100

50

0

% acetonitrilo

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CLOROFENOLES RESIDUOS DE PESTICIDAS

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SITUACIONES EXTREMAS DE BAJA RESOLUCIÓN

1. DISPOSICIÓN DE COLUMNAS EN SERIE1. DISPOSICIÓN DE COLUMNAS EN SERIE

En cromatografía de gases capilar, donde la permeabilidad es alta, pueden conectarse columnas para aumentar la resolución.

En cromatografía líquida la permeabilidad es menor por el relleno pero columnas ultrarápidas y cortas pueden conectarse en serie con gran eficacia.

2. TÉCNICA DEL RECICLAJE2. TÉCNICA DEL RECICLAJE

Ya en desuso por el gran ensanchamiento de pico que produce, repite el efecto separador de una columna haciendo pasar por ella repetidas veces la muestra.

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EFECTO SEPARADOR DEL RECICLADO

1 2 3 4 5 6 7 8

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BOMBA AUXILIAR

BOMBA PRINCIPAL

BOMBA AUXILIAR

BOMBA PRINCIPAL

COLUMNA DE RETENCIÓN

COLUMNA DE RETENCIÓN

COLUMNA DE SEPARACIÓN

COLUMNA DE SEPARACIÓN

INTRODUCCIÓN DE MUESTRA

POSICIÓN DE CARGA

desecho

desecho

ENRIQUECIMIENTO DE TRAZAS

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PLANIFICACIÓN DE ESTRATEGIAS DE ACTUACIÓN

Estudio virtual de casos prácticos:

A) Para CG se proponen las actuaciones para la resolución de un supuesto de diseño de una rutina afín como una variante de un problema conocido.

B) Para CL se estudia el tratamiento general a aplicar a un problema nuevo.

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CG: VARIANTE DE UN PROBLEMA CONOCIDO

Equipo preestablecido de CGAR:

• columna

• detector

• inyector

Variables a ensayar ajuste:

• gas portador

• presión/velocidad de flujo

• temperaturas:

• horno columna (¿programada?)

• detector

• inyector

• tamaño de muestra

• inyección (con/sin división, focalización)

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1. Programar la secuencia de cambios a realizar.

2. Marcar los intervalos lógicos en los que deben ensayarse variables y elegir el valor óptimo dentro del intervalo.

3. No debe cambiarse más de una variable a la vez. Seguir un orden secuencial preestablecido.

4. Las variaciones ensayadas no deben nunca ser muy grandes pues se puede perder el máximo del efecto producido:

5. Anotar todas las modificaciones y el efecto causado para extraer conclusiones.

*

*

u_

AEPT

variable

efe

cto *

*

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CL: TRATAMIENTO GENERAL PARA UN NUEVO ANÁLISIS

En el estudio previo de la muestra deben tenerse en cuenta las siguientes consideraciones para el diseño del sistema:

1. Estudio de la solubilidadsolubilidad. Ensayo de la serie eluotrópica como aproximación a la polaridad de la muestra:

Hexano/tolueno/cloroformo/THF/acetonitrilo/MeOH/agua

2. Intervalo de pesos molecularespesos moleculares (¿PSG útil como analítica

o como preparación de muestra?).

3. Conocimiento de grupos funcionalesgrupos funcionales (¿acidez, basicidad,ionizable, neutro?).

4. Naturaleza de la matrizmatriz en la que está la muestra (cantidad, impurezas, concentración).

5. Diferencias o similitudes estructuralesestructurales entre los componentes.

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CII = intercambio iónico

CET = exclusión por tamaño

CIP = par iónico

CFE = fase enlazada

CSL = sólido-líquido (adsorción)

ELECCIÓN DEL TIPO DE CROMATOGRAFÍA

MUESTRA

6.

40

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41

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42

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7. Elección del sistema de detección adecuado a la muestra: grupos cromóforos, fluorescentes, iónicos, átomos electronegativos, moléculas voluminosas, enlaces C-H,etc...

8. Sondeo bibliográfico orientativo.

9. Optimización de la metódica en cuanto a:

• Tiempos de retención (ajuste 2 < k’ < 8)

• Selectividad (separación)

• Eficacia (forma picos)

• Resolución

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ESTRATEGIA EXPERIMENTAL DE APROXIMACIÓN

ENSAYO

PLANIFICACIÓN TEÓRICA

CORRECCIÓN DE ERROR

VALORACIÓN

ÉXITO

ERROR

1

23

4

5

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ACCIONES A CONSIDERAR PARA INCREMENTAR LA RESOLUCIÓN

1. Aumentar la longitud de la columna.

2. Disminuir el diámetro interior de la columna.

3. Comprobar si la velocidad de flujo es correcta.

4. Revisar el estado del empacamiento de la columna.

5. Elegir un empacado uniforme y esférico (tamaño!).

6. Disminuir el tamaño de muestra introducido.

7. Seleccionar la fase estacionaria adecuada.

8. Seleccionar la fase móvil apropiada:

(naturaleza, proporción y pH).

9. Asegurarse de que la presión es la adecuada.

10. Usar un gradiente de elución.

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Las características de las partículas empleadas y su empaquetamiento, la calidad de la columna, son factores críticos para la resolución:

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THF/H2O (28:72) MeOH/H2O (58:42) CH3CN/H2O (38:62)

EFECTO DE LA VARIACIÓN DE LA FASE MÓVIL

INYECCIÓN INYECCIÓN INYECCIÓN

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EFECTO DE LA VARIACIÓN DE LA FASE ESTACIONARIA

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C18 fenilo

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EFECTO DE LA VARIACIÓN DE LA FASE ESTACIONARIA

ciano fenilo

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TRABAJO BIBLIOGRÁFICO

(1 crédito)

• Innovación de equipos

• Condiciones de trabajo

• Confección metódica

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