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CONTRIBUCIÓN AL ESTUDIO DE ALGUNOS COMPONENTES
BIOQUÍMICOS Y MOLECULARES DE LA RESISTENCIA DEL CLAVEL (Dianthus
caryophyllus L) AL PATÓGENO Fusarium oxysporum f. sp. dianthi.
Harold Duban Ardila Barrantes
Universidad Nacional de Colombia
Facultad de Ciencias, Departamento de Química
Bogotá, Colombia
2013
CONTRIBUCIÓN AL ESTUDIO DE ALGUNOS COMPONENTES
BIOQUÍMICOS Y MOLECULARES DE LA RESISTENCIA DEL CLAVEL (Dianthus
caryophyllus L) AL PATÓGENO Fusarium oxysporum f. sp. dianthi.
Harold Duban Ardila Barrantes Ms Sc
Tesis de investigación presentada como requisito parcial para optar al título de Doctor en
Ciencias-Química
Directora:
Dra. Blanca Ligia Higuera Mancipe
Codirectora:
Ms Sc. Sixta Tulia Martínez Peralta
Línea de Investigación:
Bioquímica de las interacciones hospedero-patógeno
Grupo de Investigación:
Estudio de Actividades Metabólicas Vegetales
Universidad Nacional de Colombia
Facultad de Ciencias, Departamento de Química
Bogotá, Colombia
2013
Contribución al estudio de algunos mecanismos bioquímicos y moleculares de la
resistencia del clavel a Fusarium oxysporum f. sp. dianthi raza 2
A mis padres Gilberto y Ana
A mis hermanas Diana y Maria Isabel
A mis sobrinos Laura Valentina, Sara Daniela
y Andres Felipe
Contenido V
Agradecimientos
A DIOS, porque me ha mostrado el camino correcto y ha permitido que culmine con éxito ésta
importante etapa profesional y personal.
A MIS PADRES, quienes siempre me han acompañado en los momentos fáciles y difíciles,
brindándome siempre todo su apoyo. Lo que soy en este momento se lo debo completamente.
A mis hermanas Diana y Maria Isabel y sobrinos Laura Valentina, Sara Daniela y Andrés Felipe,
por estar conmigo de manera incondicional
A LA UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA, Por permitir mi formación al más alto nivel y
darme un sinnúmero de oportunidades para crecer personal y profesionalmente. Muchas gracias
alma mater!! Siempre buscare tu bienestar y contarás con mi más profunda lealtad. A LA
FACULTAD DE CIENCIAS Y AL DEPARTAMENTO DE QUÍMICA, por la comisión de estudios
otorgada y permitir terminar esta importante etapa académica y personal.
A COLCIENCIAS Y A LA DIVISIÓN DE INVESTIGACIONES DE LA UNIVERSIDAD NACIONAL,
Por la financiación de los diferentes proyectos que permitieron llevar este trabajo a buen término y
la financiación de mi pasantía de investigación
A LA PROFESORA BLANCA HIGUERA, mi maestra, solo tengo palabras de agradecimiento y
estima. Muchas gracias por su acompañamiento, dirección y asesoría de este trabajo. Muchas
gracias por enseñarme que se puede ser un académico con altas virtudes profesionales, sin
olvidar las personales.
A LA PROFESORA SIXTA TULIA, no solo por su dedicación, asesoria y acertados consejos,
sino por su apoyo incondicional personal y profesional en todo este largo proceso.
AL GRUPO DE INVESTIGACIÓN ESTUDIO DE CAMBIOS QUÍMICOS y BIOQUÍMICOS EN
ALIMENTOS FRESCOS Y PROCESADOS, dirigido por la profesora Patricia Restrepo, por
facilitarme el uso del equipo HPLC-UV. A Mauricio Espinal, por sus valiosos consejos
Contribución al estudio de algunos mecanismos bioquímicos y moleculares de la
resistencia del clavel a Fusarium oxysporum f. sp. dianthi raza 2
AL GRUPO DE INVESTIGACIÓN ESTUDIO QUÍMICO Y DE ACTIVIDAD DE RUTÁCES Y
MIRISTICACEAS COLOMBIANAS, dirigido por el profesor Enrique Cuca, por facilitarme el uso
del equipo HPLC-DAD. A Wilman Delgado por sus observaciones
AL ÁREA DE BIOQUÍMICA, por el uso de los diferentes equipos que hacen parte del programa
de Doctorado en Ciencias-Bioquímica. AL IBUN (Instituto de Biotecnología de la Universidad
Nacional de Colombia), en especial al profesor Fabio Aristizabal e Ivonne García por el apoyo al
inicio de esta investigación en los experimentos de realtime PCR
AL LABORATORIO DE HPLC-MS DEL DEPARTAMENTO DE QUÍMICA, en especial a Angélica
Urrea por su asesoría.
AL GRUPO DE INVESTIGACIÓN DE BIOQUÍMICA Y PROTEÓMICA VEGETAL Y AGRÍCOLA
de la Universidad de Córdoba en España, por todo lo que aprendí durante la estancia que
realice. En especial al profesor Jesús, Raquel, José, Inma, Ana, Maricarmen y Lyudmila, por
permitirme integrarme al grupo y hacerme parte de la familia. AL SCAI Servicio Central de
Apoyo a la Investigación de la Universidad de Córdoba (España) por los análisis de huella
peptídica
A LOS INTEGRANTES DEL GRUPO DE INVESTIGACIÓN ESTUDIO DE ACTIVIDADES
METABÓLICAS VEGETALES, que pasaron por estos años y brindarme su apoyo y amistad:
Roquesa Mayorga, Obradith Caicedo, Patricia Martínez, Angélica Torres, Mayra Arrieta, María
Mercedes Arias, Katherine León, Jenny Martín, Carolina Cuellar, Edilene Ramírez y Alejandra
Castro
A Enrique Gómez y Juliana Barrios, por el apoyo en correcciones de forma y formato del escrito
final
A Mónica Avila, Carolina Chegwin y Nohora Vega, por su constante e incondicional amistad.
A las profesoras Laura Ortiz y Constanza López por la voz de aliento constante y apoyo durante
este tiempo
A Enrique Gómez, Sergio Acevedo, Jonb García, Laura Cerón, Olga Avila, Juliana Barrios, por su
gran apoyo, colaboración y amistad.
Resumen y Abstract IX
Resumen
En esta investigación se abordó el estudio de algunos fenómenos bioquímicos y moleculares que
demostraron tener participación en las características de resistencia, tanto pasiva como activa, de
variedades de clavel (Dianthus caryophyllus L.) al patógeno Fusarium oxysporum f. sp. dianthi,
causante del marchitamiento vascular, la enfermedad más limitante en este cultivo. Los hallazgos
obtenidos, después de realizar diversos estudios comparativos referentes a metabolitos
secundarios fenólicos, a las actividades de enzimas que participan en su biosíntesis, así como de
sus niveles de mRNA cuantificados por PCR en tiempo real, permitieron establecer que la
biosíntesis de flavonoides es un proceso bioquímico que está correlacionado positivamente con la
resistencia del clavel. Aumentos observados en los niveles de H2O2, molécula señal de particular
importancia en defensa vegetal, se asociaron con la activación de la transcripción de genes de
chalcona sintasa, chalcona isomerasa y de una peroxidasa de clase III, indicando un papel
importante de estas enzimas y de esta especie reactiva en este modelo. Adicional a esta dinámica
encontrada en procesos del metabolismo secundario, se plantea la participación de diversas
proteínas involucradas en diversos procesos celulares, las cuales, a través de la evaluación
proteómica realizada, mostraron incrementos en la variedad resistente como es el caso de las que
intervienen en metabolismo de carbohidratos, mantenimiento estructural de proteínas, biosíntesis
de etileno y traducción de mRNA para la síntesis de proteínas. Se destaca además a nivel
constitutivo, la presencia de una candidata a proteína de resistencia que presenta un dominio NB-
ARC, altamente conservado en proteínas de este tipo. La elucidación de estos fenómenos en esta
interacción planta-patógeno permitió comprobar la hipótesis de una regulación compleja espacio-
temporal de las respuestas de defensa y da fundamento para la postulación de los niveles de
flavonoides y enzimas como la chalcona sintasa y chalcona isomerasa, como probables
marcadores de resistencia en esta especie de particular importancia económica para Colombia.
Palabras claves: clavel, Fusarium oxysporum, flavonoides, proteómica, enzimas de la biosíntesis de flavonoides, transcripción de genes, resistencia vegetal.
Contribución al estudio de algunos mecanismos bioquímicos y moleculares de la
resistencia del clavel a Fusarium oxysporum f. sp. dianthi raza 2
Abstract
This research was conducted to study some biochemical and molecular involved in the resistance
characteristics, both passive and active, of carnation (Dianthus caryophyllus L.) cultivars to the
pathogen Fusarium oxysporum f. sp. dianthi, causal agent of vascular wilting, the most limiting
disease in this crop. The findings obtained after performing various comparative studies
concerning secondary metabolites, particulary phenolics, the activities of enzymes involved in their
biosynthesis, as well as mRNA levels quantified by real-time PCR, it was established that the
biosynthesis of flavonoids is a biochemical process positively correlated with the pathogen
resistance of carnation. An increase in the levels of H2O2, particularly important signaling molecule
in plant defense, is associated with activation of gene transcription of chalcone synthase, chalcone
isomerase and a class III peroxidase, indicating an important role of these enzymes and this
reactive species in this model. Additional to this dynamic processes found in secondary
metabolism, it is proposed the participation of several proteins involved in various cellular
processes, which, through proteomics evaluation performed, showed increases in the resistant
cultivar, as those involved in carbohydrate metabolism, protein structural maintenance, ethylene
biosynthesis and translation of mRNA to protein synthesis. It is established at constitutive level,
the presence of a candidate resistance protein with a NB-ARC domain, highly conserved in this
kind of proteins. The elucidation of these phenomena in this plant-pathogen interaction, allowed
proving the hypothesis of a complex spatio-temporal regulation of defense responses and allows
us to postulate that levels of flavonoids and enzymes such as chalcone synthase and chalcone
isomerase, could be probable resistance markers in this particular specie of economic significance
for Colombia.
Key words: carnation, Fusarium, flavonoide, proteomic, flavonoide biosynthesis enzymes, gene transcription, resistance
XI
Contenido
CONTENIDO XI
LISTA DE FIGURAS XVI
LISTA DE TABLAS XX
LISTA DE SÍMBOLOS Y ABREVIATURAS XXII
INTRODUCCIÓN 25
Objetivo General 31
Objetivos Específicos 31
1. ESTADO ACTUAL DEL TEMA 33
1.1. Interacción planta-patógeno 33
1.2. Resistencia y susceptibilidad 36
1.3. Reconocimiento y señalización 38
1.4. Mecanismos de defensa vegetal 41
1.4.1. Defensa vegetal pasiva o preexistente 41
1.4.2. Defensa vegetal dinámica o inducible 44
1.5. Metabolismo secundario y defensa vegetal 47
1.5.1. Ruta fenilpropanoide 48
1.5.2. Flavonoides 51
1.6. Actividad antioxidante 57
1.7. Estudios de niveles transcripcionales en modelos planta-patógeno 60
XII Contribución al estudio de algunos mecanismos bioquímicos y moleculares de la
resistencia del clavel a Fusarium oxysporum f. sp. dianthi raza 2
Título de la tesis o trabajo de investigación
1.8. Estudios proteómicos comparativos en modelos de interacción planta-
patógeno 61
1.9. Modelo experimental Dianthus caryophyllus L - Fusarium oxysporum f. sp.
dianthi raza 2 62
1.9.1. El hospedero: Clavel Dianthus caryophyllus L. 62
1.9.2. El patógeno: Fusarium oxysporum f. sp. dianthi 62
1.9.3. El marchitamiento vascular del clavel 63
1.9.4. Resistencia al marchitamiento vascular 65
2. BIOSÍNTESIS CONSTITUTIVA DE FLAVONOIDES EN EL CLAVEL Y SU
RELACIÓN CON RESISTENCIA A Fusarium oxysporum f. sp. dianthi 71
Resumen 71
Abstract 72
2.1. Introducción 72
2.2. Materiales y métodos 75
2.2.1. Material vegetal 75
2.2.2. Selección de condiciones de extracción de compuestos polifenólicos a partir de
tallos y raíces de clavel 75
2.2.3. Contenido de fenoles totales 76
2.2.4. Determinación de flavonoides totales 77
2.2.5. Inactivación del radical ABTS 77
2.2.6. Captación del radical DPPH 77
2.2.7. Preparación de extractos enzimáticos 78
2.2.8. Determinaciones de actividad enzimática 79
2.2.9. Cuantificación por PCR en tiempo real 80
2.2.10. Análisis estadístico 82
2.3. Resultados y Discusión 82
2.3.1. Selección de condiciones de extracción de compuestos polifenólicos a partir de
tallos y raíces de clavel 82
2.3.2. Determinación de niveles constitutivos de fenoles, flavonoides y actividad
antioxidante en diferentes variedades de clavel 84
2.3.3. Niveles constitutivos en raíces de clavel de enzimas involucradas en biosíntesis
de flavonoides 88
2.3.4. Análisis de correlación de Pearson 92
2.3.5. Análisis de componentes principales PCA 94
2.4. Conclusiones 97
Contenido XIII
3. BIOSÍNTESIS DE METABOLITOS FENÓLICOS EN CLAVEL DURANTE SU
INTERACCIÓN CON Fusarium oxysporum f. sp. dianthi 99
Resumen 99
Abstract 100
3.1. Introducción 101
3.2. Materiales y Métodos 103
3.2.1 Material biológico 103
3.2.2. Evaluación de parámetros asociados con la biosíntesis de flavonoides durante la
infección con el patógeno 103
3.2.3 Proceso de Inoculación 104
3.2.4. Evaluación de compuestos fenólicos, flavonoides y actividad antioxidante 105
3.2.5. Comparación de perfiles cromatográficos por HPLC 106
3.2.6. Aproximación a la estructura química de algunos compuestos de interés. 107
3.2.7. Evaluación de actividades enzimáticas 107
3.2.8. Evaluación de niveles transcripcionales 108
3.3. Resultados y Discusión 108
3.3.1 Evaluación de incidencia del marchitamiento vascular causado por Fusarium
oxysporum f. sp. dianthi raza 2 en las dos variedades de clavel 110
3.3.2. Evaluación de niveles de fenoles, flavonoides y actividad antioxidante durante la
interacción con el patógeno 113
3.3.3. Comparación de perfiles obtenidos por HPLC y análisis cuantitativo de
compuestos tipo flavonoide en raíces de clavel, durante la infección con Fod 125
3.3.4. Aproximación a la estructura química para compuestos probablemente
asociados a la resistencia del clavel 141
3.3.5. Evaluación de los niveles de actividad y transcripcionales para las enzimas PAL,
CHS y CHI, en raíces y tallos de clavel durante la interacción con Fod 155
3.4. Conclusiones 179
4. EVIDENCIAS BIOQUÍMICAS Y MOLECULARES DE LA PARTICIPACIÓN DE
PEROXIDASAS EN LA RESISTENCIA DEL CLAVEL (Dianthus caryophyllus L) A
Fusarium oxysporum f. sp. dianthi 181
Resumen 181
Abstract 182
4.1. Introducción 183
4.2. Materiales y Métodos 185
4.2.1. Material biológico y ensayo in vivo 185
XIV Contribución al estudio de algunos mecanismos bioquímicos y moleculares de la
resistencia del clavel a Fusarium oxysporum f. sp. dianthi raza 2
Título de la tesis o trabajo de investigación
4.2.2. Extracción y determinación de las actividades Guayacol-peroxidasa (GPX) y
Ascorbato-peroxidasa (APX) 186
4.2.3 Determinación de peróxido de hidrógeno 187
4.2.4. Determinación de lignina 187
4.2.5 Zimogramas de peroxidasas 187
4.2.6. Niveles transcripcionales de peroxidasas de clase III 189
4.2.7. Análisis estadístico 190
4.3. Resultados y discusión 191
4.3.1. Evaluación de niveles constitutivos de las enzimas GPX y APX, en variedades
de clavel con diferentes niveles de resistencia al marchitamiento vascular 191
4.3.2. Evaluación de los niveles de peróxido de hidrógeno, APX y GPX, durante la
inoculación con el patógeno en tallos y raíces de clavel 193
4.3.3. Zimogramas de peroxidasas usando SDS-PAGE e IEF 203
4.3.4. Niveles transcripcionales de peroxidasas de clase III 206
4.4. Conclusiones 212
5. APROXIMACIÓN PROTEÓMICA AL ESTUDIO DE LOS MECANISMOS DE
DEFENSA DEL MODELO CLAVEL-Fusarium oxysporum f. sp dianthi 215
Resumen 215
Abstract 216
5.1. Introducción 217
5.2. Materiales y métodos 219
5.2.1. Material Vegetal 219
5.2.2. Selección de condiciones de extracción 219
5.2.3. Selección de condiciones de separación en geles grandes 222
5.2.4. Análisis comparativo entre tratamientos usando electroforesis en 1D 225
5.2.5. Análisis comparativo entre tratamientos usando electroforesis 2D 226
5.2.6. Digestión de proteínas en gel e identificación de proteínas por MALDI-TOF/TOF
226
5.3. Resultados y Discusión 227
5.3.1. Selección de condiciones para la extracción y separación por electroforesis en
1D y 2D de proteínas presentes en tallos y raíces de clavel 227
5.3.2. Análisis comparativo entre tratamientos usando 1-DE 236
5.3.3. Análisis comparativo entre tratamientos usando electroforesis en 2D 245
5.3.4. Resultados de la identificación de proteínas por MALDI-TOF/TOF 258
5.3.5. Análisis de los resultados de identificación 261
Contenido XV
5.4. Conclusiones 267
6. DISCUSIÓN FINAL 269
BIBLIOGRAFÍA 281
272
281
272
281
XVI Contribución al estudio de algunos mecanismos bioquímicos y moleculares de la
resistencia del clavel a Fusarium oxysporum f. sp. dianthi raza 2
Título de la tesis o trabajo de investigación
Lista de figuras
Figura No. 1. Representación esquemática de la ruta fenil propanoide y la vía de los
flavonoides. 50
Figura No. 2. Estructura del flavano (2-fenilbenzopirano) 51
Figura No. 4. Evaluación de diferentes métodos para la extracción de metabolitos a partir
de tallos y raíces de clavel. 83
Figura No. 5. Niveles de fenoles y flavonoides constitutivos en raíces y tallos de clavel de
variedades de dos fincas productoras ubicadas en diferentes municipios de la
sabana de Bogotá. 85
Figura No. 6. Niveles de actividad antioxidante constitutiva en raíces y tallos de clavel de
variedades de dos fincas productoras ubicadas en diferentes municipios de la
sabana de Bogotá. 87
Figura No. 7. Niveles de actividades enzimáticas a nivel de raíz en variedades de clavel
de dos fincas productoras ubicadas en diferentes municipios de la sabana de
Bogotá. 89
Figura No. 8. Niveles transcripcionales de genes codificantes para CHS y CHI a nivel de
raíz en variedades de clavel de dos fincas productoras ubicadas en diferentes
municipios de la sabana de Bogotá. 91
Figura No. 9. Análisis de componentes principales para metabolitos, actividades
enzimáticas y niveles transcripcionales para el metabolismo de flavonoides en raíces
de clavel. 95
Figura No. 10. Diagrama de flujo general para el estudio de parámetros asociados a la
biosíntesis de flavonoides en clavel durante la infección con el patógeno fod 104
Figura No. 11. Distribución de esquejes en el arreglo experimental completamente
aleatorizado planteado en el estudio de parámetros asociados a la biosíntesis de
fenólicos en clavel durante la infección con Fod 105
Figura No. 12. Fotografías del ensayo in vivo a las 2 horas posinoculación. 110
Figura No. 13. Incidencia del marchitamiento vascular causado por fod durante el ensayo
in vivo con las variedades estudiadas. 112
Figura No.14. Efecto de la inoculación del patógeno Fod en los niveles de compuestos
fénolicos totales y flavonoides totales presentes en raíces de clavel. 114
Contenido XVII
Figura No. 15. Efecto de la inoculación del patógeno fod en los niveles de actividad
antioxidante presente en raíces de clavel. 119
Figura No. 16. Efecto de la inoculación del patógeno Fod en los niveles de compuestos
fénolicos totales y flavonoides totales presentes en tallos de clavel. 121
Figura No. 17. Efecto de la inoculación del patógeno Fod en los niveles de capacidad
inactivación ABTS y capacidad inactivación DPPH. 123
Figura No. 18. Perfiles cromatográficos para extractos obtenidos a partir de raíces de
clavel de las variedades L.P.Candy y Tasman. 126
Figura No. 19. Perfiles cromatográficos por HPLC para extractos obtenidos a partir de
raíces de clavel de la variedad L.P. Candy. 129
Figura No. 20. Analisis de componentes principales para los resultados obtenidos durante
la separación de compuestos de tipo flavonoide en raíces de clavel inoculados con el
patógeno causal del marchitamiento vascular. 133
Figura No. 21. Variación en el contenido de los componentes F2, F3, F9 y F10 durante la
infección con el patógeno en las variedades resistente y susceptible. 134
Figura No. 22. Perfiles cromatográficos por HPLC con detección a 350 nm para extractos
obtenidos a partir de tallos de clavel de las variedades L.P. Candy y Tasman. 135
Figura No. 23. Análisis de componentes principales para los resultados obtenidos durante
la separación de compuestos de tipo flavonoide en tallos de clavel inoculados con el
patógeno causal del marchitamiento vascular. 140
Figura No. 24. Variación en el contenido de los componentes FT2 y FT6 durante la
infección con el patógeno en las variedades resistente y susceptible. 141
Figura No. 25. Comparación de la separación cromatografica obtenida mediante los
diversos tipos de análisis realizados HPLC-MS, HPLC.DAD y HPLC-UV. 142
Figura No. 26. Comparación del perfil de elución y el TIC para el análisis por HPLC-MS
de los extractos obtenidos de raíces de clavel. 148
Figura No. 27. Comparación del perfil de elución del ión m/z= 769 y el perfil de elución a
350nm para extractos obtenidos de raíces de clavel. 150
Figura No. 28. Especto de masas en modo SCAN para el compuesto FT6 presente en
tallos de clavel. 152
Figura No. 29. Niveles de actividad fenilalanina amonio liasa en raíces de clavel durante
el ensayo in vivo de inoculación con el patógeno Fod raza 2. 158
Figura No. 30. Niveles transcripcionales para genes codificantes para la enzima PAL en
raíces de clavel durante el ensayo in vivo de inoculación con el patógeno
Fod raza 2. 159
Figura No. 31. Niveles de actividad chalcona sintasa en raíces de clavel durante el
ensayo in vivo de inoculación con el patógeno Fod raza 2. 163
Figura No. 32. Niveles transcripcionales para genes codificantes para la enzima CHS en
raíces de clavel durante el ensayo in vivo de inoculación con el patógeno
Fod raza 2. 164
Figura No. 33. Niveles de actividad chalcona isomerasa en raíces de clavel durante el
ensayo in vivo de inoculación con el patógeno Fod raza 2. 167
XVIII Contribución al estudio de algunos mecanismos bioquímicos y moleculares de la
resistencia del clavel a Fusarium oxysporum f. sp. dianthi raza 2
Título de la tesis o trabajo de investigación
Figura No. 34. Niveles transcripcionales para genes codificantes para la enzima CHI en
raíces de clavel durante el ensayo in vivo de inoculación con el patógeno
Fod raza 2. 169
Figura No. 35. Niveles de actividad fenilalanina amonio liasa en tallos de clavel durante el
ensayo in vivo de inoculación con el patógeno Fod raza 2. 173
Figura No. 36. Niveles de actividad chalcona sintasa en tallos de clavel durante el ensayo
in vivo de inoculación con el patógeno Fod raza 2. 174
Figura No. 37. Niveles transcripcionales para genes codificantes para la enzima CHS en
raíces de clavel durante el ensayo in vivo de inoculación con el patógeno
Fod raza 2. 175
Figura No. 38. Niveles de actividad chalcona isomerasa en tallos de clavel durante el
ensayo in vivo de inoculación con el patógeno Fod raza 2. 177
Figura No. 39. Niveles de actividad enzimática constitutiva ascorbato peroxidasa y
guayacol peroxidasa en tallos y raíces de clavel con diferentes niveles de resistencia
al marchitamiento vascular. 192
Figura No. 40. Niveles de peróxido de hidrógeno en raíces de clavel durante el ensayo in
vivo de inoculación con el patógeno Fod raza 2. 194
Figura No. 41. Niveles de actividad guayacol peroxidasa y ascorbato peroxidasa en
raíces de clavel durante el ensayo in vivo de inoculación con el patógeno
Fod raza 2. 197
Figura No. 42. Niveles de peróxido de hidrógeno en tallos de clavel durante el ensayo in
vivo de inoculación con el patógeno Fod raza 2. 198
Figura No. 43. Niveles de actividad ascorbato peroxidasa en tallos de clavel durante el
ensayo in vivo de inoculación con el patógeno Fod raza 2. 200
Figura No. 44. Niveles de actividad guayacol peroxidasa en tallos de clavel durante el
ensayo in vivo de inoculación con el patógeno Fod raza 2. 200
Figura No. 45. Niveles de lignina en tallos de clavel durante el ensayo in vivo de
inoculación con el patógeno Fod raza 2. 202
Figura No. 46. Comparación de perfiles electroforéticos por SDS-PAGE de extractos de
peroxidasas obtenidos a partir de tallos de la variedad resistente L.P.Candy. 203
Figura No. 47. Comparación de perfiles electroforéticos por isoelectroenfoque de
extractos de peroxidasas obtenidos a partir de tallos de clavel de la variedad
resistente L.P. Candy. 204
Figura No. 48. Comparación de niveles transcripcionales por cuantificación relativa de
peroxidasas a nivel del tallo. 206
Figura No. 49. Motivos presentes en la proteína Dcprx 02 en Dianthus cayophyllus L. 207
Figura No. 50. Niveles de mRNA para la proteína Dcprx02 a nivel del tallo durante la
inoculación con Fusarium oxysporum f. sp. dianthi raza 2. 208
Figura No. 51. Electroforesis en 1D para los extractos obtenidos mediante los diferentes
procedimientos de extracción de proteína evaluados a partir de tallos y raíces de
clavel. 229
Figura No. 52. Electroforesis en 1D para los extractos obtenidos mediante el
procedimiento TCA/acetona/fenol a partir de tallos y raíces de clavel. 230
Contenido XIX
Figura No. 53. Electroforesis en 2D para los extractos obtenidos mediante el
procedimiento TCA/acetona/fenol a partir de tallos y raíces de clavel, con diferentes
cantidades de proteína total. 231
Figura No. 54. SDS-PAGE para la comparación de los métodos de tinción en extractos
obtenidos a partir de raíces de clavel. 233
Figura No. 55. Geles 2D de extractos obtenidos a partir de tallos y raíces de clavel bajo
las condiciones de separación seleccionadas. 235
Figura No. 56. Electroforesis 1D (SDS-PAGE) en geles grandes 20x20cm de proteínas
extraídas de raíces y tallos de clavel, usando el método TCA/acetona/fenol 237
Figura No. 57. Análisis estadístico por PCA y agrupamientos jerárquicos “hierarchical
clustering” para los resultados obtenidos en 1D a nivel de la raíz durante la infección
con el patógeno. 238
Figura No. 58. Análisis estadístico por PCA y agrupamientos para los resultados
obtenidos en 1D a nivel del tallo durante la infección con el patógeno. 243
Figura No. 59. Gel master definido por el programa PD-Quest para la comparación en
raíz y muestra de geles para los tratamientos T1 6hpi y T2 6hpi. 246
Figura No. 60. Análisis estadístico por PCA y agrupamientos para los resultados
obtenidos en 2D a nivel de la raíz durante la infección con el patógeno. 248
Figura No. 61. Gel máster con las manchas proteicas asociadas a diferencias a nivel
constitutivo entre las variedades de clavel L.P Candy y Tasman en raíces
(Grupo I). 250
Figura No. 62. Gel máster con las manchas proteicas que aumentaron en la variedad
resistente inoculada a las 6hpi con el patógeno en raíces (Grupo 2). 251
Figura No. 63. Gel máster con las manchas proteicas que disminuyeron su intensidad en
la variedad resistente inoculada a las 6 hpi con el patógeno en raíces (Grupo 3). 252
Figura No. 64. Gel máster definido por el programa PD-Quest para la comparación en
raíz y muestra de geles para los tratamientos T1 6hpi y T2 6hpi. 253
Figura No. 65. Análisis estadístico por PCA y agrupamiento para los resultados obtenidos
en 2D a nivel de la raíz durante la infección con el patógeno. 255
Figura No. 66. Gel máster con las manchas proteicas que aumentaron en la variedad
resistente inoculada a las 6hpi en tallo (Grupo 4). 256
Figura No. 67. Gel máster con las manchas proteicas que disminuyeron en la variedad
resistente inoculada a las 6hpi en tallo (Grupo 6). 257
Figura No. 68. Resumen de algunos de los mecanismos de defensa en células de raíces
de clavel durante la interacción con Fod. 277
Figura No. 69. Resumen de algunos de los mecanismos de defensa en células de raíces
de clavel durante la interacción con Fod. 278
XX Contribución al estudio de algunos mecanismos bioquímicos y moleculares de la
resistencia del clavel a Fusarium oxysporum f. sp. dianthi raza 2
Título de la tesis o trabajo de investigación
Lista de tablas
Tabla No. 1. Algunas fitoanticipinas encontradas en plantas de diversas especies
vegetales 43
Tabla No. 2. Presencia de algunas fitoalexinas reportadas en diversas familias de
plantas 46
Tabla No. 3. Ejemplo de algunos flavonoides involucrados en respuestas de defensa
activa 53
Tabla No. 4. Compuestos caracterizados en clavel (Dianthus caryophyllus L.) con
probable relación en los mecanismos de defensa ante Fusarium oxysporum f. sp.
dianthi. 67
Tabla No. 5. Condiciones evaluadas para la extracción de metabolitos a partir de tallos y
raíces de clavel. 76
Tabla No. 6. Lista de cebadores usados para la cuantificación por pcr en tiempo real de
los niveles de mRNA para los genes de biosíntesis de flavonoides. 82
Tabla No. 7. Coeficientes de correlación de pearson 93
Tabla No. 8. Lista de cebadores usados para la cuantificación por pcr en tiempo real de
los niveles de mRNA para los genes codificantes para fenilalanina amonio liasa 108
Tabla No. 9. Cortes transversales de tallos para las variedades de clavel estudiadas,
controles e inoculados a las 8 semanas posinoculación con Fod 113
Tabla No. 10. Comparación del contenido total inicial de compuestos con absorción a 350
nm, presentes en extractos obtenidos a partir de raíces de clavel de variedades
resistente y susceptible 127
Tabla No. 11. Variación del contenido total de “compuestos probablemente flavonoides”
(HPLC con detección a 350nm), en raíces de clavel a diferentes tiempos
posinoculación con el patógeno Fod raza 2. 130
Tabla No. 12. Variación del contenido de “compuestos probablemente flavonoides”
especificos (HPLC con detección a 350nm), en raíces de clavel a diferentes tiempos
posinoculación con el patógeno Fod raza 2. 131
Tabla No. 13. Comparación del contenido total inicial de compuestos con absorción a 350
nm, presentes en extractos obtenidos a partir de tallos de clavel de variedades
resistente y susceptible 136
Contenido XXI
Tabla No. 14. Comparación del contenido total inicial de compuestos de tipo flavonoide
en extractos obtenidos a partir de tallos de clavel de variedades resistente y
susceptible mediante método espectrofotométrico y HPLC 137
Tabla No. 15. Variación del del contenido total de compuestos tipo flavonoide (HPLC a
350nm), en tallos de clavel a diferentes tiempos posinoculación con el patógeno Fod
raza 2. 138
Tabla No. 16. Variación del contenido de compuestos tipo flavonoide especificos (HPLC a
350nm), en tallos de clavel a diferentes tiempos posinoculación con el patógeno Fod
raza 2. 139
Tabla No. 17. Resumen de los espectros UV (250-500nm) para los compuestos del grupo
I presentes en raíces de clavel, obtenidos mediante HPLC-DAD 143
Tabla No. 18. Resumen de formula molecular, estructura y absorción UV, para
flavonoides aislados de clavel 145
Tabla No. 19. Información obtenida de los análisis por HPLC-MS modo SCAN, de
extractos obtenidos a partir de raíces de clavel 149
Tabla No. 20. Resumen de los espectros UV (250-500nm) para los compuestos del grupo
II presentes en tallos de clavel, obtenidos mediante HPLC-DAD 151
Tabla No. 21. Cebadores usados para la cuantificación por pcr en tiempo real de los
niveles de mRNA para los genes de peroxidasas en clavel 190
Tabla No. 22. Análisis estadísticos de correlación de pearson entre las variables
evaluadas 209
Tabla No. 23. Rendimiento para los diferentes métodos de extracción de proteínas totales
en tallos y raíces de clavel 228
Tabla No. 24. Resumen de los resultados de la puesta a punto de condiciones de análisis
para la separación en 2D de proteínas obtenidas de tallos y raíces de clavel 234
Tabla No. 25. Resumen de las bandas que presentaron aumento en su intensidad en la
variedad resistente por efecto de la inoculación con el patógeno. 239
Tabla No. 26. Resumen de las diferencias cualitativas encontradas para las bandas 32,
39 y 55 entre inoculados y controles a 6 hpi a nivel de la raíz 240
Tabla No. 27. Identificaciones realizadas para la banda 55 tanto en el inoculado como en
el control no inoculado a las 6 hpi 242
Tabla No. 28. Banda que presentó cambios asociados con resistencia en la variedad L.P.
Candy a nivel del tallo 244
Tabla No. 29. Identificaciones realizadas para la banda 51 en tallos de la variedad
resistente L.P. Candy a las 24hpi con Fod 244
Tabla No. 30. Resumen de la variación en el número de manchas electroforéticas para
los diferentes tratamientos para el análisis comparativo en 2D a nivel de la raíz 247
Tabla No. 31. Resumen de la variación en el número de manchas electroforéticas para
los diferentes tratamientos encontrados para el análisis comparativo en 2D a nivel
del tallo 254
XXII Contribución al estudio de algunos mecanismos bioquímicos y moleculares de la
resistencia del clavel a Fusarium oxysporum f. sp. dianthi raza 2
Título de la tesis o trabajo de investigación
Lista de símbolos y abreviaturas
En este escrito se emplearon extensivamente siglas en ingles debido a su uso
generalizado en la literatura especializada.
4CH 4-cumarato hidroxilasa
4CL p-cumarato:CoA ligasa
ABTS 2,2´-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid) diammonium salt
ANOVA Analysis of Variance
ANR Antocianidina Reductasa
ANS Antocianidina Sintasa
APAF-1 Apoptotic Protease Activating Factor 1
APX Ascorbato Peroxidasa
ATP Adenosine-5'-triphosphate
bHLH Basic-Helix-Loop-Helix
BSA Bovine Serum Albumine
CC Coiled Coil
CDPK Calmodulin-like Domain Protein Kinase
CE Cathequin Equivalent
Ced-4 Caenorhabditis elegans death-4 protein
CFT Contenido de Fenoles Totales
CHAPS Ácido 3-[(3-colamidopropil)dimetilamonio]-1-propano sulfónico
CHI Chalcona Isomerasa
CHS Chalcona Sintasa
CoA Coenzyme A
DAD Detector de Arreglo de Diodos
Contenido XXIII
DEPC Dietil Pirocarbonato
DNA Deoxyribonucleic acid
DPPH 2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl
DTT Ditio Treitol
EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid
EM Espectrometria de Masas
ERN Especies Reactivas de Nitrógeno
EROs Especies Reactivas de Oxígeno
ESI Electrospray
ETI Effector-Triggered Immunity
FDR False Discovery Rate
Fod Fusarium oxysporum f. sp. dianthi
GAE Gallic Acid Equivalents
GPX Guayacol Peroxidasa
GTP Guanosine-5'-triphosphate
GUS Beta- Glucuronidasa
HPLC High Performance Liquid Chromatography
HR Hypersensitive Response
HSP Heat Shock Protein
IE Impacto Electrónico
IEF Isoelectric Focusing Electrophoresis
LRR Leucine Rich-Repeats
MALDI Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization
MAMPs Microbial Associated Molecular Patterns
MATE Multidrug and Toxic Compound Extrusion Transporters
NAD Nicotinamida Adenina Dinucleótido
NADP Nicotinamida Adenina Dinucleótido Fosfato
NBS Nucleotide Binding Site
PAL Phenylalanine Ammonium Liase
PAMPs Pathogen-Associated Molecular Patterns
PCA Principal Component Analysis
PCR Polymerase Chain Reaction
PDA Potato Dextrose Agar
PGPR Plant Growth-Promoting Rhizobacteria
XXI
V
Contribución al estudio de algunos mecanismos bioquímicos y moleculares de la
resistencia del clavel a Fusarium oxysporum f. sp. dianthi raza 2
Título de la tesis o trabajo de investigación
PMSF Phenylmethylsulfonyl Fluoride
POD Enzima Peroxidasa
PRPs Patogen-Recognition Receptors
PTI PAMP-triggered immunity
PVPP Polyvinylpolypyrrolidone
QTLs Quantitative Trait Loci
RNA Ribonucleic Acid
RSI Resistencia Sistémica Inducida
RT-PCR Retrotranscription- Polymerase Chain Reaction
SAM S-adenosil metionina
SDS Sodium Dodecyl Sulfate
SDS-PAGE Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis
SIM Single Ion Mode
TE Trolox Equivalents
TEMED N,N,N,N'-tetrametiletilendiamina
TIR Toll and Interleukine Receptor
TOF Time of Flight
Trolox 6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2- carboxylic acid
UV Ultravioleta
Introducción
Para Colombia la exportación de flor fresca cortada se constituye como una de las
actividades económicas de mayor relevancia económica, considerando que para el año
2012, generó más de 1200 millones de dólares de divisas y casi 130 mil empleos directos
e indirectos (A. González & Sarmiento 2013). Dentro de este sector, el clavel (Dianthus
caryophyllus L), se ha posicionado como uno de los productos de mayor importancia,
representando el 19% del total de la producción generada por más de 8000 hectáreas
cultivadas principalmente en la sabana de Bogotá, Antioquia y el Valle del Cauca. Estas
condiciones han generado que nuestro país se posicione como el principal productor
mundial de clavel estándar y como el segundo productor de flores frescas cortadas,
superado únicamente por Holanda (Castellanos et al. 2009). Aun cuando en los últimos
años flores como las rosas han tenido un importante repunte dentro del gusto de los
consumidores, actualmente el cultivo de clavel en Colombia se constituye, dentro de este
sector, como una de las actividades de más importancia teniendo en cuenta la
significativa participación de esta flor dentro de la producción total (Arbeláez 2006;
Castellanos et al. 2009).
Sin embargo, a pesar de la importancia de la producción del clavel para nuestro país,
ésta ha presentado una notable disminución en los últimos años, debida principalmente
al alto costo que conlleva el manejo de enfermedades de tipo infeccioso, en especial del
marchitamiento vascular causado por Fusarium oxysporum f. sp. dianthi (Fod)
(Castellanos et al. 2009). Este patógeno que se encuentra ampliamente distribuido en los
cultivos de clavel, presenta diversas razas fisiológicas, dentro de las cuales la raza 2 es
la más agresiva y de mayor distribución en Colombia (Barrera & Gómez 1995). Con el fin
de controlar esta enfermedad, se han desarrollado un conjunto de estrategias, basadas
principalmente en prevenir la entrada del patógeno a los cultivos con medidas higiénicas
que evitan la contaminación de esquejes sanos durante las etapas de propagación y
producción.
26
Considerando que estas medidas tan solo generan un control aceptable de la
enfermedad, aumentan los costos de producción y pueden afectar el medio ambiente, la
investigación para encontrar otras alternativas de control de la enfermedad continua
(Sant et al. 2010; Melero-Vara et al. 2011). En la búsqueda de los mecanismos
bioquímicos y moleculares que permitan sustentar y agilizar la búsqueda de dichas
alternativas, se han realizado diferentes investigaciones con el fin de determinar aquellas
respuestas que se presentan como efecto de la infección del hospedero y de los
mecanismos que usa el patógeno para lograr una colonización exitosa de la planta. A
pesar de ello, a la fecha, el conocimiento bioquímico y molecular que se tiene al respecto
es poco y las bases que determinan la activación de estos procesos están lejos de estar
completamente elucidados. Particular interés han generado para el desarrollo y selección
de variedades resistentes a la enfermedad en los programas de mejoramiento, los
mecanismos de defensa que presentan las variedades que no desarrollan la enfermedad
y que generalmente determinan la resistencia al patógeno. La investigación sobre dichos
mecanismos, además de suministrar información básica para la futura generación de
variedades resistentes, apoya los programas de mejoramiento, los cuales actualmente
están limitados por la falta de marcadores moleculares o bioquímicos que permitan hacer
una selección de variedades resistentes, antes de realizar costosas pruebas de campo.
Entre los estudios realizados están los que han buscado determinar el efecto que tiene la
inoculación con el patógeno en el metabolismo secundario de la planta. Al respecto, se
ha encontrado que tanto a nivel de la raíz, como del tallo, se producen cambios
cualitativos y cuantitativos en los metabolitos especialmente fenólicos, algunos de ellos
con propiedades antifúngicas hacia Fusarium oxysporum f. sp. dianthi (Baayen et al.
1989; Niemann et al. 1991; Higuera 2001). Es interesante destacar que dentro de los
compuestos fenólicos encontrados, se cuentan algunos flavonoides, compuestos
ubicuamente distribuidos en plantas superiores, que cumplen en la misma una amplia
diversidad de funciones fisiológicas (Curir et al. 2005; Galeotti, Barile, Lanzotti, et al.
2008). De manera particular, el papel de estos compuestos ha sido de interés en las
interacciones que involucran patógenos del género Fusarium, considerando que,
estudios funcionales realizados con mutantes de lino (Linum usitatissimum) que
presentan mayores niveles de las enzimas involucradas en la producción de estos
metabolitos, han mostrado una mayor resistencia a los patógenos Fusarium oxysporum
y Fusarium culmorum (Lorenc-Kukuła et al. 2007).
27
En el clavel, los estudios realizados sobre las enzimas involucradas en la biosíntesis de
fenólicos y su papel en resistencia vegetal es incipiente. Se ha determinado que la
infección con el patógeno causal del marchitamiento vascular, tiene un efecto en los
niveles de la enzima fenilalanina amonio liasa (PAL, por sus siglas en inglés), en raíces
de plantas resistentes a la enfermedad (Ardila et al. 2011). De acuerdo con dicha
investigación, se propone que las respuestas de defensa asociadas al metabolismo
secundario para este modelo, además de ser dependientes del órgano que se encuentre
involucrado en la interacción, pueden incluir la participación de otras enzimas asociadas
a esta ruta biosintética. Este podría ser el caso por ejemplo, de la chalcona sintasa (CHS)
y la chalcona isomerasa (CHI), enzimas claves para la biosíntesis de flavonoides,
metabolitos que como se mencionó anteriormente, son de particular interés en estudios
de resistencia a patógenos del género Fusarium.
El interés sobre la biosíntesis de flavonoides y su participación en la resistencia del clavel
aumenta si se considera que muchos de estos compuestos pueden presentar actividad
antioxidante, la cual puede estar asociada con la resistencia a patógenos necrotróficos
como Fusarium oxysporum. Esto se debe a que altos niveles de especies oxidantes,
producto del metabolismo de la planta, pueden generar la muerte celular vegetal y
favorecer la obtención de nutrientes por parte de este tipo de patógenos (Barna et al.
2012). Por ello, la eliminación de estas especies ya sea por la acción de moléculas
antioxidantes o de otros mecanismos enzimáticos, puede ser parte de la respuesta
asociada con resistencia de la planta. Se ha aceptado que dentro de estos procesos,
enzimas como las peroxidasas cumplen un papel central, considerando que además de
eliminar el peróxido de hidrógeno en la planta, pueden estar involucradas de manera
simultánea, en procesos como la lignificación y suberización, fenómenos que de acuerdo
con estudios realizados usando técnicas como microscopia electrónica, son también
parte de la respuesta multi-componente asociada a la expresión de resistencia en el
clavel (Ouellette et al. 2004; Higuera & Ebrahim-Nesbat 1999).
En este modelo, la alta complejidad en la respuesta al patógeno, está de acuerdo con la
naturaleza multigénica de la resistencia a la enfermedad y evidencian la participación de
un amplio número de rutas metabólicas que deben estar reguladas, a su vez, por la
correcta activación y localización de las enzimas involucradas. Es por ello que los
mecanismos que participan en la regulación de los niveles de enzimas asociadas a la
defensa, son de interés en el estudio de la resistencia del clavel, si se quiere aprovechar
28
el potencial científico para obtener variedades resistentes o generar nuevos marcadores
de selección en los procesos de cruzamiento tradicionales.
Bajo estas consideraciones, con el fin de profundizar en los mecanismos involucrados en
la resistencia del clavel y determinar si la biosíntesis de flavonoides está relacionada con
la resistencia a la enfermedad, en la presente investigación se planteó la siguiente
hipótesis: La regulación espacio temporal de los niveles de actividad enzimática y de
transcripción para las enzimas fenilalanina amonio liasa, chalcona sintasa, chalcona
isomerasa y peroxidasa, enzimas involucradas en la biosíntesis y el metabolismo de
fenoles y flavonoides, así como la acumulación de algunos metabolitos secundarios
provenientes de las rutas metabólicas en que dichas enzimas participan, está relacionada
con la resistencia al marchitamiento vascular.
Con el fin de validar esta hipótesis, se evaluó si dichos parámetros asociados a la
regulación de la biosíntesis de flavonoides y la actividad antioxidante, estaban asociados
a la expresión de resistencia del clavel al marchitamiento vascular. Para ello, se optó por
un análisis comparativo entre variedades resistentes y susceptibles, de los niveles de
metabolitos, actividades enzimáticas y niveles de transcripción de las enzimas
mencionadas. Considerando que esta comparación se realizó tanto a nivel constitutivo
como a nivel inducible, se pudo evaluar la participación de los mismos tanto en los
mecanismos de defensa pasiva, como en la defensa activa.
La alta complejidad de las respuestas inducibles en este modelo y su especificidad de
acuerdo al órgano de la planta involucrado, generó la necesidad de realizar el estudio en
tallos y raíces de la planta de manera independiente. Esto, además de presentar un
panorama global de cómo se presenta la expresión de resistencia en toda la planta,
permitió estudiar los posibles puntos de regulación espacio-temporal de la respuesta.
Esta investigación se complementó con el estudio de otras respuestas de defensa
asociadas, realizando una comparación entre variedades resistentes y susceptibles
usando herramientas proteómicas. Esta última aproximación permitió encontrar algunos
procesos metabólicos asociados que complementan el panorama de los mecanismos de
defensa que fueron objeto de estudio.
El conocimiento generado en el presente estudio ha ampliado el escenario de los
fenómenos bioquímicos y moleculares asociados a la resistencia en este modelo, no solo
desde el punto de vista de los mecanismos de defensa que se activan en la planta, sino
también en fenómenos de reconocimiento y señalización asociados a dicha respuesta.
29
Considerando la evaluación simultánea de las respuestas en diferentes órganos de la
planta, se realizó un acercamiento a la compleja activación de los mecanismos de
defensa en toda la planta y evidenció la importancia en la regulación espacio-temporal
para la expresión de resistencia del clavel.
Estudios básicos como el que se presenta a continuación, proporcionan el conocimiento
bioquímico y molecular necesario para avanzar en el futuro desarrollo de marcadores de
selección de genotipos resistentes y de nuevas alternativas de control al marchitamiento
vascular, una evidente necesidad si se quiere fortalecer el sector productor de claveles
no solo en Colombia, sino a nivel mundial.
Los resultados de este estudio se presentan a continuación en forma de capítulos
independientes, tratando de abarcar los aspectos más relevantes de las diferentes fases
de la investigación. Considerando que la mayor parte de este estudio siguió la misma
secuencia en la que se presenta, los resultados en cada una de las fases se concatenan
unos con otros y se discuten en la parte final del escrito.
La divulgación parcial de los resultados de la presente investigación a la comunidad
científica, se ha realizado hasta la fecha, mediante la publicación de un artículo en revista
internacional, de un capítulo de libro y de diversas presentaciones en eventos, así como
de la preparación de otros artículos científicos, tal como se describe a continuación:
Articulos científicos
Ardila, H.D., Martínez S.T., Higuera B.L. (2013) Levels of constitutive flavonoid
biosynthetic enzymes in carnation (Dianthus caryophyllus L) cultivars with differential
response to Fusarium oxysporum f. sp. dianthi. Acta physiologiae plantarum. 35: 1233-
1245
Ardila, H.D., Torres, A.M., Martínez S.T., Higuera B.L. (2013) Biochemical and
molecular evidences of class III peroxidases participation in resistance to Fusarium
oxysporum f. sp. dianthi in carnation. Sometido a la revista Plant Physiology and
Biochemistry
Ardila, H.D., Martínez S.T., Higuera B.L. (2013) Flavonoid biosynthesis as a response
associated to resistance in carnation´s roots during infection with Fusarium oxysporum f.
sp. dianthi. En preparación.
30
Capítulo de Libro
Ardila H.D., González-Fernández R., Higuera BL, Redondo I, Martínez ST. Protein
extraction and gel-based separation methods to analyze responses to pathogens in
carnation (Dianthus caryophyllus L) Chapter 39. Methods in Plant Proteomics. 2ª Ed.
Humana Press. New York. 2013
Presentación en eventos científicos
XXIX CONGRESO COLOMBIANO DE FITOPATOLOGIA. Medellin (Colombia). Junio de
2008. Niveles transcripcionales de la enzima chalcona sintasa en clavel (Dianthus
caryophyllus L.) y su relación con los mecanismos de defensa ante la infección con
Fusarium oxysporum f. sp. dianthi raza 2
XXIX CONGRESO LATINOAMERICANO DE QUÍMICA. Cartagena (Colombia). Octubre
de 2010. Parámetros bioquímicos constitutivos en clavel y su correlación con tolerancia al
marchitamiento vascular.
XVI CONGRESO LATINOAMERICANO DE FITOPATOLOGÍA Y XXX CONGRESO
COLOMBIANO DE FITOPATOLOGÍA. Bogotá (Colombia). Agosto de 2011 Inducción
diferencial de peroxidasas en tallos de clavel (Dianthus caryophyllus L.) y su asociación
con la tolerancia al marchitamiento vascular
XVI CONGRESO LATINOAMERICANO DE FITOPATOLOGÍA Y XXX CONGRESO
COLOMBIANO DE FITOPATOLOGÍA. Bogotá (Colombia). Agosto de 2011. Regulación
espacio temporal de la biosíntesis de fenoles y flavonoides durante la interacción clavel
(Dianthus caryophyllus L.) y Fusarium oxysporum f. sp. dianthi
XIV CONGRESO INTERNACIONAL Y XXXIV CONGRESO NACIONAL DE
FITOPATOLOGÍA. Puerto Vallarta (México). Junio de 2012. Biochemical and molecular
parameters associated to flavonoid biosynthesis and its relation to resistance in carnation
(Dianthus caryophyllus L) – Fusarium oxysporum f. sp. dianthi
V CONGRESO DE LA SOCIEDAD ESPAÑOLA DE PROTEÓMICA. Barcelona
(España). Febrero de 2013. Proteomics approach to study early biochemical events in
Carnation (Dianthus caryophyllus L.)-Fusarium oxysporum f. sp. dianthi interaction
31
Objetivo General
Aportar al conocimiento de la regulación espacio-temporal de algunas respuestas
bioquímicas y moleculares relacionadas con resistencia en el modelo huésped-patógeno
clavel - Fusarium oxysporum f. sp. dianthi raza 2.
Objetivos Específicos
Evaluar si existen diferencias significativas en los niveles constitutivos de actividad
enzimática y de transcripción de los genes codificantes para las enzimas Fenilalanina
Amonio Liasa, Chalcona Sintasa y Chalcona Isomerasa, entre variedades de clavel con
diferentes niveles de resistencia en campo a Fusarium oxysporum f. sp. dianthi raza 2.
Comparar los niveles constitutivos con los inducidos, de compuestos fenólicos totales y
de flavonoides totales en variedades de clavel con diferentes niveles de resistencia al
marchitamiento vascular, durante el proceso de infección con Fusarium oxysporum f. sp.
dianthi raza 2.
Determinar si hay inducción de los niveles de actividad enzimática y de transcripción de
los genes codificantes para las enzimas Fenilalanina Amonio Liasa, Chalcona Sintasa y
Chalcona Isomerasa en variedades de clavel con diversos niveles de resistencia, durante
el proceso de infección con Fusarium oxysporum f. sp. dianthi raza 2.
Determinar si existen diferencias significativas en los niveles constitutivos de actividad
antioxidante, así como en los niveles de actividad enzimática para la enzima Peroxidasa,
entre variedades de clavel con diferentes niveles de resistencia a Fusarium oxysporum f.
sp. dianthi raza 2.
Establecer el efecto sobre los niveles de actividad antioxidante y los niveles de actividad
enzimática y de transcripción de los genes codificantes para la enzima peroxidasa, en
variedades de clavel con diversos niveles de resistencia al marchitamiento vascular,
durante el proceso de infección con Fusarium oxysporum f. sp. dianthi raza 2.
Evaluar los cambios en los niveles de otras proteínas asociadas a la resistencia del
clavel, mediante un análisis proteómico comparativo entre variedades de clavel con
diversos niveles de resistencia al marchitamiento vascular, durante el proceso de
infección con Fusarium oxysporum f. sp. dianthi raza 2.
32
33
1. Estado actual del tema
1.1. Interacción planta-patógeno
Las plantas son organismos complejos que perciben estímulos y se adaptan a los
mismos de manera rápida y eficiente. Esto se debe a que durante su proceso evolutivo
han desarrollado diversos mecanismos que les permite convivir en aquellas condiciones
adversas a las que eventualmente pueden estar expuestas. Dicho proceso se ha dado
por miles de años y ha estado determinado, entre otros mecanismos, por la generación
de nuevos genotipos dentro de una población ya sea por la presencia de genes
polimórficos o por la migración de genes entre organismos (Frank 1992). Factores
abióticos como la temperatura, la húmedad y la disponibilidad de nutrientes (Tapio et al.
2002) y/o factores bióticos, como la presencia de herbívoros, insectos y
microorganismos; son algunos ejemplos de condiciones que pueden afectar de alguna
manera el ciclo normal de vida de las plantas y para las cuales éstas han desarrollado
mecanismos específicos de adaptación, supervivencia y defensa.
Dentro de los factores bióticos, existen tanto microrganismos benéficos con los que
puede establecer una relación de mutua cooperación, como microrganismos con los que
dicha relación simbiótica es inexistente y que por el contrario, interfieren en las funciones
normales de la planta, generando problemas en su desarrollo, y en ciertos casos
ocasionando su muerte. Organismos como las bacterias promotoras de crecimiento
(Plant Growt-Promoting Rhizobacteria PGPR) son un ejemplo de organismos benéficos
que pueden llegar a cumplir un importante papel en la defensa de la planta, considerando
su potencial como inductoras de Resistencia Sistémica Inducida (RSI), un complejo
fenómeno que le permite a la planta estar preparada ante la posible infección de un
amplio espectro de microorganismos fitopatógenos (Albes et al. 2004; Van Loon et al.
1998) A su vez, organismos como algunos virus, bacterias y hongos pueden actuar como
34
patógenos penetrando, infectando y colonizando la planta, llegando a interferir en sus
funciones fisiológicas normales y siendo fatal en muchos de los casos
Las interacciones que se establecen entre las plantas y los microorganismos son tan
antiguas como ellas mismas, por lo que dentro de su co-evolución, las plantas han
desarrollado sistemas sensibles de quimiopercepción que les permite diferenciar las
moléculas propias de las extrañas y dentro de estas últimas, identificar cuales provienen
de potenciales patógenos para, de esta manera, desarrollar en su contra una respuesta
de defensa (Dixon & C. Lamb 1990; Mitchell-Ods & J. Bergelson 2000; Trhall & Burdon
2003). Estos sistemas de percepción permiten que una vez se presente la interacción
entre la planta y el microorganismo, se reconozcan por parte de la planta, ciertas
moléculas relacionadas con la presencia de éste. Aunque dichas moléculas pueden
variar de un modelo planta-patógeno a otro, muchas de ellas se caracterizan por tener
patrones altamente conservados asociados a moléculas fundamentales para el
funcionamiento de los microorganismos. Dichos patrones moleculares son conocidos
como MAMPs (Microbial Associated Molecular Patterns) (Gómez-Gómez 2004;
Muthamilarasan & M. Prasad 2013) y le permiten a la planta reconocer a los potenciales
patógenos en una línea inicial de defensa. Otras moléculas conocidas como efectores,
no son tan conservadas y son específicas en muchos casos del patógeno en estudio.
Dichas moléculas, que fueron desarrolladas por el patógeno para favorecer su
colonización, pueden llegar a ser detectadas por sistemas de reconocimiento específicos
en la planta. (J. D. G. Jones & Dangl 2006; Pritchard & Birch 2011). El reconocimiento de
cualquiera de estas moléculas genera respuestas de defensa en la planta a diferentes
niveles, las cuales tienen como objetivo limitar la infección y evitar la propagación del
patógeno por los tejidos no infectados (J. D. G. Jones & Dangl 2006; Muthamilarasan &
M. Prasad 2013). La distribución ubicua de estos sistemas especializados de
reconocimiento en los tejidos vegetales y su efectividad en contra de la mayoría de los
microorganismos potencialmente patógenos, convierte a la enfermedad en la excepción y
no en la regla.
En aquellos casos en donde el microorganismo patógeno logra evadir o afectar los
sistemas de reconocimiento vegetales, este coloniza la planta afectando sus funciones
normales y genera una sintomatología propia del estado patológico asociado. Entre las
enfermedades infecciosas de mayor impacto económico para la mayoría de las especies
comerciales cultivadas alrededor del mundo, se encuentran las causadas por hongos
35
fitopatógenos (Knogee 1996). Desde el siglo XIX, cuando el botánico Mont de Bary
sugirió que la causa de la devastación de los cultivos que originó la hambruna en Irlanda
para finales de ese siglo, era una enfermedad infecciosa causada por un hongo
fitopatógeno, el estudio de los mecanismos moleculares involucrados durante la infección
y la colonización de plantas por parte de estos organismos, ha sido de particular interés
para la comunidad científica. Diversos estudios han determinado que la capacidad que
tiene un parásito para infectar y causar una enfermedad en una planta, conocida como
patogenicidad (Sacristán & García-Arenal 2008), se expresa de manera selectiva sólo
frente a algunos hospederos y puede estar determinada, entre otras razones, porque no
tienen aquellos factores que son necesarios para el reconocimiento por parte de la
planta, o porque afectan los procesos de señalización posteriores y por tanto la
activación de las respuestas de defensa (Bent & Mackey 2007; Dodds & Rathjen 2010;
Pritchard & Birch 2011). Algunos reportes han mostrado que para ciertos patógenos, la
capacidad para causar enfermedad aumenta bajo ciertas condiciones ambientales
ampliando el rango de hospederos a los que puede parasitar (L. G. Barrett et al. 2009).
Considerando que para que un patógeno logre infectar y colonizar a su huésped, son
necesarios procesos como adhesión a su superficie, penetración de barreras físicas,
liberación de toxinas y eliminación o evasión de las defensas que se inducen durante
este proceso (Shafer 1994), se han realizado diferentes estudios que han evidenciado
algunos de los mecanismos moleculares que le permiten realizar cada una de estas
etapas (Stahl & J. G. Bishop 2000). Es bien sabido que la expresión génica regulada por
el complejo intercambio de señales entre ambos organismos durante la interacción,
involucra la transcripción de muchos genes en el hongo, teniendo en cuenta la
complejidad de las estructuras que desarrolla durante el proceso infectivo (Dixon & C.
Lamb 1990). Aunque hongos biotrofos, hemibiotrofos y necrótrofos no difieren mucho en
las primeras fases de la patogénesis, adhiriéndose, penetrando e infectando la célula
vegetal (Mendgen & M. 2000), los hongos biotrofos y algunos hemibiotrofos desarrollan
estructuras bastante especializadas conocidas como haustorios, los cuales les permiten
tomar nutrientes directamente del citoplasma de la célula vegetal, sin causar su muerte
(Panstruga 2003). En general, las estructuras especializadas que le permiten al patógeno
penetrar el hospedero, en conjunto con enzimas degradadoras de cutina, celulosa y
pectinas, eliminan la primera barrera física que constituye la pared celular y le permiten
entrar en contacto directo con la célula vegetal. La secreción de estas enzimas que
36
degradan la pared celular y la liberación de toxinas, son usadas en el caso de los
patógenos necrótrofos para generar la muerte celular de la célula vegetal, obtener los
nutrientes de la planta y finalmente propagarse en la misma (Mengiste 2012).
Para sortear los mecanismos de defensa vegetales, muchos patógenos han desarrollado
un conjunto de procesos que les permite evitar el reconocimiento de la planta o modificar
a su beneficio los mecanismos de señalización involucrados durante el mismo (Bent &
Mackey 2007). Esto lo realiza mediante la secreción de moléculas conocidas como
efectores, las cuales pueden tener diferentes funciones entre las que se encuentran
afectar las vías de señalización en diferentes puntos, interfiriendo en procesos de
reconocimiento, señalización y defensa (Pritchard & Birch 2011). El continuo intercambio
de señales que involucran la acción de estos efectores y el correcto reconocimiento del
patógeno por la planta, determinaran si ésta será infectada y colonizada de manera
efectiva por el hongo fitopatógeno, o si por el contrario se defenderá desencadenando
una respuesta adecuada (Dodds & Rathjen 2010). Considerando que estos procesos se
ven ampliamente afectados por factores, como el genotipo vegetal implicado, el patógeno
y las condiciones ambientales, el panorama se hace más complejo y obliga a que cada
modelo de interacción planta-patógeno sea estudiado de manera independiente
considerando las condiciones particulares de cada caso.
Con el fin de generar un panorama general de los aspectos centrales que se deben
considerar en el estudio de las respuestas de defensa vegetal, punto central de estudio
en la presente investigación, se presenta a continuación una revisión de algunos
conceptos fundamentales del reconocimiento, señalización y de algunas de las
respuestas bioquímicas, celulares e histopatológicas que componen la expresión de
defensa vegetal. Es importante resaltar que en esta revisión no se pretende tocar todos
los temas asociados a los mismos, sino aquellos que pueden estar asociados al objeto
de estudio en la presente investigación y que pueden ser mencionados por tanto, más
adelante durante el desarrollo del escrito.
1.2. Resistencia y susceptibilidad
El término resistencia ha sido comúnmente usado para describir la habilidad del
hospedero para prevenir o reducir el crecimiento del patógeno (L. G. Barrett et al. 2009),
la cual está generalmente asociada a la inhibición, restricción o aletargamiento del
37
crecimiento de éste, fundamentada en la activación efectiva de una reacción de defensa
multicomponente en la planta resistente (A. Bell 1981). En estos casos se hace
referencia a una interacción hospedero-patógeno incompatible, en donde la enfermedad
no se presenta debido a que el genotipo vegetal es resistente y por lo tanto el patógeno,
avirulento. A su vez, en la interacción compatible la enfermedad se presenta debido al
genotipo susceptible del hospedero y a la virulencia del patógeno. Dentro de este
contexto, el término virulencia hace referencia al grado de daño que causa el patógeno
en el hospedero (propiedad cuantitativa) y que está negativamente relacionado con la
productividad de la planta (Sacristán & García-Arenal 2008). De la misma manera, se ha
definido la patogenicidad como una propiedad cualitativa que describe si el parásito es
capaz o no, de causar la enfermedad en el hospedero. La susceptibilidad se puede
definir entonces, como el fenómeno donde la activación de la respuesta defensiva no se
presenta, o si se presenta, es inefectiva para aletargar o inhibir el crecimiento del
patógeno, conduciendo al establecimiento de un sistema hospedero-patógeno
compatible.
Diversos estudios a nivel genético de las enfermedades de tipo infeccioso en plantas,
han demostrado que en algunos sistemas hospedero-patógeno, la resistencia y
susceptibilidad se pueden explicar con el modelo del gen por gen elicitores-raza
específico, descrito por (Flor 1971). En este modelo, la resistencia o susceptibilidad de
las variedades de una especie hospedera a una raza fisiológica de un patógeno está
determinada por pares correspondientes de genes en el hospedero y en el patógeno. De
esta manera, en estas interacciones “gen por gen” un gen de resistencia presente en una
variedad en particular confiere resistencia contra las razas fisiológicas del patógeno que
expresen el correspondiente gen de avirulencia; dicha incompatibilidad genética se refleja
en muchos modelos planta-patógeno por la HR “Hypersensitive Response”, la cual se
caracteriza por una rápida muerte celular de las primeras células infectadas e involucra la
elaboración de un importante número de defensas inducibles (Dixon & C. Lamb 1990). A
pesar que actualmente este concepto es válido en ciertos modelos planta-patógeno, no
permite explicar modelos en donde al parecer dicha relación gen por gen no se presenta
y se necesita la presencia de más de un par de genes para que se presente la resistencia
en la planta. La resistencia poligénica u horizontal está relacionada con la activación de
mecanismos de defensa no específicos que le permite a la planta superar la infección de
todas las razas de un patógeno particular o en general a un amplio rango de patógenos.
38
Sin embargo, dicha resistencia raza no específica, es cuantitativa y está limitada por las
condiciones ambientales a las cuales puede estar sujeta la planta; su naturaleza
inespecífica determina además, que se relacione con el reconocimiento de moléculas
altamente conservadas asociadas a respuestas poco específicas que generalmente
pueden ser poco efectivas para ciertos patógenos altamente virulentos (Mcdonald &
Linde 2002; Agrios 1995). En general, todos estos fenómenos se enmarcan dentro de
procesos específicos de reconocimiento y señalización que determinan que en la planta
se activen respuestas relacionadas con defensa vegetal y por tanto se presente la
expresión de resistencia. Estos fenómenos se describen a continuación.
1.3. Reconocimiento y señalización
Es bien sabido que las plantas cuentan con un sistema de vigilancia eficaz, que les
permite realizar un reconocimiento a tiempo de la amenaza que constituye el patógeno
para, de esta manera, desarrollar un proceso defensivo específico en su contra (Hahn, M.
G., 1996). Bajo esta premisa, diversos estudios se han desarrollado para establecer
cómo dichos sistemas de reconocimiento se aplican a los diferentes modelos planta
patógeno. Un punto central en el conocimiento actual de los mecanismos de
reconocimiento, hace referencia a que los microorganismos potencialmente patógenos
pueden ser percibidos por una primera línea de receptores que hacen parte del sistema
de reconocimiento no específico, en donde algunos motivos estructurales, altamente
conservados en la mayoría de los microorganismos (MAMPs Microbial Pathogen
Associated Molecular Patterns) pueden ser reconocidos por un sistema sensible de
vigilancia ubicuamente distribuido en el reino vegetal (Gómez-Gómez 2004; Bent &
Mackey 2007; Tameling & Joosten 2008; Faulkner & Robatzek 2012). Este
reconocimiento desencadena una respuesta no específica conocida como PTI (PAMP-
triggered immunity) la cual determina la resistencia basal asociada generalmente a
resistencia no hospedero y en algunos casos a resistencia hospedero (Dodds & Rathjen
2010; Muthamilarasan & M. Prasad 2013). Este fenómeno activa un conjunto de
fenómenos en la planta como el aumento en el flujo de Ca+2 a través de la membrana
plasmática, la síntesis de especies altamente reactivas de oxígeno (EROs) y la
acumulación de carbohidratos como la calosa a nivel de la pared (Muthamilarasan & M.
Prasad 2013). Estas respuestas de defensa no específicas, que se activan ante el
ataque de muchos organismos patógeno de la planta, está determinada por la presencia
39
de los receptores a nivel de membrana (PRPs Patogen-Recognition Receptors), los
cuales además de ser altamente conservados en éstas, son determinantes en estos
procesos de reconocimiento que regulan la inmunidad innata vegetal (Tameling &
Joosten 2008; Dodds & Rathjen 2010).
Sin embargo, muchos microorganismos fitopatógenos dentro de su proceso de
evolución, se han adaptado a estos sistemas de reconocimiento y han desarrollado
factores de virulencia que suprimen partes de este sistema de reconocimiento, facilitando
su infección al hospedero (Bent & Mackey 2007). Dichos factores conocidos como
efectores, permiten que el microorganismo pueda infectar de manera exitosa la planta,
debido principalmente a su capacidad para perturbar de forma determinante los procesos
de defensa de la planta, ya sea a nivel del reconocimiento, en la transducción de la señal
o a nivel de los mecanismos de defensa que se activan debido a su presencia en los
tejidos de la planta (Bent & Mackey 2007; Pritchard & Birch 2011). Sin embargo, dentro
del mismo contexto evolutivo muchas plantas han desarrollado receptores que permiten
reconocer estos factores y generar una respuesta de defensa (Bent & Mackey 2007;
Tameling & Joosten 2008). De esta manera, los efectores que actuaban inicialmente
como factores de virulencia ahora son de avirulencia y permiten un reconocimiento en la
planta del patógeno potencialmente virulento. Estos receptores específicos generalmente
conocidos como proteínas R, (Proteínas que confieren Resistencia) pueden actuar de
diversas maneras, ya sea por interacción directa con el factor avirulento a nivel de la
membrana plasmática o a nivel citoplasmático, o por interacción indirecta reconociendo
algunas moléculas que se generan debido a la presencia del patógeno en la planta (Bent
& Mackey 2007). Este reconocimiento es la base de la ETI (Effector-Triggered Immunity),
la cual está constituida con por un conjunto de respuestas de defensa similares a las
presentadas por la PTI, pero activadas de manera espacio y temporalmente coordinada
diferente, siendo más rápidas y efectivas que esta última (Dodds & Rathjen 2010;
Muthamilarasan & M. Prasad 2013).
A nivel estructural de estas proteínas R, es importante citar que algunos dominios de
receptores del complejo responsable de la inmunidad innata en mamíferos e insectos,
son similares a los encontrados en proteínas R de diferentes especies vegetales
(Borregaard et al. 2000). El reporte de proteínas R tanto en la membrana plasmática
como a nivel del citoplasma, indica que algunas son especialistas en la detección de
ligandos presentes en los espacios intercelulares y otras lo son para el reconocimiento de
40
moléculas que se generan al interior de la célula del hospedero. A la fecha se han
descrito varios dominios funcionales y estructurales en muchos de los genes R
reportados para diferentes fuentes vegetales. Teniendo en cuenta los dominios, se ha
realizado una clasificación de las proteínas R en varios grupos. El grupo predominante
presenta un dominio de unión a nucleótidos (NBS: Nucleotide Binding Site) para la
interacción con ATP ó GTP, así como un dominio de repeticiones de Leucina (LRR:
Leucine Rich-Repeats). Este grupo de proteínas R se encuentra en el citoplasma y tiene
una arquitectura similar a la encontrada en las proteínas encargadas del reconocimiento
de infección intracelular; el dominio NBS es altamente conservado en las proteínas Apaf-
1 de mamíferos, R de plantas y Ced-4 de nemátodos y debido a esto la familia de
proteínas que lo contienen conforman la familia NBS-ARC. (Gerben Van Ooijen et al.
2008). Dentro de las proteínas que presentan los dominios NBS-LRR se encuentran dos
subgrupos, en el primero proteínas con extremo N-terminal presentan un dominio del tipo
coiled coil (CC) y son conocidas como la subfamilia CC-LRR-NBS; el otro subgrupo
presenta un dominio N terminal homólogo al receptor de interleukina y Toll (Toll and
Interleukine Receptor: TIR) y es conocida como la subfamilia TIR-NBS-LRR. Otro Grupo
importante de proteínas R se encuentra anclada a la membrana plasmática, presentando
una hélice transmembranal y dominios LRR extracelulares. Adicionalmente presenta un
dominio del tipo serina-treonina quinasa intracelular que interacciona con otras proteínas
en la transducción del estímulo. La estructura de este tipo de proteínas R sugiere que
hacen parte de un complejo de receptores encargados de reconocer un estímulo
extracelular y desencadenar procesos intracelulares relacionados con la transducción de
la señal (Gómez-Gómez 2004). En general, las diferentes combinaciones de estos
dominios característicos permiten clasificar a las proteínas R en diferentes familias, que
son conservadas en diferentes familias vegetales (Gururani et al. 2012).
Diversos estudios han reportado una mayor complejidad en el reconocimiento del factor
avirulento, por parte de las proteínas R. En dichos casos, la interacción con las proteínas
R en la planta, no se presenta directamente con el producto del gen de avirulencia del
patógeno. Por ejemplo, teniendo en cuenta que diversos genes avr del patógeno
codifican para proteasas, se ha propuesto que la acción de estas enzimas sobre
proteínas del hospedero pueden generar productos de proteólisis que a su vez pueden
tener un efecto elicitor directo al unirse con proteínas R en la planta (Gómez-Gómez
2004). La “hipótesis del guardián” propone que algunas proteínas R vigilan la integridad
41
de proteínas particulares en el hospedero que se pueden ver afectadas por acción de las
proteínas del patógeno. En este modelo la interacción de la proteína R con los
componentes del hospedero modificados por la presencia del patógeno, generarían una
respuesta de defensa específica en su contra (J. D. G. Jones & Dangl 2006; Dodds &
Rathjen 2010). Sin embargo, actualmente se conoce que en muchos casos la resistencia
determinada por el reconocimiento específico de estos efectores por parte de las
proteínas R en la planta, se puede perder debido a que el patógeno puede modificar
estos efectores ya reconocibles o generar nuevos que no son reconocido por las plantas
antes resistentes. Este fenómeno que ha sido relacionado con la pérdida de resistencia o
“quiebre de resistencia”, está determinado por la evolución del microorganismo agresor
(Mcdonald & Linde 2002; Bent & Mackey 2007). Así mismo, la presencia de estos nuevos
efectores en el patógeno, puede generar selección natural en las plantas hospederas,
favoreciendo aquellas que contengan nuevas proteínas R que permitan el reconocimiento
de estos nuevos factores de virulencia. Este modelo en el que se presentan finalmente
tres líneas de defensa vegetal, ha sido descrito por varios autores como el modelo zig-
zag (J. D. G. Jones & Dangl 2006; Dodds & Rathjen 2010)
Tal y como se puede evidenciar en esta revisión, el fenómeno de reconocimiento es
central en el proceso de interacción planta-patógeno. Sin embargo, otro aspecto
fundamental que puede determinar la resistencia vegetal, es la acción de los
mecanismos de defensa que presenta la planta. A continuación, se presentan algunos de
los mecanismos que se abordaron en esta investigación.
1.4. Mecanismos de defensa vegetal
1.4.1. Defensa vegetal pasiva o preexistente
Son aquellos mecanismos que se encuentran de manera preexistente en la planta antes
de la infección con el patógeno. Dentro de estos encontramos barreras estructurales y
químicas que forman la primera línea de defensa que deben sortear los patógenos para
poder infectar exitosamente la planta. Dentro de estos encontramos algunas barreras
físicas, como la cera y la cutícula que cubren las células epidérmicas, la estructura de las
paredes celulares de estas últimas y en general los tejidos protegidos por paredes
celulares gruesas que obstaculizan el avance del patógeno (Agrios 1995). Además,
42
encontramos ciertas sustancias químicas que forman reservorios estratégicamente
localizados, los cuales pueden cumplir un papel determinante en ciertos sistemas
hospedero-patógeno. Dentro de estas se destacan, ciertos compuestos con actividad
fungitóxica secretados a nivel radicular por algunas especies vegetales y algunos
compuestos antifúngicos entre los que se encuentran varios compuestos fenólicos y
algunos taninos, denominados inhibidores preinfeccionales o fitoanticipinas (González-
Lamothe et al. 2009; Agrios 1995; Osbourn 1996).
Fitoanticipinas
Las plantas dentro de su proceso evolutivo han desarrollado la capacidad de sintetizar
una alta diversidad de compuestos orgánicos, conocidos como metabolitos secundarios,
los cuales no son necesarios para el funcionamiento celular y le otorgan a la planta
ventajas adaptativas que generalmente determinan su supervivencia en un ambiente
cambiante y muchas veces adverso. Dentro de los estudios realizados a la fecha sobre
estos compuestos se ha encontrado que muchos de ellos pueden presentar actividad
antimicrobiana directa sobre microorganismos patógenos y por ello han sido objeto de
investigación en diversos modelos hospedero-patógeno (Goyal et al. 2012). Muchos de
estos compuestos antimicrobianos que se encuentran a nivel constitutivo, se presentan
como formas activas listas para actuar sobre el organismo patógeno o como precursores
que liberan las moléculas antimicrobianas una vez se presenta la interacción con el
microorganismo potencialmente patógeno. En este último grupo se destacan por ejemplo,
los compuestos conocidos como cianogénicos, los cuales son precursores de ácido
cianhídrico en ciertas plantas cuando son atacadas por insectos u hongos fitopatógenos
(Vanetten et al. 2001; Osbourn 1996; Zagrobelny et al. 2008)
Por otro lado, es bien sabido que estos compuestos se encuentran compartimentalizados
en las vacuolas de células especializadas, localizadas estratégicamente en las capas
externas de los órganos de la planta (Osbourn 1996; Beckman 2000). De esta manera la
extensión del daño causado durante la infección, determina la liberación de estos
compuestos de la planta y su acción sobre el patógeno. Este es el caso de los patógenos
biotrofos, los cuales al evitar el daño celular, generalmente no ocasionan la liberación de
las fitoanticipinas durante el evento de la interacción. Caso contrario sucede con
organismos necrotrofos o hemibiotrofos en donde el daño celular ocasionado por la
infección, libera los compuestos constitutivos involucrados con defensa (Osbourn 1996).
43
El efecto que sobre el metabolismo del patógeno causan las fitoanticipinas, es bastante
diverso y depende del modelo planta-patógeno involucrado. Por ejemplo, en el modelo
Tomate- Fusarium oxsysporum f. sp. lycopersici, la inducción de muerte celular en el
patógeno debida a la acción de la α-tomatina, fitoanticipina presente en la planta, ha sido
relacionada con muerte celular programada con afección del metabolismo oxidativo y
depolarización del potencial de membrana a nivel de la mitocondria (S.-I. Ito et al. 2007).
En la actualidad existen un número importante de reportes en diferentes especies
vegetales, en los que se han encontrado fitoanticipinas efectivas para muchos
microorganismos fitopatógenos. Con el fin de dar un panorama general de aquellos
estudios que involucran patógenos del tipo fúngico, y sin buscar mostrar todos los
reportes que a la fecha se han realizado, se citan en la tabla No. 1, algunas de las
fitoanticipinas que han sido caracterizadas y para las que ha sido establecido el efecto
sobre el fitopatógeno.
A pesar de la presencia de este tipo de compuestos a nivel constitutivo, ciertos
patógenos pueden lograr infectar los tejidos del hospedero, gracias a la presencia de
enzimas que les permite detoxificar dichos compuestos y generar sustancias que no
afectan su metabolismo. La presencia de este tipo de mecanismos son determinantes de
virulencia en muchos modelos planta-patógeno (P. Wang et al. 1999; Sandrock &
VanEtten 2001; Vanetten et al. 2001; Hammerschmidt 2010).
Tabla No. 1. Algunas fitoanticipinas encontradas en plantas de diversas especies vegetales
Compuesto Planta hospedera Patógeno Referencias
Saponinas
(Avenacina A1, B1, A-
2 y B2)
Avena (Avena sp.) Gaeumannomyces
graminis (Turner 1960)
Saponina
(α-Tomatina)
Tomate (Licopersicum
esculentum)
Fusarium oxsysporum f.
sp. lycopersici (S.-I. Ito et al. 2007)
44
Allicina(S-alil-L-cistein
sulfóxido)
Allium sativum L.
Hongos de diferentes
especies (Curtis et al. 2004)
Proantocianidinas
(dímeros de Flavan 3-
ol y oligómeros
correspondientes)
Catequinas
Fresa
Fragaria ananassa
Botrytis cinerea,
Cladosporium
cladosporioides,
(Terry et al. 2004)
Glicósidos de
flavonoides, diversos
compuestos fenólicos
(Detalles en la tabla
No.4 )
Clavel (Dianthus
caryophyllus)
Fusarium oxysporum f.
sp. dianthi
(Higuera 2001; Curir et al.
2001; Curir et al. 2003)
Centelloides
Saponinas
triterpenoides
Centella asiatica Amplio especto de
patógenos (James & Dubery 2009)
Glucosinolatos
indolicos
4-metil-sulfinil butil
glucosinolato
Arabidopsis thaliana Phytophthora brassicae (Schlaeppi et al. 2010)
Cumarinas 6-metoxi
melleina
Zanahoria (Daucus
carota) Alternaria Dauci (Lecomte et al. 2012)
1.4.2. Defensa vegetal dinámica o inducible
Una vez la planta reconoce la presencia de un microorganismo potencialmente patógeno,
no se comporta como huésped pasivo, sino al contrario, la planta induce un conjunto de
45
mecanismos que le permite responder y defenderse de dicha amenaza. Estas defensas
se denominan activas porque son en respuesta a un patógeno invasor y requieren del
metabolismo del hospedero. Las células de la mayoría de los órganos vegetales parecen
ser capaces de mostrar respuesta de defensa activa, característica de las interacciones
incompatibles, asociadas con la resistencia a la enfermedad (Hutcheson, S 1998) Una
vez se lleva a cabo el proceso de reconocimiento y de transducción de la señal, se
presentan los cambios a nivel bioquímico, celular e histológico que componen dicha
respuesta activa. Dentro de dichos mecanismos de defensa activa vegetal se encuentran
las modificaciones de pared celular implicadas en su fortalecimiento durante el evento de
la interacción, como la lignificación y la deposición de polisacáridos (Huckelhoven 2007),
la síntesis de proteínas relacionadas con patogénesis (PRs Pathogen Related) (Van
Loon, Rep & Pieterse, 2006; Sels, Mathys, Coninck, Cammue, & Bolle, 2008) y la
estimulación del metabolismo secundario para la síntesis de fitoalexinas (Harborne 1999;
Grayer & Kokubun 2001; González-Lamothe et al. 2009; Ahuja et al. 2012)
Considerando que este último es objeto de particular atención en la presente
investigación, a continuación se presentan algunos de los aspectos más relevantes
relacionados con el mismo.
Fitoalexinas
Las fitoalexinas han sido definidas como: “compuestos de bajo peso molecular con
actividad antimicrobiana que son sintetizados y acumulados por las células de la planta
después de la exposición a microorganismos” (Paxton 1981). Los compuestos que son
clasificados como fitoalexinas deben ser sintetizados “de novo” y ser acumulados a
concentraciones antimicrobianas en el sitio de infección, requiriendo una expresión
temprana para las diferentes enzimas involucradas en su biosíntesis. En ciertos casos
es difícil determinar si un compuesto relacionado con defensa es constitutivo o inducido,
ya que ciertas fitoalexinas se pueden encontrar a niveles indetectables a nivel
constitutivo, pero aumentar su concentración de manera importante cuando se presenta
la interacción con el patógeno. (Grayer & Kokubun 2001).
Desde que en el año 1960 fue aislada y caracterizada químicamente la primera
fitoalexina, la (+)- pisatina en tejidos de Pisum sativum (Cruickshank & Perrin 1960), se
ha encontrado que la mayoría de fitoalexinas presentan actividad antimicrobiana sobre
más de un tipo de microorganismos patógenos. Sin embargo, esta inespecificidad de
acción contrasta con la alta especificidad que presentan las rutas involucradas en la
46
biosíntesis de dichos metabolitos, la cual se evidencia cuando se evalúa la naturaleza
química de dichos compuestos y se encuentra que muchas veces está relacionada con la
familia de la planta como se presenta en la tabla No. 2 (Harborne 1999; Ahuja et al.
2012). Esto a su vez ha permitido que estos compuestos sean usados como marcadores
taxonómicos (Hammerschmidt 1999). En este aspecto, es importante citar que
actualmente se han reportado un gran número de fitoalexinas, con estructuras químicas
relacionadas en una misma familia o en un mismo género de plantas (Ahuja et al. 2012).
Particular atención ha generado la obtención de cultivares transgénicos en la producción
de fitoalexinas para aumentar la resistencia a patógenos, considerando los problemas y
limitaciones que tienen en este momento los programas de mejoramiento por métodos
tradicionales (Großkinsky et al. 2012).
Tabla No. 2. Presencia de algunas fitoalexinas reportadas en diversas familias de plantas
Familia Tipo de molécula Ejemplo específico Referencias
Caryophyllaceae
Acidos antranílicos Diantalexinas en
Clavel.
(Niemann et al. 1992;
Curir et al. 2005)
Cruciferae
Alcaloides Indólicos Caulexinas A, B. C. en
Coliflor (Pedras et al. 2003)
Ehrhartoideae
Diterpenos Momilactonas y
oryzalexinas en Arroz (R. J. Peters 2006)
Leguminosae
Isoflavonoides Faseolina en Frijol
(Dakora & Phillips 1996)
Solanaceae
Sesquiterpenos Risitina en Papa (Engstrom 1998)
Vitaceae Estilbenos Resveratrol en uvas (Calderon et al. 1993)
47
Un aspecto central que debe ser considerado cuando se estudian las fitoalexinas y su
papel en defensa de las plantas, está relacionado con la capacidad que presentan
algunos patógenos para detoxificarlas una vez éstos han infectado los tejidos de la
planta. En este aspecto, son muchos los reportes en los que enzimas secretadas por el
patógeno degradan estos compuestos y favorecen su virulencia en la infección (Vanetten
et al. 2001; Pedras & Ahiahonu 2005)
1.5. Metabolismo secundario y defensa vegetal
Es bien sabido que el metabolismo secundario en plantas comprende una enorme
diversidad de compuestos y enzimas y un amplio espectro de procesos relacionados con
la regulación de genes y fenómenos de transporte celular. Debido a esto su papel en los
mecanismos de defensa vegetal ha llamado la atención, desde hace varias décadas, la
comunidad científica ha generado muchas investigaciones enfocadas a su estudio.
Actualmente se conoce que existe una alta diversidad de compuestos que cumplen
papeles determinantes en los mecanismos de defensa vegetal, ya sea por su papel como
fitoanticipinas, fitoalexinas o moléculas señal (Harborne 1999; Grayer & Kokubun 2001;
González-Lamothe et al. 2009).
La estimulación de diversas rutas biosintéticas del metabolismo secundario en plantas
ante la presencia de ciertos microorganismos fitopatógenos, ha sido estudiada en
muchas especies vegetales y es claro que existe una alta diversidad estructural para los
compuestos que son sintetizados durante estos procesos de interacción planta-patógeno
(Hammerschmidt 1999; Bonanomi et al. 2009). Tal diversidad de compuestos ha sido
relacionada, por estudios en metabolómica, con el papel poco específico que al parecer
pueden cumplir ciertas enzimas del metabolismo secundario. Esta propuesta contrasta
con el papel altamente específico que se le ha otorgado a las enzimas, pero permite
explicar el por qué de la existencia de un número tan importante de metabolitos en
plantas, a pesar de la existencia de un número al parecer limitado de enzimas
relacionadas con biosíntesis (Schwab 2003; Kroymann 2011). Muchas de estas enzimas
se encuentran asociadas generalmente en complejos multi-enzimáticos que permiten que
la biosíntesis se lleve a cabo rápidamente en cada uno de sus pasos secuenciales, sin la
necesidad de realizar transporte de los intermediarios a través del citoplasma (Saslowsky
& Winkel-shirley 2001). Este modelo también propone que en muchos casos dicha
48
biosíntesis se realiza cerca del retículo endoplasmático, para que los metabolitos
sintetizados sean translocados para su ubicación celular o extracelular específica. Dichos
procesos involucran cambios en los potenciales de las membranas internas, afección en
el tráfico vesicular, acción de transportadores ABC y en general procesos relacionados
con la exportación de componentes al apoplasto y vacuolas (Agati et al. 2012; J. Zhao &
Dixon 2010), en aquellos tejidos en donde se expresa la respuesta de defensa por la
presencia de patógenos (Huckelhoven 2007). Muchos de los estudios que a la fecha se
han realizado sobre el metabolismo secundario y su relación con defensa vegetal, se han
llevado a cabo sobre la ruta fenilpropanoide. Considerando el papel que puede cumplir
esta ruta en la generación de algunos metabolitos de defensa en el clavel, a continuación
se presentan algunos aspectos de la misma.
1.5.1. Ruta fenilpropanoide
La ruta fenilpropanoide genera un diverso conjunto de compuestos de naturaleza
fenólica, que participan en procesos metabólicos claves para la planta. Todos los
compuestos generados por esta ruta son derivados del ácido cinámico, el cual se forma a
partir de fenilalanina por la enzima fenilalanina amonio liasa, conocida como PAL, por las
siglas de su nombre en inglés (Phenylalanine Ammonia-Lyase). Esta enzima permite
transformar la fenilalanina, un compuesto proveniente del metabolismo primario, en ácido
cinámico, un precursor que se diversifica en un amplio rango de compuestos en plantas
(N. G. Lewis & Yakamoto 1990; Hyun et al. 2011). A partir de este compuesto, por
ejemplo, se generan por reacciones de hidroxilación, metilación, deshidratación, entre
otras, los ácidos p-cumárico, cafeico, ferúlico y sinápico. Estos metabolitos a su vez
participan en diferentes procesos como la lignificación, fortalecimiento de paredes
celulares por formación de ésteres con carbohidratos de ésta y en general la biosíntesis
de otros compuestos más complejos (Dixon & N. L. Paiva 1995; Vogt 2010)
Considerando el papel central que muchos de estos compuestos juegan en la adaptación
de la planta bajo condiciones de estrés, se le ha otorgado a esta ruta biosintética un
papel determinante para la supervivencia vegetal. Dicho papel está relacionado con
condiciones de estrés como: la deficiencia de algunos nutrientes, las bajas temperaturas,
la exposición a luz U.V, entre otros (Dixon & N. L. Paiva 1995; Dixon et al. 2002; Vogt
2010).
49
Dentro de los productos de mayor interés para la ruta fenilpropanoide se destacan
aquellos que se generan con la participación de compuestos provenientes de otras rutas,
como es el caso de los flavonoides. En la ruta de los flavonoides, el p-cumaroil coA
proveniente de la ruta fenilpropanoide, reacciona con malonilCoA, proveniente del
metabolismo primario, para generar la naringerina, gracias a la acción conjunta de las
enzimas Chalcona Sintasa y Chalcona Isomerasa (Harborne et al. 1975). A partir de este
punto, la diversificación de la naringerina gracias a la acción de un importante número de
enzimas, genera una alta diversidad de compuestos con múltiples funciones en la planta,
entre los cuales se destacan las flavononas, los flavonoles, las flavonas, las
proantocianidinas y las antocianinas (Figura No. 1). Muchas de las enzimas involucradas
en esta ruta han sido purificadas, y sus genes han sido caracterizados en varias especies
vegetales (T. Yamaguchi et al. 1999; Boddu et al. 2004; J. R. M. Almeida et al. 2007;
Bellés et al. 2008; Y. Y. Han et al. 2009; K. Saito et al. 2013). Se ha encontrado que, a
pesar que la mayoría de dichas enzimas se encuentran codificadas por familias de genes
regulados de manera diferencial en función del tejido vegetal en estudio (Naoumkina et
al. 2010), se presentan factores de transcripción comunes que regulan su expresión
génica (Dixon et al. 2002; Vom Endt et al. 2002; Agati et al. 2012; K. Saito et al. 2013).
Uno de los aspectos de mayor interés para el estudio de los flavonoides en plantas, es el
de su aplicación en campos como la farmacéutica, los alimentos y la misma fitopatología.
De esta manera se han creado un importante número de líneas de investigación que han
estudiado sus diferentes aplicaciones y ha generado interés por los mecanismos
bioquímicos y moleculares que determinan la biosíntesis de estos compuestos, tanto a
nivel de su estimulación, usando diferentes técnicas de elicitación (Vasconsuelo & Boland
2007; Troncoso-Rojas et al. 2012) o mediante sobreexpresión generando genotipos
recombinantes que presentan altos niveles constitutivos de estos compuestos (Schijlen et
al. 2004; S. Wu & Chappell 2008; Rahnama et al. 2012).
50
1Figura No. 1. Representación esquemática de la ruta fenil propanoide y la vía de los flavonoides. Se muestran las enzimas que actúan en cada uno de los pasos. 4CL, p-cumarato:CoA ligasa; ANR, Antocianidin Reductasa; ANS, Antocianidin Sintasa; C3H, p-cumaroil-CoA 3-hidroxilasa, C4H, Cinamato 4-hidroxilasa; CHI, Chalcona Isomerasa; CHS, Chalcona Sintasa; DFR, Dihidroflavonol 4-reductasa; FGTs, Glicosiltranseferasas para flavonoides, FHT, Flavanona 3β-hidroxilasa; FLS, Flavonol Sintasa; FNS, Flavanona Sintasa; LAR, Leucoantocianidin Reductasa; PAL, Fenilalanina Amonio Liasa.
PAL
CHS CHS
CHI
51
1.5.2. Flavonoides
Los flavonoides son compuestos polifenólicos, ubicuamente distribuidos en plantas, que
cumplen con funciones muy importantes, generalmente relacionadas con procesos como
la atracción de polinizadores, la protección contra la luz ultravioleta, la señalización
celular y la interacción con otros organismos como los insectos y microrganismos
benéficos o patógenicos (Harborne & Williams 2000; L. J. Shaw et al. 2006). La
estructura básica de los flavonoides es el núcleo flavano que consta de 15 átomos
de carbono en tres anillos C6-C3-C6 (difenilpropano) que son nombrados A, B y C
(figura No. 2). Las diferentes clases de flavonoides difieren en su nivel de oxidación
y su patrón de sustitución sobre oxígeno y carbono en los anillos A y B. Las clases
más comunes son flavonoles, flavonas, flavanonas, catequinas, antocianidinas,
isoflavonas, dihidroflavonoles, proantocianidinas y chalconas
O
A
B
C
4'
1'
2'
104
3
2
1
3'
5'
6'
8
7
6
5
9
Figura 6. Estructura del Flavano (2 fenilbenzopirano)
2Figura No. 2. Estructura del flavano (2-fenilbenzopirano)
3
Esta alta diversidad estructural está determinada por la presencia de diferentes enzimas
que actúan modificando la estructura de estos compuestos y aumentando la diversidad
en el grupo. Enzimas del tipo sintasas, metiltransferasas, isomerasas, oxidoreductasas e
hidroxilasas, se han encontrado como las enzimas que participan en la biosíntesis de
flavonoides en plantas (Bernd Weisshaar & Jenkins 1998; K. Saito et al. 2013). Tal y
como se presenta en la figura No 1, son muchas las enzimas que participan en la
diversificación de los flavonoides. Diferentes estudios han propuesto que al parecer,
enzimas como fenilalanina amonio liasa (PAL), chalcona sintasa (CHS) y chalcona
isomerasa (CHI), tienen un papel central en la regulación de estas vías biosintéticas. En
este punto se destaca la relación que existe entre los niveles de flavonoides y de
actividad para estas enzimas lo cual ha permitido postular que, al modificar los niveles de
éstas, se afectan los niveles de flavonoides y también por ende, los efectos que estos
últimos presentan en la planta (Winkel-Shirley 2002; Schijlen et al. 2006; Lorenc-Kukuła
52
et al. 2007). Dicho papel regulador al parecer está relacionado con la naturaleza de la
reacción que catalizan y de los factores de transcripción que regulan su expresión génica
(Vom Endt et al. 2002; Dubos et al. 2010; Agati et al. 2012).
Papel de los flavonoides en defensa vegetal
Diferentes estudios han encontrado que los flavonoides hacen parte de la respuesta de
defensa activa que presentan las plantas ante el ataque fitopatógenos (Pedras et al.
2003; McNally et al. 2003; Boddu et al. 2004; Steinkellner et al. 2007; Mikulič Petkovšek
et al. 2011; H. G. Kim et al. 2011; Großkinsky et al. 2012; Kröner et al. 2012). En muchos
de estos casos, estos compuestos se clasifican como fitoalexinas propiamente,
considerando que no se encuentran a nivel constitutivo o no son detectados con las
técnicas usadas. En otros casos, dichos compuestos se pueden encontrar a nivel
constitutivo y presentar un aumento en sus niveles pos infección, siendo considerados
compuestos similares a fitoalexinas. La clasificación formal de un flavonoide como
fitoalexina, requiere que se presente activación de novo de su biosíntesis generalmente
asociada a la expresión de genes durante el proceso infectivo (Treutter 2006; González-
Lamothe et al. 2009). En general, se ha encontrado que la diversidad estructural de los
flavonoides involucrados en este tipo de respuestas activas, es alta e incluye en muchos
de los casos, diferentes tipos de flavonoides glicosilados (tabla No. 3). Considerando su
ubicua distribución en plantas y su versatilidad funcional, se ha propuesto que la
participación de estos compuestos en resistencia puede estar asociada a diferentes
factores entre los que se destacan su actividad antimicrobiana y propiedades
antioxidantes (Treutter 2006; Weston & Mathesius 2013). Con respecto a sus
propiedades antimicrobianas, se ha descrito que está asociada con un efecto al proceso
de germinación de estructuras de latencia y con la inhibición directa del crecimiento por la
acción sobre la síntesis de ácidos nucleicos en el proceso de replicación (Cushnie & A. J.
Lamb 2011).
En otros casos se ha propuesto que la participación de los flavonoides en resistencia
puede tambien estar asociada a su capacidad antioxidante asociada a la regulación de
los niveles de especies altamente oxidantes (Especies Reactivas de Oxígeno “ERO” y
Especies Reactivas de Nitrógeno “ERN”) (Garcia-Limones et al. 2003; Lorenc-Kukuła et
al. 2007; Polkowska-Kowalczyk et al. 2007; Sá et al. 2009; Agati et al. 2012). Estas
especies son generadas como parte del proceso de defensa, cumpliendo diversas
53
funciones relacionadas con señalización. Sin embargo, pueden afectar proteínas vitales
para la célula vegetal si no se hace una regulación estricta de los niveles de los mismos
(Hammerschmidt 2005). De esta manera, la misma planta controla los procesos que
aunque hacen parte de la respuesta de defensa, pueden afectar algunas funciones
necesarias para su funcionamiento una vez se ha superado la infección con el patógeno
(Agati et al. 2012). El modo de acción particular o su papel como fitoanticipinas o
fitoalexinas, dependen de factores como la especie vegetal y el patógeno involucrado
(Treutter 2006)
Tabla No. 3 Ejemplo de algunos flavonoides involucrados en respuestas de defensa activa
Especie
vegetal Tipo de molécula Metabolito específico Referencias
Pinus strobus Flavanona (2S)- Pinocembrina (Hanawa et al.
2001)
Oryza sativa
Flavanona Sakuranetina (Kodama et al.
1992)
Sorghum spp Antocianidinas
Epigenidina y Luteolinidina
(Boddu et al. 2004)
Glycine max
Isoflavonoides
Faseolina
(Dakora & Phillips
1996)
Thlaspi
arvense C- glicósido de flavona
Isovitexin ( apigenina- 6-C--
glucopiranosido )
(Pedras et al. 2003)
Cucumis
sativus L.
C-glicósido de flavonoide
Cucumerina A
(McNally et al.
2003)
Citrus unshiu Flavanonas, flavonas y O-
glicósidos de flavonas
Naringina, hesperidina, poncirina,
Isosinensetina, hexametoxiflavona,
(H. G. Kim et al.
2011)
54
Solanum
tuberosum O- Glicósidos Rutina y nicotiflorina (Kröner et al. 2012)
V.
corymbosum O- Glicósidos Quercetina-3-O-rhamnosido (Miles et al. 2013)
Juglans nigra L O- Glicósidos Quercetina- 3-O- rhamnosido (Mikulič Petkovšek
et al. 2011)
Vitis vinífera O- Glicósido Quercetina- 3-O- glicósido (Ali et al. 2012)
Enzimas involucradas en la biosíntesis de flavonoides
Dentro del variado conjunto de enzimas que participan en la biosíntesis de flavonoides
(figura No. 1), se ha citado que enzimas como la fenilalanina amonio Liasa (PAL), la 4-
cumarato hidroxilasa (4CH), la chalcona sintasa (CHS), y la Chalcona Isomerasa (CHI)
son claves para la acumulación de estos compuestos en plantas (Dixon et al. 2002;
Schijlen et al. 2004; Naoumkina et al. 2010). A continuación se presentan algunos
aspectos claves de las enzimas que son objeto de estudio en esta investigación, las
enzimas PAL, CHS y CHI:
PAL: FENILALANINA AMONIO LIASA (E. C. 4.3.1.5)
La enzima Fenilalanina Amonio Liasa (4.3.1.5) cataliza la primera reacción de la ruta
fenilpropanoide, que consiste en la formación de acido cinámico a partir de fenilalanina
(figura No. 1). Desde hace ya algunas décadas se ha propuesto que esta enzima juega
un papel clave en la regulación de esta ruta del metabolismo secundario (Bate et al.
1994; Hyun et al. 2011). La PAL en plantas vasculares se encuentra codificada en el
núcleo por un conjunto de genes que pueden presentar diferentes patrones de expresión
de acuerdo con la parte de la planta y las condiciones medioambientales en que se
encuentre expuesta (Y. Y. Kao et al. 2002; Cochrane et al. 2004).
Considerando que la PAL cataliza el primer paso de la ruta fenilpropanoide, desde hace
ya algunas décadas se ha propuesto que esta enzima juega un papel clave en su
regulación (Bate et al. 1994). Se ha determinado que en monocotiledóneas también
puede tomar una vía alterna usando L-Tirosina como sustrato para generar ácido p-
cumárico (Rosler et al. 1997). Se encuentra en la fracción citoplasmática de la célula,
generando metabolitos que son translocados vía retículo endoplasmático hacia el
55
apoplasto, en donde participan en lignificación y fortalecimiento de las paredes celulares
(Sato et al. 2004; J. Zhao & Dixon 2010).
Los estudios clásicos realizados con Arabidopsis thaliana y Nicotiana tabacum,
permitieron encontrar algunos de los mecanismos moleculares que estaban involucrados
en la regulación de los genes codificantes para estas enzimas (Kawamata et al. 1997).
En dichas investigaciones con plantas de tabaco transformadas que presentaban
diferente formas de la proteína quimérica de fusión entre el promotor PSPAL1 y el gen de
la Beta- Glucuronidasa (GUS), se encontró que la expresión de estas proteínas está
regulada por el desarrollo de la planta, así como por estímulos externos. Dentro de estos
últimos se destacan principalmente factores medioambientales y la acción de
microorganismos fitopatógenos. Estudios más recientes, han estado enfocados a
determinar cuáles son los factores que están involucrados en la regulación de estos
genes y se ha encontrado que existen factores comunes de transcripción para muchos
de ellos, lo que indica que su transcripción se presenta de manera coordinada luego de
un estímulo externo (Vom Endt et al. 2002; Dubos et al. 2010).
CHS: CHALCONA SINTASA (E.C.2.3.1.74)
La chalcona sintasa (E.C.2.3.1.74), es una enzima homodimérica que cataliza la
formación del anillo aromático A del esqueleto flavonoide por condensaciones
secuenciales de tres moléculas de malonil-CoA, produciendo la 2´,4,4´,6´,
tetrahidroxichalcona. Esta condensación se asemeja a la que se presenta en el
metabolismo primario durante la biosíntesis de ácidos grasos (Michael B. Austin &
Joseph P. Noel 2003). La enzima fue descrita por primera vez en la década de los
setenta, cuando se determinó, gracias al uso de sustratos marcados isotópicamente, que
extractos obtenidos de células en suspensión, eran capaces de realizar la síntesis de
naringerina (Kreuzaler & Hahlbrock 1975). Esta enzima se encuentra ampliamente
distribuida en tejidos vegetales, de plantas gimnospermas y angiospermas, siendo
purificada y caracterizada de muchas fuentes vegetales (Michael B. Austin & Joseph P.
Noel 2003; J-L Ferrer et al. 2008). Su importancia en la biosíntesis de flavonoides le ha
otorgado un papel protagónico en muchos procesos fisiológicos, entre los que se
encuentran la resistencia a patógenos (Dao et al. 2011).
Los genes que codifican para estas proteínas se encuentran distribuidos en familias para
algunas de las plantas estudiadas a la fecha (Koes & Spelt 1989; M. Ito et al. 1997). La
56
regulación de la expresión de estos genes está al parecer controlada de manera
diferencial en los diferentes tejidos de la planta (Claudot et al. 1997), por el control de
algunos factores de transcripción altamente conservados en plantas, de acuerdo con
estudios realizados en maíz y en Arabidopsis thaliana (Vom Endt et al. 2002). En dichos
estudios, se ha encontrado que la expresión de varios de los genes que codifican
enzimas involucradas en el metabolismo fenilpropanoide, incluyendo los de la enzima
CHS, están regulados por el mismo conjunto de factores de transcripción (Vom Endt et
al. 2002). Dichos factores corresponden a proteínas que forman parte de dos distintas
familias de factores de transcripción, que presentan homología a la proteína codificada
por el proto-oncogen c-MYB y la proteína básica-Helix-Loop-Helix (bHLH) codificada por
el proto-onco gen c-MYC. Otros niveles de regulación postranscripcional como la
inhibición por producto, RNA interferente o activación de enzimas inactivas se pueden
presentar en ciertas especies vegetales (Kasai et al. 2004; Dao et al. 2011).
CHI: CHALCONA ISOMERASA (E.C. 5.5.1.6)
La enzima chalcona isomerasa (E.C. 5.5.1.6) cataliza la ciclización intramolecular de la
chalcona sintetizada por la chalcona sintasa (CHS), para formar de manera específica la
(2S)-Naringerina, compuesto central para la generación de otros flavonoides más
complejos. Aunque es bien sabido que dicha reacción se presenta de manera
espontánea, cuando la isomerización se presenta se obtiene una mezcla de isómeros
correspondientes a los compuestos (2S)-Naringenina y (2R)-Naringenina. Además, de
permitir la isomerización enantioespecífica, la acción de la enzima puede aumentar la
velocidad de reacción a casi 100000 veces comparando con la isomerización espontánea
(Jez et al. 2002). Mutantes que presenten compromisos en la actividad catalítica de esta
enzima, presentan disminuciones muy importantes en los niveles de flavonoides (Reuber
et al. 1997; Hong et al. 2012), mientras que la sobreexpresión genera un aumento en los
niveles de estos mismos compuestos (F.-X. Li et al. 2006; N. Il Park et al. 2011). Se ha
establecido el mecanismo químico de la isomerización y se han identificado los
aminoácidos del sitio activo que están comprometidos con la catálisis enzimática, así
como las fuerzas intermoleculares que permiten la estabilización del complejo enzima-
sustrato (Jez & Joseph P Noel 2002).
57
La chalcona isomerasa está constituida por unidades monómericas de aproximadamente
220 residuos y se ha aislado de diversas especies vegetales. Los diversos estudios que
se han llevado a cabo con el fin de evaluar a nivel conformacional la estructura de la
enzima, han permitido establecer que presenta forma de “pinzas” que toman el sustrato
de manera específica y lo acomodan para llevar a cabo la reacción enantioselectiva,
gracias a la presencia de diferentes α-hélices y hojas β-plegadas que favorecen dicha
interacción (Jez et al. 2002). Diferentes investigaciones recientes a nivel bioquímico y
molecular han estado enfocadas a profundizar sobre su papel en plantas y se ha
determinado que pueden presentar mecanismos de regulación semejantes a los que han
sido reportado para otras enzimas de la ruta (Czemmel et al. 2012; W. Wang et al. 2012).
1.6. Actividad antioxidante
Las reacciones de óxido reducción tienen una amplia distribución en la naturaleza y
suceden tanto en el reino animal como en el vegetal, durante el proceso de respiración
celular mientras se consume oxígeno, y se genera ATP, produciendo dióxido de carbono
y agua. Sin embargo, durante esta transformación normal se producen también otras
moléculas residuales, las especies reactivas del oxígeno (EROS) (Céspedes & Sánchez
2000; Hansberg 2002). Dichas especies participan en diversos procesos de señalización
que tienen como objetivo, la modulación de la respuesta al estrés especifico al cual está
sometida la planta (G Paul Bolwell & Daudi 2009; Grant & Loake 2000; Mendoza 2011;
Faulkner & Robatzek 2012; Barna et al. 2012).
Las EROS son átomos o moléculas, dotadas de un electrón desapareado en un nivel
energético superior y por tanto con propiedades paramagnéticas que las hace inestables
y altamente reactivas. Atacan los enlaces de proteínas de los tejidos, los fosfolípidos
poliinsaturados de las membranas celulares, carbohidratos y los ácidos nucleicos de las
células. Al actuar, se activa una reacción en cadena que podría incluso llevar a la muerte
de la célula (Hansberg, 2002). Entre las EROS cabe destacar los radicales: ión
superóxido (O2.-), radical hidroxilo (˙OH), alcoxilo (RO˙), peroxilo (ROO˙) y óxido de
nitrógeno (NO˙) y las no radicales: peróxido de hidrógeno (H2O2) y peroxinitrito (ONOO-)
(Hansberg 2002).
Es importante recordar que la producción de especies altamente oxidadas no es un
fenómeno exclusivo de las condiciones de estrés, de hecho la producción de EROs y
58
nitrógeno (Especies reactivas de nitrógeno ERN) por parte de ciertas reacciones de
oxido-reducción del metabolismo, se presenta de manera normal a nivel celular ante
fenómenos como el transporte de electrones en la cadena respiratoria, la auto-oxidación
de aminoácidos, proteínas, lípidos y ácidos nucleicos. Sin embargo, la célula vegetal, así
como en general las células de los organismos aerobios, cuentan con sistemas de
protección en los que participan enzimas como la superóxido dismutasa, la glutatión
peroxidasa, la catalasa, entre otras (Gara et al. 2003; Mittler et al. 2004; Mandal et al.
2008; Nikraftar et al. 2013). Además de este control enzimático, existen diferentes
compuestos químicos a nivel celular que permiten disminuir los niveles de estos
compuestos altamente reactivos, teniendo en cuenta que tienen la capacidad de
reaccionar con éstos y disminuir sus niveles, como es el caso de los carotenoides (β-
caroteno) y compuestos fenólicos como flavonoides (antocianinas), entre otros.
Reportes recientes en algunas especies vegetales, han propuesto que altos niveles de
actividad antioxidante pueden estar relacionados con defensa ya que el control estricto
de los niveles de EROS, es necesario para evitar daños a nivel de membrana y en
proteínas necesarias para el funcionamiento celular (Hammerschmidt 2005). Es por ello
que al parecer altos niveles de sustancias antioxidantes pueden estar relacionados con
resistencia a diferentes tipos de patógenos incluyendo algunos del género Fusarium
(Garcia-Limones et al. 2003; Lorenc-Kukuła et al. 2007; Polkowska-Kowalczyk et al.
2007; Sá et al. 2009).
POD: PEROXIDASAS (E.C.1.11.1.7)
La peroxidasa (POD) es una enzima implicada en la diferenciación y desarrollo de las
plantas y en respuestas defensivas contra patógenos. Un incremento en la actividad y/o
en la expresión de isoenzimas de peroxidasas es característico de la defensa de las
muchas plantas (Morkunas & Gmerek 2007; A. Dihazi et al. 2011; L. Huang &
Backhouse 2005; P. Prasad et al. 2003; Madadkhah et al. 2012; Mandal et al. 2008). Las
peroxidasas no poseen actividad antifúngica por sí mismas, pero están involucradas en
respuestas a enfermedades porque junto con enzimas como las polifenoloxidasas,
catalizan la oxidación de compuestos fenólicos para la polimerización de la lignina. A
pesar de que las reacciones químicas básicas de las PODs están bien establecidas,
involucrando peróxido de hidrógeno y donores de hidrógeno, también se ha encontrado
que pueden estar asociadas a la generación de peróxido de hidrógeno en la planta
59
(Kawano 2003; Schweizer 2008). Cuando se presentan situaciones de estrés por frío,
estrés mecánico, osmótico o por defensa al ataque de fitopatógenos, es característico
que se produzca como respuesta un incremento súbito en el contenido de sustancias
oxidantes, teniendo lugar una rápida generación de anión superóxido y acumulación de
H2O2 en el apoplasto. Aparentemente, esta acumulación de peróxido tiene diferentes
funciones: induce señales para la transcripción de proteínas de defensa, así como para la
síntesis de fitoalexinas; además, actúa como una forma directa de defensa debido a la
naturaleza antimicrobiana del H2O2 provocando cambios en la estructura de la pared
celular por una rápida insolubilización de las proteínas existentes en la misma, lo que
conduce a su endurecimiento (G Paul Bolwell & Daudi 2009; Mendoza 2011; Heller &
Tudzynski 2011).
A nivel estructural las peroxidasas presentes en los diferentes reinos se pueden clasificar
en 3 súper familias, dentro de las peroxidasas del tipo I encontramos las ascorbato
peroxidasa, enzimas citoplasmáticas, ampliamente conservadas en procariotes y
eucariotes que están involucradas en los sistemas antioxidantes de protección celular
junto con otras enzimas como la catalasa y la glutation reductasa (Gara et al. 2003;
Zámocký et al. 2010; Nikraftar et al. 2013). El grupo II incluye peroxidasas glicosiladas
ampliamente distribuidas en los hongos, las cuales, considerando sus potenciales
aplicaciones en la industria, presentan alto interés biotecnológico (Franken et al. 2011).
Finalmente y no por ello menos importantes, están las peroxidasas de tipo III,
hemoproteínas que se encuentran ubicadas principalmente a nivel del apoplasto, con
puentes disulfuro característicos y dominios de unión a Ca+2 (Mathé et al. 2010).
Considerando que muchas de las enzimas de esta familia presentan ubicación
extracelular, su papel en la inactivación de peróxido de hidrógeno y lignificación, ha sido
ampliamente asociado a la expresión de resistencia vegetal (Almagro et al. 2009; Mathé
et al. 2010; Lüthje et al. 2011). Con respecto al papel que esta enzima cumple en el
metabolismo de las EROs, se ha descrito que hace parte de los sistemas antioxidantes
enzimáticos que protegen a las células de los posibles daños que dichas especies
pueden ocasionar. Dicho papel está relacionado con la capacidad que presentan de
descomponer H2O2, especie altamente oxidante generada por el metabolismo oxidativo
(Polkowska-Kowalczyk et al. 2007; Tománková et al. 2006; Mandal et al. 2008; Almagro
et al. 2009).
60
1.7. Estudios de niveles transcripcionales en modelos planta-patógeno
El estudio de los niveles de transcripción de genes relacionados con defensa constituye
uno de los aspectos de mayor interés en el estudio de las interacciones hospedero-
patógeno (Wise et al. 2007). Actualmente los avances tecnológicos permiten evaluar de
manera simultánea, la expresión de cientos de genes mediante el uso combinado de
técnicas como microarreglos o RNAseq, asociados a diferentes herramientas de análisis
bioinformático (Dhaubhadel et al. 2007; Desmond et al. 2008; Alessandra et al. 2010;
Zhuang et al. 2012). La generación de información a gran escala por parte de estas
aproximaciones holísticas, proporciona un panorama global de la respuesta de defensa
de la planta en términos de los cambios en los transcriptomas y permite la aplicación de
herramientas de la biología de sistemas (Pinzón et al. 2010). Es importante destacar que
para que estos resultados sean validados, se requiere del uso de técnicas como realtime
PCR que permiten confirmar las diferencias en los niveles de transcripción encontradas
para los genes de interés (Desmond et al. 2008; D’Ippólito et al. 2010; Boava et al. 2011;
Bailey et al. 2013).
Para ciertos modelos, si se tienen evidencias histológicas, celulares o bioquímicas que
permitan conocer de antemano cuáles son los fenómenos asociados con la expresión de
resistencia en la planta, el estudio de los niveles de transcripción para genes específicos
asociados, permiten obtener información sobre los mecanismos de regulación que están
involucrados en una respuesta en particular de la planta (Hao et al. 2009; Upchurch &
Ramirez 2010; Gaige et al. 2010; Louime et al. 2011; B. G. Kim et al. 2012). Este es el
caso, por ejemplo, del metabolismo secundario y su papel en resistencia vegetal, en
donde bajo dicha aproximación, se han realizado diversos estudios usando técnicas
como Northern Blot o RT-PCR, en especies vegetales como: uvas (Kostekamp 2006),
pepino cohombro (Cools & H. Ishii 2002), trigo (D. . Bishop 2002), sorgo (Little & C. W.
Magill 2003), yuca (Gómez-Vásquez et al. 2004), arveja (Arfaoui et al. 2007), lino
(Lorenc-Kukuła et al. 2007), arroz (Kuroda et al. 2006), naranja (Ballester et al. 2006),
pera (Mohamed Faize et al. 2004). Sin embargo, el uso de realtime PCR se ha
posicionado en los últimos años como la herramienta más usada en este tipo de
estudios, considerando que permite una cuantificación fiable de los niveles
transcripcionales en muestras biológicas. Esta técnica se ha aplicado, entre otros, para el
caso de almatruz (Morkunas et al. 2011), carretón truncado (Die et al. 2009), arroz (Hao
61
et al. 2009), soya (Upchurch & Ramirez 2010), uva (Louime et al. 2011) y álamo (B. G.
Kim et al. 2012).
1.8. Estudios proteómicos comparativos en modelos de interacción planta-patógeno
Los estudios a nivel proteómico de diferentes modelos planta patógeno han venido en
aumento en los últimos años y se han convertido en una herramienta clave para la
caracterización de las respuestas asociadas a resistencia (Thurston et al. 2005b; Quirino
et al. 2010). Si bien es cierto que muchos de los estudios que actualmente se realizan en
fitopatología molecular están basados en análisis genómicos y transcriptómicos, es
importante no olvidar que son las proteínas las que determinan los distintos fenotipos
vegetales y deben ser por tanto, objeto de particular atención en el momento de estudiar
la resistencia vegetal (Jesús V. Jorrín-Novo et al. 2008). Además, considerando que en
muchas ocasiones los resultados de expresión génica no correlacionan con los datos
proteómicos (Mackay et al. 2004), es ideal validar con experimentos a nivel proteíco o
funcional, los resultados obtenidos mediante técnicas transcriptómicas. El éxito del uso
de una técnica proteómica en plantas está determinado por la selección de las técnicas
adecuadas para extracción, separación y análisis de proteínas, así como en el
planteamiento de un diseño experimental adecuado, sobre todo si se trata de estudios
comparativos (Valledor & Jorrín 2011). Al respecto, las aproximaciones proteómicas
comparativas basadas en electroforesis en 2 dimensiones y posterior análisis de
identificación mediante espectrometría de masas (MALDI-TOF matrix-assisted laser
desorption/ionization – time of flight), se han constituido en herramientas usadas en el
estudio de los mecanismos de defensa en especies como: arroz (Y.-Z. Lin et al. 2008;
Koga et al. 2012), arabidopsis (Mukherjee et al. 2010), trigo (Ding et al. 2011), garbanzo
(Palomares-Rius et al. 2011), menta (Sinha & Chattopadhyay 2011), guisantes (Barilli et
al. 2012), uva (Milli et al. 2011) y fresa (Xianping Fang et al. 2012). Es importante
destacar que aproximaciones metodológicas alternas, que requieran el uso de geles
como el DIGE (2-dimenssional difference gel electrophoresis) (Asano et al. 2012) o que
no lo requieran como las MudPIT (multidimensional protein identification technology), se
usan también para el estudio de las interacciones planta-patógeno (J. F. González et al.
2012; Petriccione et al. 2013). Considerando el alto impacto a nivel económico que tienen
las enfermedades causadas por hongos del género Fusarium, son varios los estudios a
62
nivel proteómico que han buscado dilucidar los mecanismos de defensa vegetal
asociados a su resistencia (Ding et al. 2011; Palomares-Rius et al. 2011; K. Shin et al.
2011; Eggert et al. 2011; Asano et al. 2012).
1.9. Modelo experimental Dianthus caryophyllus L - Fusarium oxysporum f. sp. dianthi raza 2
1.9.1. El hospedero: Clavel Dianthus caryophyllus L.
El clavel es una planta herbácea perteneciente al género Dianthus y a la familia de las
Cariofiláceas. Nativo del Mediterráneo, Dianthus caryophyllus L. es actualmente el origen
de múltiples variedades obtenidas principalmente por cruzamientos.
Dianthus caryophyllus L. es una planta de tendencia rastrera, de tallos articulados y
nudosos; de hojas lineales, opuestas, paralilenervias, de color verde claro, recubiertas
por una capa cerosa. Sus flores son hermafroditas, frondosas, de gran vistosidad y están
ubicadas al final del tallo. Además, poseen características favorables para su
comercialización como son la duración de la flor una vez cortada, la resistencia al
embalaje y la posibilidad de producción durante todo el año (Pizano de M 2000). La
reproducción del clavel se efectúa por semilla o por esquejes, siendo la primera la más
utilizada para la obtención de nuevas variedades. La propagación por esquejes es el
sistema utilizado comercialmente, porque mantiene las características de la variedad y
por el elevado número de esquejes que se obtienen de la planta madre. Las condiciones
climáticas de la sabana de Bogotá; 18 a 20oC de día y 6 a 8oC por la noche, son las
ideales para la producción del clavel, las que sumadas a otros factores, han permitido
que el cultivo de esta flor sea una de las más importantes dentro de las flores de
exportación cultivadas en nuestro país (Pizano de M 2000; Castellanos et al. 2009).
1.9.2. El patógeno: Fusarium oxysporum f. sp. dianthi
Fusarium oxysporum es una especie cosmopolita, habitante natural del suelo, constituido
por líneas patogénicas y no patogénicas, clasificadas en este grupo en función de
criterios morfológicos como la forma de sus macroconidias, la estructura del
microconideoforo y la formación y disposición de clamidosporas (Bosland 1988).
Presenta un micelio aéreo, abundante, algodonoso y con una coloración que puede
variar del blanco al rosado, y en algunos casos de púrpura a violeta intenso dependiendo
63
de la edad (Di pietro et al. 2003). En los últimos años se ha determinado que puede
llegar a ser patogénico para personas inmunosuprimidas y se ha propuesto que es
debido a la variabilidad genética propia de la especie (M. I. Roncero et al. 2003).
Fusarium oxysporum se caracteriza por presentar una reproducción predominantemente
asexual, en donde participan 3 tipos de esporas (Barrera & Gómez 1995): las
microconidias, estructuras unicelulares de pared delgada y generalmente de forma
redonda a elipsoidal, las cuales cumplen una importante función en la diseminación del
patógeno en los haces vasculares de la planta; las macroconidias, estructuras de mayor
tamaño que las anteriores, tienen pared delgada y están compuestas de 3 a 6 células.
Estas son un criterio clave para la clasificación taxonómica, pues su forma fusiforme, (de
ahí el nombre de este organismo) es característica de este género (Pizano de M 2000) y
las clamidosporas, son estructuras bastante resistentes a condiciones ambientales
adversas, lo que les permite cumplir un papel importante en la supervivencia del
patógeno en ausencia del hospedero.
Actualmente se han caracterizado más de 120 formas especiales que se diferencian de
acuerdo con la especie vegetal a la que infectan. Dentro de la forma especial dianthi, se
presentan 8 razas fisiológicas, que difieren ampliamente en su virulencia. Dentro de estas
se ha identificado la raza 2 como la más patogénica, las razas 8, 4 y 1 que le siguen en
virulencia y por último las razas 5, 6 y 7.
Las especies que se encuentran clasificadas dentro del género Fusarium presentan
dentro del arsenal que despliegan en el momento de infectar y colonizar una planta,
mecanismos bastante complejos dentro de los que se destacan un sistema de
percepción bastante sensible que le permite regular sus efectores y factores de
virulencia, proteínas degradadoras de la pared celular vegetal (poligalacturonasas,
pectatoliasas y pectinmetilesterasas) y factores que le permiten realizar una
destoxificación de las fitoalexinas y fitoanticipinas relacionadas con la defensa vegetal (Di
pietro et al. 2003).
1.9.3. El marchitamiento vascular del clavel
Desde finales del siglo XIX, cuando fue reportada por primera vez en Estados Unidos, la
marchitez vascular causada por Fusarium en el clavel, se ha convertido en un factor
limitante de la producción comercial de esta flor. Actualmente esta enfermedad se
64
encuentra ampliamente distribuida a nivel mundial, sin excepción, en todas las regiones
donde se cultiva clavel (Pizano de M 2000).
En nuestro país esta enfermedad se presenta desde 1975, cuando fue introducida por la
importación de esquejes infectados desde Europa, Estados Unidos e Israel. El impacto
de esta enfermedad en la producción del clavel en Colombia ha sido tal, que ha generado
una disminución importante en su producción, ya que a pesar de contar con medidas de
control, estas aumentan significativamente los costos de producción (Castellanos et al.
2009). Dicho aumento a su vez ha generado un ambiente favorable para el cultivo de
otras flores, que se han incorporado exitosamente al comercio internacional y han
desplazado al clavel del primer puesto en las exportaciones. Sin embargo, la producción
de esta flor sigue siendo muy importante para el país, ubicándose como la segunda flor
mas sembrada del país y generando varios miles de millones de dólares en
exportaciones (Arbeláez 2006). La enfermedad se caracteriza por la aparición unilateral
de los síntomas, en donde inicialmente la planta desarrolla amarillamiento seguido por el
marchitamiento de las hojas base y amarillamiento de las venas medias. El ciclo de la
enfermedad se inicia con la germinación de las clamidosporas en dormitancia
estimuladas por los exudados secretados por las raíces de las plantas recién sembradas
(Di pietro et al. 2003). Las hifas del hongo penetran la epidermis, la corteza y
posteriormente la endodermis, hasta llegar a los tejidos vasculares, donde se propagan
en forma ascendente, ya sea por crecimiento miceliar o por difusión pasiva de
microconidias (Baayen & Maat 1987; Baaye et al. 1988; Sarrocco et al. 2007). En las
variedades susceptibles el patógeno coloniza los vasos de todo el tallo y degrada el área
invadida, disolviendo las paredes celulares y formando grandes cavidades llenas de aire
y residuos de los vasos lignificados, los que interrumpen el paso de agua a través del
tallo ocasionando la muerte de la planta (Baayen & D M Elgersma 1985).
Además de secretar un conjunto de fito-toxinas y péptidos que favorecen el proceso de
colonización, este patógeno presenta la secreción de proteínas que le permiten
detoxificar las fitoanticipinas presentes en los tejidos de clavel (Curir et al. 2000; Di pietro
et al. 2003). Los síntomas se mueven lentamente hacia el lado afectado de la planta en
las hojas y los brotes laterales, extendiéndose lentamente hacia arriba a medida que el
patógeno asciende, causando un marchitamiento generalizado y posterior muerte de la
planta (Barrera & Gómez 1995). El patógeno al parecer se restringe a los tejidos
65
vasculares en la planta viva; sin embargo, una vez la planta muere puede llegar a
colonizar los tejidos parenquimáticos de la misma (Di pietro et al. 2003).
La severidad de la enfermedad y las pérdidas económicas que generan están
gobernadas por varios aspectos importantes, entre los que se destacan, por parte de la
planta: la resistencia de la variedad (completa o parcial); por parte del patógeno:, la raza
fisiológica del hongo, su virulencia e infectividad y la cantidad de inóculo, y
adicionalmente los factores ambientales:, como la intensidad solar, el fotoperíodo, la
temperatura y el substrato utilizado para la siembra (Ben-Yephet & Shtienberg 1997). El
desarrollo de las técnicas de cruzamiento ha permitido encontrar algunos genotipos que
presentan resistencia a la enfermedad (Ben-Yephet, Y. et al. 1997.). Sin embargo, dichos
genotipos han sido obtenidos por cruces inespecíficos de variedades, en donde los
mecanismos bioquímicos de dicha resistencia no han sido estudiados y en donde al
parecer las características genotípicas de dicha resistencia no son transmitidas en cruces
posteriores. Teniendo en cuenta esto, el desarrollo de nuevos fungicidas de origen
sintético que presenten una acción importante sobre este patógeno (M. L. Gullino et al.
2002), son una alternativa constante a pesar de los efectos que puedan presentar sobre
el medio ambiente.
1.9.4. Resistencia al marchitamiento vascular
Se han realizado varios estudios encaminados a encontrar los fenómenos más
relevantes de la histopatología y la bioquímica de la respuesta de defensa que presentan
los genotipos resistentes de clavel. En dichos estudios, se ha encontrado que la infección
activa un proceso defensivo multicomponente y compartimentalizado, que tiene como
objetivo localizar el patógeno en los tejidos vasculares xilemáticos infectados (Niemann
1990; Baayen et al. 1996). En este proceso, inicialmente se presenta la formación de
geles, compuestos principalmente de polisacáridos y compuestos fenólicos en los vasos,
ambos exudados de las células parenquimáticas adyacentes al punto de infección. Una
vez los fenólicos se fusionan a la pared y a las gomas, estos pueden estar sujetos a
reacciones de polimerización y oxidación que pueden dar lugar a la formación de una
barrera durable en la interfase de la infección y los tejidos sanos, la cual podría también
ser fortalecida con la deposición de calosa en las células adyacentes (Niemann & Baayen
1988; M. I. Trillas et al. 2000). Por otro lado, se ha encontrado que adicional a la
66
suberización alrededor del punto de infección a nivel del tallo (Niemann et al. 1991;
Niemann et al. 1992) y a nivel de la raíz (Higuera 2001), se producen aumentos en los
compuestos de naturaleza fenólica solubles o parcialmente enlazados a pared. Dentro de
los compuestos encontrados en tallo, se identificaron algunos compuestos nitrogenados
derivados del ácido antranilico, que teniendo en cuenta su carácter inducible y fungitóxico
fueron clasificados como fitoalexinas (Tabla No. 4). De éstos se determinó que su
proporción y velocidad de formación, dependen tanto de la variedad, como de la raza del
patógeno involucrada en la infección (Niemann et al. 1991; Niemann et al. 1992;
Niemann & Baayen 1988). En estudios realizados de manera específica a nivel de la raíz,
se encontraron algunos metabolitos que presentaron patrones de acumulación
relacionados con resistencia o susceptibilidad. Este es el caso del ácido ferúlico, la
escopoletina, una cumarina con importante actividad biológica, y un derivado de la
acridona, estos últimos acumulados en mayor proporción de manera constitutiva en
variedades resistentes al patógeno (Higuera 2001). En este mismo órgano y en tallo,
fueron recientemente identificados, además de un glicósido del kaempferol conocido
como kaempferido 3-O-[2G--D-glucopiranosil] -rutinósido (Tabla No. 4), su respectiva
aglicona del tipo flavonoide (kaempferido), que se encuentran de manera constitutiva y
fueron clasificados como fitoanticipinas (Curir et al. 2001). Estudios recientes sobre estos
últimos compuestos indican que es probable que se acumulen después de la infección y
presenten el comportamiento inducible característico de las fitoalexinas (Curir et al.
2005). A su vez, otros compuestos que presentan actividad antifúngica directa sobre el
patógeno en estudio, son los encontrados en callos de clavel por el grupo de Curir, P et
al. 2003 (Curir et al. 2003) En dicho estudio se reportan los ácidos, protocatecuico,
vanilico y 2,6-dimetoxibenzoico, además de la flavona datistecina y el glicósido de la
quercetina, peltatósido. Es importante citar que los metabolitos reportados en este último
estudio, aunque son encontrados en una variedad resistente, no se comenta si se
presentan de manera diferencial en función de los niveles de resistencia. El resumen de
estos resultados se presenta a continuación en la tabla No. 4.
67
Tabla No. 4. Compuestos caracterizados en clavel (Dianthus caryophyllus L.) con probable
relación en los mecanismos de defensa ante Fusarium oxysporum f. sp. dianthi raza 2.
Órgano de
la planta Compuesto
Características
del compuesto Referencia
Tallo
Diantalexinas
Fitoalexina
(Baayen &
Niemann
1989)
Tallo
Diantramidas
R2= H, OH, OCH3 R1= H,CH3
R1´R2´= H, OH, OCH3
Fitoalexinas
(Baayen &
Niemann
1989)
Tallo
Acetofenona
Fitoanticipina Curir P et al.
1996.
Raiz
Escopoletina
Probable
fitoalexina
(Higuera
2001)
68
Raiz
Acido ferúlico
Disminución de
niveles por
lignificación
(Higuera
2001)
Raiz
Derivado de la acridona
Probable
fitoalexina
(Higuera
2001)
Callos
Ácido 3, 4, dihidroxibenzoico “Ácido
protocatecuico”
Probable
fitoanticipina
(Curir et al.
2003)
Callos
Ácido 4-hidroxi-3-metoxibenzoico “Ácido
vanilico”
Probable
fitoanticipina
(Curir et al.
2003)
69
Callos
Ácido 2, 6-dimetoxibenzoico
Probable
fitoanticipina
(Curir et al.
2003)
Callos
Peltatosido
Probable
fitoanticipina
(Curir et al.
2003)
Callos
Datiscetina
Probable
fitoanticipina
(Curir et al.
2003)
Tallos y raices
kaempferido 3-o-[2G--D-glucopiranosil] -
rutinosido
Fitoanticipina
(Curir et al.
2005; Curir et
al. 2001)
70
Al analizar los compuestos presentes en la tabla No. 4, se evidencia el papel que los
compuestos derivados de la ruta fenilpropanoide cumplen en este modelo, siendo
determinantes de los fenómenos de resistencia y sugiriendo que la vías biosintéticas de
estos compuestos deben ser, a su vez, también determinantes en la expresión de
resistencia en este modelo planta-patógeno. Sin embargo, son pocos los estudios que se
han realizado en las enzimas que participan en dichas rutas biosintéticas. En este
aspecto diversos estudios realizados por el grupo de investigación Estudio de actividades
metabólicas vegetales del departamento de Química de la Universidad Nacional de
Colombia, han sugerido que la participación de algunas enzimas del metabolismo
secundario durante la respuesta de defensa del clavel ante la infección, pueden ser
determinantes en la expresión final de resistencia a este patógeno (Ardila & Higuera,
2005; Ardila, 2006; Ardila 2011). En dichos estudios se encontró que variedades de
clavel resistentes a la enfermedad, presentan tanto a nivel del tallo como de raíz, una
inducción de la enzima polifenol oxidasa, enzima central en el metabolismo de los
fenoles, participando probablemente en biosíntesis de fitoalexinas y lignificación (Ardila &
Higuera 2005; Ardila 2006). Posteriormente, dicha enzima fue purificada y caracterizada
(Mayorga, R. 2006). Estudios recientes han determinado que existe una correlación
positiva entre los niveles constitutivos de expresión de genes codificantes para la enzima
PAL y los niveles de resistencia a la enfermedad, además de su inducción diferencial a
nivel de la raíz en una variedad resistente a la enfermedad. (Ardila et al. 2011). Estos
estudios generaron particular interés considerando que esta enzima presentó una
inducción diferencial en raíces de variedades con diferentes niveles de resistencia,
siendo más temprana para el caso de la variedad resistente e inducida a nivel del tallo,
solamente por la acción de elicitores provenientes del patógeno (Ardila et al. 2007).
Considerando que los factores de transcripción que están involucrados en el proceso de
transcripción de los genes codificantes para la PAL en plantas, son los mismos que
participan en la transcripción de otros genes de la ruta fenilpropanoide (Vom Endt et al.
2002), es probable que el comportamiento que se ha presentado en el clavel pueda ser
extrapolado para otras enzimas de estas rutas biosintéticas. Sin embargo, es necesario
realizar estudios específicos para las diferentes enzimas presentes en el clavel, con el fin
de validar dicha hipótesis.
71
2. Biosíntesis constitutiva de flavonoides en el clavel y su relación con resistencia a Fusarium oxysporum f. sp. dianthi
Resumen
Con el fin de estudiar el papel de los flavonoides en los mecanismos de defensa que
actúan de manera constitutiva en plantas de clavel contra Fusarium oxysporum f. sp
dianthi, se investigó la relación entre algunos componentes bioquímicos preexistentes
asociados con la biosíntesis de estos metabolitos y la resistencia de algunas variedades
al marchitamiento vascular, enfermedad causada por dicho patógeno. Se evaluaron los
niveles constitutivos de fenoles totales, flavonoides y actividad antioxidante, en tallos y
raíces de 9 variedades comerciales de clavel, que se cultivan en Colombia, y que
presentan diferentes niveles de resistencia a la enfermedad. Respecto al tallo, estos
parámetros no mostraron correlación con resistencia, mientras que en raíz las variedades
resistentes mostraron contenidos más altos de flavonoides y de actividad antioxidante,
que los encontrados en variedades susceptibles. Así mismo, se evaluaron las actividades
de algunas enzimas implicadas en la biosíntesis de flavonoides en raíz. Mientras que
para la enzima fenilalanina amonio liasa (PAL) no se vieron diferencias asociadas con
resistencia a la enfermedad, las actividades chalcona sintasa (CHS) y chalcona
isomerasa (CHI) fueron mayores en raíces de las variedades resistentes a la
enfermedad, al comparar con las susceptibles. También se determinaron los niveles de
transcripción, evaluados por PCR en tiempo real para CHS y CHI, los cuales fueron
significativamente mayores en las variedades resistentes, lo que indica que estas
enzimas pueden ser probablemente reguladas a nivel transcripcional. Estos resultados
sugieren que los niveles constitutivos de flavonoides totales a nivel de la raíz, están
probablemente asociados con la resistencia a Fusarium oxysporum f. sp. dianthi, y que
72
dichas diferencias pueden atribuirse a una mayor expresión de genes en la vía
fenilpropanoide, específicamente para CHS y CHI, enzimas que han sido previamente
asociadas a la regulación de la biosíntesis de flavonoides en otras especies.
Abstract
To study the role of flavonoids in the constitutive defense mechanisms against Fusarium
oxysporum f. sp. dianthi in carnations, we investigated the relationship between several
biochemical components associated with the biosynthesis of these metabolites and the
resistance of various carnation plants to vascular wilt caused by this pathogen. We
assessed the constitutive total phenol and flavonoid contents and the antioxidant activity
levels in the stems and roots of nine commercial varieties of carnation grown in Colombia.
Plants with different levels of resistance to the disease were chosen for the study. At the
stem level, these parameters were not correlated with resistance, but at the root level,
resistant varieties exhibited higher levels of flavonoids and antioxidant activity than those
found in susceptible varieties. The activities of some enzymes involved in the biosynthesis
of these compounds were evaluated at the root level. Differences in the phenylalanine
ammonia-lyase enzyme (PAL) activity levels were not associated with disease resistance,
but the activities of chalcone synthase (CHS) and chalcone isomerase (CHI) were higher
in the roots of disease-resistant varieties. Likewise, the transcript levels of CHS and CHI
were significantly higher in resistant varieties, as evaluated by real-time PCR, indicating
that these enzymes are most likely regulated at the transcriptional level. These results
suggest that the constitutive levels of flavonoids at the root level are most likely
associated with resistance to Fusarium oxysporum f. sp. dianthi. Such differences may be
attributed to increased expression of genes in the phenylpropanoid pathway, specifically
CHS and CHI, which are enzymes that have been previously associated with the
regulation of flavonoid biosynthesis in other species.
2.1. Introducción
El marchitamiento vascular causado por Fusarium oxysporum f. sp. dianthi (Fod), es la
enfermedad más importante que afecta la producción del clavel a nivel mundial. Varias
estrategias de control se han utilizado para controlar este patógeno, pero ninguna ha
proporcionado una protección completa. El cultivo de variedades resistentes y el control
biológico se han planteado como opciones de interés (Ben-Yephet et al. 1997; Sant et al.
73
2010; Melero-Vara et al. 2011). De acuerdo con la resistencia multigénica y cuantitativa
del clavel a este patógeno (Baayen et al. 1991), la mayoría de variedades comerciales
presentan una resistencia parcial o susceptibilidad a la enfermedad. En todos los
programas para la obtención de cultivares comercialmente atractivos, la resistencia a
este hongo es uno de los criterios de selección más importantes. Sin embargo, los
estudios para la caracterización de genes de resistencia y el desarrollo de marcadores
para la selección de variedades resistentes no han sido exitosos debido a la falta de
información bioquímica sobre este patosistema. Para dilucidar los fenómenos
bioquímicos asociados a los mecanismos de defensa que actúan en los cultivares
resistentes, se han desarrollado algunos estudios bioquímicos, histológicos y
ultraestructurales (Baayen et al. 1989; Higuera & Ebrahim-Nesbat 1999; Ouellette et al.
2004). Se ha establecido que la capacidad de resistir a la colonización, a la degradación
del tejido y al marchitamiento vascular, depende principalmente de la capacidad del
hospedero para compartimentar la infección en una zona restringida, así como de la
acumulación a nivel del tallo de fitoalexinas derivadas del ácido antranílico (Baayen &
Plas 1992; Baayen et al. 1991). Los compuestos fenólicos juegan un papel central en
este proceso, ya que se liberan de células especializadas del parénquima alrededor de la
infección, se oxidan y se polimerizan para generar una barrera duradera entre la zona de
colonización y de la zona de defensa (Niemann et al. 1991; Higuera & Ebrahim-Nesbat
1999).
Varios estudios han propuesto que algunos compuestos fenólicos del tipo flavonoide
podrían estar asociados con resistencia, actuando a nivel constitutivo como fitoanticipinas
(Curir et al. 2001; Curir et al. 2003; Galeotti, Barile, Lanzotti, et al. 2008), o a nivel
inducible como fitoalexinas (Curir et al. 2005). Los flavonoides son metabolitos
secundarios que se encuentran ubicuamente en las plantas estando asociados a muchos
procesos fisiológicos incluyendo las interacciones simbióticas (Ponce et al. 2009), la
adaptación a la radiación UV (Ryan et al. 2002) y al ataque de herbívoros e insectos
(Simmonds 2003), la regulación del desarrollo (Taylor & Grotewold 2005) y la infección
por microorganismos (Pedras et al. 2003; Lorenc-Kukuła et al. 2007; Loureiro et al. 2012).
El papel de flavonoides en defensa de la planta está relacionado con su actividad
antimicrobiana frente a hongos y bacterias, debido a que presentan capacidad para
inhibir la germinación de las estructuras latentes y a su acción sobre procesos como el
transporte de membrana, la biosíntesis de ácidos nucleicos y el procesamiento
74
energético (Cushnie & A. J. Lamb 2011). Sin embargo, algunos estudios han propuesto
que su papel en la defensa vegetal, podría estar asociada a la actividad antioxidante que
presentan estos compuestos (Kangatharalingam et al. 2002; Lorenc-Kukuła et al. 2007;
Mikulič Petkovšek et al. 2009), la cual puede ser usada por las plantas para regular los
niveles de especies reactivas de oxígeno (EROS) que se generan durante los procesos
infecciosos (Hammerschmidt 2005).
El análisis funcional, utilizando mutantes de genes asociados a la biosíntesis de
flavonoides, han demostrado que los niveles de estos compuestos se regulan por la
acción de un amplio conjunto de enzimas, dentro de las que se destacan la fenilalanina
amonio liasa, la chalcona sintasa y la chalcona isomerasa (Winkel-shirley 2001; Dixon et
al. 2002; Schijlen et al. 2004). La fenilalanina amonio liasa (PAL, EC 4.3.1.5), cataliza la
primera reacción en la vía fenilpropanoide para generar, a partir de fenilalanina, una
amplia variedad de productos incluyendo lignina, flavonoides y compuestos fenólicos.
Considerando el papel de estos compuestos en la planta, esta enzima ha estado
asociada con procesos de adaptación y con la resistencia a enfermedades (Dixon & N. L.
Paiva 1995). Una supresión parcial de la expresión génica PAL puede conducir a una
mayor susceptibilidad a hongos fitopatógenos (Shadle et al. 2003). La enzima chalcona
sintasa (CHS, E.C. 2.3.1.74) cataliza la condensación iterativa de 3 unidades de malonil-
CoA sobre p-coumaroil CoA, producto final de la vía fenilpropanoide, para generar 2',
4,4',6´- tetrahidroxichalcona. A su vez, la chalcona isomerasa (CHI, E.C. 5.5.1.6) cataliza
la ciclación intramolecular enantioselectiva para generar (2S)-naringerina a partir del
producto de CHS. Las mutaciones del sitio activo que afectan la actividad catalítica de
esta enzima están asociadas con una disminución significativa en los niveles de
flavonoides (Reuber, et al. 1997), mientras que la sobreexpresión de esta enzima
produce un aumento significativo en sus niveles (F.-X. Li et al. 2006). Se han estudiado
los niveles transcripcionales para estas enzimas en diferentes especies vegetales
durante la infección con patógenos del género Fusarium oxysporum y se ha propuesto
que un aumento en éstos hace parte de las respuestas de defensa asociadas con
resistencia al marchitamiento vascular (Arfaoui et al. 2007; P. L. A. Chang et al. 2008;
Morkunas et al. 2011).
Considerando que el análisis cualitativo y cuantitativo de los niveles de flavonoides se ha
propuesto como una herramienta para la clasificación de variedades de clavel (Galeotti,
75
Barile, Lanzotti, et al. 2008) y que actualmente no se han reportado marcadores
moleculares para una selección rápida de variedades resistentes en los procesos de
mejoramiento genético, la posible relación entre los niveles de flavonoides y la resistencia
se plantea como una herramienta potencial para la selección de variedades resistentes al
marchitamiento vascular. En esta investigación, se evaluaron algunos parámetros
bioquímicos y moleculares relacionados con la biosíntesis de flavonoides en plantas de
nueve variedades comerciales con diferentes niveles de resistencia al marchitamiento
vascular, para aportar al conocimiento de los mecanismos de defensa que actúan a nivel
constitutivo en esta planta y, de esta manera, proponer marcadores potenciales para la
selección de cultivares resistentes.
2.2. Materiales y métodos
2.2.1. Material vegetal
Esquejes enraizados de nueve variedades comerciales de clavel cultivadas en Colombia
fueron suministrados por dos fincas localizadas en diferentes puntos geográficos de la
Sabana de Bogotá (Colombia): Ubicación 1: Grupo Chía en Tocancipá, latitud norte, 4 °
58' y longitud oeste 73 ° 55 ', T 13o C. Ubicación 2: Sb Talee en Fómeque de latitud norte
4 ° 29' y longitud oeste 73 ° 54 ', T 18 ° C. Las variedades de clavel (S susceptibles y R
resistentes a la raza Fod 2) fueron las siguientes: Star ( S), Tasman (S), Komashi Blanco
(R), LP Candy (R) y Giolee (R), suministrados por el Grupo Chía y Spitfire (S), Bellisima
(S), Esperia (R) y Topacio (R), suministradas por la empresa SB Talee. Para cada
variedad, treinta esquejes de clavel con 3 semanas de enraizamiento fueron separados
en tallos y raíces, lavados exhaustivamente, macerados con nitrógeno líquido y
almacenados a -70 º C para su posterior análisis.
2.2.2. Selección de condiciones de extracción de compuestos polifenólicos a partir de tallos y raíces de clavel
Con el fin de realizar la extracción de metabolitos a partir de tallos y raíces de clavel, bajo
unas condiciones que presentaran los mejores rendimientos en términos de las variables
a analizar, se evaluaron las 4 condiciones de extracción que se describen a continuación
(Biglari et al. 2008; Z. Yi et al. 2008).
76
Tabla No. 5. Condiciones evaluadas para la extracción de metabolitos a partir de tallos y raíces de clavel.
Condición de extracción Solvente usado Uso de ultrasonido
T1 Metanol 80% NO
T2 Metanol 80% SI
T3 Acetona NO
T4 Acetona SI
Estas diferentes condiciones de extracción fueron ensayadas usando 200mg (peso
fresco) de tallos o raíces de la variedad resistente L.P. Candy, usando 1 mL del solvente
descrito en la tabla No. 5 (1:5 p/v). La mezcla se sometió a un tratamiento con ultrasonido
(42Hz y 100w) si era el caso (T2 y T4), durante 15 minutos. Después de la centrifugación
(12000 g, 15 min), el sobrenadante se transfirió a un tubo eppendorf y se almacenó en la
oscuridad a -70oC para su posterior análisis. Todos los análisis se llevaron a cabo por
triplicado para cada órgano de la planta y para cada tratamiento. La selección de las
mejores condiciones de extracción estuvo basada en la comparación estadística
(ANOVA), de los valores obtenidos para las variables fenoles totales, flavonoides totales
y actividad antioxidante (ABTS y DPPH), determinadas usando métodos
espectrofotométricos de acuerdo con las condiciones que son descritas posteriormente.
El análisis comparativo entre variedades se realizó usando el método de extracción
seleccionado, por triplicado para cada variedad, en cada órgano de la planta.
2.2.3. Contenido de fenoles totales
El contenido total de compuestos fenólicos se midió utilizando el método de Folin-
Ciocalteu (Singleton & Rossi Jr JA 1965) con ligeras modificaciones. La mezcla de
reacción contenía 50 µL de los extractos en metanol, 100 µL de reactivo Folin-Ciocalteu y
100 µL de H2O destilada-desionizada. Después de 5 min se adicionaron 200 µL de
Na2CO3 7% y 200 µL de agua destilada-desionizada. Luego de 1 h de incubación a T
amb se midió la absorbancia (764 nm) de la mezcla de reacción (espectrofotómetro
Thermo Genesys 10 UV). Se comparó con una curva de calibración preparada usando 0,
5, 10, 15, 20, 25, 35, 50 ppm de ácido gálico (Sigma ®). Los resultados de fenoles totales
fueron dados como mg de equivalentes de ácido gálico por g de tejido fresco.
77
2.2.4. Determinación de flavonoides totales
El contenido de flavonoides se determinó utilizando el método colorimétrico reportado por
(Z. Jia et al. 1999) y (Barros, Baptista & Ferreira, 2007) con ligeras modificaciones. La
mezcla de reacción contenía 100 µL de extracto de clavel, 30 µL de solución de NaNO2
5% y 100 µL de agua desionizada, a la que se adicionaron después de 5 min, 60 µL de
solución de AlCl3 al 10%. Luego de incubar a T amb por 6 min, se adicionaron 100 µL de
NaOH 2M y se midió la intensidad de color rosa a 510 nm. Se comparó con una curva de
calibración preparada usando 0, 1, 2, 3, 4, 5, 7, 10, 15 ppm de catequina (+) (Sigma®) y
los resultados se expresaron como mg equivalentes de catequina por g de tejido fresco.
2.2.5. Inactivación del radical ABTS
La capacidad para inactivar el radical ABTS (Acido 2,2´-azinobis (3-etilbenzotiazolin)-6-
sulfonico) por parte de extractos de tallos o raíces de clavel, se determinó utilizando el
método descrito por Re et al (1999) con algunas modificaciones. Se preparó una solución
de ABTS disolviendo este compuesto en agua desionizada (concentración final 7 mM) y
generando el catión radical ABTS.+ con la adición de persulfato de amonio (2,5 mM
concentración final). La mezcla se dejó en reposo en la oscuridad a temperatura
ambiente por 18 h antes de su uso. La solución del catión radical ABTS.+ se diluyó con
etanol para obtener una absorbancia entre 0.7-0.9 a 734nm. La mezcla de reacción
contenía 500 µL de solución ABTS diluido y 100 µL de extracto. Después de 20 minutos
de reacción en la oscuridad, se midió la absorbancia a 734 nm y se comparó con una
curva de calibración previamente preparada usando 0,5, 1, 1,5 y 2,0 mM de Trolox (Acido
6-Hydroxi-2,5,7,8-tetrametilcroman-2-carboxilico) (Sigma®). Los resultados finales se
expresaron como mol de equivalentes Trolox (TE) por g de tejido fresco.
2.2.6. Captación del radical DPPH
La capacidad de captación del radical libre DPPH (2,2-difenil-1-picrilhidracilo) se
determinó de acuerdo con (Yoo et al. 2008). Se preparó un control positivo usando 100
µL de solución de ácido ascórbico (0,05 mg/mL) y 500 µL de solución de DPPH (0.4
mg/mL), mientras que el control negativo se obtuvo usando 100 µL de metanol y 500 µL
de la misma solución de DPPH. La determinación en muestras de raíces y tallos de clavel
se llevó a cabo utilizando 100 µL de extracto y 500 µL de solución de DPPH. La mezcla
78
se homogenizó suavemente, se dejó reposar a temperatura ambiente durante 15 minutos
y se realizaron lecturas a 510 nm. La capacidad de captación del radical libre DPPH se
calculó según la siguiente fórmula:
Capacidad de inactivación (%) = (Abs control negativo - Abs muestra) / Abs control
negativo
Se preparó una curva de calibración utilizando 0,02, 0,04, 0,06, 0,08, 0,10 y 0,20 mM de
Trolox (Sigma ®) determinando en cada caso la capacidad de inactivación del radical
DPPH (%). Los resultados finales se expresaron como mol equivalentes de Trolox (TE)
por g de tejido fresco.
2.2.7. Preparación de extractos enzimáticos
Los extractos enzimáticos de las raíces de clavel se obtuvieron de manera independiente
para cada enzima con el fin de obtener ensayos enzimáticos sensibles y reproducibles.
Para el caso de la actividad PAL, se pesaron 0,2 g de material vegetal, se maceraron
usando nitrógeno líquido y se le adicionaron 600 µL de acetona a -20°C. Después de
centrifugar a 4°C (5 min, 12000g), el sobrenadante se eliminó cuidadosamente. Este
procedimiento se repitió tres veces más para eliminar los compuestos fenólicos que
podrían interferir con el ensayo de determinación de la actividad (Ardila 2006). La
extracción a partir del pellet se llevó a cabo utilizando 1 mL de buffer ácido bórico- NaOH
100 mM, pH 8,0, 20 mM EDTA y 20 mM de β-mercaptoetanol. Las muestras se
centrifugaron a 4°C (30 min, 16000g) y el extracto enzimático se recuperó y se almacenó
a -20 ° C para análisis posteriores.
La enzima chalcona isomerasa (CHI) se extrajo de acuerdo con Li et al (2006), con
algunas modificaciones. La eliminación de compuestos interferentes se realizó usando
0,2 g de material vegetal y acetona, tal y como se describió anteriormente. La extracción
posterior se llevó a cabo usando 1mL de buffer Na2HPO4-NaH2PO4 100 mM pH 8,0, 3
mM EDTA, 20 mM β-mercaptoetanol y 2% PVPP. Las muestras se centrifugaron a 4°C
(30 min, 16000g) y el extracto se recuperó y se almacenó a -20 ° C para análisis
posteriores.
79
La enzima chalcona sintasa (CHS) se extrajo de acuerdo con Lozovaya et al (2007) con
algunas modificaciones. Para ello se usó 1,0 g de raíces y 10 mL de buffer de fosfatos
100 mM, pH 7,0 que contenía, 0,5 M de sacarosa, 0,2 mM PMSF, 20 mM de ácido
ascórbico, 1% PVPP, 3 mM EDTA y 0,1% de BSA. Después de centrifugar a 4 ° C (30
min, 16000g), el extracto se recuperó, se concentró y se desalinizó usando
concentradores de tipo ultra-celular cell (Millipore ® 10000 MWCO) hasta un volumen de
1,5 mL. Este extracto se mantuvo a 4 ° C para determinar la actividad en el mismo día.
2.2.8. Determinaciones de actividad enzimática
La actividad PAL se midió utilizando el método espectrofotométrico (Assis et al. 2001)
con algunas modificaciones de acuerdo con (Ardila et al. 2007). La mezcla de reacción
contenía 100 µL de extracto de enzima y 400 µL de L-fenilalanina 20mM en buffer
fosfatos 100 mM, pH 6. Después de 15 min a 37°C, la enzima se inactivó por
calentamiento (15 min a 92oC) y el ácido cinámico generado se evaluó con lecturas a 270
nm (espectrofotómetro Thermo Genesys 10 UV) e interpolación en una curva de
calibración preparada utilizando ácido cinámico (Sigma ®). Una unidad de actividad
enzimática (katal) se definió como la cantidad de enzima que cataliza la formación de 1
mol de ácido cinámico en 1 s. La actividad de la enzima se expresó como nkat de ácido
cinámico / g de tejido fresco.
La actividad chalcona isomerasa (CHI) se determinó utilizando el método
espectrofotométrico reportado por Li et al (2006). La isomerización de 2',4,4',6´-
tetrahidroxichalcona, previamente sintetizada por el método de Moustafa y Wong (1967),
se cuantificó usando 100 µL de extracto enzimático y 400 µL de una solución 100 mM de
este sustrato disuelto en Tris-HCl 100 mM pH 7,6. Los cambios en absorbancia a 390nm
en la mezcla de reacción se evaluaron durante 5 min en un espectrofotómetro (Genesys
® 10UV Thermo) utilizando como control negativo (blanco combinado de enzima y
sustrato) una mezcla que contenía extracto enzimático previamente inactivado por
calentamiento por 5 min a 90oC. Teniendo en cuenta el coeficiente de absorción molar
para el sustrato (E = 29400M-1cm-1), una unidad de actividad enzimática (katal) se definió
como la cantidad de enzima que cataliza la isomerización de 1 mol de chalcona en 1 s.
La actividad enzimática se expresó como microkat chalcona isomerizado / g de tejido
fresco.
80
La actividad chalcona sintasa (CHS) se determinó por el método cromatográfico
reportado por Lozovaya et al. (2007) y (Flores-Sanchez & R. Verpoorte 2008), con
algunas modificaciones. La mezcla de reacción se preparó usando 250 µL de extracto
enzimático concentrado, 150 µL de buffer fosfatos 100 mM pH 8,0, con BSA al 2% (p/v),
β-mercaptoetanol 2,8 mM y 100 µL de sustratos p-cumaroil-CoA (TransMIT
Flavonoidforschung Giessen, Alemania) y malonil-CoA (Sigma ®) a concentraciones
finales de 5 µM y 10 µM, respectivamente. Después de 90 min a 30°C, la reacción se
detuvo mediante la adición de 20 µL de HCl 4M. Se adicionaron 800 µL de acetato de
etilo y después de agitar vigorosamente, se centrifugó durante 2 min. Se recuperó la fase
orgánica y se repitió este procedimiento. Las fases orgánicas se evaporaron en una
centrífuga de vacío y el residuo se mantuvo a 4°C. Las muestras se re disolvieron en 80
µL de metanol HPLC para su análisis posterior. La cuantificación de la naringenina se
realizó por HPLC utilizando un cromatógrafo líquido LC-20AT Shimadzu ®, una columna
RP-18 Phenomenex® (250mmx4.60mm, 5 micras) y un detector UV-VIS Prominence ®
SPD-20AT. Para el análisis por HPLC las condiciones fueron las siguientes: fase móvil A:
agua: H3PO4 (400:2), fase móvil B: metanol 100% y el gradiente como se describe a
continuación: 0 min A 100%, 2 minutos-12 minutos B 45%, 31min - 33min B 78%, 36min-
46min B100%, 48min-54min B0%. El flujo fue 1mL/min y 290 nm para la detección. Los
resultados se obtuvieron por interpolación en una curva de calibración utilizando
naringenina (Sigma ™). La actividad de la enzima se expresó como pkat naringenina/ g
tejido fresco.
2.2.9. Cuantificación por PCR en tiempo real
Para la extracción del RNA total, las raíces de clavel se maceraron usando nitrógeno
líquido en un mortero previamente lavado con una solución de dietil pirocarbonato
(DEPC). Se pesaron 0,4 g del material macerado y se llevó a cabo la extracción
utilizando Trizol (Invitrogen ®) de acuerdo con las instrucciones del proveedor. El RNA se
cuantificó por lecturas de absorbancia a 260 nm (Genesys ® 10UV Thermo). Con el fin
de asegurar la calidad de los ácidos nucleicos usados en las determinaciones, las
muestras que se usaron para estos ensayos presentaron una relación A260/A280 entre
1,9 hasta 2,0. Para evitar la contaminación de ADN, se trataron 2 µg de RNA total con
ADNasa (Epicentre ®) de acuerdo con las condiciones recomendadas por el proveedor.
81
Posteriormente, la síntesis de cDNA a partir de RNA se realizó utilizando oligo dT y la
transcriptasa inversa M-MLV (virus de leucemia murina de Moloney, Invitrogen ®) de
acuerdo con el protocolo del fabricante. Los niveles de transcripción de genes CHS y CHI
en clavel fueron evaluados por PCR en tiempo real mediante cuantificación absoluta
(SYBR ® Green MasterMix IQTM Biorad). Con el fin de usar la misma cantidad de cDNA
en cada reacción (10 ng), se realizó cuantificación por fluorescencia (Qbit ® Invitrogen).
Los cebadores utilizados para la amplificación de los genes de CHS y CHI se citan en la
tabla No. 6. El diseño de éstos se realizó utilizando las secuencias del genebank
identiicadas con GI 1067124 y GI 12239389. Sobre estas secuencias reportadas para el
clavel, mediante alineamientos con secuencias reportadas para otras especies usando el
programa clustalW, se seleccionaron aquellas secuencias conservadas para cada
enzima y sobre éstas se realizó el diseño correspondiente mediante el programa primer3.
La verificación del tamaño de los fragmentos y la especificidad de la amplificación se
realizó mediante electroforesis en geles de agarosa del 1,5%. Las condiciones de
amplificación para ambos casos, consistieron en una desnaturalización inicial a 95◦C
durante 10 min, seguidos de 35 ciclos a 95◦C (15 s), 53,5◦C (20 s), 72oC (20s) y
finalmente 72◦C (1 min). La cuantificación se realizó mediante el método de la curva
estándar. En cada ensayo para cada DNA blanco, se prepararon curvas de calibración
utilizando diluciones seriales de 5 a 6 veces de los amplicones previamente clonados en
un plásmido (sintetizados por la empresa GeneArt ®) desde 100 a 10000000 copias/
reacción. Para cada ensayo se evaluaron por duplicado controles sin plantilla (NTC), las
muestras de cDNA y controles positivos (amplicones previamente clonados). La
especificidad de los productos se validó por el análisis de la curva de fusión y la posible
presencia de contaminantes que pudiesen afectar la eficiencia de la amplificación se
evaluó para cada reacción usando el método de (Ramakers et al. 2003). En este se
evalúa la eficiencia en cada muestra mediante la comparación de las gráficas obtenidas
del Log Fluorescencia vs. tiempo. El análisis se realizó utilizando un C1000Thermalcycle
acoplado a un CFX96 Biorad, sistema en tiempo real. El nivel de expresión de los genes
de interés se reportó como copias/µg de RNA extraído como media de tres repeticiones.
82
Tabla No. 6. Lista de cebadores usados para la cuantificación por PCR en tiempo real de los niveles de mRNA para los genes de biosíntesis de flavonoides.
Nombre de las
proteínas Cebadores Secuencia 5´ 3´
Tamaño del
fragmento
Chalcona sintasa
CHS directo
CHS reverso
GTGGGTCTCACTTTTCACCTG
AATCGAGCCCTTCACCTGCTGT
319pbs
Chalcona isomerasa
CHI directo
CHI reverso
GACAACAATACGCCGACAAA
AGAGTGTCCGGGAGGAAAAT
140pbs
2.2.10. Análisis estadístico
El análisis estadístico se realizó para cada variable en los diferentes tratamientos
evaluados por triplicado. Los datos fueron reportados como medias + / - SD. El análisis
de varianza y las diferencias significativas entre las medias se analizaron mediante
ANOVA de una vía utilizando Statgraphics ® Software versión 5.1. La correlación de
Pearson y el análisis de PCA se realizaron para determinar las correlaciones entre las
medias y la visualización de las diferencias y similitudes entre las variedades, en
términos de los parámetros evaluados, utilizando Microsoft Excel y el software de la línea
de las matrices de Nia. http://lgsun.grc.nia.nih.gov/ANOVA/index.html. Con el fin de
normalizar para el análisis de PCA, todos los datos se transformaron con la función
(Log10 X). La significancia de los coeficientes de correlación de Pearson se realizó con
un α = 0,005 según Azzimonti (2003).
2.3. Resultados y Discusión
2.3.1. Selección de condiciones de extracción de compuestos polifenólicos a partir de tallos y raíces de clavel
Durante la selección de condiciones de extracción se evaluaron diferentes protocolos
frecuentemente usados para la extracción de este tipo de metabolitos en diferentes
especies (Biglari et al. 2008; Z. Yi et al. 2008; Hossain et al. 2011; Kunradi et al. 2011). Si
bien es cierto que existen algunos reportes para la extracción de estos metabolitos en
clavel (Curir et al. 2003; Galeotti, Barile, Curir, et al. 2008), estos incluyen procesos
83
largos de reflujo (1-2 h) que pueden ser poco prácticos cuando se trabaja con un número
importante de muestras. Es por ello que en esta investigación se evalúo el uso de
ultrasonido considerando que puede presentar mejores eficiencias de extracción que el
reflujo, en tiempos más cortos (Paniwnyk et al. 2001). Los resultados correspondientes
para las condiciones de extracción evaluadas, se presentan en las figura 4.
4Figura No. 4. Evaluación de diferentes métodos para la extracción de metabolitos a partir de tallos y raíces de clavel. A) Fenoles totales, B) Flavonoides totales, C) Inactivación de ABTS, D) Inactivación de DPPH. T1: Metanol 80%, T2: Metanol 80% + ultrasonido, T3: Acetona, T4: Acetona + ultrasonido. Las barras verticales presentan la desviación estándar de cada promedio (n = 3). Los análisis estadísticos se realizaron para cada órgano de manera independiente. Los valores marcados con letra diferente, presentan diferencias significativas (P < 0.05).
De acuerdo al análisis estadístico realizado se evidenció el efecto positivo que tiene el
ultrasonido en la extracción de este tipo de metabolitos (T2 y T4), al comparar con los
tratamientos que no lo incluyen (T1 y T3). Esto se debe al conocido efecto cavitacional
que presenta el ultrasonido, favoreciendo la extracción de compuestos polifenolicos
asociados de manera no covalente a componentes insolubles de la planta que se
eliminan durante la extracción (Wrolstad et al. 2005). Así mismo, se determinó que el
metanol al 80% presenta la mayor eficiencia en la extracción de fenoles totales y
0
50
100
150
200
250
T1 T2 T3 T4
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b a
b
a a a
b
b
a
A B
C D
84
compuestos con actividad antioxidante al comparar con la acetona (figura No. 4 A-D).
Esto se debe a que la polaridad de este solvente permite una mayor extracción de
compuestos polares, como es el caso de aquellos flavonoides glicosilados reportados
como mayoritarios en clavel (Curir et al. 2003; Galeotti, Barile, Curir, et al. 2008; Galeotti,
Barile, Lanzotti, et al. 2008). En el caso de los flavonoides totales, los extractos obtenidos
con acetona presentaron valores estadísticamente similares a los obtenidos usando
metanol al 80% (figura No. 4 B). Esto se debe a que con acetona se favorece la
extracción de los compuestos de baja polaridad, como es el caso de flavonoides no
glicosilados que pueden detectarse bajo las condiciones del método colorimétrico usado.
Sin embargo, considerando que no se presentaron diferencias significativas con respecto
a la extracción con el metanol al 80%, el tratamiento T2, fue el seleccionado para los
procesos posteriores.
2.3.2. Determinación de niveles constitutivos de fenoles, flavonoides y actividad antioxidante en diferentes variedades de clavel
Para el análisis comparativo entre variedades de clavel con diferentes niveles de
resistencia al marchitamiento vascular, se usaron esquejes de clavel provenientes de dos
fincas ubicadas en diferentes puntos de la sabana de Bogotá. Considerando que la
composición del sustrato de enraizamiento, determinante en el ambiente de la rizosfera y
por ende en los niveles de algunos flavonoides (J.-T. Lin et al. 2010), era diferente en
cada una de las fincas (Grupo Chía mezcla de suelo-cascarilla de arroz, S.B talee:
cascarilla de arroz), se realizaron análisis estadísticos independientes de los resultados
de cada finca, con el fin de evaluar la posible relación entre los parámetros en estudio y
la resistencia al marchitamiento vascular (figura No. 5). Se encontró que la variedad
resistente L.P Candy y la variedad susceptible Bellisima presentaron los mayores
contenidos de fenoles en raíces, para la ubicación 1 y 2 respectivamente (P‹0.05). A nivel
de la raíz, las variedades resistentes presentaron contenidos estadísticamente mayores
(P‹0.05) para flavonoides totales, con excepción de la variedad Komashi Blanco (R), la
cual presentó valores similares a la variedad susceptible Tasman. En general, los niveles
de fenoles y de flavonoides encontrados estuvieron en el rango de 40-120 mg de ácido
gálico y 12-45mg equivalentes de catequina por 100 g material vegetal en base húmeda,
respectivamente.
85
5Figura No. 5. Niveles de fenoles y flavonoides constitutivos en raíces y tallos de clavel de variedades de dos fincas productoras ubicadas en diferentes municipios de la sabana de Bogotá (Tocancipa- Finca Grupo Chia y Cota- Finca S.B. Talee). Contenido de fenoles totales en Tocancipa (A) y Cota (B). Flavonoides totales en Tocancipa (C) y Cota (D). Las barras verticales presentan la desviación estándar de cada promedio (n = 3). Los análisis estadísticos se realizaron para cada órgano de manera independiente. Los valores para cada variedad y cada determinación marcados con diferente letra, presentan diferencias significativas (P < 0.05). S=susceptible y R= Resistente a Fod
Estos valores encontrados para el contenido de fenoles totales (CFT) en tallos y raíces
de clavel (figura No. 5) (40-120 mg equivalentes de ácido gálico/ 100g material húmedo
que corresponden a 4-12 mg equivalentes de ácido gálico GAE/g material en peso seco)
se encuentran en los rangos reportados para diferentes tejidos vegetales (0.2 y 150 mg
GAE / g material en peso seco) (Kahkonen et al. 1999), siendo comparables a los
encontrados en tejidos de diferentes especies como hojas de Cucumber sativum (4 mg
GAE/g material en peso seco), hojas de Daucus carota (7.4 mg GAE/g material en peso
seco) y hojas de Trifolium pratense (7.8 mg GAE/g material en peso seco). Para
flavonoides, los niveles encontrados en este estudio (10-40mg CE/g material fresco que
A B
C D
a a
a
a
c
d
a b
a
a
a a a ab
ab
b
c
a
b
b
a
a
ab ab
a
b
a
a
a a
a
a
a
bc c c
a ab
86
corresponden a 100-400mg CE/100 g peso seco) se encuentran en el orden de los
reportados para tejidos similares, como es el caso de raíces de Glycin tomentella que
están entre 100 y 200 mg CE/100g material en peso seco (J.-T. Lin et al. 2010), pero son
bajos al comparar con los reportados en tejidos fotosintéticos de diferentes plantas (200-
400 mg CE/ 100g material fresco, Yoo et al 2008). En general, los niveles de estos
metabolitos en tallos y raíces, tienden a ser menores a los encontrados en otros tejidos
más activos a nivel metabólico como hojas o frutos, en donde estos compuestos juegan
un papel importante como pigmentos o como protectores UV (Fico et al. 2000; Ryan et al.
2002). A pesar del potencial que tienen los flavonoides localizados en tallos y raíces para
ser usados como marcadores de selección de variedades en esta especie vegetal (Curir
et al. 2003; Galeotti, Barile, Lanzotti, et al. 2008) y del papel que pueden tener en
resistencia vegetal (Treutter 2006), los niveles de algunos parámetros asociados a la
biosíntesis constitutiva de estos compuestos no habían sido evaluados a nivel de la raíz,
órgano en donde se presenta el primer punto de contacto entre el clavel y el agente
causal del marchitamiento vascular. Algunos estudios referentes a la biosíntesis habían
sido realizados en esta especie, pero enfocados principalmente a la caracterización de
los pigmentos que, a nivel de la flor, generan las diferentes variedades de interés
comercial (Fukui et al. 2003; Yoshida et al. 2004). De acuerdo a los resultados
encontrados, los cuales mostraron que los niveles de fenoles y flavonoides en raíces son
superiores a los de tallo, se pudo observar que en clavel, como en otras especies, la
biosíntesis de estos compuestos está regulada en función del órgano en estudio y de sus
necesidades adaptativas (Fico et al. 2000; Hernández et al. 2009). Mayores niveles de
flavonoides en este órgano pueden estar asociados a procesos propios del ambiente de
la rizosfera como son, captación de nutrientes (Tomasi et al. 2008), crecimiento (Taylor &
Grotewold 2005) e interacción con microrganismos del suelo (L. J. Shaw et al. 2006).
Los resultados de actividad antioxidante en términos de capacidad de inactivación de los
radicales ABTS y DPPH, indicaron que, al igual que lo encontrado para fenoles y
flavonoides, los niveles en raíces fueron superiores a los de tallo (figura No. 6) y fueron
superiores en las variedades resistentes respecto a las susceptibles (P‹0.05). A nivel del
tallo, los niveles de inactivación del radical DPPH fueron estadísticamente iguales para
todas las variedades usadas.
87
6Figura No. 6. Niveles de actividad antioxidante constitutiva en raíces y tallos de clavel de variedades de dos fincas productoras ubicadas en diferentes municipios de la sabana de Bogotá (Tocancipa- Finca Grupo Chia y Cota- Finca S.B. Talee). Inactivación ABTS en variedades de Tocancipa (A) y Cota (B). Inactivación de DPPH en variedades de Tocancipa (C) y Cota (D). Las barras verticales presentan la desviación estándar de cada promedio (n = 3). Los análisis estadísticos se realizaron para cada órgano de manera independiente. Los valores para cada variedad y cada determinación marcados con diferente letra, presentan diferencias significativas (P < 0.05). S=susceptible y R= Resistente a Fod
Los valores de actividad antioxidante ABTS encontrados en raíces (1-12 µmol TE/g peso
seco), son bajos al comparar con otros rangos reportados en plantas (0-2125 µmol TE/g
peso seco), comparables a los encontrados en raíces de Daucus carota (3-28 µmol TE/g
peso seco), raíces de Dioscorea alata (3-8 µmol TE/g peso seco), tallos de Allium
sativum (3-18 µmol TE/g peso seco) y raíces de Ipomoea batata (3-15 µmol TE/g peso
seco) (R. Y. Yang et al. 2006). Los valores de actividad antioxidante por este método
fueron más altos que los encontrados usando DPPH, indicando que existen diferencias
en la capacidad de los compuestos extraídos para inactivar los radicales usados, lo cual
ha sido previamente reportado en otras fuentes vegetales (H. Zhao et al. 2008). El
0
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120
140
Tasman (S) Star (S) Komashi(R)
Gioele (R) L.P. Candy(R)
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a
d
a
88
análisis estadístico realizado usando los resultados encontrados en cada finca, indicó
que las variedades resistentes presentaron mayores niveles de actividad antioxidante
respecto a las susceptibles a nivel de la raíz (figura No. 6), indicando que la presencia de
metabolitos con capacidad antioxidante, podría estar asociada con la resistencia al
marchitamiento vascular causado por Fod. Otros resultados que están de acuerdo a los
encontrados en esta investigación han sido reportados en otras especies vegetales en
las que metabolitos con actividad antioxidante han presentado actividad antifúngica
contra patógenos del género Fusarium y se ha propuesto una posible relación con
resistencia. Por ejemplo en Linum usitatissimum (Lorenc-Kukuła et al. 2007), Ocimum
basilicum (Hussain et al. 2008) y Myracrodruon urundeuva (Sá et al. 2009). Así como se
ha propuesto, es probable que en el clavel, mayores niveles constitutivos de sustancias
antioxidantes en las variedades resistentes, les puede otorgar ventaja adaptativa durante
la interacción. Esto considerando que el patógeno requiere de un ambiente altamente
oxidante que sea favorable para la muerte de las células vegetales en ciertas fases de la
interacción, la cual se puede ver afectada por la presencia de sustancias antioxidantes en
la planta. Es probable que además, el papel en resistencia de estos metabolitos se
potencialice considerando su ya conocida actividad antifúngíca sobre Fod (Curir et al.
2001; Curir et al. 2003; Galeotti, Barile, Curir, et al. 2008).
2.3.3. Niveles constitutivos en raíces de clavel de enzimas involucradas en biosíntesis de flavonoides
En esta etapa se quiso conocer sobre la biosíntesis constitutiva de los flavonoides en
términos de las enzimas involucradas, con el fin de relacionarlas posiblemente con los
niveles de estos metabolitos y con resistencia a la enfermedad. La enzimas fenilalanina
amonio liasa (PAL), primera enzima de la ruta fenilpropanoide y las enzimas chalcona
sintasa (CHS) y chalcona isomerasa (CHI), participan en las primeras reacciones de la
ruta de biosíntesis de flavonoides. Considerando que en este punto de la investigación, al
menos a nivel constitutivo, los niveles de flavonoides en raíces presentaron relación con
resistencia a la enfermedad, las actividades de las enzimas asociadas con la biosíntesis
de estos metabolitos se evaluaron solamente en este órgano (figura No. 7).
89
7Figura No. 7. Niveles de actividades enzimáticas a nivel de raíz en variedades de clavel de dos fincas productoras ubicadas en diferentes municipios de la sabana de Bogotá. Finca 1, Tocancipa-Grupo Chia: Tasman (S1), Star (S2), Komashi (R1), Gioele (R2) y L.P. Candy (R3). Finca 2, S.B. Talle: Spitfire (S3), Bellisima (S4), Topacio (R4) and Esperia (R5). A) Actividad PAL, B) Actividad CHI, C) Actividad CHS. Las barras verticales presentan la desviación standard de cada promedio (n = 3). Los valores para cada variedad y cada determinación que presentan diferente letra, presentan diferencias significativas (P < 0.05). S=susceptible y R= Resistente a Fod
Para PAL, las variedades Gioele (R) y Esperia (R), presentaron los mayores niveles
(P‹0.05) en cada una de las fincas, respectivamente. Sin embargo, no se presentaron
diferencias significativas entre el resto de variedades. Esta enzima presentó valores de
actividad (300-10000 nkat ácido cinámico/g peso fresco) que se encuentran dentro de los
rangos previamente reportados para esta planta (100-10000 nkat ácido cinámico/g peso
fresco) (Ardila et al. 2011). Con respecto a las actividades enzimáticas CHS y CHI fueron
superiores para las variedades resistentes en ambas fincas, encontrándose valores entre
13 y 300 pkat/g material vegetal para CHS y entre 500 y 4000 µkat/g material vegetal
para CHI. Para las variedades Gioele (R) y Esperia (R) se obtuvieron los mayores valores
de actividad CHS y para las variedades Komashi Blanco (R) y Topacio (R) de CHI. En
0
2000
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ab
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FINCA 1 FINCA 2
C
A B
90
general los niveles de estas dos enzimas, claves para la biosíntesis de flavonoides,
fueron superiores en las raíces de las variedades resistentes de clavel.
Al evidenciar que los niveles de estas enzimas (CHS y CHI) presentaban particular
interés a nivel de raíz, se quiso evaluar si existía relación entre la actividad enzimática y
los niveles transcripcionales para, de esta manera, indagar sobre los puntos de
regulación probables. Los resultados de la evaluación de los niveles transcripcionales
usando qRT-PCR, se presentan en la figura No. 8, expresados como Log (número de
copias/μg de RNA extraído), considerando el orden de las diferencias encontradas entre
las variedades evaluadas (en algunos casos mayor a 3 órdenes). Las tres réplicas para
cada variedad se encontraron dentro del mismo orden de magnitud. Es importante citar
que no se encontraron diferencias en la eficiencia de amplificación entre patrones
(plásmidos recombinantes) y las muestras de cDNA, indicando que la posible presencia
de contaminantes en estas últimas, no afectaba la amplificación y por tanto los resultados
obtenidos. En general, con excepción de la variedad Komashi blanco (R3) que presentó
valores similares a los encontrados para la variedad Star (S2), se pudo determinar que
las raíces de las variedades resistentes presentaron niveles superiores de mRNA para
CHS y CHI, respecto a los encontrados en variedades susceptibles (P‹0,05). El
comportamiento encontrado para la variedad R3, puede estar asociado a sus
características fenotípicas en campo, tal y como se discutirá más adelante.
Es importante citar que, para la enzima PAL, no se determinaron los niveles
transcripcionales considerando que sus niveles de actividad no mostraron relación con la
resistencia a Fod. Algunos reportes han citado que variedades resistentes a patógenos
como los nemátodos Pratylenchus penetrans o Radopholus similis presentan niveles
transcripcionales constitutivos mayores de la PAL, al comparar con variedades
susceptibles, indicando un papel en resistencia (Baldridge et al. 1998; Paparu et al.
2007). Sin embargo, en el caso del clavel es evidente que el papel de la enzima PAL a
nivel constitutivo puede estar asociado entre otros fenómenos, a la generación de los
bloques para la construcción de lignina (Dixon & N. L. Paiva 1995) proceso que a su vez
puede estar relacionado con otras características fenotípicas propias de la planta.
91
8Figura No. 8. Niveles transcripcionales de genes codificantes para CHS y CHI a nivel de raíz en variedades de clavel de dos fincas productoras ubicadas en diferentes municipios de la sabana de Bogotá. Finca 1, Tocancipa-Grupo Chia: Tasman (S1), Star (S2), Komashi (R1), Gioele (R2) y L.P. Candy (R3). Finca 2, S.B. Talee: Spitfire (S3), Bellisima (S4), Topacio (R4) y Esperia (R5). A) CHS, B) CHI. Las barras verticales presentan la desviación estándar de cada promedio (n = 3). Los valores para cada variedad y cada determinación con diferente letra, presentan diferencias significativas (P < 0.05). S=susceptible y R= Resistente a Fod
A través de la evaluación de los niveles de actividad y niveles transcripcionales de las
enzimas CHS y CHI en raíces de clavel, se evidenció que los valores encontrados en las
variedades resistentes son mayores que los de las susceptibles (figuras No. 7B, 7C y 8).
Esto indica que a nivel constitutivo, las variedades resistentes de clavel presentan un
metabolismo favorable para la producción de flavonoides. En general, la mayoría de las
investigaciones sobre estas enzimas en defensa vegetal han estado enfocadas hacia su
inducción durante la infección y pocos hacen referencia al papel pre-infeccional que
pueden tener durante la biosíntesis de fitoanticipinas. Sin embargo, se ha reportado que
altos niveles de transcripción constitutivos, presentes de manera natural (Baldridge et al.
1998) o de manera artificial, ya sea por ingeniería genética (Loren-Kukula et al 2007) o
por el uso de inductores (Fofana et al. 2002), pueden generar un aumento en los niveles
de actividad de las enzimas y de metabolitos con potencial como fitoanticipinas.
Bladridge et al (1998) encontraron que altos constitutivos altos de mRNA para CHS en
raíces de variedades resistentes de alfalfa (Medicago sativa L), podían estar asociados
con la resistencia al nemátodo Pratylenchus penetrans, proponiendo así su papel en
defensa preexistente o constitutiva.
0
1
2
3
4
5
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FINCA 1 FINCA 2 FINCA 1 FINCA 2
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A B
92
2.3.4. Análisis de correlación de Pearson
En la Tabla No. 7 se presentan los resultados del análisis de correlación entre los
parámetros, evaluados a nivel de raíz, usando la herramienta estadística de Pearson
(Azzimonti 2003). Se determinó que existe correlación positiva entre las variables,
contenido de fenoles totales (CFT), Flavonoides totales (Flav) y actividad antioxidante,
evaluada como inactivación de los radicales DPPH y ABTS (coeficientes entre 0.67 a
0.89 α=0.05), indicando que, dichos metabolitos están asociados a la capacidad
antioxidante que exhiben los extractos obtenidos a partir de esta especie vegetal, así
como ha sido reportado en otras plantas (H. Zhao et al. 2008; C. Xu et al. 2010; Lizcano
et al. 2010; Barros et al. 2012). Así mismo, se determinó que a nivel constitutivo
solamente la actividad enzimática CHI presentó una correlación positiva con los niveles
de flavonoides y con los niveles de actividad antioxidante DPPH (correlación de Pearson
0.82 y 0.85). Estudios funcionales con la enzima CHI han demostrado su papel en la
regulación de los niveles de flavonoides en diferentes plantas (Schijlen et al. 2004). Por
ejemplo, la sobre expresión de una secuencia heteróloga de CHI en Saussurea
involucrata generó un aumento significativo en los niveles de apigenina, un flavonoide
con innumerables propiedades biológicas (F.-X. Li et al. 2006). Así mismo, se ha
encontrado su inducción a nivel transcripcional durante el ataque de microrganismos
patógenos y se ha propuesto un papel en resistencia a enfermedades (Morkunas et al.
2011). Considerando que la enzima PAL participa en la primera reacción de la ruta
fenilpropanoide, que genera una alta cantidad de metabolitos asociados a diferentes
procesos, no solo flavonoides, no es extraño que los niveles de esta enzima y los niveles
de estos metabolitos o de actividad antioxidante, no presenten correlación estadística
(coeficientes de 0.28 y 0.29). Para el caso de la actividad CHS, teniendo en cuenta sus
niveles de actividad en las variedades resistentes de clavel, en la presente investigación
se propone un papel en la regulación de niveles de flavonoides y en resistencia, así como
se ha sugerido en diferentes especies vegetales (Schijlen et al. 2004; Lozovaya et al.
2007; Arfaoui et al. 2007). Es probable que la baja correlación estadística entre los
niveles de estos metabolitos y la actividad de esta enzima se deba a que participa en la
generación no solo de flavonoides, sino también de chalconas, las cuales se pueden
encontrar de manera natural en las plantas (Stevens & Page 2004; Vogel et al. 2008).
Las chalconas en clavel han sido reportadas en flores de algunas variedades de flores
amarillas (Yoshida et al. 2004) y se ha propuesto que se pueden acumular por la
intervención de mecanismos que evitan la acción generalmente inmediata de la enzima
93
CHI (Yoshida et al. 2004; Schlangen et al. 2009). No se puede descartar la presencia de
estos mecanismos en otros órganos de las plantas de clavel, considerando la alta
diversidad de metabolitos secundarios que se pueden encontrar en las raíces de esta
planta (Higuera 2001). Sin embargo, es necesario hacer estudios adicionales que
permitan profundizar el papel de las chalconas en órganos diferentes a los pétalos del
clavel.
Tabla No. 7. Coeficientes de correlación de pearson
CFT Flav ABTS DPPH PAL CHS CHI mRNA
CHS
mRNA
CHI
CFT 1
Flav 0,89 1
ABTS 0,76 0,77 1
DPPH 0,67 0,72 0,77 1
PAL 0,29 0,28 0,34 0,61 1
CHS 0,04 0,39 0,48 0,55 0,40 1
CHI 0,64 0,82 0,65 0,85 0,52 0,59 1
mRNACHS 0,31 0,40 0,73 0,80 0,68 0,75 0,67 1
mRNACHI 0,26 0,14 0,61 0,58 0,62 0,33 0,28 0,81 1
CTF: Contenido de fenoles totales, Flav: Contenido de flavonoides totales, ABTS: Actividad antioxidante sobre
ABTS, DPPH: Actividad antioxidante sobre DPPH, PAL: Actividad enzimática fenilalanina amonio liasa, CHS:
Actividad enzimática chalcona sintasa, CHI: Actividad enzimática chalcona isomerasa, mRNACHS: Niveles
transcripcionales chalcona sintasa, mRNACHI: Niveles transcripcionales chalcona isomerasa
Dentro de los resultados encontrados en esta investigación también se pudo evidenciar
que la regulación de estas enzimas en clavel puede darse a nivel transcripcional,
considerando la correlación encontrada entre los niveles de CHS y mRNA de CHS
(Correlación de Pearson 0.75 α=0.05). La regulación a nivel transcripcional de las
enzimas involucradas en la biosíntesis de flavonoides se ha documentado ampliamente
(Schijlen et al 2004). Sin embargo, es bien conocido que ésta se puede dar en otros
niveles, por ejemplo a nivel pos-transcripcional por acción de mecanismos de RNA
interferente (Depicker & Montagu 1997). De acuerdo al presente estudio, los mecanismos
que actúan para la regulación de estas enzimas en el clavel pueden ser al parecer de tipo
transcripcional, dada la correlación entre los niveles de actividad enzimática y los niveles
94
de mRNA. Sin embargo, considerando lo reportado en otras especies como en soya
(Glicine Max), en la que se han encontrado otros puntos de regulación
postranscipcionales para CHS, no se puede descartar la acción de mecanismos alternos
en otros órganos y procesos en el clavel (Senda et al. 2004; Kasai et al. 2004). Así como
(Claudot A. C. et al. 1999) encontraron correlación entre los niveles transcripcionales, la
actividad enzimática y metabolitos de tipo flavonoide presentes en un hibrido de nogal
(Juglans nigra x Juglans regia), en raíces de clavel también se evidenció dicha relación a
nivel constitutivo, indicando que estas enzimas son responsables de generar metabolitos
activos que pueden jugar un papel como fitoanticipinas ante el patógeno causal del
marchitamiento vascular. Es importante citar que se deben realizar estudios adicionales
que pretendan profundizar en si las diferencias encontradas a nivel transcripcional se
deben a diferencias genéticas entre variedades o a diferencias en la activación
constitutiva de factores de transcripción entre las mismas.
Al respecto, es importante anotar que si se tiene en cuenta la correlación positiva entre
los niveles de mRNA de CHS y CHI (Correlación de Pearson 0.81), es probable que la
acumulación de mRNA para estas enzimas se presente en clavel de manera simultánea
y coordinada por la acción de los mismos factores de transcripción (Vom Endt et al. 2002;
Broun 2005), así como se ha reportado en especies como Arabidopsis thaliana (Mehrtens
et al. 2005). Sin embargo, es necesario realizar estudios adicionales que permitan
confirmar la presencia de este proceso de regulación en el clavel.
2.3.5. Análisis de componentes principales PCA
Los análisis estadísticos multivariados se constituyen en una herramienta de interés para
la clasificación y agrupamiento de genotipos vegetales, teniendo en cuenta parámetros
de su metabolismo secundario (Hossain et al. 2011). De acuerdo con el análisis de
componentes principales para los parámetros asociados a la biosíntesis de flavonoides
en el clavel (figura No. 9A), con excepción de la variedad Komashi Blanco (R), la cual se
encuentra en el lado derecho de la gráfica, el PC1 (62.6%) permite agrupar las
variedades en función de su nivel de resistencia al marchitamiento vascular. De esta
manera las variedades resistentes se encuentran agrupadas hacia el lado izquierdo de la
gráfica, mientras que las variedades susceptibles lo hacen al derecho. Por otro lado, el
PC2 (19.8%), permite explicar la variación propia determinada por la localización de la
finca y el suelo usado en el enraizamiento. Esto considerando que las variedades
95
provenientes de la finca 1 (Grupo Chia-Tocancipa) se encuentran en la parte superior de
la gráfica, mientras que las de la segunda finca (Cota-SB Talee) lo hacen en la parte
inferior. A pesar de que (L. S. Wu et al. 2009) no encontraron diferencias importantes en
los niveles de flavonoides en Houttuynia cordata en función de la región geográfica, se ha
reportado que las condiciones ambientales, el suelo de la siembra, la humedad y otros
factores externos pueden determinar los niveles de los metabolitos secundarios, entre
ellos los flavonoides (Winkel-Shirley 2002; J.-T. Lin et al. 2010; Agati et al. 2012;
Ballizany et al. 2012). Este es el caso de Glycin tomentella, en donde se determinó que el
suelo usado en la siembra afecta los niveles de algunos flavonoides en raíces (J.-T. Lin
et al. 2010).
9Figura No. 9. Análisis de componentes principales para metabolitos, actividades enzimáticas y niveles
transcripcionales para el metabolismo de flavonoides en raíces de clavel. A) Distribución de variedades de clavel en los componentes de variación. B) Distribución de las variables evaluadas en los componentes de variación (Gráfica de cargas o loadings)S=susceptible y R= Resistente a Fod
Considerando que el componente PC1 permitió explicar la mayor parte de la variación de
los resultados obtenidos, con un 62.6%, se propone que existe una relación entre los
niveles de resistencia a la enfermedad y la biosíntesis de flavonoides a nivel de la raíz.
Este resultado tiene potenciales aplicaciones considerando que una agrupación de
variedades resistentes y susceptibles con base en los parámetros asociados al
metabolismo secundario, puede ser una herramienta candidata para la discriminación de
variedades en función de la resistencia a la enfermedad (figura No. 9 A). La aplicación
PC1
PC2
Act CHS
mRNA CHS
mRNA CHI
Act PAL
Act CHI Gioele (R)
Komashi (R)
Topacio (R)
Esperia (R)
Tasman (S)
Star (S)
Spitfire (S)
Bellisima (S)
L.P Candy (R)
PC1
PC2
Resistencia Susceptibilidad
Finca 1
Finca 2
A B
96
del PCA para la clasificación de variedades de cebada (Hordeum vulgare L) usando
como variables los contenidos de fenólicos, flavonoides y actividad antioxidante, se ha
planteado como una alternativa para la selección de variedades con características
organolépticas de interés (H. Zhao et al. 2008). En general, el PCA basado en diferencias
en el contenido de fenoles, flavonoides y actividad antioxidante está siendo usado para la
clasificación de variedades de diferentes especies vegetales (C. Xu et al. 2010; Hossain
et al. 2011; Bernaert et al. 2012). Reportes recientes han incluido también para este tipo
de clasificaciones, datos tanto a nivel de actividades enzimáticas y niveles de
transcripción (Thill et al. 2012). Esto se debe a que la evaluación conjunta de las rutas
biosintéticas a nivel de la presencia de proteínas activas (actividad enzimática) y niveles
de mRNA, permite evaluar de manera simultánea cuáles son aquellos posibles puntos de
regulación de la ruta. Es importante citar que a dicho patrón de clasificación usando PCA,
reportado por esta investigación, solo se escapa la variedad resistente Komashi blanco,
la cual presentó niveles intermedios de flavonoides, actividad antioxidante, actividad de la
enzima CHS y niveles transcripcionales de CHI. Se sabe, por información de los
cultivadores, que dicha variedad presenta también niveles menores de resistencia a la
enfermedad en campo.
La gráfica de distribución de variables (figura No. 9B), muestra cuales son las principales
variables que influyen sobre la generación de los componentes generados (PC1, PC2,
PC3, etc). En este caso se evidencia que las variables mRNACHS y Act CHS, son las
que tienen un mayor efecto sobre los componentes PC1 Y PC2. Esto nos indica que la
distribución de variedades susceptibles y resistentes en la figura 9A, está influenciada en
gran medida, por los niveles de actividad y transcripcionales de la enzima chalcona
sintasa. Bajo estos resultados se puede concluir que los niveles de esta enzima, son
importantes en el agrupamiento estadístico realizado y generan particular interés cuando
se requiera seleccionar un parámetro con el fin de profundizar en el papel del
metabolismo de flavonoides en la resistencia del clavel.
De acuerdo con esta fase de la investigación, se propone que uno de los componentes
de la resistencia del clavel al marchitamiento vascular, es una mayor biosíntesis
constitutiva de flavonoides a nivel de la raíz, proceso que al parecer está regulado a nivel
enzimático por las enzimas CHI y CHS. Esta propuesta se realiza teniendo en cuenta la
naturaleza poligénica de la resistencia del clavel al marchitamiento vascular reportada
(Baayen et al. 1991), en donde se ha determinado que son varios los componentes
97
génicos que determinan el fenotipo resistente en el clavel. Así mismo, se propone que la
biosíntesis de estos metabolitos puede llegar a ser un potencial marcador de resistencia
que deberá ser evaluado en un mayor número de variedades con el fin de avanzar en la
generación de marcadores para la selección de variedades de clavel resistentes al
marchitamiento vascular.
2.4. Conclusiones
Las condiciones seleccionadas para la extracción de flavonoides totales y actividad
antioxidante a partir de tallos y raíces de clavel, incluyen un tratamiento con metanol al
80% y ultrasonido por 15min.
Los niveles constitutivos de flavonoides y actividad antioxidante en clavel fueron mayores
en raíces que en tallos para todas las variedades evaluadas, indicando que existe una
regulación órgano dependiente de la biosíntesis de este tipo de metabolitos, determinada
por las necesidades adaptativas de la planta.
La actividad antioxidante obtenida a partir de raíces de clavel y evaluada mediante los
métodos espectrofotométricos, está asociada a la presencia de metabolitos de tipo
fenólico y/o flavonoide, tal y como ha sido reportado para otras especies vegetales.
Los niveles constitutivos de flavonoides y actividad antioxidante en raíz, son superiores
en las variedades resistentes al comparar con las susceptibles, indicando un posible
papel de dichos metabolitos en los mecanismos de defensa pasiva asociada con la
resistencia al patógeno.
Los niveles de actividad CHS y CHI están asociadas con resistencia al marchitamiento
vascular en las variedades evaluadas, indicando que a nivel constitutivo, estas enzimas
regulan la generación de los metabolitos de tipo flavonoide y capacidad antioxidante en
las raíces del clavel. Dicho comportamiento se sustenta a nivel estadístico en especial
para la enzima CHI de acuerdo a la correlación entre los niveles de actividad enzimática
y metabolitos.
Los niveles transcripcionales de los genes codificantes para CHS y CHI están asociados
con resistencia a la enfermedad en las variedades estudiadas y con la actividad para las
98
enzimas que dichos genes codifican, en especial para la CHS, para la que se encontró
una correlación estadística entre actividad enzimática y niveles de mRNA.
De acuerdo con los análisis estadísticos multivariados se puede concluir que el PCA
permitió agrupar las variedades de clavel objeto de estudio en esta investigación, en
función de la resistencia a la enfermedad, posicionándose éste como un posible
marcador para la selección de variedades resistentes al marchitamiento vascular.
La biosíntesis de flavonoides a nivel de las raíces del clavel está asociada con la
resistencia al marchitamiento vascular y está mayormente determinada por la
transcripción de los genes codificantes para las enzimas chalcona sintasa y chalcona
isomerasa, en este organo, primer punto natural de contacto entre la planta y el
patógeno.
99
3. Biosíntesis de metabolitos fenólicos en clavel durante su interacción con Fusarium oxysporum f. sp. dianthi
Resumen
Se evaluó el efecto que tiene la inoculación con Fusarium oxysporum f. sp. dianthi raza 2
sobre algunos parámetros bioquímicos y moleculares asociados a la biosíntesis de
fenólicos en tallos y raíces de las variedades de clavel L.P Candy (Resistente) y Tasman
(Susceptible). Esta evaluación comparativa buscó determinar si la biosíntesis de dichos
compuestos, se activa como respuesta asociada a la resistencia al patógeno causal del
marchitamiento vascular.
Se determinó que en la variedad resistente, tanto a nivel de la raíz como a nivel del tallo,
se presenta un aumento en los niveles de fenoles y flavonoides totales, asi como de
actividad antioxidante, durante las primeras horas de la interacción con el patógeno.
Considerando que en la variedad susceptible dicho aumento se presentó solo a nivel de
la raíz, a tiempos mas tardíos y con niveles menores a los encontrados en la variedad
resistente, se concluyó que la regulación espacio temporal de las cantidades de estos
metabolitos es importante en la resistencia de la planta. Se encontró usando la técnica de
HPLC, que al menos 4 compuestos con características químicas similares a las de los
flavonoides, están asociados a estos procesos en la raíz (Grupo I) y 2 compuestos a nivel
del tallo (Grupo II). Se propone al Kaemferido 3-O-β-D–glucopiranosil-(1→2)-O--L-
ramnopiranosil-(1→6)- β-D –glucopiranosido como perteneciente a dichos grupos de
compuestos en raíz, y al Kaemferol 3-O-β-D–glucopiranosil-(1→2)-O--L-
100
ramnopiranosil-(1→6)-β-D–glucopiranosido en el tallo. Los aumentos en los niveles de
flavonoides en las raíces de la variedad resistente, se asociaron con la modulación de la
actividad de las enzimas chalcona sintasa (6 y 48hpi), chalcona isomerasa (48hpi) y
fenilalanina amonio liasa (96 hpi). Para el caso del tallo, solo los niveles de la enzima
chalcona sintasa, presentaron un cambio significativo en esta variedad (96hpi). El
aumento en actividad CHS y CHI en raíz a las 48 hpi parece estar asociado al cambio en
los niveles de mRNA para estas enzimas a las 12 y 24 hpi. En el tallo, los niveles de
mRNA para la enzima CHS aumentaron en la variedad resistente inoculada con respecto
al control a las 48hpi. En general, se evidenció un aumento de la biosíntesis de
flavonoides en tallos y raíces de la variedad resistente inoculada, indicando que estos
metabolitos están asociados a los mecanismos de defensa activa del clavel, durante su
interacción con Fod.
Abstract
We evaluated the effect of Fusarium oxysporum f. sp. dianthi race 2 inoculation, on some
biochemical and molecular parameters associated to flavonoid biosynthesis in stems and
roots of two carnation cultivars (LP Candy resistant and Tasman susceptible). This
comparative evaluation aimed to determinate the role of biosynthesis of flavonoids in
active defense mechanisms associated to resistance to vascular wilt in carnation
The resistant cultivar showed increased levels of total phenols and flavonoids, as well as
antioxidant activity, at both root (6.12 and 96 pih) and stem level (12 and 96 hpi). In the
susceptible cultivar, this increase was found at root level, at later times (96 hpi) and lower
levels, than those found in the resistant cultivar. Acording to these results, it was found
that spatio-temporal regulation of flavonoid and phenol levels is important in resistance to
vascular wilt. It was determined by HPLC that at least 4 compounds in roots (Group I)
and 2 in stems (Group II) with similar characteristics to those expected for flavonoids,
were associated to disease resistance. We are proposing as belonging to these groups,
the compounds Kaempheride 3-O-β-D-glucopyranosyl (1 → 2)-O- -L-rhamnopyranosyl-
(1 → 6) - β-D-glucopyranoside at root level and kaempherol 3-O-β-D-glucopyranosyl (1
→ 2)-O- -L-rhamnopyranosyl-(1 → 6) - β-D-glucopyranoside in stems. The increased
levels of flavonoids in the resistant roots were associated to activity of enzymes, chalcone
synthase (6 y48hpi), chalcone isomerase (48hpi) and phenylalanine ammonia lyase (96
101
hpi). At stem, the levels of the enzyme chalcone synthase, showed a significant change at
96hpi. It was determined that the enzymatic response at 48hpi for CHS and CHI in roots,
was associated with increased transcriptional levels at 12 and 24 hpi. In stems, levels of
mRNA for CHS increased in the resistant cultivar inoculated when were compared to the
non-inoculated control at 48hpi. In conclussion, an increased flavonoid biosynthesis in the
inoculated roots and stems of resistant cultivar (L.P Candy) showed that these
metabolites are associated with active defense mechanisms in carnation, during its
interaction with Fod.
3.1. Introducción
El cultivo de variedades resistentes de clavel (Dianthus caryophyllus L) se ha posicionado
como una de las herramientas más eficientes para el manejo del marchitamiento vascular
causado por Fusarium oxysporum f. sp. dianthi. Es por ello que dentro de las
características de mayor interés en los programas de cruzamiento se encuentra la
resistencia en campo a esta enfermedad. En estudios realizados en estas variedades se
ha determinado que la resistencia al patógeno es multigénica (Baayen et al. 1991) y que
la capacidad para detener la colonización y degradación de los tejidos vasculares está
determinada por diversos factores que se deben activar de manera coordinada durante la
infección. La acumulación de diversos metabolitos secundarios es uno de estos procesos
y se ha identificado que puede estar asociado a la resistencia, tanto por su papel en el
fortalecimiento de paredes celulares (Niemann et al. 1991; Higuera & Ebrahim-Nesbat
1999; Ouellette et al. 2004), como por su acción antifúngica directa sobre el patógeno
(Baayen & Niemann 1989; Curir et al. 2001; Curir et al. 2003; Galeotti, Barile, Curir, et al.
2008). Se ha reportado que en el clavel, esta respuesta depende del órgano de la planta
involucrado, ya que a nivel del tallo algunos de estos compuestos son nitrogenados
derivados del ácido antranilico (Baayen & Niemann 1989), mientras que a nivel de la raíz,
primer punto de contacto con el patógeno, dichos metabolitos nitrogenados no se
detectan, pero si otros metabolitos de tipo fenólico (Higuera & Montes de Gómez 1996).
Particular interés en este modelo ha generado la presencia de flavonoides con actividad
antifúngica contra Fod a nivel constitutivo e inducible (Curir et al. 2001; Curir et al. 2003;
Curir et al. 2005; Galeotti, Barile, Curir, et al. 2008). Se ha propuesto al respecto, que
estos compuestos pueden cumplir un papel central dentro de la respuesta de defensa
102
activa o inducible de la planta, como es el caso del compuesto kaempferido 3-O-[2G--D-
glucopiranosil]--rutinosido (tabla No. 4). Este presentó aumento en sus niveles en tallos
y raíces de la planta, durante la inoculación con el patógeno y se clasificó como un
compuesto similar a fitoalexina (Curir et al. 2005). Esta clasificación se debe a que,
aunque cumple con la premisa de presentar un aumento durante la inoculación con el
patógeno, al encontrarse de manera constitutiva, no puede ser clasificado como una
fitoalexina real. Sin importar su clasificación en este modelo particular, la naturaleza
inducible de estos compuestos genera particular interés en los mecanismos de defensa
del clavel, considerando el papel protagónico que pueden tener en la resistencia a
patógenos como Fusarium, en donde la maquinaria antioxidante de la planta puede jugar
un papel central (Farnochi et al. 2005; Lorenc-Kukuła et al. 2007; Sá et al. 2009; Kamil
Kostyn et al. 2012; Barna et al. 2012).
Diversos estudios realizados con mutantes han permitido determinar que los niveles de
estos metabolitos pueden estar regulados por algunas de las enzimas que participan en
su biosíntesis, como son fenilalanina amonio liasa (PAL), chalcona sintasa (CHS) y
chalcona isomerasa (CHI) (Schijlen et al. 2004; Winkel-Shirley 2002; Vogt 2010). Se ha
determinado que la modulación de los niveles de actividad y transcripcionales de estas
enzimas durante la infección, puede estar asociada a la resistencia vegetal a patógenos
del género Fusarium (P. L. A. Chang et al. 2008; Arfaoui et al. 2007; Lorenc-Kukuła et al.
2007; Kamil Kostyn et al. 2012; Morkunas et al. 2010). En el clavel, se han realizado
diversos estudios sobre la biosíntesis de estos metabolitos en procesos como floración y
senescencia (Fukui et al. 2003; Mato et al. 2000; Yoshida et al. 2004). Si bien es cierto
que, de acuerdo a la primera etapa de este estudio, se determinó que los niveles
constitutivos de actividad y mRNA para las enzimas CHS y CHI en raíces del clavel,
están asociados a los niveles de flavonoides totales (Ardila, S. T. Martinez, et al. 2013),
no se conoce como se regula la biosíntesis de estos metabolitos en la planta durante la
infección con el patógeno. Esto es central, considerando que solo mediante evidencias
bioquímicas o moleculares que indiquen que las rutas involucradas en la biosíntesis de
estos metabolitos se activan por efecto de la inoculación, se puede postular su papel en
los mecanismos de defensa del clavel. En la discusión acerca del papel de un metabolito
en defensa para un modelo planta-patógeno determinado, debe contrastarse los niveles
de dichos metabolitos con determinaciones asociadas a las actividad y expresión de
genes para enzimas involucradas en su biosíntesis (Hammerschmidt 1999; Treutter
103
2006). En esta etapa de la investigación, se evalúo el efecto que tiene la inoculación con
Fod sobre los niveles de compuestos fenólicos, flavonoides totales y actividad
antioxidante, en 2 variedades de clavel que presentan diferentes niveles de resistencia a
la enfermedad. Así mismo, se compararon los perfiles por HPLC de los metabolitos tipo
flavonoide y se verificó su inducción en la planta durante la infección. Los niveles de
estos metabolitos se contrastaron con los niveles de actividad y transcripcionales de
algunas de las enzimas involucradas en su biosíntesis, (PAL, CHS y CHI). El análisis
conjunto de estos resultados permitió obtener información de los fenómenos que pueden
ser probables puntos de regulación durante la interacción con el patógeno y se postulan
aquellos mecanismos que pueden estar asociados con la resistencia a la enfermedad.
3.2. Materiales y Métodos
3.2.1 Material biológico
Para el presente estudio se usaron esquejes indexados libres de patógenos, con 3
semanas de enraizamiento, de dos variedades comerciales de clavel (Dianthus
caryophyllus L) cultivadas en Colombia (L.P Candy, Resistente y Tasman, Susceptible)
suministradas por la empresa Grupo Chia ubicada en Gachancipá (Sabana de Bogotá,
Colombia). Se usó un aislamiento de Fusarium oxysporum f. sp. dianthi raza 2 obtenido
por la empresa floricultora Grupo Chia a partir de plantas susceptibles con sintomatología
típica de marchitamiento vascular. Se evidenció a través de microscopia (50X) la
presencia de macroconideas típicas de la especie y se verificó con herramientas
moleculares la especie (Abd-elsalam et al. 2003) y la raza (Chiocchetti et al. 2009). Este
patógeno se mantuvo en medio sólido PDA hasta el momento de la inoculación.
3.2.2. Evaluación de parámetros asociados con la biosíntesis de flavonoides durante la infección con el patógeno
Para llevar a cabo este análisis comparativo de los parámetros de interés entre las
variedades seleccionadas, se realizó un ensayo in vivo de inoculación, usando cuatro
tratamientos (T1 resistente control; T2, resistente inoculado; T3, susceptible control; T4,
susceptible inoculada) y diferentes tiempos de muestreo posinoculación. Para ello se
104
siguió el diagrama de flujo descrito a continuación. Los detalles de las diferentes etapas,
se describen en los numerales siguientes.
10Figura No. 10. Diagrama de flujo general para el estudio de parámetros asociados a la biosíntesis de flavonoides en clavel durante la infección con el patógeno Fod
3.2.3 Proceso de Inoculación
La mitad de los esquejes (150) de las dos variedades de clavel fueron inoculados con el
patógeno por inmersión de las raíces en una suspensión de conidias durante 20
segundos tal y como se describió previamente (Higuera & Montes de Gómez 1996). El
inóculo fue preparado en medio Czapek Dox Broth previamente esterilizado, mediante
AISLAMIENTO DE Fusarium oxysporum f.
sp, dianthi raza 2
DETERMINACIÓN DE FENOLES TOTALES,
FLAVONOIDES TOTALES Y ACTIVIDAD
ANTIOXIDANTE (ABTS Y DPPH)
Métodos
espectrofotométricos
ENSAYO in vivo PROCESO DE INOCULACIÓN
T1, Resistente Control, T2 Resistente inoculado, T3 Susceptible control, T4 Susceptible inoculado
MUESTREO POSTINOCULACIÓN
0, 6, 12, 24, 48 y 96 HORAS
COMPARACIÓN DE
PERFILES Y ANÁLISIS
CUANTITATIVO
HPLC-UV
VARIEDADES DE CLAVEL CON DIFERENCIAS
EN LOS NIVELES DE RESISTENCIA AL
MARCHITAMIENTO VASCULAR
VARIEDAD RESISTENTE L.P. Candy
VARIEDAD SUSCEPTIBLE Tasman
NIVELES DE ACTIVIDAD ENZIMÁTICA (chalcona
sintasa, chalcona Isomerasa, fenilalanina
amonio liasa)
Métodos espectrofotométricos y
HPLC
NIVELES
TRANSCRIPCIONALES PARA LOS GENES DE LAS
ENZIMAS (chalcona sintasa, chalcona isomerasa,
fenilalanina amonio liasa)
RT- PCR en tiempo real
APROXIMACIÓN A LA
ESTRUCTURA QUÍMICA DE
COMPUESTOS DE INTERÉS
HPLC-DAD HPLC-MS
105
agitación por 7 dias a 25oC, en erlenmeyers de 200 mL. El contenido del medio fue
diluido con agua estéril para obtener una concentración final de 1,0 x 106 conidias/mL. De
manera simultánea, 150 esquejes control de estas mismas variedades, fueron sometidos
al mismo proceso pero usando agua estéril en cambio de inóculo. Se contó asi con 4
tratamientos: T1 resistente control, T2, resistente inoculado, T3, susceptible control, T4,
susceptible inoculado. Una vez inoculados, los esquejes fueron sembrados en recipientes
plásticos sobre una mezcla de suelo y cascarilla de arroz 50/50 previamente esterilizada
(30 plántulas/recipiente). Estos fueron dispuestos al azar, de acuerdo al diseño
experimental completamente aleatorizado propuesto (figura No. 11). Los muestreos se
realizaron a las 0, 6, 12, 24, 48 y 96 horas posinoculación, tanto de los esquejes control
como de los inoculados, para las dos variedades, tomando 25 individuos de cada uno de
los 4 tratamientos. Los esquejes fueron lavados con abundante agua para eliminar el
exceso de suelo y separados los tallos de las raíces, para ser mantenidos a -80oC hasta
la realización de los análisis posteriores.
11Figura No. 11. Distribución de esquejes en el arreglo experimental completamente aleatorizado planteado en el estudio de parámetros asociados a la biosíntesis de fenólicos en clavel durante la infección con Fod
3.2.4. Evaluación de compuestos fenólicos, flavonoides y
actividad antioxidante
Esta evaluación se realizó en tallos y raíces de clavel para los diferentes tratamientos
bajo las mismas condiciones de extracción y cuantificación de metabolitos, descritas en
la primera etapa de esta investigación (numerales 2.2.3-2.2.6). Cada determinación se
realizó usando triplicado biológico y duplicado analítico. La comparación estadística
(ANOVA de una sola vía) se realizó en cada tiempo, para cada órgano de la planta,
usando el programa Statgraphics 5.1.
Resistente control
Resistente inoculado Susceptible inoculado
Susceptible control
106
3.2.5. Comparación de perfiles cromatográficos por HPLC
Considerando los resultados obtenidos en el contenido de fenoles totales, flavonoides
totales, y de actividad antioxidante, se seleccionaron aquellos tiempos en los que se
presentaron cambios estadísticamente significativos, asociados a la inoculación con el
patógeno (raíz 6 y 96 horas, tallo, 96 horas). La evaluación de perfiles cromatográficos
por HPLC se realizó de acuerdo con las condiciones de separación y análisis que fueron
puestas a punto, según los ensayos preliminares en los que se seleccionaron gradientes,
solventes y volúmenes de inyección. Se usó un cromatógrafo líquido LC-20AT Shimadzu
®, una columna RP-18 Phenomenex® (250mmx4.60mm, 5 micras) y un detector UV-VIS
Prominencia ® SPD-20AT. Para la separación las condiciones fueron las siguientes: fase
móvil A: agua: H3PO4 400:2 pH 2,5, fase móvil B: acetonitrilo 100% y el gradiente como
se describe a continuación: 0 min A 100%, 0 minutos-10 minutos B 15%, 10 min-45 min
B 30%, 45min- 70min B 50%, 70min- 75min B100%, 75min- 80min B100%, 80min- 82min
B 0%, 82min-90min B 0%. El Flujo usado fue de 1mL/min y las inyecciones se realizaron
usando un loop de 100µL. Para la detección se usaron las absorbancias a 280 y 350nm,
esta última longitud de onda fue la seleccionada para el análisis de flavonoides, de
acuerdo con reportes previos en esta especie vegetal (Galeotti, Barile, Lanzotti, et al.
2008). Se hicieron ensayos con diferentes patrones de manera independiente y con
mezclas de los mismos para asegurar la separación con el gradiente seleccionado. Las
sustancias usadas como patrones fueron ácido cafeico SIGMA®, ácido ferúlico SIGMA®,
quercetina TRANSMIT® y kaempferol TRANSMIT®. La comparación de los perfiles se
realizó a 350nm, usando los valores de áreas para cada pico, correspondiente a un
compuesto o grupo de compuestos que fueron separados de acuerdo a las condiciones
seleccionadas. Los resultados fueron analizados mediante ANOVA de una vía utilizando
Statgraphics ® Software versión 5.1. Así mismo, mediante análisis de PCA se evaluaron
similitudes entre los tratamientos en términos de los compuestos o grupos de
compuestos cuantificados, usando el software de la línea de las matrices de Nia.
http://lgsun.grc.nia.nih.gov/ANOVA/index.html. Con el fin de normalizar para el análisis de
PCA, todos los datos se transformaron con la función (Log10 X). Bajo estas condiciones,
se seleccionaron algunos compuestos o grupos de compuestos que al estar
probablemente asociados con la resistencia a la enfermedad, fueron sujetos a análisis
posteriores con el fin de obtener información estructural de los mismos.
107
3.2.6. Aproximación a la estructura química de algunos
compuestos de interés.
Con el fin de obtener información acerca de la estructura química de los compuestos (o
grupo de compuestos) que al presentar aumento de sus niveles en la variedad resistente
durante la infección, presentaban interés particular en este estudio, se usaron técnicas
como HPLC-DAD y HPLC-MS. La obtención de los espectros UV se realizó en el
cromatógrafo líquido HPLC – DAD Merck-Hitachi D-7000, equipado con un detector de
arreglo de diodos L-4500, bomba inteligente L-6200A e interfase L-6000A. Las
condiciones de separación y análisis fueron las descritas previamente en el numeral
anterior 3.2.5. en la que se realizó la comparación cuantitativa de los perfiles
cromatográficos para los diferentes tratamientos. Para el análisis por HPLC-MS de baja
resolución se usó el equipo Shimadzu® LCMS- 2010 con bomba LC-10ADvp, detector
UV SPD-10Avp y detector de masas LCMS 2010EV. Las condiciones de separación en
este equipo fueron las mismas usadas anteriormente pero cambiando la fase móvil A por
una solución acuosa de acido acético pH 3,0. En el espectrómetro de masas se usó
electrospray (ESI) como fuente de ionización, con un voltaje de 1,5 kV y un flujo de gas
nebulizador (N2) de 1,5 mL/min.
3.2.7. Evaluación de actividades enzimáticas
La evaluación de las actividades enzimáticas fenilalanina amonio liasa (PAL), chalcona
sintasa (CHS) y chalcona isomerasa (CHI) durante la interacción con el patógeno, se
realizó de acuerdo a las condiciones de extracción y de cuantificación previamente
descritas, tanto en tallos como en raíces de clavel (2.2.7 y 2.2.8). Cada determinación se
realizó usando triplicado biológico y duplicado analítico. La comparación estadística se
realizó usando ANOVA de una sola vía para los datos de cada tiempo y para cada
órgano de la planta, se usó el programa Statgraphics 5.1.
108
3.2.8. Evaluación de niveles transcripcionales
La evaluación de los niveles de transcripción para los genes codificantes de fenilalanina
amonio liasa (PAL), chalcona sintasa (CHS) y chalcona isomerasa (CHI) durante la
interacción con el patógeno, se realizó de acuerdo a las condiciones previamente
descritas (2.2.9). Este análisis se llevó a cabo solo para aquellas enzimas que
presentaron cambios significativos en términos de su actividad enzimática. Los
cebadores usados para esta etapa de la investigación, son los que se describen en las
tablas No. 7 y 8. Cada determinación se realizó usando triplicado biológico y duplicado
analítico. Los resultados obtenidos después de la cuantificación absoluta se reportaron
como número de copias / pg cDNA (Y. Lu et al. 2012). Se verificó que no se presentaran
variaciones en la eficiencia de amplificación de muestras y patrones usando el algoritmo
reportado por (Ramakers et al. 2003). Los resultados también se presentan como la
relación de la expresión del inoculado con respecto al control (Desmond et al. 2008;
Godard et al. 2009), para evaluar diferencias propias del proceso de inoculación con el
patógeno. La comparación estadística de los resultados obtenidos de la cuantificación
absoluta, se realizó en cada tiempo, para cada órgano de la planta, usando ANOVA de
una sola via con el programa Statgraphics 5.1.
Tabla No. 8. Lista de cebadores usados para la cuantificación por PCR en tiempo real de los niveles de mRNA para los genes codificantes para fenilalanina amonio liasa
Nombre de la
proteína Cebadores Secuencia 5´ 3´
Tamaño del
fragmento
Fenilalanina amonio
liasa
PAL directo
PAL reverso
ACTTGGTCCCGCTTTCCTAC
GTGAGGATCTCACCGTTGG 85 pbs
3.3. Resultados y Discusión
La presente etapa de esta investigación buscó profundizar sobre los componentes
bioquímicos y moleculares que se activan durante la infección por Fod y que están
asociados con la resistencia al marchitamiento vascular del clavel. Particularmente se
evaluó si dentro de dichos mecanismos de defensa activa, se encuentra la biosíntesis de
109
flavonoides, metabolitos dinámicos que pueden cumplir diversos papeles en la defensa
vegetal. La información adquirida en esta fase de la investigación, complementaba el
panorama que se había generado en la etapa anterior en la que se había determinado
que a nivel constitutivo, las variedades resistentes de clavel presentan una biosíntesis de
flavonoides más activa que las variedades susceptibles (Ardila, S. T. Martinez, et al.
2013). Con este fin, se planteó el diagrama de flujo que se describió anteriormente (figura
No. 10). Este se encuentra dividido en tres grandes etapas, la primera correspondiente al
análisis de metabolitos, la segunda a las determinaciones de actividades enzimáticas y la
tercera a la evaluación de los niveles transcripcionales. Es importante comentar que, con
el fin de asegurar que las respuestas bioquímicas y moleculares estudiadas estuvieran
relacionadas con diferencias en los niveles de resistencia de las variedades objeto de
estudio, se hizo seguimiento del avance de la enfermedad durante cuatro semanas pos
inoculación y se determinó al final de este periodo, los niveles de incidencia al
marchitamiento de la enfermedad en cada uno de los tratamientos propuestos. Cada una
de las etapas de esta fase de la investigación se presenta a continuación de manera
independiente y finalmente se comparan en conjunto, con el fin de conocer el panorama
general de la modulación espacio-temporal de las respuestas evaluadas, para cada una
de las variedades en estudio.
Es importante resaltar que las condiciones de inoculación usadas en la investigación
presente, han permitido evaluar respuestas asociadas a la resistencia del clavel en
estudios previos (Higuera 2001; Ardila & Higuera 2005; Cuervo et al. 2009; Ardila et al.
2011). Se ha determinado que la inmersión de las raíces en una suspensión de conidias
del hongo, además de semejar las condiciones que el patógeno usa para infectar las
plantas en el campo, es la que presenta mayor efectividad en la infección, al comparar
con otras técnicas de inoculación de raíces como el “drench“ o la inoculación directa del
suelo (Higuera 2001). Considerando que se querían evaluar respuestas asociadas a
defensa en tallos y raíces, otras técnicas de inoculación como las que son usadas
directamente en el tallo, fueron descartadas. Dichas técnicas requieren además, del uso
de cortes o punciones en este órgano (Niemann & Baayen 1988; Baayen & Niemann
1989), condiciones que generan respuestas al estrés no deseadas que pueden interferir
con las respuestas a evaluar. La generación de heridas en papa (Solanum tuberosum)
por ejemplo, puede desencadenar aumentos en enzimas involucradas en metabolismo
de fenoles como las polifenoloxidasas (Thipyapong et al. 1995).
110
Durante este ensayo in vivo, los diferentes tratamientos propuestos se mantuvieron bajo
las mismas condiciones ambientales de iluminación, temperatura y humedad (figura No.
12). Esto permitió, en el momento de realizar el análisis de resultados, tener en cuenta
con base en los controles, el posible efecto que las condiciones ambientales pueden
presentar en los parámetros de interés, pues es sabido que por ejemplo altos niveles de
radiacion o altas fuerzas iónicas en la rizosfera, pueden afectar la biosíntesis de
flavonoides (Ryan et al. 2002; Agati et al. 2011).
12Figura No. 12. Fotografías del ensayo in vivo a las 2 horas poinoculación. A) vista general del ensayo con las 600 plantas usadas para los 4 tratamientos. B) Vista superior de un recipiente con plantas de la variedad susceptible. C). Vista superior de un recipiente con plantas de la variedad resistente
3.3.1 Evaluación de incidencia del marchitamiento vascular causado por Fusarium oxysporum f. sp. dianthi raza 2 en las dos variedades de clavel
La selección del material vegetal es un punto central en el éxito de cualquier estudio
comparativo sobre mecanismos de defensa vegetales y debe considerar la inclusión de al
menos 2 genotipos con diferencias marcadas en términos de la resistencia a la
enfermedad en estudio (Wise et al. 2007). La selección de las variedades que fueron
usadas en el presente estudio se realizó teniendo en cuenta la opinión de expertos de la
empresa de floricultura Grupo Chia (comunicación oral con el Ingeniero agrónomo
Alejandro Saavedra), quienes teniendo en cuenta su comportamiento en campo, han
clasificado a la variedad Tasman como susceptible y a la variedad L.P Candy como
A B C
111
resistente al marchitamiento vascular. Considerando su resistencia a la enfermedad, esta
última variedad ha sido usada como referente en otras investigaciones en las que se han
estudiado algunos cambios químicos que se presentan en la planta durante la
inoculación con el patógeno (Higuera 2001).
Adicional a los estudios previos y los reportes de la empresa floricultora proveedora del
material vegetal sobre el comportamiento de las variedades Tasman y LP Candy en
campo, se confirmó bajo las condiciones particulares de inoculación de este ensayo, que
efectivamente estas variedades se comportan diferencialmente en términos de la
resistencia a la enfermedad. Esto era importante considerando que la presión de inóculo
que se usó en el presente estudio, es superior a la comúnmente encontrada en el suelo
usado para los cultivos. Es por ello que se realizó una evaluación visual de la incidencia
de síntomas en las plantas controles e inoculadas de las variedades estudiadas, a
tiempos posteriores a los seleccionados para realizar los muestreos, cuando se espera,
se inicie la expresión de la sintomatología típica de la enfermedad.
Se determinó que a las 4 semanas posinoculación, la variedad susceptible inoculada,
presentó un proceso de marchitamiento evidente, con inclinación del tallo y
amarillamiento de las hojas del tercio inferior con visibles síntomas de deshidratación, en
un 87 % de los esquejes. Para las plantas control de esta misma variedad, un 14% de los
esquejes presentaban algún tipo de amarillamiento leve en sus hojas, el cual no fue
asociado con los síntomas típicos de marchitamiento. (figura No. 13. T3 y T4). En el caso
de la variedad resistente, solamente se presentó este mismo amarillamiento leve en
algunas de las plantas control e inoculadas, que correspondieron al 14 y 20% del total,
respectivamente (figura No. 13. T1 y T2). Este leve amarillamiento, que solo se presentó
en algunas de las hojas, no fue generalizado ni considerado grave, ya que aquellas
plantas que lo presentaban, se recuperaron posteriormente del mismo y fue asociado a la
adaptación a alguna condición ambiental del ensayo en el momento de la evaluación (4
semanas posinoculación). Es importante resaltar que la evaluación de las respuestas
bioquímicas se realizó a tiempos tempranos (máximo a 4 dias posinoculación), periodo
en el cual, tallos, raíces y hojas, presentaron una apariencia sana y vigorosa para ambos
genotipos estudiados. En dichos tiempos se espera se presenten los evetnos tempranos
asociados con la resistencia a la enfermedad (Beckman 2000; Zhou & F. Wu 2009;
Mandal et al. 2008; Van Pelt-Heerschap & Smit-Bakker 1999; Morkunas et al. 2011).
112
13Figura No. 13. Incidencia del marchitamiento vascular causado por Fod durante el ensayo in vivo con las variedades T1) variedad resistente control, T2) variedad resistente inoculada, T3) susceptible control, T4) Susceptible inoculada.
Finalmente, a las 8 semanas posinoculación, la presencia de los síntomas se evidenció
solamente en la variedad susceptible inoculada en la que el 100% de los individuos
evaluados (15 en total) presentaron un amarillamiento completo hasta el tercio superior,
con evidente pardeamiento del haz vascular del tallo y aspecto leñoso y hueco del
mismo, que les ocasionó la muerte. Esto se pudo observar mediante cortes transversales
realizados en algunas plantas seleccionadas comparadas con los respectivos controles
(tabla No. 9). Vale la pena anotar, que en este tiempo posinoculación, las plantas
controles de las dos variedades y las de la variedad resistente inoculada, no presentaron
la sintomatología típica del marchitamiento vascular. El corte transversal de la variedad
resistente inoculada, permitió evidenciar a su vez, la presencia de un anillo café en los
tejidos vasculares, típico de la activación de los mecanismos asociados con lignificación y
oxidación de compuestos fenólicos (tabla No. 9).
Bajo esta evidencia experimental, se confirmaron a nivel fisiológico, las diferencias en los
niveles de resistencia para las variedades objeto de estudio y se generó la confianza
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
T1 T2 T3 T4
INC
IDEN
CIA
DE
AM
AR
ILLA
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p
lan
tas
con
re
spe
cto
al t
ota
l)
TRATAMIENTO
113
necesaria para asociarlas con los resultados de los parámetros bioquímicos y
moleculares que se evaluaron.
Tabla No. 9. Cortes transversales de tallos para las variedades de clavel estudiadas, controles e inoculados a las 8 semanas posinoculación con Fod
Control Inoculado
Variedad
Susceptible
Tasman
Variedad
Resistente
L.P Candy
3.3.2. Evaluación de niveles de fenoles, flavonoides y actividad antioxidante durante la interacción con el patógeno
a. Evaluación de fenoles y flavonoides totales en raíces de clavel
En primer lugar se evaluó la acumulación de fenoles totales, variable que permite un
acercamiento preliminar al comportamiento general de este tipo de metabolitos y que
puede estar asociada a los niveles de flavonoides, considerando la naturaleza
polifenólica de estos últimos. Al respecto, se encontró que en raíces de la variedad
resistente, se generó un aumento temprano de los niveles de fenoles totales a las 6 y 12
hpi (Fig. 14 A). Este aumento, que resultó ser significativo de acuerdo al análisis
estadístico realizado (α=0,05), no se presentó ni en el control correspondiente, ni en la
variedad susceptible inoculada a estos tiempos. Además de esta acumulación temprana
de compuestos fenólicos, también se presentó un aumento significativo a las 96 hpi en
este mismo tratamiento (figura No. 14 A), indicando que la respuesta de defensa de la
planta a nivel de este órgano se presenta en dos fases, una temprana (6-12 hpi) y otra
tardia (96 hpi) así como ha sido reportado anteriormente en otros modelos (Matern &
Kneusel 1988; Panka et al. 2013).
114
14Figura No. 14. Efecto de la inoculación del patógeno Fod en los niveles de compuestos fénolicos totales (A) y flavonoides totales (B) presentes en raíces de clavel. Las barras verticales presentan la desviación estándar de cada promedio (n = 3). Los valores con diferente letra, presentan diferencias significativas (P < 0.05).
Considerando que este comportamiento particular ha sido también reportado para otras
respuestas asociadas a defensa en plantas, como es el caso de la acumulación de
peróxido de hidrógeno (Mittler et al. 2004; Tománková et al. 2006), es probable que este
tipo de respuestas estén relacionadas entre ellas, de acuerdo a la naturaleza
multicomponente y coordinada de la defensa vegetal (Nikraftar et al. 2013). Para el caso
particular del clavel, la relación de la acumulación de estos compuestos y la inducción de
peróxido de hidrógeno, se discutirá en el siguiente capitulo.
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Variedad resistente control Variedad resistente inoculada Variedad susceptible control Variedad susceptible inoculada
Tiempo posinoculación
115
Este comportamiento en dos fases, se presentó tambien para el caso de los niveles de
flavonoides en este órgano de la planta durante la infección con el patógeno (figura No.
14 B). En este caso, los niveles de estos metabolitos aumentaron de manera significativa
a los mismos tiempos posinoculación en la variedad resistente inoculada (6,12 y 96 hpi),
indicando que hacen parte de la respuesta activa de la planta a nivel de la raíz y que
están relacionadas con los valores encontrados para fenoles totales.
Estos resultados concuerdan con el ya reportado aumento que se presenta en los niveles
de ciertos compuestos fenólicos evaluados por HPLC en este órgano de la planta por
efecto de la inoculación con el patógeno (Higuera 2001). Sin embargo, se presentan
algunas diferencias considerando que en dicho estudio, el aumento de los mismos se
presenta a partir de las 96 hpi y no se registró el mismo aumento temprano a las 6-12 hpi
encontrado en la presente investigación. Esta discrepancia se puede deber a las
diferencias propias en las técnicas usadas; es probable que en el proceso de extracción
puesto a punto en el estudio actual (Numeral 2.2.1), el metanol al 80% (v/v), permita la
extracción de componentes fenólicos más polares, que no son extraídos con acetona,
solvente de extracción usado por Higuera 2001. De esta manera, es probable que los
compuestos que se inducen en estas primeras etapas (6-12h), sean aquellos fenólicos de
mayor polaridad, entre los que se pueden incluir algunos glicosilados, o ácidos
hidroxicinámicos como el ácido férulico, el ácido caféico o el ácido p-coumárico. Sobre
estos últimos compuestos existen diferentes reportes que los vinculan a la primera línea
de defensa química en las plantas, ya que se acumulan a tiempos tempranos de la
interacción y pueden participar como precursores de diferentes fenómenos asociados al
fortalecimiento de paredes celulares durante el evento de la interacción con el patógeno
(Matern & Kneusel 1988; Mandal & Mitra 2007; Bellés et al. 2008; Santiago & Armas
2009; Vogt 2010). Esto tiene un evidente papel en defensa considerando que la
esterificación de estos compuestos sobre componentes de la pared celular, disminuye la
degradación de ésta (Jones, Chattopadhyay, Shukla, Zón, & Saxena, 2012) y evitan la
efectividad en la acción de enzimas del patógeno.
Así mismo, el aumento en los niveles de compuestos fenólicos a las 96 hpi puede estar
asociado a diferentes procesos que han sido ampliamente discutidos en estudios previos
(Higuera 2001). La infusión de dichos compuestos a polisacáridos para la generación de
gomas que tienen como objetivo localizar al patógeno en los tejidos vasculares a nivel de
raíz. Es probable que estos se liberen de los compartimentos especializados y por acción
116
de diferentes enzimas, se oxiden y polimericen a los diferentes elementos de la pared
celular o de las gomas, que en este órgano del clavel, se ha demostrado juegan un papel
en los mecanismos de defensa de la planta (Higuera & Ebrahim-Nesbat 1999).
Otro de los procesos que involucra estos compuestos ens las raíces de la planta, es la
acumulación de metabolitos con actividad antifúngica (Higuera 2001). Si bien es cierto
que, de acuerdo al estudio comparativo usando HPLC, no existe evidencia de la
acumulación de nuevos metabolitos por efecto de la inoculación en la variedad resistente
(Higuera & Montes de Gómez 1996), algunos compuestos que se encontraban a nivel
constitutivo, presentaron un comportamiento inducible asociado probablemente a su
capacidad antifúngica hacia este patógeno; este es el caso particular de una cumarina
con propiedades biológicas y un derivado de la acridina (Higuera 2001). El aumento en
los niveles del compuesto fenólico de naturaleza flavonoide Kaemferido 3-O-[2G--D-
glucopiranosil]--rutinosido, el cual presentó además actividad antifúngica sobre este
patógeno, tambien ha sido reportado en este órgano de la planta (Curir et al. 2001; Curir
et al. 2005).
En el caso particular de modelos planta-patógeno que involucran patógenos del género
Fusarium, se ha encontrado que dentro de la activación de la respuesta de defensa de
las plantas, se presenta un aumento en los niveles de compuestos de tipo flavonoide
(Lorenc-Kukuła et al. 2007; Morkunas et al. 2011; R. S. Sekhon et al. 2006; Arfaoui et al.
2007; A. Dihazi et al. 2011). A pesar de dichas evidencias, considerando la muy conocida
especificidad de la activación de las respuestas defensivas vegetales, la cual a su vez es
dependiente del patógeno y de la planta involucrada en cada interacción (Berrocal-Lobo
& Molina 2008), no se pueden generalizar este tipo de respuestas para todas las
especies vegetales que son hospederos de estos patógenos y hace necesario que cada
modelo sea estudiado de manera independiente si se quiere profundizar en la
comprensión de enfermedades específicas. Este es el caso del clavel, ya que si bien es
cierto que se había caracterizado la acumulación de compuestos fenólicos en raíces
(Higuera, 2001) y se había encontrado una relación con los mecanismos de defensa
pasiva de la planta (Ardila, Martínez, et al. 2013), era necesario realizar estudios que
permitieran confirmar que la inducción de dichos metabolitos estaba asociada con los
mecanismos de defensa activa de la planta. Ese fue el objetivo de esta parte de la
investigación y permitió determinar que efectivamente en raíces, órgano de la planta en
donde se establece el primer punto de contacto con el patógeno, los niveles de
117
flavonoides totales tienen un comportamiento inducible asociado a resistencia similar al
encontrado para fenoles totales (figura No. 14 B).
Es interesante analizar que dicha acumulación coincide con estudios previos en los que
se ha encontrado aumento en los niveles del flavonoide kaemferido 3-O-[2G--D-
glucopiranosil] -rutinosido en raíces de clavel inoculadas con el patógeno (Curir et al.
2005). Sin embargo, en dicho reporte la acumulación de este metabolito es lineal con el
tiempo y no se presenta el comportamiento bifásico descrito en la presente investigación
(6-12 y 96 hpi) (figura No. 14 B). Esto se puede deber a que en la investigación presente,
se evaluaron los niveles totales de compuestos flavonoide presentes en cada órgano de
la planta (tallos y raíces) y no de compuestos particulares como en el estudio de Curir et
al. 2005. Es probable que los resultados reportados de flavonoides totales, no se afecten
de manera significativa por los cambios en un solo metabolito.
Es bien sabido que los compuestos flavonoides a nivel de la raíz, están asociados a
diferentes procesos desarrollado en la rizosfera como captación de nutrientes (Tomasi et
al. 2008), crecimiento (Taylor & Grotewold 2005) e interacción con microrganismos del
suelo (L. J. Shaw et al. 2006; Weston & Mathesius 2013) De acuerdo a la evidencia
encontrada en el presente estudio, en el clavel dichos metabolitos están asociados a los
mecanismos de defensa pasiva de la planta (Capítulo No. 2) y a mecanismos de defensa
activa que se inducen en este primer punto de contacto con el patógeno Fod.
El papel de estos metabolitos en raíces de clavel debe estar asociado a los fenómenos
previamente descritos en este órgano, como son la generación de estructuras para
confinar el patógeno (Higuera & Ebrahim-Nesbat 1999). Se ha encontrado que en
algodón (Gossypium hirsutum L.) algunos flavonoides se fusionan a la pared celular
durante su interacción con la bacteria Xanthomonas campestris p.v. malvacearum (G. H.
Dai et al. 1996). Asi mismo, pueden estar asociados a actividad antifúngica, tal y como
se ha sugerido por autores como (Curir et al. 2001) y (Curir et al. 2005). Sin embargo,
considerando reportes en otras especies, en los cuales se ha propuesto que el papel de
estos metabolitos en defensa puede estar tambien asociada a su actividad antioxidante,
es probable que este comportamiento pueda presentarse tambien en el clavel. Con el fin
de estudiar esta posibilidad, se determinaron los niveles de actividad antioxidante en
raíces de la planta durante la infección con el patógeno.
118
b. Evaluación de los niveles de actividad antioxidante en raíces de clavel
De acuerdo a los resultados del presente estudio (figura No. 15), se determinó que la
inoculación con Fod genera un aumento significativo en los niveles de actividad
antioxidante evaluada hacia los radicales ABTS+. y DPPH., en raíces de la variedad L.P.
Candy (Resistente) a las 6,12 y 96 hpi.
Estos resultados muestran que un aumento en los niveles de especies antioxidantes en
raíces de la planta hace parte de los mecanismos asociados con resistencia al
marchitamiento vascular causado por Fod. Este comportamiento está de acuerdo con lo
encontrado previamente en otros modelos que involucran a patógenos del género
Fusarium (Lorenc-Kukuła et al. 2007; Hussain et al. 2008; Sá et al. 2009).
Es evidente, de acuerdo a estos resultados, la relación de los niveles de flavonoides y
actividad antioxidante, considerando que estas variables presentan sus máximos valores
a los mismos tiempos posinoculación (figuras No. 14 y 15). Es importante no olvidar, que
dichas variables mostraron correlación positiva a nivel estadístico en el estudio a nivel
constitutivo (capítulo 2) y es probable que a estos tiempos tempranos dicha relación se
mantenga. Bajo esta consideración, es muy factible que la actividad antioxidante
inducible que se presentó por la infección por el patógeno, esté asociada a los cambios
que se presentan en los niveles de estos compuestos, asi como se ha propuesto para
otros modelos (Morkunas & Bednarski 2008; Lorenc-Kukuła et al. 2007; Boba et al.
2011).
Estos resultados indican que no se puede descartar que la planta use los compuestos de
tipo flavonoide para regular la respuesta de defensa vegetal, en términos de la
inactivación de especies altamente reactivas que pueden favorecer la colonización por
parte del patógeno y regular finalmente la respuesta de defensa vegetal. Se ha
reportado, que a tiempos posteriores al reconocimiento inicial (por ejemplo 96 hpi), estas
especies altamente oxidantes no se requieren en la misma proporción y deben ser
eliminadas para evitar la muerte celular que puede favorecer la propagación de
patógenos que presentan fases necrotróficas de crecimiento como ciertos patógenos del
género Fusarium (Lorenc-Kukuła et al. 2007; Hussain et al. 2008; Sá et al. 2009). Así
mismo, considerando el papel que tienen en la defensa a patógenos vasculares las
células parenquimáticas ubicadas en el tejido vascular de la planta, la muerte celular de
119
las mismas se constituiría además, en un punto a favor para el patógeno dentro del
complejo intercambio de señales que determina la expresión de resistencia o
susceptiblidad de la planta.
15Figura No. 15. Efecto de la inoculación del patógeno Fod en los niveles de actividad antioxidante presente en raíces de clavel. A: capacidad inactivación ABTS y B: capacidad inactivación DPPH. Las barras verticales presentan la desviación estándar de cada promedio (n = 3). Los valores con diferente letra, presentan diferencias significativas (P < 0.05).
Si se detallan los resultados encontrados a nivel de raíz para el caso de la variedad
susceptible, se puede evidenciar que a 96 hpi se alcanza a presentar un aumento
significativo en los niveles de actividad antioxidante con respecto al control no inoculado
(figura No. 15 A y B). Este resultado indica que es probable que la acumulación de estos
metabolitos se presente a tiempos más tardíos en esta variedad y que por tanto, la
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correcta activación y regulación espacio temporal de su biosíntesis sean necesarias para
que finalmente se presente la expresión de resistencia. La activación de estos
mecanismos de manera más tardia en la variedad susceptible, no le permitiría afrontar la
infección desde las primeras etapas de la interacción y seria una evidente ventaja para el
patógeno en su objetivo de colonizar la planta. Sin embargo, es necesario realizar
estudios adicionales que permitan evaluar a tiempos más tardíos la acumulación de estos
compuestos en la variedad susceptible.
Considerando que la acumulación de compuestos fenólicos es una respuesta común en
tejidos vegetales durante diferentes tipos de estrés biótico como la interacción con virus
(Rasoul et al. 2012), bacterias (Hassan & Abo-elyousr 2013) y hongos (Tománková et al.
2006; Mikulič Petkovšek et al. 2009; Jabeen et al. 2009; Dinis et al. 2011; Panka et al.
2013; Nikraftar et al. 2013), se ha propuesto que este aumento puede hacer parte de la
respuesta basal de las plantas y estar determinado por el reconocimiento de diferentes
tipos de motivos asociados a microorganismos (MAMPs Microbial Associated Molecular
Patterns). En algunos modelos planta patógeno, en los que la resistencia es poligénica y
puede estar basada en estos mecanismos, se ha determinado que diferencias propias en
la regulación espacio temporal de esta respuesta en la planta, pueden hacer la diferencia
entre la expresión de resistencia o susceptibilidad (Dinis et al. 2011; Nikraftar et al. 2013).
Bajo dichas consideraciones, los resultados del presente estudio estarían de acuerdo con
la resistencia multigénica que se ha establecido para la raza 2 de Fod (Baayen et al.
1991).
c. Evaluación de fenoles y flavonoides totales en tallos de clavel
La evaluación de los niveles de fenoles y flavonoides en el tallo permitió determinar que
estos aumentan en la variedad resistente inoculada con respecto al control, a las 6 y 96
hpi para fenoles y a las 6, 12 y 96 hpi para flavonoides, mientras que para la variedad
suceptible no se presentan cambios (figura No. 16). Esto comprobó que la respuesta de
defensa vegetal asociada a la biosíntesis de metabolitos secundarios está
compartimentalizada en el clavel, siendo dependiente del órgano evaluado, tal y como
había sido previamente descrito (Higuera 2001). Este comportamiento se pudo evidenciar
teniendo en cuenta que la acumulación temprana de compuestos fenólicos en tallos de la
121
variedad resistente, no estuvo acompañada con un aumento en los niveles de
flavonoides, tal y como se presentó en la raíz.
16Figura No. 16. Efecto de la inoculación del patógeno Fod en los niveles de compuestos fénolicos totales (A), flavonoides totales (B), presentes en tallos de clavel. Las barras verticales presentan la desviación estándard de cada promedio (n = 3). Los valores con diferente letra, presentan diferencias significativas (P < 0.05).
Es probable que el aumento en compuestos fenólicos en este tiempo, esté asociado a un
proceso de fortalecimiento de las paredes de la planta durante la infección en estas
primeras etapas (Matern & Kneusel 1988; Bellés et al. 2008; Mandal & Mitra 2007;
Santiago & Armas 2009). Se ha reportado, por ejemplo, que la infusión de metabolitos
derivados de los ácidos cinámico y benzoico a la pared celular se presenta como
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respuesta a la presencia del patógeno en tallos de clavel infectados por Fod (Niemann et
al. 1991), lo cual está asociado con la generación de barreras físicas y gomas que se
inducen para localizar el patógeno y evitar su propagación en los tejidos de la planta
(Baaye et al. 1988; Niemann & Baayen 1988).
Por otra parte, se ha propuesto que la biosíntesis de fitoalexinas en este órgano, debe
contar con niveles suficientes de compuestos fenólicos derivados del ácido cinámico o
del ácido benzoico. Es por ello que a 12 y 96 hpi, (Fig 16A) el aumento de fenólicos
totales tambien puede estar asociado al suministro de dichos precursores, los cuales se
requieren para la biosíntesis de diantalexinas y diantramidas, compuestos nitrogenados
que han sido encontrados a nivel del tallo y han sido clasificado como fitoalexinas
(Niemann 1992; Baayen et al. 1991; Niemann et al. 1992). De esta manera, un suministro
de estos últimos compuestos a partir de fenoles provenientes de la rutas fenilpropanoide
o del ácido shikimico (Wildermuth 2006), es necesario para la respuesta de defensa
exitosa de la planta a este nivel.
Es probable que asi como se encontró en raíz, la respuesta en términos de compuestos
de tipo flavonoide, esté asociada a un aumento en los niveles de actividad antioxidante.
Con el fin de corroborar esta posibilidad, se evaluaron los niveles de actividad
antioxidante en este órgano de la planta en los diferentes tratamientos propuestos.
d Evaluación de actividad antioxidante a nivel de tallos de clavel
La evaluación de los niveles de actividad antioxidante durante la infección con el
patógeno a nivel del tallo, permitió encontrar un aumento en los niveles de especies
antioxidantes a las 6, 12 y 96 hpi en la variedad resistente inoculada (figura No. 17).
Estos resultados indican que tal y como había sido encontrado en raíz, un aumento en
dichas especies hace parte de los mecanismos de defensa asociados con resistencia a la
enfermedad.
123
17Figura No. 17. Efecto de la inoculación del patógeno Fod en los niveles de capacidad inactivación ABTS (A) y capacidad inactivación DPPH (B), presentes en tallos de clavel. Las barras verticales presentan la desviación estándard de cada promedio (n = 3). Los valores con diferente letra, presentan diferencias significativas (P < 0.05).
Es interesante observar que a las 96 hpi, la acumulación de compuestos fenólicos está
asociada a un aumento en compuestos de tipo flavonoide y de la actividad antioxidante.
Este resultado corrobora las características inducibles que tienen los flavonoides en este
órgano de la planta y que están asociados muy probablemente a la capacidad antifúngica
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Variedad resistente control Variedad resistente inoculada Variedad susceptible control Variedad susceptible inoculada
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que presentan estos metabolitos (Curir et al. 2005) Asi mismo, ésta puede estar
complementada con la capacidad antioxidante, la cual aumenta de manera conjunta, con
los niveles de flavonoides en la planta de acuerdo a este estudio (figuras No. 16 y 17).
En general, en esta fase de la investigación se determinó que en la variedad resistente,
se presentan cambios significativos en los niveles de flavonoides durante la interacción
con el patógeno. Considerando que esta respuesta se presentó tanto en tallos como en
raíces del clavel, es probable que dentro de los componentes que determinan la
resistencia poligénica a la raza 2 de Fod, se encuentre una biosíntesis de flavonoides
más activa. Esta puede a su vez hacer parte de los mecanismos de defensa basal de la
planta, considerando que en este hospedero, fenómenos que involucran el metabolismo
de los fenoles, se pueden presentar de manera no especifica para otros patógenos
vasculares (Niemann 1992) y que la correcta regulación espacio temporal de los niveles
de estos versátiles metabolitos, es la que finalmente determina la expresión de
resistencia (figuras No. 14 y 16).
No hay que olvidar que otros fenómenos como la correcta localización de los flavonoides
en la planta durante la infección, pueden ser otros factores que pueden afectar en alguna
medida la acción de estos metabolitos y por tanto la resistencia a la enfermedad
(Hammerschmidt 2011; Agati et al. 2012). La exudación de estos metabolitos desde la
planta hacia la rizosfera es un punto que puede ser determinante para que dichos
metabolitos puedan ser efectivos contra patógenos (Weston & Mathesius 2013). Este es
el caso por ejemplo, de Medicago truncatula en donde el silenciamiento de un
transportador ABC asociado al transporte de flavonoides en tejidos vasculares, aumenta
la incidencia por parte del patógeno Fusarium oxysporum (Banasiak et al. 2013).
Estudios futuros que permitan evaluar la ubicación de estos metabolitos en la planta a
nivel histológico y celular, son de interés dentro de la elucidación de su papel en el
modelo objeto de estudio.
Es probable que los componentes genéticos asociados a la biosíntesis de estos
metabolitos sean de interés en la identificación de QTLs (Quantitative trait loci) para ser
usados como marcadores moleculares de selección para resistencia en este modelo, asi
como ha sido reportado en el modelo trigo-Fusarium graminareum (Gunnaiah et al.
2012). Sin embargo, si bien es cierto que esta aproximación genómica puede ser una
alternativa para el desarrollo de marcadores de selección, otra aproximación puede ser la
125
aplicación de técnicas de separación e identificación de metabolitos, para el desarrollo de
marcadores metabolómicos. Es por ello que el primer acercamiento que se debe hacer al
respecto es identificar de manera preliminar, cuales son aquellos compuestos que
pueden participar en la resistencia de la planta y ser potencialmente usados para iniciar
estudios para el desarrollo de dichos marcadores. Para ello, mediante el uso de técnicas
cromatográficas se abordó el estudio de los metabolitos particulares que al aumentar en
las variedades resistentes, pueden ser de interés en la interacción.
3.3.3. Comparación de perfiles obtenidos por HPLC y análisis cuantitativo de compuestos tipo flavonoide en raíces de clavel, durante la infección con Fod
En la siguiente etapa se analizaron los perfiles cromatográficos de metabolitos de tipo
flavonoide acumulados durante la infección con el patógeno, esto sin olvidar que de
acuerdo a la compartimentalización de las respuestas de defensa en este modelo
(Higuera 2001), era muy probable que se presentaran diferencias cualitativas y
cuantitativas importantes para dichos metabolitos en función del órgano de la planta
estudiado. Para ello, se compararon los perfiles de separación por HPLC de extractos
obtenidos en aquellos tiempos en los que, de acuerdo con los resultados descritos en el
númeral anterior 3.3.2., se presentaron los mayores cambios en el contenido de
flavonoides y actividad antioxidante por efecto de la inoculación con el patógeno (raices 6
y 96 hpi y tallos 96 hpi).
Estos análisis se realizaron usando detección a 350 nm, en donde se presenta la banda I
característica del espectro de absorción UV de estos compuestos, ocasionada por la
presencia del anillo B de su estructura (figura No. 2). Si bien es cierto que esta longitud
de onda es ampliamente usada para el análisis de flavonoides en diferentes fuentes
vegetales (Galeotti, Barile, Lanzotti, et al. 2008; Tattini et al. 2010; Mikulič Petkovšek et
al. 2009; Azevedo et al. 2010), no se debe olvidar que bajo estas mismas condiciones
otros metabolitos de diferentes naturaleza química con diferentes grupos cromóforos,
pueden absorber y actuar como interferentes. Sin embargo, a esta longitud de onda se
pueden obtener espectros más limpios que los obtenidos a 280 nm, tal y como se
presenta en la figura No. 18 para extractos obtenidos a partir de raíces de las dos
variedades objeto de estudio.
126
18Figura No. 18. Perfiles cromatográficos para extractos obtenidos a partir de raíces de clavel de las variedades LPcandy (Resistente) y Tasman (Susceptible). Comparativo a 280 nm y 350 nm variedad LP Candy (A) y Tasman (B). Perfiles con detección a 350 nm ampliados para las variedades LP Candy (C) y Tasman (D). Se muestran los compuestos o grupo de compuestos separados que son considerados en el análisis.
Estas consideraciones son tenidas en cuenta por (Galeotti, Barile, Lanzotti, et al. 2008),
quienes realizan un análisis comparativo con diferentes variedades de clavel, en términos
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Detector A Ch2:350nm
5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 45.0 50.0 55.0 60.0 65.0 min
0
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100
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150
175mAU
Detector A Ch2:350nm Detector A Ch1:280nm
5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 45.0 50.0 55.0 60.0 65.0 min
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75
100
125
150
175mAU
Detector A Ch2:350nm Detector A Ch1:280nm
10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 45.0 50.0 55.0 60.0 65.0 min
0
10
20
30
40
50mAU
Detector A Ch2:350nm
F9 F10 F1
F2 F3
F4 F5 F6 F7 F8
F9
F10 F1
F2
F3
F4
F5 F6 F7 F8
A
B
C
D
127
de la composición de flavonoides en diferentes órganos de la planta y determinan que
diferencias cuantitativas en los niveles de dichos metabolitos, pueden ser usadas para la
clasificación de variedades. Teniendo en cuenta estos antecedentes, en el presente
trabajo, y con el fin de mantener un lenguaje homogéneo a lo largo del escrito, los
diferentes compuestos que sean detectados bajo estas condiciones, serán denominados
“compuestos de probable naturaleza flavonoide”.
De acuerdo a la comparación realizada a nivel constitutivo entre raíces de las dos
variedades, se encontraron diferencias principalmente cuantitativas en los compuestos
detectados. Es importante destacar que la complejidad en términos de la composición del
extracto, sumada con los bajos niveles en que se encontraban los compuestos de interés
con respecto a otros componentes, hizo necesario considerar volúmenes de inyección de
100 µL y tener en cuenta sólo aquellos compuestos que se encontraban sobre el limite
de cuantificación previamente evaluado (9800 unidades arbitrarias de área que
corresponden a 10 veces el ruido del equipo).
Bajo estas consideraciones se encontraron 10 compuestos o grupos de “compuestos de
probable naturaleza flavonoide”, comunes en ambas variedades (figura No. 18) y se
determinó que a nivel constitutivo, estos compuestos se encuentran en mayor cantidad
en la variedad resistente con respecto a la susceptible, de acuerdo a la comparación
estadística realizada de la suma del área, para todos los 10 compuestos separados (tabla
No. 10)
Tabla No. 10. Comparación del contenido total (1) inicial de compuestos con absorción a 350 nm, presentes en extractos obtenidos a partir de raíces de clavel de variedades resistente y susceptible
Variedad L.P Candy (Resistente) Tasman (Susceptible)
Area (unidades
arbitrarias)(1)
1512577 b
1170138 a
(1) Expresado como la sumatoria de área de todos los picos del cromatrograma obtenido por HPLC según
condiciones establecidas en númeral 3.2.5
(2) Los valores seguidos con letras diferentes presentan diferencias significativas (α=0,05)
128
Estos resultados están de acuerdo con lo encontrado previamente (Capitulo 2) y con lo
ya reportado para compuestos fenólicos totales por Higuera 2001, en cuanto a que las
variedades resistentes tienen constitutivamente, mayores niveles de compuestos
fenólicos a nivel de la raíz. Estas diferencias entre variedades también están de acuerdo
con los resultados obtenidos previamente con el método espectrofotométrico (Figura No.
15) y constituyen una evidencia experimental más sobre el probable papel de los
flavonoides en la defensa pasiva de las raíces del clavel. Considerando su naturaleza
constitutiva, es importante no olvidar que además de su acción como fitoanticipinas y/o
como bloques para el fortalecimiento de barreras físicas, estos metabolitos pueden
cumplir diversos papeles a nivel fisiológico en la planta, generando muy probablemente,
ventajas adaptativas para la planta resistente en otros procesos importantes como la
captación de nutrientes o la interacción con microorganismos benéficos para la rizosfera
(Weston & Mathesius 2013).
La comparación entre los niveles de estos compuestos acumulados por efecto de la
inoculación con Fusarium oxysporum f. sp. dianthi raza 2 (figura No. 19) permitió
determinar que en este órgano de la planta, en los tiempos evaluados, solamente se
presentaron cambios a nivel cuantitativo en los niveles de los “compuestos
probablemente flavonoides” separados y que no se encontraron, al nivel de detección
trabajado, cambios cualitativos asociados a la aparición o desaparición de señales.
(Figura No. 19)
129
19Figura No. 19. Perfiles cromatográficos por HPLC para extractos obtenidos a partir de raíces de clavel de la variedad LPcandy a diferentes tiempos posinoculación con Fod. A) Control a 6h, B) Inoculado a 6h, C) Control a 96h D) Inoculado a 96h.
Con el fin de tener una aproximación inicial del efecto de la inoculación con el patógeno
sobre los niveles de estos compuestos, se comparó la suma de las áreas totales de los
10 compuestos (o grupos) para cada tratamiento en los diferentes tiempos
posinoculación. Se determinó que existen diferencias significativas entre los valores
promedio encontrados para los diferentes tratamientos en el ensayo in vivo (tabla No. 11)
10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 45.0 50.0 55.0 60.0 65.0 min
0
10
20
30
40
50mAU
Detector A Ch2:350nm
15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 45.0 50.0 55.0 60.0 65.0 min
0
10
20
30
40
50mAU
Detector A Ch2:350nm
15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 45.0 50.0 55.0 60.0 65.0 min
0
10
20
30
40
50
mAUDetector A Ch2:350nm
10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 45.0 50.0 55.0 60.0 65.0 min
10
20
30
40
50
mAUDetector A Ch2:350nm
A
B
C
D
130
Tabla No. 11. Variación del contenido total de “compuestos probablemente flavonoides” (HPLC con detección a 350nm), en raíces de clavel a diferentes tiempos posinoculación con el patógeno Fod raza 2.
Resistente
control
Resistente
inoculada
Susceptible
control
Susceptible
inoculada
0 horas 1512577 b 1512577 b 1170138 a 1170138 a
6 horas 1682700 a 1975762 b 2095652 b 2349296 b
96 horas 2817350 a 4065055 b 3074887 ab 2882967 ab
(1) Expresado como la sumatoria de área de todos los picos del cromatrograma
(2) Los tratamientos seguidos con letras diferentes presentan diferencias significativas (α=0,05)
Al comparar los resultados obtenidos entre tratamientos, en cada uno de los tiempos
posinoculación, se encuentra que la inoculación con el patógeno tuvo efecto en los
niveles de estos compuestos únicamente en la variedad resistente al nivel de
significancia trabajado (α=0,05). Si bien es cierto que para la variedad susceptible se
presentó un aumento en los valores promedio para los dos tiempos evaluados (0 y 96
hpi), dichos valores no son diferentes estadísticamente al comparar con el respectivo
control no inoculado. Estos resultados, están de acuerdo con los obtenidos previamente
usando la técnica espectrofotométrica de formación de complejos con el AlCl3 (aq), la cual
se basa en la conocida reacción entre los flavonoides y el Al+3 (Harborne et al. 1975) y
que ha sido usada de manera frecuente en reportes recientes con el fin de determinar los
contenidos de flavonoides totales en diferentes muestras vegetales (J.-T. Lin et al. 2010).
Esto demuestra que mediante las dos técnicas usadas, los niveles constitutivos de
compuestos flavonoides en raíces, son mayores en las variedades resistentes que las
susceptibles. Así mismo, se evidencia el efecto que tiene la inoculación con el patógeno
sobre los niveles de flavonoides en raíces de la variedad resistente.
Estos resultados evidencian el efecto que tienen las condiciones externas y/o los
cambios propios basales en el metabolismo de la planta, sobre los niveles de estos
metabolitos, ya que a los diferentes tiempos, tanto para controles como para inoculados,
se presenta un aumento en los contenidos totales de los mismos. Es probable que las
condiciones ambientales afecten los niveles de estos metabolitos a nivel de raíz, tal y
como se ha sido recientemente revisado (Weston & Mathesius 2013). En Ligustrum
vulgare por ejemplo, se ha encontrado que diferencias en radiación y salinidad del suelo,
131
pueden afectar los niveles de flavonoides a nivel de la raíz (Tattini et al. 2010). Los
resultados encontrados en la presente investigación, confirman la necesidad de tener un
control no inoculado en cada tiempo posinoculación, con el fin de descontar el efecto que
pueden tener factores externos asociados al ambiente o factores propios de la planta,
asociados a cambios fisiológicos que se pueden presentar durante los tiempos en los que
se realizan los muestreos.
Con el fin de conocer cuál era el comportamiento durante la infección con el patógeno de
los compuestos o grupo de compuestos de manera independiente, se compararon las
áreas promedio de tres réplicas biológicas en cada uno de los casos. Los resultados
correspondientes se presentan en la tabla No. 12.
Tabla No. 12. Variación del contenido de “compuestos probablemente flavonoides” especificos (HPLC con detección a 350nm) de acuerdo a las Figuras No. 18 y 19, en raíces de clavel a diferentes tiempos posinoculación con el patógeno Fod raza 2.
0 HORAS 6 HORAS 96 HORAS
T1 T3 T1 T2 T3 T4 T1 T2 T3 T4
F1 197232 b 84958 a 141030 a 237712b 87134ª 117636a 191383a 188721ª 205425ª 197411 a
F2 297145 b 185286 a 339713 b 491773 c 110144 a 173030 a 393991 b 583361 c 212496 a 198270 a
F3 189136 b 85854 a 178592 b 262637 c 97601 a 115323 a 221659 b 240410 b 87285 a 85796 a
F4 146107 b 221887 a 222737 b 211173 c 696638b 713087 ab 147272a 158934ª 811378ª 753760a
F5 83905ª 142935b 51939a 81557ª 344404b 354208b 79802 a 64327 a 556724 b 473538 b
F6 48637 a 81991a 91262a 136351ª 102253ª 95012a 136414a 126239ª 80896ª 57626a
F7 61513ª 67604a 65358ab 61963ab 92561b 49816a 61070a 147719ª 99390ª 80276a
F8 31539ª 78609b 22120a 50203b 64769b 89723c 52647a 69450ª 67989ª 59150a
F9 211048b 95017a 267533a 225240ª 309973ª 276602a 646509a 991021b 532961ª 518279a
F10 246316b 125996a 259951a 326521ab 243434ª 364860b 886602b 1561540c 420342ª 458861a
(1) Los tratamientos seguidos con letras diferentes presentan diferencias significativas (α=0,05)
(2) Los tratamientos se definen en el númeral 3.2.3. (T1 resistente control, T2 resistente inoculado, T3
susceptible control y T4 susceptible inoculado)
Grupo I
Grupo I
132
Se presenta un grupo de compuestos (Grupo I) que presentan niveles estadísticamente
mayores en raíces de la variedad resistente inoculada, cuando se comparan con
respecto al control no inoculado en el mismo tiempo (α=0,05). Estos resultados coinciden
con lo encontrado previamente en raíces de esta misma planta, donde la inoculación con
el patógeno generó un aumento significativo para los niveles en un grupo de compuestos
constitutivos de tipo fenólico en la variedad resistente LP Candy (Higuera, 2001) y
permite proponer, considerando que el aumento no se presentó en la variedad
susceptible, que los compuestos pertenecientes a dicho grupo (Grupo I) deben estar
asociados a los mecanismos de defensa que se activan ante la presencia del patógeno a
nivel de la raíz.
Con el fin de evaluar en conjunto los resultados obtenidos para los diferentes
compuestos, se usaron herramientas de análisis multivariado (PCA). Estas herramientas
se han venido usando frecuentemente en metabolómica, permitiendo estudiar el efecto
que tienen tratamientos específicos en los niveles de varios compuestos de manera
simultánea (Steffensen et al. 2011; Ballizany et al. 2012; Bernaert et al. 2012; H. Zhao et
al. 2008). Para este caso se pudo determinar que la variación completa de los datos está
asociada tanto a la variedad involucrada como al tiempo posinoculación (figura No. 20).
Se evidenció que el componente principal 1 (PC1), explica el 68 % de la variación en los
resultados y permite hacer agrupaciones en función del genotipo vegetal; los tratamientos
que incluyen a la variedad resistente, se encuentran hacia la derecha, mientras que los
de la susceptible, se agrupan hacia la izquierda. Este comportamiento indica que
diferencias cuantitativas propias en los perfiles de estos metabolitos entre variedades,
determinan la separación encontrada en dicho componente. Así mismo, se evidencia
que las condiciones externas determinan el 14 % de la variación y permite separar los
tratamientos correspondientes a las 96 hpi, de los demás tiempos. A este tiempo (4 dias
posinoculación) se deben presentar los mayores efectos posibles evaluados
considerando que fue el último tiempo de muestreo en este ensayo in vivo.
133
20Figura No. 20. Análisis de componentes principales para los resultados obtenidos durante la separación de compuestos de tipo flavonoide en raíces de clavel inoculados con el patógeno causal del marchitamiento vascular. A) Distribución de los diferentes tratamientos en los componentes de variación. B) Distribución de los compuestos “tipo flavonoide” en los componentes de variación (Loading graph) S=susceptible, R= Resistente a Fod, C= Control, I= Inoculado
Asi mismo, la gráfica de distribución de compuestos de “tipo flavonoide” (Figura No. 20B)
permite definir aquellos metabolitos que están determinando la separación encontrada.
Se puede ver que los compuestos F2, F3, F9 y F10, los cuales se encuentran en el grupo
I previamente definido, determinan de manera importante el agrupamiento realizado por
el análisis multivariado para los tratamientos de la variedad resistente. Estos compuestos
son además de particular interés, considerando que presentan una variación significativa
por efecto de la inoculación con el patógeno en la variedad resistente (figura No. 21 y
tabla No. 12).
Es de interés para este modelo planta-patógeno, la identidad de estos metabolitos
considerando que los mismos deben cumplir algún papel en la resistencia de la planta,
algunos de ellos pueden presentar propiedades como actividad antifúngica o actividad
antioxidante. Es por ello que en la siguiente etapa, se abordó una aproximación a la
identificación de al menos uno de estos metabolitos, para de esta manera conocer su
naturaleza química y finalmente aumentar la evidencia sobre la participación de estos
metabolitos en los mecanismos de defensa del clavel.
F9
Susceptible A B
F10
F5
F4
F3
F2
Grupo I
Resistente
SC96h RC96h
RI96h
RC6h
RC0h
RI96h
SI96h
SC6h
SC0h
SI6h
134
21Figura No. 21. Variación en el contenido de los componentes F2 (A), F3 (B), F9 (C) y F10 (D) durente la infección con el patógeno en las variedades resistente y susceptible. El análisis estadístico correspondiente se encuentra en la tabla No. 12. Los tratamientos seguidos con letras diferentes presentan diferencias significativas (α=0,05).
Con respecto al análisis de compuestos de tipo flavonoide en tallo, se realizó el mismo
proceso pero evaluando los perfiles solamente a 96 hpi, tiempo en el que se presentaron,
de acuerdo a la fase anterior del estudio (figura No.16), las diferencias más importantes
en los niveles de flavonoides por efecto de la inoculación con el patógeno. De manera
inicial, se compararon los perfiles de metabolitos probablemente flavonoides a nivel
constitutivo y se encontraron diferencias tanto a nivel cualitativo como a nivel cuantitativo
entre las variedades LP Candy y Tasman (figura No. 22). Se determinó que de acuerdo a
este análisis existen al menos 8 compuestos de tipo flavonoide en este órgano de la
planta, los cuales presentaron una distribución diferente en función de la variedad. Al
comparar estos perfiles con los obtenidos en extractos de raíces de la planta (figura No.
18), se evidencia que, al menos al nivel de detección trabajado, no existen compuestos
comunes entre ambos órganos de la planta y que, considerando los tiempos de
retención, en el caso del tallo, se encuentran compuestos tipo flavonoide más polares.
Estos resultados son consistentes con los reportados por (Galeotti, Barile, Lanzotti, et al.
2008), quien encontró diferencias principalmente a nivel cualitativo entre los perfiles de
Variedad resistente control Variedad resistente inoculada Variedad susceptible control Variedad susceptible inoculada
0
100000
200000
300000
400000
500000
600000
700000
0 HORAS 6 HORAS 96 HORAS
AR
EA (
UN
IDA
DES
AR
BIT
RA
RIA
S)
TIEMPO POSINOCULACIÓN
F2
0
200000
400000
600000
800000
1000000
1200000
0 HORAS 6 HORAS 96 HORAS
AR
EA (
UN
IDA
DES
AR
BIT
RA
RIA
S)
TIEMPO POSINOCULACIÓN
F9
0
500000
1000000
1500000
2000000
0 HORAS 6 HORAS 96 HORASAR
EA (
UN
IDA
DES
AR
BIT
RA
RIA
S)
TIEMPO POSINOCULACIÓN
F10
0
50000
100000
150000
200000
250000
300000
350000
400000
0 HORAS 6 HORAS 96 HORAS
AR
EA (
UN
IDA
DES
A
RB
ITR
AR
IAS)
TIEMPO POSINOCULACIÓN
F3
A
C D
B
a
b
c
b b
a a
a
c
b
a
b
c
a
b
a
b
a a
b
a a
b
a
c
135
flavonoides para diferentes variedades de clavel y que los compuestos encontrados en
tallo son eluidos a tiempos de retención más tempranos en fase reversa. Es importante
no olvidar que para ambos órganos de la planta se usaron las mismas condiciones de
separación y que los análisis se realizaron por triplicado en cada uno de los tratamientos.
22Figura No. 22. Perfiles cromatográficos por HPLC con detección a 350 nm para extractos obtenidos a partir de tallos de clavel de las variedades A) LP Candy (Resistente) y B) Tasman (Susceptible). Se muestran los compuestos o grupo de compuestos separados que son considerados en el análisis.
Al comparar en función de la variedad, las sumatorias totales de áreas obtenidas para los
diferentes compuestos o grupo de compuestos “probablemente flavonoides” en este
órgano de la planta, se determinó que la variedad resistente presenta mayores niveles de
metabolitos de tipo flavonoide que los encontrados en la variedad susceptible. (tabla No.
13). Estos resultados están de acuerdo a lo encontrado en el numeral anterior 3.3.2, en
donde para estas mismas variedades, los niveles de flavonoides totales presentes en
tallo, son estadísticamente superiores en la variedad resistente (figura No. 16). Esto
indica que efectivamente existe una relación entre los resultados obtenidos por las dos
técnicas usadas en este estudio.
5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 45.0 50.0 55.0 60.0 min
0
50
100
150
mAUDetector A Ch2:350nm
5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 45.0 50.0 55.0 60.0 65.0 min
0
25
50
75
100
125
150
175mAU
Detector A Ch2:350nm
F1 F2
F3
F4
F7 F8
F1 F2
F3 F4 F5
F6
F7 F8
B
A
136
Tabla No. 13. Comparación del contenido total inicial de compuestos con absorción a 350 nm, presentes en extractos obtenidos a partir de tallos de clavel de variedades resistente y susceptible
Variedad L.P Candy (Resistente) Tasman (Susceptible)
Area (unidades arbitrarias) 6366257 b
4737583 a
(1) Expresado como la sumatoria de área de todos los picos del cromatrograma
(2) Los tratamientos seguidos con letras diferentes presentan diferencias significativas (α=0,05)
Sin embargo, si los resultados obtenidos mediante el método cromatográfico en tallos y
raíces para una misma variedad, se comparan con los obtenidos mediante la técnica
espectrofotométrica, dicha relación no se mantiene (tabla No. 14). Se esperaría, de
acuerdo a los resultados obtenidos en la primera fase de esta investigación (Capitulo 2),
que la sumatoria de las áreas para la raíz fuesen superiores a las encontradads para
tallo. Sin embargo, se presenta lo contrario y los valores encontrados en tallo son
superiores a los encontrados en raíz para las dos variedades analizadas. Al parecer, las
condiciones analíticas que se usan para la cuantificación por HPLC de los metabolitos
“probablemente flavonoides” en tallo, presenta interferentes como son la la presencia de
otro tipo de metabolitos que pueden absorber a la longitud de onda de análisis. Este
resultado puede explicarse dado que estos extractos no fueron sujetos a ningún proceso
de purificación previo al analisis como el uso de precolumnas para extracción en fase
sólida (Wrolstad et al. 2005).
Otra posibilidad es que, considerando las diferencias entre tallos y raíces en términos de
la composición de compuestos tipo flavonoide, las cuales se evidencian al comparar los
perfiles a 350nm, es probable que los metabolitos que se encuentran en tallos además
de ser más polares, pueden presentar mayores coeficientes de absortividad a este λ, que
aquellos que se encuentran en la raíz de la planta. Esto podría pasar teniendo en cuenta
que los diferentes tipos de flavonoides presentan diferencias entre sus espectros UV y
por tanto diferencias en la absorción a una longitud de onda determinada (Harborne et al.
1975; Wrolstad et al. 2005).
137
Tabla No. 14. Comparación del contenido total inicial de compuestos de tipo flavonoide en extractos obtenidos a partir de tallos de clavel de variedades resistente y susceptible mediante método espectrofotométrico y HPLC
Variedad Variedad resistente Variedad susceptible
Órgano Tallo Raíz Tallo Raíz
Método espectrofotométrico
(mg equivalentes catequina/ 100g) 19,1 28,8 14,1 22,0
Metodo cromatográfico (Unidades
arbitrarias de area)
6982838
1512577
5833177
1170138
Se determinó el efecto que tenia la inoculación con el patógeno, sobre el total de la
sumatoria de las áreas para los compuestos o grupo de compuestos detectados en cada
tratamiento a nivel del tallo (tabla No. 15). Mediante dicha comparación, se evidenció que
las condiciones ambientales y los cambios en el metabolismo basal de la planta durante
los tiempos de muestreo tienen un efecto sobre los niveles totales de estos metabolitos
considerando que para todos los tratamientos, a 96 hpi, se presenta un aumento general
en los niveles de los mismos.
De acuerdo al análisis estadístico realizado con estos resultados (α=0,05), no se
encontraron diferencias significativas entre controles e inoculados para ninguna variedad,
indicando que esta comparación en términos de áreas totales no era la más conveniente;
era probable en ese punto que algunos de los flavonoides mayoritarios a nivel del tallo
aumenten solamente por efecto de la inmersión y pudiesen estar enmascarando cambios
en los niveles de aquellos flavonoides que realmente pudiesen aumentar por efecto de la
inoculación con el patógeno.
138
Tabla No. 15. Variación del del contenido total de compuestos tipo flavonoide (HPLC A 350nm), en tallos de clavel a diferentes tiempos posinoculación con el patógeno Fod raza 2.
T1 T2 T3 T4
0 horas 6366257 b 6366257 b 4737583 a 4737583 a
96 horas 8262905 a 8293885 a 6931289 a 6592795 a
(1) Expresado como la sumatoria de área de todos los picos del cromatrograma
(2) Los tratamientos seguidos con letras diferentes presentan diferencias significativas (α=0,05)
(3) Los tratamientos corresponden a los definidos en el númeral 3.2.3. (T1 resistente control, T2 resistente
inoculado, T3 susceptible control y T4 suseptible inoculado)
Bajo estas condiciones, se optó por recurrir directamente a un análisis independiente
para cada compuesto o grupo de compuestos separados (tabla No. 16). Este análisis
permitió realizar una evaluación independiente de los compuestos que absorben a esta
longitud de onda y facilitó por tanto, la asociación de los cambios en los niveles de los
mismos durante la inoculación con el patógeno. Se pudo determinar que al igual que en
el caso de la raíz, dentro de los compuestos que presentaban algún tipo de variación
estadística, se incluían algunos que aumentaban por efecto de la inoculación en la
variedad resistente y fueron clasificados en el Grupo II.
Estos corresponden a los compuestos FT2 y FT6, los cuales presentaron un aumento
significativo en sus niveles en la variedad resistente inoculada, con respecto al control a
tiempo 0 y a 96h. Esto indicaba que estos compuestos podrian estar asociados al
aumento encontrado previamente (figura No. 16) y en donde se había encontrado que la
inducción diferencial de flavonoides, está asociada a la resistencia a la enfermedad en
este órgano también.
139
Tabla No. 16 Variación del contenido de compuestos tipo flavonoide especificos (HPLC a 350nm), en tallos de clavel a diferentes tiempos posinoculación con el patógeno Fod raza 2.
0 HORAS 96 HORAS
T1 T3 T1 T2 T3 T4
FT1 1045973 a 1071234 a 3421600 a 2887411 a 2867765 a 2350172 a
FT2 794037 a 755052 a 717422 a 1096101 b 675770 a 693246 a
FT3 959453 a 1212690 b 880410 a 896910 a 1576783 b 1449509 ab
FT4 808525 b 658021 a 440338 a 501719 a 914832 b 1035668 b
FT5 1547595 b 66646 a 1442619 b 1526336 b 58175 a 62160 a
FT6 510994 b 43750 a 503610 b 628327 c 47776 a 45467 a
FT7 305718 a 523141 b 439679 a 342968 a 420599 a 538060 a
FT8 393963 a 407049 a 417228 a 414113 a 369590 a 419252 a
(1) Los tratamientos seguidos con letras diferentes presentan diferencias significativas (α=0,05)
(2) Los tratamientos corresponden a los definidos en el númeral 3.2.3. (T1 resistente control, T2 resistente
inoculado, T3 susceptible control y T4 susceptible inoculado)
Con el fin de evaluar todos los resultados, se usaron herramientas de análisis
multivariado (PCA) y se deteminó que en conjunto, la variación de los resultados está
determinada principalmente por la variedad involucrada. Es evidente que de acuerdo al
PC1, el cual permite explicar el 95 % de la variación en los resultados, se pueden
diferenciar los extractos obtenidos de las dos variedades estudiadas (figura No. 23). De
la misma manera, se determinó que apenas un 4 % de la variación está definida en el
componente 2, el cual permite separar a los tratamientos de la variedad resistente en
función del tiempo posinoculación, esto se puede deber a que esta variedad
probablemente reacciona de manera más eficiente a los cambios ambientales debido a
características fisiológicas propias y que evidentemente la diferencian de la variedad
susceptible. Esta propuesta está basada en los resultados encontrados hasta ese
momento de la investigación, en donde se evidenciaba un metabolismo de biosíntesis de
flavonoides más dinámico para esta variedad resistente. Para la variedad susceptible, el
segundo componente, no generó separación indicando que no hay diferencias entre los
mismos.
Grupo II
Grupo II
140
De acuerdo a la gráfica de distribución de compuestos (figura No. 23 B) que permite
explicar como éstos afectan la distribución previamente realizada, es evidente que los
compuestos o grupo de compuestos FT5 y FT6 tienen un importante efecto en el
agrupamiento de los tratamientos de la variedad resistente hacia la derecha de la gráfica.
Esto es de esperarse considerando que los mismos se encuentran en altos niveles en la
variedad resistente, mientras que en la variedad susceptible, los niveles de los mismos
son mucho más bajos. Este comportamiento indica que el cambio evaluado a este tiempo
posinoculación está determinado por un aumento de los niveles de compuestos
preexistentes de la planta, fenómeno que ha sido ampliamente discutido en este modelo
planta-patógeno (Higuera, 2001)
23Figura No. 23. Análisis de componentes principales para los resultados obtenidos durante la separación de compuestos de tipo flavonoide en tallos de clavel inoculados con el patógeno causal del marchitamiento vascular. A) Distribución de los diferentes tratamientos en los componentes de variación. B) Distribución de los compuestos de tipo flavonoide en los componentes de variación (Loading graph) S=susceptible and R= Resistente a Fod. I: Inoculado; C. Control.
En conclusión, el grupo de compuestos FT2 y FT6 son de particular interés, en el estudio
de los mecanismos que se activan en la variedad resistente, considerando que presentan
una variación significativa por efecto de la inoculación con el patógeno en la variedad
resistente (figura No. 24).
FT4
FT5
FT6
Resistente
SC96h
RC96h
RI96h
RC0h
SI96h
SC0h
Susceptible
FT1
A B
141
24Figura No. 24. Variación en el contenido de los componentes FT2 (A) y FT6 (B) durante la infección con el patógeno en las variedades resistente y susceptible. El análisis estadístico correspondiente se encuentra en la tabla No. 16. Los tratamientos seguidos con letras diferentes presentan diferencias significativas (α=0,05).
De acuerdo a los resultados encontrados hasta este punto, fue evidente un aumento en
los niveles de metabolitos que presentaban absorción a 350nm, por efecto de la
inoculación con el patógeno en raíces (Grupo I) y tallos (Grupo II). Estos presentan
particular interés para el estudio de este modelo teniendo en cuenta su comportamiento
inducible asociado con resistencia. Sin embargo, como se discutió previamente, es de
interés para este estudio determinar si algunos de los componentes de dichos grupos son
efectivamente flavonoides.
Es por ello, que sin pretender elucidar completamente la estructura de los mismos, se
usaron diferentes herramientas analíticas para tener una aproximación de las
características estructurales de dichos metabolitos de interés.
3.3.4. Aproximación a la estructura química para compuestos probablemente asociados a la resistencia del clavel
Para conocer algunas caracteristicas estructurales de los compuestos de los grupos I y II,
y sin pretender realizar una elucidación estructural completa, se analizaron los extractos
Variedad resistente control Variedad resistente inoculada Variedad susceptible control Variedad susceptible inoculada
0
200000
400000
600000
800000
1000000
1200000
1400000
0 HORAS 96 HORAS
AR
EA (
UN
IDA
DES
AR
BIT
RA
RIA
S)
TIEMPO POSINOCULACIÓN
FT2
0
200000
400000
600000
800000
1000000
1200000
0 HORAS 96 HORAS
AR
EA (
UN
IDA
DES
AR
BIT
RA
RIA
S)
TIEMPO POSINOCULACIÓN
FT6
A B
a a a
b
a
c
b b
a
142
crudos obtenidos a partir de raíces y tallos de clavel infectados con el patógeno,
mediante técnicas como HPLC-DAD y HPLC-MS. Los resultados correspondientes se
presentan por órgano de la planta resaltando los aspectos más relevantes de estos
análisis y realizando propuestas estructurales para cada caso.
a. Análisis de metabolitos de interés en raíz (Grupo I)
Dentro de este grupo de metabolitos se encuentran aquellos que a nivel de la raíz
presentaron un aumento significativo en sus niveles en la variedad resistente por efecto
de la inoculación con el patógeno (F2, F3, F9 y F10). A pesar de que la separación
mediante las tres técnicas disponibles se realizó en cromatógrafos diferentes, el perfil
resultó ser exactamente igual para cada uno de los casos considerando que se usó la
misma columna y el mismo gradiente de elución (figura No. 25)
25Figura No. 25. Comparación de la separación cromatografica obtenida mediante los diversos tipos de análisis realizados (A) HPLC-MS, (B) HPLC-DAD Y (C) HPLC-UV
A continuación se presentan en la tabla No. 17, los resultados correspondientes para el
análisis de los metabolitos del grupo I, obtenidos por HPLC-DAD
F9
F10
F2
F3
HPLC-UV
HPLC-DAD
HPLC-MS
A
B
C
30 35 40 45 50 55 60 65 min
143
Tabla No. 17 Resumen de los espectros UV (250-500nm) para los compuestos del grupo I presentes en raíces de clavel, obtenidos mediante HPLC-DAD
Compuesto o
grupo de
compuestos
Tiempo de
Retención (min) Espectro UV
Maximos de absorción
(nm)
F2 35,34
<250, 285 h, 320
F3 35,84
<250, 295h , 335
F9 54,72
260,290, 320h
F10 60,05
290 h, 330
Se puede evidenciar que todos los compuestos presentan un máximo de absorción entre
320 y 350nm, típica de estructuras con grupo cinamoil como es el caso de los flavonoides
Dicho comportamiento no fue tan evidente para el compuesto F9, que presenta apenas
un hombro de baja intesidad a 320nm. En general los diferentes analitos presentan al
menos dos bandas de absorción en el rango de 260 a 400nm, lo cual es propio, pero no
necesariamente exclusivo, de los compuestos de tipo flavonoide. Es importante recordar
que los espectros de absorción UV de este tipo de compuestos, presentan diferentes
144
cambios en sus máximos de absorción en función de sus patrones de sustitución y del
solvente en el cual se encuentra disuelto (Harborne et al. 1975) y que su calidad depende
tambien, de la concentración del metabolito. Bajo estas consideraciones, teniendo en
cuenta que los máximos valores de absorbancia para estos compuestos se encuentran
en rangos bajos (0,020 UA a 350nm), es probable que estos espectros no presenten la
mejor calidad para obtener información estructural concluyente sobre los compuestos de
interés. Además, la posible coelución de otros compuestos que presenten absorción a
longitudes de onda cercanas, pueden interferir con la calidad de los resultados, tal y
como parece suceder para el caso de los compuestos F2 y F3, en donde la absorción a
longitudes de onda menores a 250 nm, puede afectar la calidad del espectro.
Los resultados encontrados para los compuestos del grupo I se compararon con los
valores de los máximos de absorción reportados para los diferentes compuestos de tipo
flavonoide que a la fecha han sido aislados y caracterizados del clavel (tabla No. 18). Tal
y como se observa en esta tabla, muchos de los flavonoides aislados a la fecha son
derivados glicosilados del kaemferol, flavonol con conocida actividad biológica
ampliamente distribuido en plantas (Hernández et al. 2009; Ballizany et al. 2012)
(Hernandez I 2009, Ballizany 2012). Estos compuestos presentan bandas de absorción
en la zona de 260 a 330nm, comportamiento típico de los flavonoles 3-O sustituidos
(Harborne et al. 1975; T. J. Mabry et al. 1980). Esto se debe a que la sustitutición en
dicha posición genera un corrimiento hipsocromico en la banda I del espectro, con
respecto a las del compuesto kaemferol puro ( λmax banda I en metanol 367nm ).
Al comparar estos resultados con los encontrados en la presente investigación (tabla No.
17) es probable que este tipo de compuestos (flavonoles 3-O-sustituidos) aislados de
variedades cultivadas en Europa tambien se encuentren en las variedades cultivadas
comercialmente en nuestro pais, considerando que los espectros obtenidos para los
compuestos encontrados en la presente investigación, tambien presentan valores de
absorción entre 250 y 320 nm (tabla No. 18). Esto es muy probable ya que de acuerdo a
(Galeotti, Barile, Lanzotti, et al. 2008), dichos compuestos se presentan en muchas
variedades de clavel en diferentes órganos de la planta y es probable que sean propios
de la especie vegetal de interés, Dianthus caryophyllus L. Sin embargo, esto es apenas
una aproximación sustentada en la comparación de máximos de absorción, criterio
preliminar para realizar una afirmación de este tipo, considerando que otros flavonoides
glicosilados pueden tambien presentar comportamiento similares (Harborne et al. 1975).
145
Tabla No. 18. Resumen de fórmula molecular, estructura y absorción UV, para flavonoides aislados de clavel
Fórmula
molecular y
masa molar
calculada
Estructura y nombre
Absorción
en el UV
(nm)
Referencia
C39H50O25
918,7973
CH3OH
O
OH
OH
O
O
OH
OH
O
O
O
OH
O
OHOH
OH
O
OHOH
OH
OH
OH
O
O
OH
Kaemferol 3-O-β-D –glucopiranosil (1→2)-O- β-
D –glucopiranosil (1→2)-O--L-ramnopiranosil-
(1→6)- β-D –glucopiranosido
324, 302,
266 en
metanol
(Galeotti,
Barile, Curir, et
al. 2008)
C33H40O20
756,6587
CH3OH
O
OH
OH
O
O
OH
OH
O
O
OH
O
OHOH
OH
OH
OH
O
O
OH
Kaemferol 3-O-β-D –glucopiranosil (1→2)-O--
L-ramnopiranosil-(1→6)- β-D –glucopiranosido
322 302
267
(Galeotti,
Barile,
Lanzotti, et al.
2008)
146
C27H30O15
594,5181
CH3OH
O
OH
OH
O
O
OH
OH
OH
O
OH
OH
O
O
OH
Kaemferol 3-O- -L-ramnopiranosil-(1→6)- β-D
–glucopiranosido
322, 302,
267
(Galeotti,
Barile,
Lanzotti, et al.
2008)
C27H30O15
594,5181
OH
O
OH
OH
OH
OH
O
OHOH
OH
OH
OH
O
O
OH
Apigenin 6,8-di-C- β- D –glucopiranosido
329, 298 y
273
(Galeotti,
Barile,
Lanzotti, et al.
2008)
C34H42O20
770,6850
CH3
CH3OH
O
OH
OH
O
O
OH
OH
O
O
OH
O
OHOH
OH
O
OH
O
O
OH
Kaemferido 3-O-β-D –glucopiranosil (1→2)-O-
-L-ramnopiranosil-(1→6)- β-D –
glucopiranosido
350 216
264
(Curir et al.
2001)
C26H28O16
596,49092
OH
OH
OH
OH
O
O
OH
O OH
O OH
OH
O
OH
O
OH
3-6-O-(-L-arabinopiranosil)-β-D-
glucopiranosil-quercetina (peltatosido)
359, 297,
270, 257
(Curir et al.
2003)
147
C15H10O6
286,2363
OH
OH
O
O
OH
OH
3,5,7,2´tetrahidoxiflavona (Datiscetina)
264, 398 (Curir et al.
2003)
Con los resultados obtenidos hasta este punto, se tenía alguna información acerca de la
probable naturaleza flavonoide de los compuestos del grupo I. Es por ello que se
prosiguió con los análisis por HPLC-MS buscando que estos análisis permitirian obtener
mas información para proponer algunas características estructurales de los mismos. Los
análisis se realizaron con un detector de masas de baja resolución, que presentaba una
interfase de ionización con electrospray (ESI) (Metodologia 3.2.6). Este método de
ionización débil, permite obtener información principalmente acerca del ión
pseudomolecular y permite deducir por tanto, la masa de los compuestos de interés
(Prasain et al. 2004). Esta aproximación experimental fue considerada válida para
efectos del presente estudio, teniendo en cuenta que no se buscaba elucidar
completamente la estructura de los compuestos de interés y que además, con la
información de la masa de los compuestos flavonoides mayoritarios del clavel (tabla No.
18), se podría comparar y proponer la posible correspondencia de estos compuestos con
los pertenecientes al grupo I.
Bajo estas consideraciones se realizaron los análisis para los extractos obtenidos de
raíces resistentes inoculadas a 6 hpi, inicialmente mediante modo SCAN en el rango de 0
a 2000 m/z (figura No. 26). Considerando la baja concentración de los metabolitos en la
muestra y que solamente se hicieron inyecciones con volúmenes de 5 µL, los TIC (Total
ion chromatogram) de los diferentes análisis mostraban que la detección de los iones
provenientes de los compuestos que eluian en los tiempos de interés era baja.
148
26Figura No. 26. Comparación del perfil de elución y el TIC para el análisis por HPLC-MS de los extractos obtenidos de raíces de clavel. Condiciones de elución y análisis por MS de acuerdo al numeral 3.2.6.
Los espectros obtenidos mediante este modo de análisis, permitieron la detección de un
número importante de iones en cada tiempo de elución, lo que indicaba que
efectivamente se trataba de mezclas de compuestos, además de ruido correspondiente
al equipo (tabla No. 19), considerando que con las condiciones suaves propias del
método de ionización usado, era poco probable que los iones que se detectaban fuesen
producto de un proceso de fragmentación típico, obtenido de un proceso de ionización
más fuerte como el que se puede obtener mediante impacto electrónico (IE).
El análisis de los posibles abductos que se podrían formar para los diferentes
compuestos flavonoides que a la fecha han sido reportados en clavel (tabla No. 18), se
realizó teniendo en cuenta los diferentes componentes de la fase móvil (ácido acético y
acetonitrilo) y el modo de detección usado (modo negativo). Para ello se usó la hoja de
cálculo suministrada desde http://www.alchemistmatt.com/mwtwin.html, en donde se
determinó que, de los diferentes iones encontrados en estos tiempos de elución en modo
SCAN (tabla No. 19), en raíces de clavel, ninguno correspondia a los metabolitos
esperados (tabla No. 18). Esto indicaba que esta aproximación experimental no era la
adecuada y que probablemente los iones detectados se generaban por la elución de
otros compuestos o a ruido propio del equipo.
10 20 30 40 50 60 70 80 min
0.00
0.25
0.50
0.75
1.00
1.25
mAU(x10)Detector A Ch2:350nm
TIC
Perfil de elución
a 350nm
149
Tabla No. 19. Información obtenida de los análisis por HPLC-MS modo SCAN, de extractos obtenidos a partir de raíces de clavel
Compuesto o
mezcla de
compuestos
Tiempo retención en
HPLC-MS (min) Señales encontradas (m/z)
F2 34,1 600.15, 659.05, 713.45 *, 791.25, 1017.05
F3 35,0 600,15, 713.45, 826.50* 904.55, 1017.05
F9 59,1 329.25, 657.25*, 713.35, 826.90, 911.40
F10 64,3 281.95, 713.15, 826.45, 930.70*, 980.05
Bajo estas consideraciones, se optó por realizar un seguimiento de la elución de iones
específicos, como la que se puede realizar mediante el modo SIM (Selected Ion
Monitoring); este permite aumentar la sensibilidad de la detección de ciertos iones de
interés que se presentan en muy bajos niveles en matrices complejas. Específicamente
se evaluó si el compuesto Kaemferido 3-O-β-D–glucopiranosil-(1→2)-O--L-
ramnopiranosil-(1→6)- β-D–glucopiranosido (peso molecular: 770,6 uma), el cual ha sido
encontrado en tallos y raíces de clavel infectadas por el patógeno (Curir et al. 2005), se
encontraba en las raíces de la planta. Así mismo, este análisis permitiría determinar, por
comparación con los tiempos de retención de los compuestos del grupo I, si dicho
compuesto era alguno de estos metabolitos, que de acuerdo con el presente estudio,
están asociados a los mecanismos de defensa activa y a la resistencia al marchitamieto
vascular.
El análisis en modo SIM, para el ión pseudomolecular correspondiente a este compuesto
(M-1) con un m/z=769 se presenta a continuación en la figura No. 27. Se pudo
determinar que el ión de interés eluye en un tiempo de 35,4 min, tiempo en el que se
espera eluyan los iones correspondientes al compuesto F2. Considerando la naturaleza
polar de este compuesto, era de esperarse que eluyera en los tiempos de retención
cercanos a los del compuesto F2; la elución de los flavonoides glicosilados se debe
presentar en tiempos de retención menores que los encontrados para las agliconas
teniendo en cuenta la mayor polaridad de los primeros y que se estaba usando una
columna en fase reversa (Wrostland 2005).
150
27Figura No. 27. Comparación del perfil de elución del ión m/z= 769 y el perfil de elución a 350nm para extractos obtenidos de raíces de clavel. Condiciones de elución en HPLC y análisis de MS de acuerdo al númeral 3.2.6.
En general, la coincidencia encontrada en los tiempos de elución se constituyó en
evidencia para proponer que el compuesto Kaemferido 3-O-β-D –glucopiranosil (1→2)-O-
-L-ramnopiranosil-(1→6)- β-D –glucopiranosido, era probablemente el compuesto F2,
el cual de acuerdo al análisis previamente realizado, participaba en los mecanismos de
defensa activa en raíces de clavel, tal y como había sido propuesto por Curir et al (2005).
En este punto de la investigación, considerando los resultados obtenidos en HPLC-DAD
y HPLC-MS, se tenía evidencia para proponer que al menos uno de los compuestos del
grupo I, era un flavonoide y que este era probablemente el mismo compuesto que había
sido aislado en estudios previos por Curir 2005. El análisis en modo SIM de los otros
iones pseudomoleculares esperados para los demás compuestos de la tabla No. 18, no
presentaron resultados concluyentes considerando que el tiempo de elución encontrado
para cada uno de ellos, no coincidían con los tiempos de elución que habían sido
definidos para los compuestos del grupo I. Considerando que se había cumplido con el
objetivo de encontrar evidencia sobre la presencia de flavonoides inducibles en este
órgano de la planta, determinando la presencia de al menos uno de ellos, el análisis de
los demás compuestos F3, F9 y F10, queda como tema de investigación para próximos
estudios en donde se usen herramientas como sistemas de detección de alta resolución
y sistemas de ionización secuenciales, como HPLC-MS-MS, técnica ampliamente usada
10 20 30 40 50 60 70 80 min
-2.0
-1.0
0.0
1.0
2.0
3.0
4.0
mAUDetector A Ch2:350nm
Perfil cromatográfico elución A
350nm
151
en el análisis de este tipo de compuestos en matrices vegetales (Prasain et al. 2004;
Truchado et al. 2009; Aguirre-Hernández et al. 2010; Gunnaiah et al. 2012).
b. Análisis de metabolitos de interés en tallo (Grupo II)
Con el fin de determinar la naturaleza de los compuestos del grupo II, los cuales
presentaron una inducción diferencial en tallos de clavel por la infección con el patógeno,
se evaluaron de manera inicial los espectros UV mediante la técnica HPLC-DAD (tabla
No. 20) En este caso particular, se encontraron espectros con bandas bien definidas,
típicas de compuestos de tipo flavonoide, indicando que los compuestos FT2 y FT6,
probablemente correspondían a esta familia de compuestos.
Tabla No. 20. Resumen de los espectros UV (250-500nm) para los compuestos del grupo II presentes en tallos de clavel, obtenidos mediante HPLC-DAD
Compuesto o
grupo de
compuestos
Tiempo de
Retención (min) Espectro UV
Maximos de absorción
(nm)
FT2 21,01
270, 330
FT6 30,21
265, 340
Al comparar los valores de los máximos de absorbancia para estos metabolitos, con
respecto a los ya reportados en otros compuestos aislados del clavel (tabla No. 18), se
pudo determinar que era muy probable que existieran coincidencias. Sin embargo, tal y
como se citó para los compuestos de la raíz, el criterio de los máximos de absorción, es
apenas un acercamiento a la estructura de dichos metabolitos.
152
Bajo esta consideración, se realizaron los análisis correspondientes de HPLC-MS en
modo SCAN inicialmente, considerando que la buena calidad de los espectros UV para
estos compuestos, indicaba que era probable que los resultados en este modo de
análisis generaran mejores resultados que en raíz. Sin embargo, este no fue el caso para
aquellos tiempos de retención en donde se esperaba la elución del compuesto FT2,
teniendo en cuenta que se presentó un importante número de iones, de manera similar a
lo encontrado en el caso de los componentes del grupo I de raíz. Para el caso del
compuesto FT6, se encontró un espectro de masas relativamente limpio, con un ión de
m/z= 755,10 +/- 0,5 (figura No. 28). Considerando que en esta relación carga/masa se
esperaba el ión pseudomolecular (M-1) para el compuesto Kaemferol-3-O-β-D–
glucopiranosil-(1→2)-O--L-ramnopiranosil-(1→6)-β-D–glucopiranósido (masa
molecular = 756,6 uma), se propuso que este compuesto era el FT6, metabolito que se
induce por infección por el patógeno en tallos de la variedad resistente L.P Candy. En
este espectro se evidencia tambien la coelución de un ión pseudomolecular con una
relación m/z de 600,4, lo que indica que tampoco para el compuesto FT6, se presentó
una elución totalmente independiente.
28Figura No. 28. Especto de masas en modo SCAN para el compuesto FT6 presente en tallos de clavel. Las condiciones correspondientes de separación y análisis por HPLC-MS se describen en el númeral 3.2.6.
Con este resultado se pudo proponer la naturaleza flavonoide para el compuesto FT6 y
permitió por tanto confirmar que en tallos del clavel, se presenta la participación de
flavonoides en los mecanismos de defensa activa de la planta. Bajo estas
consideraciones, no se realizaron análisis posteriores para el compuesto FT2, y el
análisis estructural completo para este compuesto, queda como objetivo de próximas
investigaciones.
En conjunto, los resultados obtenidos en tallos y raíces de clavel en esta parte de la
investigación, se constituyeron en más evidencia acerca del papel que estos compuestos
153
pueden jugar en la interacción con el patógeno y permitieron seguir proponiendo a los
flavonoides, como parte de los mecanismos que se activan en la planta resistente en su
interacción con el patógeno, tal y como había sido ampliamente discutido en apartes
anteriores de la investigación. Considerando las características antifúngicas de los
metabolitos Kaemferol 3-O-β-D –glucopiranosil (1→2)-O--L-ramnopiranosil-(1→6)- β-D
–glucopiranosido y Kaemferido 3-O-β-D –glucopiranosil (1→2)-O--L-ramnopiranosil-
(1→6)- β-D –glucopiranosido, reportadas en estudios previos (Curir et al. 2005; Curir et
al. 2001), se puede pensar que el papel de estos metabolitos puede estar referido a estas
propiedades antifúngicas. Un aumento en los niveles de estos metabolitos en las
primeras etapas de la infección, puede ser una caracteristica determinante para evitar el
éxito de la colonización del patógeno en los tejidos de la planta.
La distribución de los derivados glicosilados del kaemferol en los tejidos vegetales, ha
sido ampliamente documentada y se han asociado con procesos de adaptación a
diferentes estados de estrés (Sánchez-Rodríguez et al. 2011). A pesar de que la
actividad antioxidante reportada para estos metabolitos, es menor que la reportada para
otros flavonoles glicosilados con patrón de hidroxilación 3´,4´en el anillo B, la presencia
del patrón de sustitución 5,7 del anillo A, ha sido asociada a la capacidad de inactivar
radicales y por tanto presentar actividad antioxidante (Catherine Rice-Evans et al. 1996).
Es por ello que no se puede descartar una posible acción de los mismos, en la
inactivación de especies altamente oxidantes, sobre todo en aquellas etapas de la
interacción en donde la presencia de dichas moléculas oxidantes, no es benéfica para la
planta. Sin embargo, considerando que la localización de estos metabolitos finalmente es
la que permitirá su interacción con dichas especies oxidantes, ésta debe ser un punto
determinante para su acción (Agati et al. 2012).
Se ha propuesto que estos compuestos glicosilados se acumulan en las vacuolas de las
células parenquimaticas adyacentes a los vasos del xilema, en donde se constituyen
como reservorios para ser usados en el momento en que se necesiten durante la
interacción con potenciales patógenos (Beckman 2000). Se ha reportado que algunas
enzimas del tipo UDP-glicosil transferasas, involucradas en la biosíntesis de estos
compuestos glicosilados, se inducen por el efecto de la inoculación con patógenos
(Miranda et al. 2007; Veljanovski & Constabel 2013). Asi mismo una vez sintetizados,
éstos pueden ser transportados a través de procesos como el tráfico vesicular, por acción
154
de transportadores MATE (Multidrug and toxic compound extrusion transporters) o por la
acción de transportadores ABC, para su almacenamiento en las vacuolas o su
localización en el punto de acción a nivel del apoplasto (J. Zhao & Dixon 2010; Agati et
al. 2012).
A pesar de que se ha propuesto que las correspondientes agliconas son las que
presentan la mayor actividad antimicrobiana, diferentes glicosidos del kaempferol han
sido asociados con resistencia vegetal (Abdel-farid et al. 2009; Kröner et al. 2012;
Troncoso-Rojas et al. 2012). En clavel, tanto el flavonoide kaemferido (3´-metil
kaemferol), como su derivado triglicosilado kaemferido 3-O-β-D –glucopiranosil-(1→2)-O-
-L-ramnopiranosil-(1→6)- β-D –glucopiranosido, presentan actividad antifungica sobre
Fod. Sin embargo, se ha encontrado que la especie glicosilada puede presentar una
actividad más alta que la correpondiente aglicona (Curir et al. 2005). Teniendo en cuenta
que en esta especie vegetal no se han realizado estudios a nivel histológico que permitan
conocer como se ubican a nivel subcelular dichos compuestos y se desconoce por tanto
su modo de acción en la planta, deberán realizarse próximas investigaciones para
determinar finalmente cual es papel que cumplen los mismos en esta interacción.
En conjunto, los resultados obtenidos hasta este punto de la investigación permiten
proponer un papel para los compuestos de tipo flavonoide en los mecanismos de defensa
que se activan en las plantas de clavel. Sin embargo, era claro que con el fin de tener
aún más evidencia sobre el papel de estos metabolitos en la planta, era de interés
conocer si se presentaba estimulación de las rutas biosintéticas asociadas, durante la
interacción con el patógeno. La acumulación de metabolitos y enzimas asociadas a su
biosíntesis, es un fenómeno que debe ser estudiado en cada interacción planta-
patógeno, con el fin de determinar si realmente existe una generación de dicho
metabolito por parte de la planta durante la interacción (Hammerschmidt 1999; Treutter
2006).
155
3.3.5. Evaluación de los niveles de actividad y transcripcionales para las enzimas PAL, CHS y CHI, en raíces y tallos de clavel durante la interacción con Fod
Teniendo como antecendente lo estudiado en la primera fase de esta investigación
(Capítulo 2) en donde se encontró la relación que a nivel constitutivo existía entre los
niveles de flavonoides y de las enzimas asociadas con su biosíntesis, era de interés para
este modelo, conocer como se presentaba la regulación espacio temporal de dichas
enzimas, en la interacción particular de la planta con este patógeno. De esta manera, en
la presente etapa, se evaluaron los niveles de actividad y transcripciónales para las
enzimas fenilalanina amonio liasa (PAL), chalcona sintasa (CHS) y chalcona isomerasa
(CHI) tanto en raíces como en tallos de clavel, y se relacionaron con la acumulación de
flavonoides previamente descrita y con la resistencia a la enfermedad marchitamiento
vascular.
Los análisis de actividades enzimáticas se llevaron a cabo para ambos órganos de la
planta en todos los tiempos posinoculación planteados (0, 6, 12, 24, 48 y 96 hpi) y de
acuerdo con los resultados obtenidos, se seleccionaron aquellas enzimas para las cuales
se realizó la evaluación de niveles transcripcionales; si la infección con el patógeno no
generaba un aumento en los niveles de actividad enzimática, no era de interés, al menos
para esta investigación, conocer como se modulaban los niveles de mRNA
correspondientes.
Las determinaciones de actividades enzimáticas y niveles transcripcionales se realizaron
de acuerdo a las condiciones descritas en los numerales 3.2.7 y 3.2.8. Al respecto de la
evaluación de los niveles de mRNA, teniendo en cuenta los resultados obtenidos en
ensayos preliminares, en donde no se encontró un gen casero que presentara niveles
relativamente constantes durante el periodo posinoculación evaluado (los genes
codificantes para la β-actina variaban en mas de 4 órdenes de magnitud y otros como los
de las histonas y del factor de elongación no amplificaron o presentaron
inespecificidades), se optó por realizar una evaluación por cuantificación absoluta de los
niveles transcripcionales para las diferentes enzimas objeto de estudio. De esta manera
los resultados correspondientes se presentan como número de copias/pg de cDNA de
acuerdo a las recomendaciones citadas por (Y. Lu et al. 2012), para tejidos que se
encuentran en el mismo estado de desarrollo y no presentan cambios importantes en la
156
expresión genómica global. Se asume que durante el tiempo del estudio (0 a 96 hpi), no
se presentan cambios importantes al respecto, en raíces y tallos de clavel.
Con el fin de tener en cuenta los cambios en las condiciones ambientales o en el
metabolismo basal de la planta durante los tiempos de muestreo, los resultados se
expresan también como la relación entre los niveles de mRNA entre inoculados y
controles para cada tiempo posinoculación y cada tratamiento, de esta manera se evalua
solamente el efecto que presenta la inoculación con el patógeno (Desmond et al. 2008;
Godard et al. 2009). Se usaron condiciones semejantes en los procesos de extracción de
RNA y retrotranscripción para todas las muestras y se cuantificó el cDNA por
fluorescencia en cada una de las reacciones (metodología 3.2.8). De esta manera se
aseguró que la eficiencia en los procesos previos al análisis por PCR en tiempo real
fuese la misma (Cikos & Koppel 2009; Y. Lu et al. 2012). Finalmente la eficiencia de
amplificación se evaluó usando los datos de fluorescencia vs No. de ciclos (Ramakers et
al. 2003), y se determinó que bajo las condiciones de trabajo no se presentaba
contaminantes que afectaran finalmente los resultados obtenidos.
Se presentan para cada órgano de la planta y para cada enzima, los resultados de
manera independiente, mostrando primero los resultados de actividad y si es el caso,
inmediatamente después, sus niveles transcripcionales correspondientes. Posteriormente
se discuten los resultados obtenidos en cada órgano objeto de estudio y finalmente se
comparan todos los resultados obtenidos para tener un panorama general de la
respuesta en toda la planta.
a. Fenilalanina Amonio Liasa (PAL) en raíces de clavel
En esta fase del estudio se respondió la pregunta si había relación entre el aumento en
los niveles de flavonoides encontrados en este órgano durante la infección con el
patógeno y los niveles de actividad de las enzimas asociadas con su biosíntesis. Se pudo
determinar que para el caso de la enzima PAL (figura No. 29), los niveles de actividad
presentaron un aumento significativo en la variedad resistente inoculada a las 96 hpi,
mientras que en la variedad susceptible no se presentó cambio alguno. El aumento en la
actividad de esta enzima, que fue de casi 3 veces con respecto al control no inoculado,
constituyó evidencia de su participación en el aumento de compuestos fenólicos que se
presentan en este órgano de la planta a este mismo tiempo posinoculación (figura No.
157
15). Este resultado está de acuerdo con un estudio previo realizado en el grupo con la
variedad resistente Kiss, en el que bajo las mismas condiciones de inoculación, se
presento un aumento en los niveles de esta enzima, a las 48 hpi con el patógeno (Ardila
et al. 2011).
Estos resultados coinciden con estudios realizados en otras plantas en donde el aumento
de la actividad de esta enzima, es un fenómeno asociado a resistencia a diferentes
patógenos o al reconocimiento de elicitores provenientes de los mismos (Giberti et al.
2012; Rahman & Punja 2005; Forlani 2010; Y. Ge et al. 2013). Se ha encontrado por
ejemplo, un aumento en los niveles de esta enzima asociados con resistencia a Fusarium
oxysporum f. sp. albedinis en palma (Modafar et al. 2001) y Fusarium oxysporum f.sp.
cubense en banana (Subramaniam et al. 2006).
El hecho de que los niveles de esta enzima no cambien en tiempos más tempranos
cuando se presenta un aumento en los niveles de fenoles y flavonoides (6 hpi), indica
que, sí en este tiempo posinoculación se presenta la acumulación de compuestos
derivados del ácido hidroxicinámico propuesta previamente, es probable que sea debido
a procesos independientes a la estimulación de la ruta fenilpropanoide. Tal y como ha
sido sugerido, la acumulación de estos metabolitos a tiempos tempranos no
necesariamente requiere la activación de la transcripción y traducción de genes
codificantes para enzimas asociadas a su biosíntesis (Matern & Kneusel 1988;
Naoumkina et al. 2007). De esta manera, es probable que la posible acumulación de
ácidos hidroxicinámicos, se deba a su liberación a partir de formas glicosiladas
disponibles, como las que se pueden encontrar en vacuolas de células especializadas
ubicadas estratégicamente en los tejidos parenquimáticos que se encuentran junto a los
vasos xilemáticos (Beckman 2000). Los procesos de descompartimentalización
intracelular y posterior localización de estos metabolitos en la planta, en donde
participarían β-glucosidasas y transportadores ABC serían, a este tiempo posinoculación,
los que finalmente podrían estar asociados con la expresión de resistencia, tal y como ha
sido propuesto para células de Medicago truncatula tratadas con ácido jasmonico
(Naoumkina et al. 2007).
158
29Figura No. 29. Niveles de actividad fenilalanina amonio liasa en raíces de clavel durante el ensayo in vivo de inoculación con el patógeno Fod raza 2. Se presentan los resultados promedio de tres extracciones independientes para cada tratamiento. Las letras diferentes muestran tratamientos diferentes significativamente (α= 0,05)
El aumento en la actividad de enzima a las 96 hpi, indica que es probable que la
inducción de ésta en clavel, sea un fenómeno asociado con el reconocimiento de
elicitores generales provenientes de patógenos de este género y a la activación de
mecanismos asociados a la resistencia basal de la planta, lo cual concuerda con estudios
previos en este modelo en donde se presentó un aumento en la actividad de esta
enzima, por el tratamiento con elicitores crudos provenientes de este patógeno (Ardila et
al. 2007). Sin embargo, solo con estudios adicionales que permitan obtener una mayor
evidencia al respecto, se puede corroborar dicha hipótesis en el clavel. Por ejemplo,
estudios que permitan evaluar los niveles de esta enzima en otros genotipos del clavel, o
que permitan determinar cuales son los receptores de la planta y los elicitores
provenientes del patógeno asociados con dicho reconocimiento, permitirían obtener
mayor evidencia al respecto para apoyar o refutar dicha hipótesis.
Con el fin de indagar si uno de los puntos de regulación de la enzima está a nivel de la
transcripción, se evaluaron en estos tiempos posinoculación, los niveles de mRNA
mediante la técnica de realtime PCR con cuantificación absoluta, siguiendo las
recomendaciones que se citaron previamente en los ensayos preliminares (figura No. 30.
A y C). Con estos mismos datos se determinó tambien, la relación entre los niveles de
mRNA entre inoculados y controles para cada tiempo posinoculación (figura No. 30. B y
0
100000
200000
300000
400000
500000
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SUSCEPTIBLE
C), para tener en cuenta el efecto de las condiciones ambientales (Desmond et al. 2008;
Godard et al. 2009).
30Figura No. 30. Niveles transcripcionales para genes codificantes para la enzima PAL en raíces de clavel durante el ensayo in vivo de inoculación con el patógeno Fod raza 2. Variedad resistente L.P. Candy cuantificación absoluta (A) y relación inoculado/ control (B). Variedad susceptible Tasman cuantificación absoluta (C) y relación inoculado/ control (D). Se presentan los resultados promedio de tres extracciones independientes para cada tratamiento. Las letras diferentes muestran tratamientos diferentes significativamente (α= 0,05). El análisis estadístico para la relación inoculado/control se realizo entre los diferentes valores encontrados para los diferentes tiempos
Los resultados que se encontraron, indicaron que en general los niveles transcripcionales
a las 6hpi, tanto para controles e inoculados para las dos variedades estudiadas, son
superiores a los encontrados para las cero horas, hecho que se puede explicar teniendo
en cuenta los diferentes reportes en donde se ha encontrado en otras especies
vegetales, un aumento en los niveles de mRNA para esta enzima y/o de promotores
asociados con su transcripción, en diferentes condiciones ambientales (Seelakshmri &
0
100
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300
400
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a
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ab
a
ab
160
R. Sharma 2008; Lea et al. 2007; Winkel-Shirley 2002; Agati et al. 2011). El proceso de
inmersión de las raíces de la planta en una solución de conidías o en agua, supone un
cambio en las condiciones de temperatura y de humedad, para el cual la planta debe
activar un conjunto de mecanismos que le permiten su adaptación. De acuerdo a los
resultados de este estudio, estos fenómenos, estan sujetos a un aumento en los niveles
de transcripción para dichos genes, lo cual a su vez, debe estar asociado a los aumentos
que se presentaron para todos los tratamientos, a este mismo tiempo posinoculación en
los niveles de actividad enzimática y en los niveles de “compuestos probablemente
flavonoides” determinados por HPLC (figura No. 29 y tabla No. 11).
Un aumento en los niveles de mRNA tambien se presentó a 48 hpi, en el control y el
correspondiente inoculado para la variedad resistente L.P Candy (figura No. 30). Es
evidente que este aumento se presenta por efecto de las condiciones ambientales
propias del ensayo y que la variedad susceptible no responde de la misma manera a
dichas condiciones ambientales. Es probable que diferencias propias a nivel del genotipo,
le den a las plantas resistentes la capacidad de responder a diferentes condiciones de
estrés vegetal, incluyendo la interacción con microorganismos o condiciones ambientales
particulares. Se ha propuesto que las respuestas que se activan en plantas resistentes
ante patógenos y la adaptación a condiciones de estrés abiótico, deben tener algunos
mecanismos comunes; se ha determinado que diferentes condiciones de estrés, pueden
estar asociados a cambios en los niveles de enzimas del metabolismo secundario de
manera similar a lo encontrado durante la interaccion con otros patógenos (J. J. Choi et
al. 2001; YunSheng Wang et al. 2012; Boava et al. 2011; Seelakshmri & R. Sharma
2008).
Con respecto a la inoculación con el patógeno (figura No. 30 B yD), se evidencia que
tanto en la variedad resistente como en la susceptible, se presentan niveles superiores
de mRNA para los tratamientos inoculados con el patógeno, siendo de hecho, más
temprano el aumento en el caso de la variedad susceptible (6 hpi). Estos resultados
indican que la presencia del patógeno genera tanto en plantas resistentes como
susceptibles, aumentos en los niveles de mRNA para esta enzima, siendo por tanto una
respuesta inespecífica, la cual debe estar asociada con la respuesta basal de la planta en
ambas variedades de clavel. Es probable que el número de conidias del patógeno que
entran en contacto entre los tejidos vasculares de la planta, aumente más rapidamente
en el caso de la variedad susceptible y generen una inducción más temprana en la
161
transcripción de estos genes (6hpi), que el presentado para la variedad resistente (12
hpi). Diferentes fenómenos asociados a la defensa extravascular, pueden actuar a nivel
de este órgano (Baayen & Plas 1992) y es probable que generen diferencias en la
velocidad con la que el patógeno entra en contacto con los tejidos vasculares entre la
variedad resistente y la susceptible. Estos resultados tambien concuerdan con estudios
previos realizados en el grupo, en el que se encontró que los niveles transcripcionales
para la enzima PAL a nivel de la raíz en este modelo, aumentan primero en la variedad
susceptible usando la técnica RT-PCR semicuantitativa (Ardila et al. 2011).
De acuerdo con los resultados encontrados en la presente investigación, se encontró que
el aumento encontrado en los niveles de mRNA para la enzima PAL en la variedad
resistente (12 y 24 hpi) (figura No. 30), no se presenta de manera simultánea con el
aumento en la actividad de la enzima (96 hpi) (figura No. 29). Es probable que el
aumento en los niveles de mRNA encontrados puedan conducir a la síntesis de la PAL, la
cual se puede producir de forma inactiva y a las 96 hpi activarse con otra señal en la
proteína activa. Esto estaría de acuerdo con lo sugerido previamente, sobre la acción
mecanismos de regulación postranscripcional para esta enzima en raíces de clavel
durante la infección con este patógeno (Ardila et al. 2007). Algunos reportes han citado
que pueden existir diversos mecanismos de regulación postranscripcional que pueden
determinar los niveles de actividad de la PAL en plantas como la inhibición por producto
(Blount et al. 2000), glicosilación (N. M. Shaw et al. 1990), defosorilación (S. Cheng et al.
2001; Seelakshmri & R. Sharma 2008). Es probable que algunos de estos mecanismos
de regulación, estén asociados a diferentes fenómenos de reconocimiento del patógeno y
final activación de los mecanismos de defensa en este órgano de la planta a las 96 hpi,
con el fin de aumentar los niveles de esta enzima y generar un aumento final de
metabolitos en este tiempo posinoculación. Esta propuesta estaría de acuerdo con lo
reportado por (S. Cheng et al. 2001) en Arabidopsis thaliana, en donde la activación de la
PAL por fosforilación se debe a la acción de una kinasa con dominios similares a
calmodulina (CDPK por sus siglas en ingles para calmodulin-like domain protein kinase),
la cual es sensible a los cambios en los niveles de Ca+2 a nivel citoplasmático, fenómeno
que a su vez, ha sido asociado al reconocimiento de elicitores (S. Cheng et al. 2001). Es
importante recordar que un aumento en los niveles de Ca+2 citoplasmático ha sido
asociado a la activación de este tipo de kinasas, debido a un reconocimiento de MAMPs
162
en la expresión de la resistencia basal o inmunidad activada por MAMPs (MTI, de sus
siglas en ingles MAMP trigered inmunity) (Muthamilarasan & M. Prasad 2013).
En general, el aumento en los niveles de esta enzima en la variedad resistente a este
tiempo posinoculación, genera inquietudes con respecto al comportamiento de la
actividad en tiempos posteriores; no se sabe si los niveles de esta enzima siguen
aumentando o disminuyen luego de un tiempo para establecer un comportameinto
modular. Así mismo, no se sabe si a tiempos posteriores pos inoculación, se presenta un
aumento en los niveles de actividad en la variedad susceptible, asociado a la posible
activación de aquellos mecanismos de regulación postranscripcional previamente
mencionados para la variedad resistente. Estos deben ser objeto de estudio a futuro en
próximas investigación que permitan profundizar sobre dichas inquietudes y en general,
sobre el papel de esta enzima en los mecanismos de defensa del clavel.
b. Chalcona Sintasa CHS en raíces de clavel
Con respecto a los niveles de actividad chalcona sintasa (CHS), enzima asociada con la
biosíntesis de chalconas y flavonoides en tejidos vegetales (figura No. 31), se evidenció
un aumento estadísticamente significativo en raíces de la variedad resistente inoculada a
las 6 y 48 hpi, mientras que para la variedad susceptible, en ningún tiempo evaluado se
presentaron cambios significativos entre controles e inoculados. Estos resultados
evidencian que el aumento en los niveles de esta enzima están asociados con los
mecanismos de defensa que se activan en el clavel durante la infección con el patógeno,
tal y como ha sido encontrado para otras especies vegetales (Â. D. Campos et al. 2003).
163
31Figura No. 31. Niveles de actividad Chalcona sintasa en raíces de clavel durante el ensayo in vivo de inoculación con el patógeno Fod raza 2. Se presentan los resultados promedio de tres extracciones independientes para cada tratamiento. Las letras diferentes muestran tratamientos diferentes significativamente (α= 0,05)
Hasta este punto es importante anotar con respecto a este aumento en la actividad CHS
presente en raíces de clavel, que si bien es un fenómeno que habia sido asociado a
resistencia en diferentes modelos planta-patógeno (Dao et al. 2011), no había sido
estudiado en esta especie particular durante la interacción con patógenos. De acuerdo a
los resultados de la presente investigación, este aumento en la actividad enzimática debe
estar asociado con el aumento en metabolitos de tipo flavonoide descrito en apartes
previos de esta investigación; el aumento de esta enzima que se presentó a las 48 hpi,
probablemente generó la inducción de este tipo de metabolitos a las 96 hpi en esta
variedad (figura No. 15). Asi mismo, el aumento que se presentó a las 6hpi en el
contenido de flavonoides totales, debe tambien estar asociado con los niveles de
actividad para esta enzima.
Estos resultados evidencian el papel que tiene la chalcona sintasa en los mecanismos de
defensa activa de la planta y generan inquietudes respecto a como se regulan sus formas
activas a nivel de las raíces de clavel. Con el fin de indagar sobre estos procesos, en los
mismos tiempos posinoculación se determinaron los niveles de mRNA para los genes
codificantes de esta enzima, tal y como se describió en la metodología 3.2.8. (figura No.
32)
0
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40
60
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Tiempo posinoculación
164
32Figura No. 32. Niveles transcripcionales para genes codificantes para la enzima CHS en raíces de clavel durante el ensayo in vivo de inoculación con el patógeno Fod raza 2. Variedad resistente L.P. Candy cuantificación absoluta (A) y relación inoculado/ control (B). Variedad susceptible Tasman cuantificación absoluta (C) y relación inoculado/ control (D). Se presentan los resultados promedio de tres extracciones independientes para cada tratamiento. Las letras diferentes muestran tratamientos diferentes significativamente (α= 0,05). El análisis estadístico para la relación inoculado/control se realizó entre los diferentes valores encontrados para los diferentes tiempos
Como parte de estos resultados (Fig 32 B y D), se pudo determinar que la inoculación
con el patógeno genera un aumento significativo para las dos variedades, siendo mas
temprano y superior para el caso de la variedad resistente (12 y 24hpi) al comparar con
la variedad susceptible (24hpi). Este aumento en los niveles de mRNA para esta enzima
muestra que la expresión diferencial de estos genes está asociada con la resistencia.
Resultado similar se reportó para otras especies vegetales como palma (Arfaoui et al.
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50
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Tiempo posinoculación Tiempo posinoculación
A
D C
B
165
2007), soya (Upchurch & Ramirez 2010), Uva (Louime et al. 2011), almatruz amarillo
(Morkunas et al. 2011), arroz (Hao et al. 2009), lino (Kamil Kostyn et al. 2012), algodón
(Y. Cui et al. 2000). Asi mismo, dentro de estos reportes se encuentra que la expresión
de los genes que codifican para esta enzima, está asociada a resistencia a patógenos del
género fusarium como Fusarium oxysporum f. sp. ciceris (Arfaoui et al. 2007), Fusarium
oxysporum f. sp. lupini (Morkunas et al. 2011) y Fusarium oxsyporum sp. lini (Kamil
Kostyn et al. 2012).
Para el caso de la variedad susceptible, se presentó un aumento en los niveles de mRNA
para esta enzima con respecto al control no inoculado de 3 veces a las 24 hpi (figura No.
32 D). Este aumento evidencia que la correcta regulación temporal de la transcripción de
estos genes está asociada con resistencia; un aumento a dicho tiempo de 3 veces con
respecto al control, se constituiría como una respuesta tardía que puede no ser eficiente
en el momento de responder a la infección del patógeno. Considerando estos resultados
y la evidencia encontrada en otros modelos (Arfaoui et al. 2007; Morkunas et al. 2011;
Kamil Kostyn et al. 2012), es probable que la activación transcripcional de estos genes
haga parte de la defensa basal de la planta de clavel, activada por moléculas señal que
se encuentran en este patógeno y que haria parte de los mecanismos de defensa
determinantes en este modelo. Esta propuesta estaria de acuerdo con la conocida
naturaleza poligenica para la resistencia a la raza 2 de este patógeno en el clavel
(Baayen et al. 1991).
Al comparar los niveles de actividad y transcripcionales de la variedad resistente, se
evidencia que el aumento presentado en los niveles transcripcionales a las 12 y 24 hpi
(figura No. 32), debe estar asociado al aumento en los niveles de actividad enzimática
observados a las 48 hpi (figura No. 31). Estos resultados indican que tal y como ha sido
reportado para otras plantas (Lozovaya 2007, Naoumkina 2010, Wang et al 2010), en el
clavel una parte de la regulación de esta enzima se lleva a cabo a nivel transcripcional.
Sin embargo, considerando el importante aumento en los niveles de actividad de esta
enzima a las 6 hpi en las raíces de las plantas resistentes, que no está correlacionado
con un aumento en los niveles de mRNA a este mismo tiempo, es evidente que a este
tiempo posinoculación deben existir otros mecanismos de regulación que determinen
finalmente el aumento en la actividad de esta enzima en las raíces de la planta.
166
Al respecto, se ha citado que los mecanismos de regulación de esta enzima tambien se
pueden presentar a nivel postranscripcional (Dao et al. 2011). Por ejemplo, se ha
encontrado que altos niveles de flavonoides pueden inhibir la actividad chalcona sintasa
en centeno (A. Peters et al. 1988) y zanahoria (Hinderer & H. U. Seitz 1985) y no se
puede descartar por tanto una regulación por retroinhibición por producto (feedback) a
nivel citoplasmático, compartimento celular donde se encuentra esta enzima (Saslowsky
& Winkel-shirley 2001). Con esta evidencia se propuso que cambios en los niveles
citoplasmáticos de estos metabolitos pueden afectar la actividad de esta enzima y que
por tanto una disminución en los niveles de los mismos, podría estar activando esta
enzima. Esto podría ser extrapolado a las 6 hpi para el clavel, cuando es probable que,
se presenten fenómenos que generen una disminución de estos compuestos a nivel del
citoplasma, como pueden ser la rápida exportación de este tipo de compuestos hacia el
apoplasto para actuar en los procesos de defensa contra el patógeno o hacia las
vacuolas donde estos metabolitos se acumulan generalmente en sus formas glicosiladas
(Miranda et al. 2007). El transporte de metabolitos mediante mecanismos de exportación
activa, ha generado particular interés en modelos que involucran patógenos del género
Fusarium y se ha encontrado que son determinantes en resistencia a este tipo de
patógenos en plantas como almatruz amarillo (Banasiak et al. 2013), maíz (Lanubile,
Bernardi, Battilani, et al. 2012) y banana (Paparu et al. 2013).
Es probable que estos fenómenos sean importantes también a nivel de la raíz en este
modelo, en donde se ha encontrado que una buena parte de la respuesta de defensa al
patógeno se presenta en los vasos del xilema y en el apoplasto de las células
parenquimáticas adyacentes (Higuera & Ebrahim-Nesbat 1999) y en donde a este tiempo
posinoculación, hay un aumento en los niveles del compuestos glicosilado F2, el cual
teniendo en cuenta estas consideraciones puede ser acumulado en las vacuolas de la
planta o ser exportado fuera de la célula para su acción contra el patógeno.
Se puede deducir por tanto, que es probable que el aumento en los niveles de
flavonoides totales presentes en este órgano durante la infección con el patógeno a las 6
hpi (figura No. 15 B), esté asociado a metabolitos que se encuentran en el apoplasto y en
las vacuolas que han sido transportados por los mecanismos previamente mencionados.
Sin embargo, es importante realizar nuevos estudios encaminados a evaluar la
localización de estos metabolitos en las primeras horas de la interacción y confirmar
167
evidencia experimental que permita conocer mas sobre estos procesos se llevan a cabo
en el clavel.
c. Chalcona Isomerasa en raíces de clavel
Diferentes estudios han sugerido que las enzimas de la biosíntesis de flavonoides se
encuentran asociadas entre ellas como complejos multienzimáticos (Winkel-shirley 2001;
Saslowsky & Winkel-shirley 2001) y que su regulación a nivel transcripcional se lleva a
cabo de manera conjunta en la célula vegetal. Es por ello que en el presente estudio se
quiso evaluar si el comportamiento encontrado para la enzima CHS en raíces del clavel
de la variedad resistente, se podía extrapolar para el caso de la CHI. Se determinó que
esta última enzima presenta un aumento significativo (α = 0,05) en sus niveles de
actividad a las 48 hpi para la variedad resistente inoculada con respecto a su control no
inoculado, mientras que en la variedad susceptible controles e inoculados no varían a
ningún tiempo (figura No. 33). Esto evidencia el papel de esta enzima en los mecanismos
de defensa que se activan en las raíces de la variedad resistente. De acuerdo a los
resultados es probable que este papel en defensa esté asociado al que se encontró para
la enzima CHS y se constituye como la primera evidencia sobre la pobable regulación
conjunta que tienen estas enzimas en el clavel durante la interacción con patógenos.
33Figura No. 33. Niveles de actividad chalcona isomerasa en raíces de clavel durante el ensayo in vivo de inoculación con el patógeno Fod raza 2. Se presentan los resultados promedio de tres extracciones independientes para cada tratamiento. Las letras diferentes muestran tratamientos diferentes significativamente (α= 0,05)
0
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1500
2000
2500
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0 h 6 h 12 h 24 h 48 h 96 h
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Resistente Control Resistente Inoculado
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a
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a
b
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a
a
a a
a a
Tiempo posinoculación
168
La participación de la enzima CHI en los mecanismos de defensa del clavel a nivel de la
raíz, coincide con lo encontrado en otros reportes para otras especies vegetales (Fofana
et al. 2002; Morkunas et al. 2011). En el clavel, considerando los tiempos de inducción
encontrados para las actividades enzimáticas CHS y CHI (48 hpi), es probable que estas
participen en conjunto para generar el aumento en los niveles de compuestos flavonoides
a tiempos más tardíos (96 hpi). Teniendo en cuenta la diferencia en los tiempos de
inducción (48 hpi para las enzimas y 96 hpi para los metabolitos) y la naturaleza
glicosilada de los metabolitos de tipo flavonoide que se inducen en este órgano de la
planta (Por ejemplo, compuesto F2: Kaemferido 3-O-β-D–glucopiranosil (1→2)-O--L-
ramnopiranosil-(1→6)- β-D –glucopiranosido), es probable que estas enzimas participen
en la síntesis de la estructura básica de los flavonoides y que posteriormente, a tiempos
entre 48 y 96hpi, se presente la acción de enzimas como la flavonol sintasa o la glicosil
transferasa, que permitan la biosíntesis final de los metabolitos que tienen un papel en la
defensa de la planta. Acumulación de estas enzimas son parte importante de la
respuesta ante diferentes condiciones de estrés en otras especies vegetales (Miranda et
al. 2007; Päsold et al. 2010).
Este efecto se evidencia también cuando se analizan los resultados obtenidos a nivel
transcripcional para esta enzima (figura No. 34), en donde al igual que en el caso de las
enzimas PAL y CHS, el proceso inoculación, tanto en controles como inoculados, genera
un aumento significativo en los niveles de mRNA. De manera similar se presentó un
aumento a las 48 hpi, en los niveles de mRNA (No. de copias/ pg cDNA) para estas
mismas enzimas por efecto de las condiciones ambientales (Gráficas A y C de las figuras
No. 30, 32 y 34), indicando que posiblemente en clavel, para los tres casos se comparten
los mecanismos que regulan el proceso de transcripción, tal y como ha sido ampliamente
reportado en otras especies vegetales (Vom Endt et al. 2002; Dubos et al. 2010;
Czemmel et al. 2012).
Al respecto se conoce que la expresión de estos genes está regulada de manera directa
por una combinación de dos distintas familias de factores de transcripción, que presentan
homología a la proteína codificada por el proto-oncogen c-MYB y la proteína básica-
Hélice-Bucle-Hélice (bHLH por sus siglas en inglés basic-Helix-Loop-Helix) codificada por
el proto-onco gen c-MYC (Vom Endt et al. 2002), los cuales se unen a secuencias
promotoras comunes en los genes que codifican para esas proteínas. Se ha reportado
169
que los niveles de estos factores de transcripción pueden estar estimulados por
diferentes condiciones como respuesta a la luz, radiación UV, tratamiento con elicitores y
heridas (J. Zhao et al. 2005; C.-Q. Yang et al. 2012). Considerando que el papel de
dichos factores de transcripción ha sido reportado en diferentes especies como tabaco
(Gális et al. 2006), Arabidopsis thaliana (Dubos et al. 2010), uva (Czemmel et al. 2012),
té Camellia sinensis (Dongqing Yang et al. 2012), Medicago truncatula (Verdier et al.
2011), su acción puede tratarse de un mecanismo altamente conservado en plantas
vasculares, y puede ser probablemente extrapolado al clavel.
34Figura No. 34. Niveles transcripcionales para genes codificantes para la enzima CHI en raíces de clavel durante el ensayo in vivo de inoculación con el patógeno Fod raza 2. Variedad resistente L.P. Candy cuantificación absoluta (A) y relación inoculado/ control (B). Variedad susceptible Tasman cuantificación absoluta (C) y relación inoculado/ control (D). Se presentan los resultados promedio de tres extracciones independientes para cada tratamiento. Las letras diferentes muestran tratamientos diferentes significativamente (α= 0,05). El análisis estadístico para la relación inoculado/control se realizo entre los diferentes valores encontrados para los diferentes tiempos
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2
4
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8
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0 6 12 24 48 96
Rela
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SUSCEPTIBLE CONTROL
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ab
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a
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a
Tiempo posinoculación Tiempo posinoculación
A
D C
B
170
De esta manera, es probable que durante el ensayo in vivo, cambios en las condiciones
ambientales pueden afectar los niveles de dichos factores de transcripción y generar un
cambio en los niveles de transcripción de manera simultánea, para estos tres grupos de
genes codificantes para PAL, CHS y CHI. Por otro lado, cuando se evalua el efecto que
tiene la inoculación con el patógeno en la variedad resistente sobre los niveles
transcripcionales para esta enzima, permite evidenciar que tal y como se presentó para la
enzima CHS, el aumento en los niveles de actividad a las 48 hpi, están probablemente
asociados a una regulación transcripcional a las 12 y 24 hpi (figura No. 34). Este
aumento por efecto de la inoculación por patógenos del género Fusarium en los niveles
de mRNA para estas enzimas, ha sido descrito para plantas como almatruz amarillo
(Morkunas et al. 2011) y Lino (Lorenc-Kukuła et al. 2007), indicando que la regulación
transcripcional para las mismas es un proceso asociado con resistencia a este tipo de
patógenos y corrobora, que dentro de los mecanismos asociados a la resistencia
poligenica descrita en el clavel, se encuentra un aumento en la biosíntesis para estos
metabolitos en los tiempos evaluados.
Estos resultados evidencian que asi como ha sido discutido para el estrés ambiental, la
inoculación con patógenos en esta planta, afecta la transcripción de los genes en estudio
(C.-Q. Yang et al. 2012; Ambawat et al. 2013), muy probablemente involucrando a los
factores de transcripción previamente citados. Por ejemplo, se ha encontrado que en
Sorgo (Sorghum spp.), mutaciones en el alelo que codifica para el factor de transcripción
de la familia cMYB, yellow seed 1, presenta una disminución importante en la
acumulación de cierta familia de flavonoides (3-deoxiantocianidinas) que actúan como
fitoalexinas durante la infección con Colletotrichum sublineolum (Boddu et al. 2005). Se
podría pensar por tanto que a las 12 y 24 hpi, en raíces de la variedad resistente
inoculada, un aumento en los niveles de estos factores de transcripción estimularía la
síntesis de mRNA y generaría acumulación de las enzimas CHS y CHI (48hpi) y
finalmente aumento en los niveles de flavonoides (96 hpi).
Es importante no olvidar que es probable que se presenten en este órgano de la planta,
otros mecanismos de regulación, como parece suceder a las 6 y 96 hpi para el caso de
las enzimas CHS y PAL respectivamente. Este panorama muestra la complejidad que
tienen los mecanismos moleculares asociados con la regulación de los niveles de los
171
metabolitos secundarios en plantas, ya que dependiendo del tipo de estrés al cual se
encuentre expuesta, ésta puede activar unos u otros mecanismos dependiendo de sus
necesidades. Es por ello que otras aproximaciones experimentales que permitan el
estudio conjunto de las respuestas ya sea a nivel transcriptómico o proteómico, se
constituyen en alternativas para encontrar esas otras proteínas que eventualmente
pueden estar involucradas en el fenómeno estudiado.
No se puede olvidar además, que una de las limitaciones que tiene este tipo de estudios,
es que al tratar de analizar un proceso dinámico con solo algunos tiempos del proceso,
se pierde información que puede ser de importancia cuando se presenta la activación de
la respuestas, en tiempos que no fueron evaluados. Es por ello que los resultados
encontrados a las 6 horas en términos de la acumulación de metabolitos, deben estar
asociados a cambios a tiempos más tempranos; la acumulación del compuesto F2 que
presentó un aumento significativo en la variedad resistente a este tiempo, debe estar
asociado a un aumento de su biosíntesis a tiempos más tempranos (menores a 6hpi), tal
y como se presentó en la acumulación de este metabolito a las 96hpi.
Con esta información se propone que el aumento en la actividad CHS a las 6 hpi y la
actividad CHI constitutiva, pueda explicar el aumento significativo que se presenta en los
niveles del compuesto F2 (Kaemferido 3-O-β-D–glucopiranosil (1→2)-O--L-
ramnopiranosil-(1→6)- β-D –glucopiranosido) en las raíces de la variedad resistente
inoculada. Además es probable que a este tiempo y posteriores (entre 6 y 12hpi) se
presente también la acumulación de compuestos de tipo chalcona, los cuales requieren
la acción de la enzima CHS, pero no de la CHI (figura No. 8). Se ha reportado que
dihidrochalconas aisladas de Piper septuplinervium presentan actividad antifúngica sobre
Fusarium oxsyporum f. sp. dianthi (Avila et al. 2011). La presencia de estos metabolitos
no puede ser descartada en raíces del clavel y eventualmente podría ser el “metabolito
probable flavonoide” F3, que presentó un aumento significativo a ese mismo tiempo
posinoculación.
En general, de acuerdo a los resultados encontrados hasta ese punto de la investigación
en raíces de clavel, se evidencia que un aumento en la biosíntesis de compuestos de tipo
flavonoide está asociada con la resistencia a la enfermedad y corrobora la hipótesis incial
planteada, sobre su participación en los mecanismos de defensa activa de la planta. Con
el fin de determinar si este mismo comportamiento se presenta en tallo, se evaluaron los
172
niveles de estas mismas enzimas, en los tiempos posinoculación planteados, tal y como
se describió en la sección de materiales y métodos (3.2.7)
En esta parte de la investigación se quería complementar el panorama con respecto al
comportamiento de las enzimas asociadas a la biosíntesis de flavonoides en clavel y su
relación con resistencia al marchitamiento vascular en tallo. De esta forma, tal y como se
describió en raíces, se evaluaron los niveles de actividad en los tratamientos propuestos
en tallo y si era el caso, se determinaron los niveles transcripcionales correspondientes.
d. Actividad fenilalanina amonio liasa en tallos de clavel
Para el caso de la enzima PAL, en los tiempos 6 y 12 hpi, si bien se presentó un aumento
significativo en la variedad resistente inoculada (T2) cuando se compara con respecto al
tratamiento control (T1) en un análisis pareado (solamente estos dos tratamientos)
(α=0,05), al realizar el análisis estadístico con los tratamientos de la variedad susceptible
(T3 y T4), los 4 tratamientos resultaron ser estadísticamente similares. De esta manera,
no se evidencia una relación entre los niveles de esta enzima y la resistencia a la
enfermedad marchitamiento vascular (figura No. 35).
Estos resultados están de acuerdo con estudios previos en los que se demostró que en
este órgano de la planta no se encuentra una relación entre los niveles de esta enzima y
resistencia (Ardila et al. 2007; Ardila et al. 2011). Con estos resultados no se puede
descartar que a tiempos mas tardíos, se pueda presentar un aumento en la actividad de
esta enzima con el fin de suministrar los compuestos fenólicos que se requieren para la
biosíntesis de metabolitos de tipo fitoalexina, que a tiempos mas tardíos (2 semanas), se
acumulan en este órgano de la planta (Van Peer et al. 1990; Niemann et al. 1992). Al
respecto, no se debe olvidar que el objetivo de este estudio, era determinar los cambios
que se presentan a tiempos tempranos solamente, donde se activan los procesos más
determinantes en la expresión de resistencia para este tipo de patógenos (Beckman
2000; Mandal et al. 2008; Morkunas et al. 2011; Van Pelt-Heerschap & Smit-Bakker
1999).
Asi mismo, es importante recordar que el patógeno se encuentra en los tejidos
vasculares de la planta y que la evaluación se realizó en todo el tallo, es probable que si
el aumento que se presenta por efecto de la inoculación no es muy alto, como parece
suceder a las 6 y 12 hpi, se puede presentar una “dilución” de la respuesta considerando
173
que la extracción se realiza usando tallos completos que incluyen corteza, epidermis y
endodermis. Sin embargo, bajo las condiciones del presente estudio, las cuales tambien
han sido frecuentemente usadas para el análisis de esta enzima en otras especies
vegetales (Mandal & Mitra 2007; Seelakshmri & R. Sharma 2008; Forlani 2010), no se
encontró un aumento en la actividad PAL que permitiera asociarla con resistencia, al
menos en los tiempos tempranos evaluados. Considerando este resultado, no fue de
interés para este estudio, realizar una evaluación de los niveles transcripcionales para
esta enzima en los tiempos evaluados. Al respecto es importante comentar, que estudios
previos al respecto realizados usando la técnica de RT-PCR semicuantitativo, no
generaron resultados que asociaran los niveles de mRNA para esta enzima con
resistencia (Ardila et al. 2011).
35Figura No. 35. Niveles de actividad fenilalanina amonio liasa en tallos de clavel durante el ensayo in vivo de inoculación con el patógeno Fod raza 2. Se presentan los resultados promedio de tres extracciones independientes para cada tratamiento. Las letras diferentes muestran tratamientos diferentes significativamente (α= 0,05)
e. Niveles de chalcona sintasa en tallos de clavel
Con respecto a los niveles de la enzima chalcona sintasa, se determinó que al contrario
de lo encontrado en raíz, la infección con el patógeno no generó cambios
estadísticamente significativos en la variedad resistente inoculada a tiempos de
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a
b
a
Tiempo posinoculación
174
inoculación tempranos (Fig 36). A pesar de esto, es interesante resaltar que a las 96 hpi,
se encontró que esta enzima aumenta en la variedad resistente inoculada con respecto al
control correspondiente, pero los niveles asociados a dicho aumento, no varian
estadísticamente con respecto a la variedad susceptible control. Considerando que era
de interés para el presente estudio, solo aquellas respuestas asociadas con resistencia,
dicho aumento indicaba que no había relación en los niveles de actividad en este órgano
y la resistencia a la enfermedad. No hay que olvidar que la comparación con los niveles
de la variedad susceptible, son el punto de referencia con el fin de determinar si una
respuesta en la variedad L.P candy está asociada o no con la resistencia a la
enfermedad.
36Figura No. 36. Niveles de actividad chalcona sintasa en tallos de clavel durante el ensayo in vivo de inoculación con el patógeno Fod raza 2. Se presentan los resultados promedio de tres extracciones independientes para cada tratamiento. Las letras diferentes muestran tratamientos diferentes significativamente (α= 0,05)
Sin embargo, el significativo aumento con respecto al control en esta variedad resistente,
indicaba que era probable que la actividad de esta enzima aumentara sus niveles por
efecto de la inoculación con el patógeno y que los niveles estadísticamente iguales en la
variedad susceptible control, podrian estar asociados a alguna condición ambiental
externa que de manera particular estaria afectando los niveles de esta enzima en dicha
variedad.
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No
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A
RESISTENTECONTROL
RESISTENTEINOCULADO
Es por ello que, con el fin de determinar si existía un aumento en los niveles de
transcripción que estuviesen asociados a los cambios en la actividad enzimática
encontrados, se deteminaron los niveles de mRNA tal y como había sido realizado a nivel
de la raíz previamente; diferencias en los niveles de mRNA para esta enzima en la
variedad resistente inoculada, ratifican que el aumento que se encontró estaba asociado
con la resistencia a la enfermedad (figura No. 37).
37Figura No. 37. Niveles transcripcionales para genes codificantes para la enzima CHS en tallos de clavel durante el ensayo in vivo de inoculación con el patógeno Fod raza 2. Variedad resistente L.P. Candy cuantificación absoluta (A) y relación inoculado/ control (B). Variedad susceptible Tasman cuantificación absoluta (C) y relación inoculado/ control (D). Se presentan los resultados promedio de tres extracciones independientes para cada tratamiento. Las letras diferentes muestran tratamientos diferentes significativamente (α= 0,05). El análisis estadístico para la relación inoculado/control se realizo entre los diferentes valores encontrados para los diferentes tiempos
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Tiempo posinoculación Tiempo posinoculación
A
B A
D C
B
176
Al respecto se determinó que la inoculación con el patógeno, efectivamente generó un
aumento en los niveles de mRNA para la enzima chalcona sintasa en la variedad
resistente inoculada a las 24 y 96 hpi, y que el aumento en los niveles de actividad a este
último tiempo efectivamente estaban asociados con resistencia al patógeno. Resultados
similares han sido reportados por otros autores en otros modelos vasculares como
Fusarium oxysporum f. sp. ciceris (Arfaoui et al. 2007), Fusarium oxysporum f. sp. lupini
(Morkunas et al. 2011) y Fusarium oxsyporum sp. lini (Kamil Kostyn et al. 2012).
f. Niveles de chalcona isomerasa en tallos
Por otro lado durante la evaluación de los niveles de actividad CHI en tallos de la planta
(figura No. 38), se determinó que en ningun tiempo posinoculación, se presentó un
aumento para los tratamientos sometidos a inoculación. De esta manera, se encontró
que en este órgano, al menos en los tiempos evaluados, no se presenta un aumento en
los niveles de ésta enzima asociado a la resistencia de la planta. Bajo esta
consideración, tambien se descartó evaluar los niveles transcripcionales para esta
enzima, en los tiempos posinoculación propuestos en este estudio.
De acuerdo a estos resultados, se evidencia que en este órgano de la planta, el aumento
en los niveles de flavonoides a 96 hpi, está asociado a un aumento en los niveles de la
enzima CHS, pero no de la CHI. Sin embargo, la acción de esta última enzima no se
puede descartar siendo probable que la reacción de isomerización del compuesto tipo
chalcona que se genera por acción de la CHS en este órgano de la planta, se presente
enzimáticamente por acción de la actividad CHI que se encuentra de manera constitutiva.
Otra posibilidad es que en los tiempos en donde no se realizaron muestreos, es decir
entre 24 y 48 hpi o entre 48 y 96 hpi, se presente un aumento en la actividad de esta
enzima que no pudo ser evaluada y que está asociada con el aumento de los niveles de
estos metabolitos a las 96 hpi.
Otra posibilidad para justificar este aumento en los niveles de la enzima CHS, puede ser
que tal y como se propuso en raíces a las 6 hpi, la inoculación con el patógeno en la
variedad resistente estimule la biosíntesis de metabolitos de tipo chalcona, los cuales tal
y como se discutió previamente, pueden ser potenciales actores de la respuesta de la
planta (Avila et al. 2011). Estudios que permitan obtener mayor información estructural de
aquellos metabolitos que presentaron inducción diferencial en este órgano, como es el
177
caso del compuesto FT6, permitirán conocer más sobre los mecanismos de defensa que
se activan en tallos de clavel.
38Figura No. 38. Niveles de actividad chalcona isomerasa en tallos de clavel durante el ensayo in vivo de inoculación con el patógeno Fod raza 2. Se presentan los resultados promedio de tres extracciones independientes para cada tratamiento. Las letras diferentes muestran tratamientos diferentes significativamente (α= 0,05)
Considerando que el aumento en los niveles de compuestos fenólicos totales
encontrados a las 12 hpi en este órgano de la planta (figura No. 16) no se correlaciona
con un aumento en los niveles para ninguna de las enzimas evaluadas, es probable que
otros procesos que no involucran la síntesis de fenilpropanoides determinen este
aumento en este tiempo posinoculación. Se ha reportado que la liberación de metabolitos
a partir de compuestos glicosilados por acción de la acción de diferentes enzimas de tipo
glicosidasas pueden presentarse durante la interacción con patógenos a tiempos
tempranos (Naoumkina et al. 2007).
En general, el presente estudio permitió demostrar que en tallos de clavel, la biosíntesis
de los flavonoides se presenta tambien, como parte de la respuesta de defensa vegetal al
patógeno causal del marchitamiento vascular. Sin embargo, es necesario realizar nuevas
investigaciones que permitan determinar como se comportan especificamente estas
enzimas en los tejidos vasculares de la planta, tal y como ha sido propuesto para otras
enzimas por (Van Pelt-Heerschap & Smit-Bakker 1999). Esta aproximación permitiría
determinar cómo se lleva a cabo la respuesta de la planta de manera amplificada, ya que
es probable que la presencia de la epidermis, corteza y endondermis de los tallos, tejidos
0
200
400
600
800
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0 h 6 h 12 h 24 h 48 h 96 h
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Resistente Control Resistente Inoculado
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a
a a
Tiempo posinoculación
178
que no coloniza el patógeno y se constituyen como la mayor parte de la masa de los
tallos de la planta, diluyan la respuesta evitando que se evidencien cambios
estadísticamente significativos entre tratamientos de interés. A pesar de esto, es
evidente que el aumento de los niveles de flavonoides a nivel del tallo a las 96hpi, está
asociado, tal y como fue encontrado en raíz, a un aumento en su biosíntesis
acompañado con cambios a nivel enzimático y transcripcional para la enzima CHS.
En general, la evidencia que se encontró con respecto a la regulación transcripcional y
postranscripcional para estas enzimas en el clavel, muestra la complejidad de los
procesos que están implicados en la activación de las respuestas de defensa a Fod.
Estas a su vez, deben estar determinadas por fenómenos como el reconocimiento y
posterior señalización, específicos para este patógeno, asi como ha sido sugerido para
las diferentes formas especiales de Fusarium oxysporum (Berrocal-Lobo & Molina 2008).
Con el fin de aportar al estudio particular de estos procesos de reconocimiento y
señalización que están asociados a la activación de la biosíntesis de flavonoides, en la
próxima etapa de esta investigación, se estudiaron los niveles de una especie altamente
reactiva de oxigeno como es el peróxido de hidrógeno. Esta especie altamente oxidante,
involucrada en muchos procesos a nivel celular, ha sido asociada a la activación de
factores de transcripción MYB. Estos a su vez, tal y como se citó previamente, estimulan
la transcripción de genes de las enzimas PAL, CHS y CHI, siendo por tanto reguladores
positivos de la biosíntesis de flavonoides en estados de estrés en otras especies
vegetales (Agati et al. 2012). A su vez, teniendo en cuenta la conocida capacidad
antioxidante de estos metabolitos, cambios en sus niveles pueden tambien afectar las
especies reactivas de oxígeno (EROs) y finalmente determinar un ambiente redox
adecuado para el funcionamiento celular.
Con el fin de conocer más sobre el papel de estos metabolitos en la interacción clavel-
Fusarium oxysporum f. sp dianthi, en la siguiente fase de la investigación se presenta
una comparación de los niveles de peróxido de hidrógeno, con los niveles de estos
metabolitos y su posible relación con otros mecanismos de regulación antioxidante como
el que involucra enzimas del tipo peroxidasas como lo son la guayacol peroxidasa GPX y
la ascorbato peroxidasa APX.
179
3.4. Conclusiones
Los resultados que se presentan en esta investigación constituyen el primer reporte
conocido acerca de la relación entre la biosíntesis de compuestos flavonoides a nivel
enzimático y transcripcional con los mecanismos de defensa activa del clavel a Fusarium
oxysporum f. sp. dianthi, encontrándose que la regulación espacio-temporal de esta ruta
biosintética está asociada con resistencia al marchitamiento vascular
El presente estudio permitió deteminar que las variedades de clavel resistente (L.P.
Candy) y susceptible (Tasman), presentan diferencias en términos de la activación de la
biosíntesis de flavonoides durante la infección con el agente causal del marchitamiento
vascular tanto a nivel del tallo, como de la raíz
La inoculación con el patógeno generó un cambio en los niveles de compuestos fenólicos
y flavonoides totales a las 6,12 y 96 hpi en raíces y 12 y 96 hpi en tallos de la variedad
resistente, indicando que la activación de la respuesta de defensa activa incluye una
regulación espacio-temporalmente coordinada de la acumulación de estos metabolitos en
el clavel.
El aumento en los niveles de actividad antioxidante en raíces de la variedad resistente a
las 6,12, y 96 hpi y en tallos a las 96 hpi, está al parecer asociado a la acumulación
observada de flavonoides durante los tiempos posinoculación evaluados.
El análisis estadístico multivariado de los datos obtenidos por HPLC evidenció diferencias
cuantitativas y cualitativas en los perfiles obtenidos para extractos de raíces de las dos
variedades de clavel en los diferentes tiempos posinoculación evaluados, indicando que
las condiciones ambientales y el genotipo involucrado, afectan en mayor proporción los
niveles de los metabolitos separados. Con respecto a la inoculación con el patógeno se
encontraron al menos 4 compuestos a nivel de la raíz (Grupo I) y 2 compuestos en el
tallo (Grupo II), que aumentan sus niveles significativamente en la variedad altamente
resistente L.P. Candy.
180
La aproximación a la estructura química de al menos un compuesto de los grupos I y II,
permitió determinar que éstos poseen estructura de tipo flavonoide. Dentro del grupo I, el
compuesto F2 es probablemente el kaemferido 3-O-β-D –glucopiranosil (1→2)-O--L-
ramnopiranosil-(1→6)- β-D–glucopiranosido y el compuesto FT6 del grupo II,
corresponde probablemente al kaemferol 3-O-β-D –glucopiranosil (1→2)-O--L-
ramnopiranosil-(1→6)- β-D–glucopiranosido.
Un aumento en los niveles de actividad enzimática fenilalanina amonio liasa (96hpi),
chalcona sintasa (6 y 48 hpi) y chalcona isomerasa (48 hpi), en raíces de la variedad
resistente L.P. Candy, evidencian la participación de estas enzimas del metabolismo
fenilpropaonoide en los mecanismos de defensa que se activan en este órgano de las
plantas de clavel durante la inoculación con Fod.
Un aumento en los niveles del mRNA para las enzimas CHS y CHI, por efecto de la
inoculación con el patógeno a las 12 y 24 hpi, a nivel de la raíz en la variedad resistente,
indica una relación entre la resistencia a la enfermedad y la estimulación de la
transcripción de los genes que codifican dichas enzimas.
Existe relación entre los niveles de metabolitos (fenoles totales, flavonoides totales y
actividad antioxidante) a las 96hpi y los niveles de enzimas CHS y CHI (actividad y
niveles de mRNA) a las 48 hpi en raíces, indicando que el aumento en los metabolitos
por efecto de la inoculación con el patógeno, puede estar ocasionado por el aumento en
los niveles de las enzimas, mientras que a nivel del tallo la inoculación con el patógeno
no generó aumentos significativos en los niveles de actividad de las enzimas PAL y CHI
en tallos, indicando que estas no están asociadas con el aumento de metabolitos descrito
para este órgano a las 12 y 96 hpi.
En la variedad resistente L.P. Candy se presentó a nivel del tallo un aumento en los
niveles de actividad enzimática CHS y de mRNA por efecto de la inoculación del
patógeno, indicando que una estimulación de esta enzima, está asociada con el aumento
de metabolitos (96hpi) y con la resistencia al marchitamiento vascular.
181
4. Evidencias bioquímicas y moleculares de la participación de peroxidasas en la resistencia del clavel (Dianthus caryophyllus L) a Fusarium oxysporum f. sp. dianthi
Resumen
Esquejes de dos variedades de clavel (Dianthus caryophyllus L) con respuesta diferencial
al marchitamiento vascular causado por Fusarium oxysporum f. sp. dianthi (Fod), fueron
inoculados con este patógeno y comparados los niveles de peróxido de hidrógeno,
actividad guayacol peroxidasa (GPX) y ascorbato peroxidasa (APX). A nivel de la raíz, se
presentó un aumento significativo a las 6, 24, 48 y 96 hpi en los niveles de peróxido de
hidrógeno en la variedad resistente (L.P Candy), mientras que los niveles de las enzimas
APX y GPX, permanecieron constantes durante los tiempos evaluados. A nivel del tallo,
se presentó un aumento significativo en la actividad GPX a las 12, 24 y 48 horas
posinoculación (hpi), mientras que en la variedad susceptible (Tasman), se evidenció
solo un ligero aumento a un tiempo mayor (96 hpi). Los niveles de peróxido de hidrógeno
en la variedad resistente aumentaron a las 12 y 24 hpi en este órgano, mostrando
correlación (α=0.05) con los aumentos en los niveles de actividad GPX. Los niveles de la
enzima APX permanecieron constantes durante estos tiempos posinoculación. Para la
variedad susceptible se observó en tallo, un aumento en contenido de peróxido de
hidrógeno a las 12 hpi que no mostró correlación con los niveles de actividad enzimática
GPX. Los contenidos de lignina no cambiaron durante los tiempos evaluados y por tanto
no se pudieron asociar a la actividad GPX en etapas tempranas de la interacción a nivel
del tallo. Mediante zimogramas se determinó que el aumento en la actividad GPX en
182
tallos de la variedad resistente se debe al aumento en los niveles de isoformas
constitutivas, como es el caso de una peroxidasa con un pI de 6.9, y no a la generación
de nuevas isoformas. La cuantificación absoluta de los niveles transcripcionales de la
peroxidasa de clase III, Dcprx02, indicó que en la variedad resistente, los niveles de
mRNA aumentaron casi 8 veces con respecto al control a las 6 hpi, comparado con la
variedad susceptible en la que solo hubo un aumento cercano a dos veces, a 12 hpi. Se
pudo determinar que el aumento en los niveles de peróxido de hidrógeno, está
correlacionado con el aumento en los niveles transcripcionales de Dcprx02. Diferencias
en la regulación temporal de las variables evaluadas durante la infección, permiten
postular que la producción de especies reactivas de oxígeno (EROs) y su posterior
regulación mediada por la acción de enzimas antioxidantes como GPX, son relevantes en
la resistencia al agente causal del marchitamiento vascular.
Abstract
Roted cuttings of two carnation (Dianthus caryophyllus L) cultivars with differential
response to vascular wilt caused by Fusarium oxysporum f. sp. dianthi (Fod), were
inoculated and the levels of hydrogen peroxide, guaiacol peroxidase (GPX) and ascorbate
peroxidase (APX) activities evaluated. At root level, it showed a significant increase in the
levels of hydrogen peroxide in the resistant variety (LP Candy) inoculated at 6, 24, 48 and
96 hpi, whereas the levels of enzymes GPX and APX were constant over the times
studied. At stem level instead, it showed a significant increase in GPX activity at 12, 24
and 48 hours post-inoculation (hpi), whereas the susceptible variety (Tasman), showed
only a slight increase to a longer time (96 hpi). The levels of hydrogen peroxide in the
resistant variety increased to 12 and 24 hpi, showing correlation (α = 0.05) with GPX
activity levels. The APX enzyme levels remained constant during these times after
inoculation. Stems of the susceptible cultivar showed an increase in hydrogen peroxide
content at 12 hpi which showed no correlation with the GPX enzymatic activity levels.
Lignin content did not change during the days tested, and are therefore not able to
associate the GPX activity in early stages of interaction in this organ. By zymograms was
determined that the increased GPX activity in the resistant variety, is due to increased
levels of constitutive isoforms, as is the case of a peroxidase with a pI of 6.9, rather than
the generation of new isoforms. The absolute quantification of transcriptional levels of
183
class III peroxidase, Dcprx02, indicated that in the resistant variety, their mRNA levels
increased almost 8-fold over control at 6 hpi compared with the susceptible variety in
which there was only one increased nearly twice, and 12 hpi. It was determined that the
increased levels of hydrogen peroxide are correlated with increased transcriptional levels
Dcprx02. Differences in the temporal regulation during infection assessed variables allow
production postulate that reactive oxygen species (ROS) and subsequent regulation
mediated by the action of antioxidant enzymes such as GPX are relevant in resistance to
the causal agent of wilt vascular.
4.1. Introducción
Se ha generado en los últimos años un particular interés en el desarrollo de nuevas
alternativas de control para el marchitamiento vascular causado por Fusarium oxyporum
f. sp. dianthi en el clavel (Dianthus caryophyllus L) (Borrero et al. 2008; Gryczka et al.
2010; Sant et al. 2010). Sin embargo, la poca información que se tiene sobre las bases
bioquímicas y moleculares de la resistencia a la enfermedad, ha generado un aparente
retraso al respecto. Algunos estudios en este sentido, han mostrado que las variedades
resistentes activan la biosíntesis de compuestos con actividad antifúngica directa sobre el
patógeno para afrontar la infección (Curir et al. 2003; Galeotti, Barile, Curir, et al. 2008;
Clematis et al. 2011), además de procesos de lignificación, suberización y localización de
material electrodenso (Higuera & Ebrahim-Nesbat, 1999; Niemann et al., 1991; Ouellette
et al., 2004; Trillas et al., 2000). En este proceso, inicialmente se presenta en los vasos
xilemáticos la formación de geles, compuestos principalmente de polisacáridos y de
compuestos fenólicos, exudados de las células parenquimáticas adyacentes al punto de
infección. Una vez estos compuestos se fusionan a la pared pueden presentar
reacciones de polimerización y oxidación, con el fin de formar una barrera durable en la
interfase de la infección y los tejidos sanos. En este tipo de respuestas, se ha propuesto
que la oxidación de compuestos fenólicos, catalizada por enzimas del tipo guayacol-
peroxidasas (GPX) y polifenoloxidasas (PFO), es fundamental en la expresión de
resistencia en plantas vasculares (Beckman 2000). Particularmente en el modelo clavel-
Fusarium, estas enzimas han generado interés en estudios previos, considerando que se
inducen de manera diferencial en variedades resistentes a la enfermedad durante la
infección por el patógeno (Ardila & Higuera 2005; Cuervo et al. 2009). En conjunto con
184
las ascorbato peroxidasas (APX), las GPX se han asociado a la regulación de especies
reactivas de oxígeno (EROs) en diferentes interacciones hospedero-patógeno (Sarowar
et al. 2005; Simonetti et al. 2010; Asano et al. 2012), incluyendo las que involucran
patógenos del género Fusarium (Morkunas & Gmerek 2007; Goswami & Punja 2008).
Las EROs están relacionadas con los procesos de reconocimiento, siendo fundamentales
en la activación transcripcional asociada a varias respuestas de defensa vegetal (Agati et
al. 2012; Barna et al. 2012). A pesar de la importancia de estas especies en señalización,
para modelos que involucran patógenos necrotróficos, los niveles de dichas especies
deben ser regulados por la misma planta considerando que si se mantienen altos en
etapas posteriores al reconocimiento, pueden causar muerte celular vegetal y ser una
ventaja para el patógeno (Hammerschmidt 2005; Barna et al. 2012; Mendoza 2011). Al
respecto, considerando que muchas de las GPX han sido localizadas en el apoplasto, su
papel ha estado asociado con la regulación de los niveles de peróxido de hidrógeno a
nivel extracelular, mientras que para el caso de las APX, es probable que su papel
regulatorio se presente principalmente a nivel intracelular considerando su ubicación
citoplasmática o en organelos como cloroplastos, mitocondrias y peroxisomas (Almagro
et al. 2009). En diferentes estudios se ha determinado que las peroxidasas de clase III,
en donde se clasifican las GPX, tienen relación con resistencia vegetal, considerando su
participación en lignificación (Marjamaa et al. 2009), en la generación de H2O2 durante su
interacción con patógenos (Bindschedler et al., 2006; Kawano, 2003), o por la capacidad
antioxidante asociada a la detoxificación del mismo durante el evento de interacción
(Tománková et al. 2006). Es probable que el aumento ya reportado en la actividad
peroxidasa durante la infección con Fod en el clavel (Cuervo et al. 2009), esté asociado
también a la regulación de alguno de estos fenómenos. Sin embargo, a la fecha no
existen estudios en clavel que permitan relacionar la actividad de la enzima GPX con
estos otros procesos asociados con resistencia, como puede ser la regulación de EROs.
Tampoco se ha profundizado sobre los puntos de regulación de las GPX en esta especie
vegetal, conocimiento necesario para la generación de alternativas que permitan
aumentar la actividad de esta enzima en plantas susceptibles, así como se ha realizado
en otras especies vegetales para aumentar la resistencia a patógenos (Schweizer 2008).
Actualmente en la base de datos Peroxibase (Bakalovic et al. 2006), se encuentran 6
secuencias de aminoácidos para peroxidasas de clase III para esta especie, deducidas
por traducción teórica de una base de datos de ESTs obtenida a partir de pétalos de
clavel (http://peroxibase.toulouse.inra.fr/). En general, un aumento en los niveles de
185
transcriptos de genes asociados a la defensa vegetal durante la interacción con
organismos patógenos del género Fusarium es un fenómeno documentado (Arfaoui et al.
2007; Desmond et al. 2008; Zhou & F. Wu 2009; Alessandra et al. 2010). Sin embargo,
considerando la acción de diferentes puntos de regulación de la expresión de genes en
plantas (Mackay et al. 2004), los estudios a nivel de las proteínas son necesarios para
validar estos resultados obtenidos a nivel transcriptomico. En el presente estudio se
evaluó la relación que existe entre la resistencia a la enfermedad marchitamiento
vascular y los niveles que se presentan por inoculación con Fod, de la actividad
enzimática GPX y APX. Así mismo, los niveles de estas se relacionaron con otros
parámetros como el contenido de peróxido de hidrógeno y de lignina, número de
isoformas y niveles transcripcionales de genes codificantes para peroxidasas de clase III
en el clavel. Un mayor conocimiento sobre los fenómenos que se activan de manera
coordinada durante la infección con el patógeno en este modelo, permitirá establecer
aquellos factores determinantes para la generación de nuevas alternativas de control
para el marchitamiento vascular.
4.2. Materiales y Métodos
4.2.1. Material biológico y ensayo in vivo
En esta parte de la investigación se determinaron los niveles constitutivos de actividad
APX y GPX, en tallos y raíces de las 9 variedades de clavel que fueron descritas en la
primera fase de esta investigación (Capitulo 2) y que presentaban diferentes niveles de
resistencia a Fod (Metodología 2.2.1). La evaluación de los niveles inducibles para estas
mismas enzimas se realizó en las variedades L.P Candy (Resistente) y Tasman
(Susceptible), en muestras provenientes del ensayo in vivo que se describe
detalladamente en el Capitulo 3 (3.2). El análisis de las diferentes enzimas, se realizó por
triplicado en los mismos tiempos posinoculación propuestos (0, 6, 12, 24, 48 y 96 hpi).
186
4.2.2. Extracción y determinación de las actividades Guayacol-peroxidasa (GPX) y Ascorbato-peroxidasa (APX)
La extracción y cuantificación de la actividad GPX se realizó de acuerdo con Mandal et.
al. (2008). Para ello se tomaron 0.2 g de tallos o raíces, los cuales fueron macerados
usando nitrógeno liquido y transferidos a un tubo Eppendorf. Sobre este macerado se
adicionó 1mL de buffer fosfatos 100 mM pH 7.0, 10 mM ácido ascórbico y se agitó
vigorosamente. Las muestras se centrifugaron a 4° C (30 min, 16000 g) y el extracto
enzimático se recuperó y se almacenó a -20°C para posteriores análisis. La
determinación de actividad peroxidasa (EC1.11.1.7) se realizó usando el seguimiento
espectrofotométrico a temperatura ambiente de la oxidación de guayacol a tetraguayacol.
La mezcla de reacción consistió en 100 µL de guayacol (Sigma ®) 20mM, 300 µL de
buffer ácido cítrico-citrato de sodio (Sigma ®) 100 mM pH 5.5, 100 µL de peróxido de
hidrógeno (Sigma ®) 40mM y 5 µL del extracto enzimático. Una vez realizada esta
mezcla, se siguió la oxidación del sustrato a 470 nm durante 2 min usando un
espectrofotómetro Thermo Genesys 10 UV. Los resultados se expresaron como micromol
guayacol consumidos/min* g material vegetal, tomando el promedio de tres repeticiones.
La extracción y determinación de la actividad APX (E.C. 1.11.1.11) se realizó de acuerdo
a Mandal (2008), con algunas modificaciones. En ensayos previos, se determinó que las
mejores condiciones de extracción de esta enzima en tallos y raíces de clavel, incluían el
tratamiento de 0.2 g de material vegetal previamente macerado con nitrógeno liquido, con
400 μL de acetona fría para eliminar compuestos interferentes (Ardila & Higuera 2005;
Ardila, S. T. Martinez, et al. 2013). Luego de someter el material a este tratamiento con
acetona por dos veces, se adicionó 1mL de buffer fosfatos 100 mM pH 7.0, 1 mM ácido
ascórbico y 1% (p/v) de PVPP (polivinil polipirrolidona). Luego de agitar vigorosamente,
las muestras se centrifugaron a 4° C (30 min, 16000 g) y el extracto enzimático se
recuperó y se almacenó a -20°C para posteriores análisis. La mezcla de reacción para la
determinación de la actividad, consistió en 100 µL de una solución de ácido ascórbico
(Sigma ®) 2,5 mM, 300 µL de buffer fosfatos 100 mM pH 7.0, 100 µL de peróxido de
hidrógeno (Sigma ®) 1,0 mM y 20 µL del extracto enzimático. Una vez realizada esta
mezcla, se siguió la oxidación del sustrato a 290 nm durante 2 min usando un
espectrofotómetro Thermo Genesys 10 UV. Los resultados se expresaron como
micromoles de ácido ascórbico consumidos/min* g material vegetal, tomando el
promedio de tres repeticiones.
187
4.2.3 Determinación de peróxido de hidrógeno
Se realizó de acuerdo al método reportado por Mandal S, et al. (2008). Tallos o raíces de
clavel fueron macerados con nitrógeno liquido y homogenizados con ácido tricloroacético
al 0.1% en una relación 1:10 (w/v). Se centrifugaron por 15 min a 12000 g a 40C. La
cuantificación se realizó mezclando 100 µL del sobrenadante con 200 µL de una solución
de yoduro de potasio (KI) 1M, dejando incubar por 5 min a temperatura ambiente, con el
fin de determinar la absorbancia del producto de oxidación a 390nm. La cantidad de
peróxido fue calculada por interpolación en una curva de calibración obtenida en las
mismas condiciones usando soluciones de concentraciones conocidas de H2O2: 1, 5, 10,
25, 50, 75, 100 micromolar. Los resultados se expresaron como pmol peróxido de
hidrógeno/ g material vegetal en base húmeda.
4.2.4. Determinación de lignina
La determinación de los niveles de lignina en tallos de clavel se realizó de acuerdo con el
procedimiento reportado por (Bruce & West 1989). Se usaron de 0.2 a 0.4 g de tallos de
clavel previamente macerados, a los que se adicionó 500 µL de etanol absoluto y se
centrifugó por 10 min a 5000 g. El precipitado se secó a 60 ºC durante 24 h, se pesaron
aproximadamente 5 mg de material vegetal seco y se re-suspendieron en 500 µL de HCl
2N y 50 µL de ácido tioglicólico. La mezcla se calentó durante 4 h a 92ºC. Una vez
enfriada a 4ºC durante 10 min, se centrifugó a 16000 g por 15 min. Los precipitados se
lavaron con 500 µL de agua desionizada, se les adicionó 500 µL de NaOH 0.5N y se
dejaron en agitación durante toda la noche a temperatura ambiente. El residuo insoluble
fue removido por centrifugación y el tioglicolato de lignina se precipitó por la adición de
500 µL de HCl concentrado y enfriamiento a 4ºC durante 3 h. Después de centrifugar a
16000g por 10 min, el residuo fue re-suspendido en 750 µL de NaOH 0.5N y finalmente
se hizo la lectura a 280 nm. El contenido de lignina se expresó en unidades de
absorbancia por mg de material vegetal seco.
4.2.5 Zimogramas de peroxidasas
La separación electroforética de las isoenzimas GPX se realizó por SDS-PAGE usando el
sistema vertical mini-gel (Thermo EC 120). El gel de resolución fue del 12% y el de
188
concentración del 5% (p/v). El buffer de corrido fue Tris-HCl 0.05M- Glicina 0.2M-SDS
0.1%, pH 8.3. En cada pozo se colocaron 20 µg de proteína (Bradford 1976) linealizado
por (Zor & Sellinger 1996), provenientes de los extractos previamente desalinizados y
concentrados usando el sistema Amicon ® Ultra-0.5mL 10KDa. La separación se realizó
a voltaje constante de 100V. La asignación de pesos moleculares se efectuó usando
patrones de peso molecular en el rango 6500-66000 Da (Marker Low range Sigma ®),
que fueron separados en el mismo gel pero teñidos usando Coomassie coloidal. La
tinción para evidenciar la presencia de las bandas con actividad peroxidasa se describe
posteriormente y se aplicó tanto para esta separación, como para la realizada por punto
isoeléctrico.
El isoelectroenfoque se realizó de acuerdo con las condiciones reportadas por Olmos, E.
et al. 1997, con algunas modificaciones, en geles de poliacrilamida al 5% preparados
usando 1.6 mL de una mezcla de acrilamida (30% (w/v) y 1% (w/v) bisacrilamida), 0.2 mL
de anfolitos Biorad ® de un rango 3-10 unidades de pH, 5.75 mL de agua dd, 50 µL de
persulfato de sodio al 10% (p/v) y 5 µL de TEMED. La mezcla se polimerizó en el
montaje de los vidrios del sistema electroforético Thermo EC Vertical mini-system. La
separación por isoelectroenfoque se realizó con un protocolo previo de
acondicionamiento a 100V por 1h. Luego de aplicar la muestra, la separación se realizó
por 1 h a 100V, 30 min a 200V, 1.5 h a 400 V y 30 min a 600V. Se usaron como
soluciones de corrido en el cátodo NaOH 20mM y en el ánodo CH3COOH 20mM. Para
cada pozo se colocaron 20 µg de proteína, provenientes de los extractos previamente
desalinizados y concentrados usando el sistema Amicon ® Ultra-0.5mL 10KDa. Con el fin
de realizar la asignación de pI, se usaron en cada uno de los geles los patrones IEF en el
rango de 3.6 a 9.3. La asignación de pI de las peroxidasas se realizó comparando con
una curva construida con la movilidad electroforética y el punto isoeléctrico de los
patrones.
La tinción específica de peroxidasas se llevó a cabo por inmersión del gel en una
solución de guayacol 20mM y peróxido de hidrógeno 40mM, preparada en el buffer ácido
cítrico-citrato de sodio 100mM pH 5.5. Se agitó suavemente hasta la aparición de bandas
y se tomó la imagen del gel usando la cámara Coolpix 8700 Nikon del Digimage System
de Major Science.
189
4.2.6. Niveles transcripcionales de peroxidasas de clase III
La evaluación de los niveles transcripcionales para los genes que codifican las
peroxidasas de clase III en tallos de clavel durante el ensayo in vivo, se llevó a cabo
usando el mismo procedimiento y condiciones de extracción de RNA y retrotranscripción
que se describen para el capítulo 3. Los niveles de transcripción de los genes
codificantes para las proteínas en clavel DcPrx01, DcPrx02, DcPrx03, DcPrx04 y
DcPrx05 (codificación de acuerdo a la base de datos http://peroxibase.toulouse.inra.fr/.)
fueron evaluados a las 12 hpi, por PCR en tiempo real mediante cuantificación relativa
con el método de 2-Ct (Wong & Medrano 2005), usando β-Actina como gen control
(Goswami & Punja 2008; Simonetti et al. 2010; Alessandra et al. 2010). Se confirmaron
los niveles de mRNA de la proteína DcPrx02 mediante cuantificación absoluta usando
SYBR ® Green MasterMix IQTM Biorad y usando como patrón, un plásmido con la
secuencia correspondiente del gen dcprx02. Con el fin de usar la misma cantidad de
cDNA en cada reacción (10 ng), se realizó cuantificación por fluorescencia (Qbit ®
Invitrogen). Los cebadores utilizados para la amplificación de los genes codificantes para
peroxidasas en clavel se citan en la tabla No. 21. El diseño de estos cebadores se realizó
usando el programa primer3 sobre aquellas secuencias de nucleótidos consignadas en el
ncbi (http://www.ncbi.nlm.nih.gov), que codifican para las peroxidasas de clase III
reportadas en la peroxibase (http://peroxibase.toulouse.inra.fr). La verificación del tamaño
de los fragmentos y la especificidad de la amplificación se realizó mediante electroforesis
en geles de agarosa al 1,5%. Las condiciones de amplificación para ambos casos
consistieron en una desnaturalización inicial a 95◦C durante 10 min, seguida de 35 ciclos
a 95◦C (15 s), 60◦C (20 s), 72oC (20s) y finalmente 72◦C (1 min). La cuantificación de los
niveles de mRNA de la proteína DcPrx02 se realizó mediante el método de la curva
estándar. En cada ensayo se prepararon curvas de calibración utilizando diluciones
seriadas de 5 a 6 veces del fragmento de dcprx02 previamente clonado en un plásmido
(sintetizados por la empresa GeneArt ®) desde 100 a 10000000 copias/ reacción. Para
cada ensayo se evaluaron por duplicado controles sin plantilla (NTC), las muestras de
cDNA y controles positivos (amplicones previamente clonados). La especificidad de los
productos se validó por el análisis de la curva de fusión. El análisis se realizó utilizando
un C1000Thermalcycle acoplado a un CFX96 Biorad sistema en tiempo real.
Considerando que se usaron tallos en un mismo estado de desarrollo, los niveles de
transcripción de la secuencia codificante para la proteína DcPrx02 se reportaron como
190
copias/ ng de cDNA como media de tres repeticiones (Y. Lu et al. 2012). Se verificó que
no se presentaran variaciones en la eficiencia de amplificación de muestras y patrones
usando el algoritmo reportado por (Ramakers et al. 2003). Los resultados también se
presentan como la relación de la expresión del inoculado con respecto al control
(Desmond et al. 2008; Godard et al. 2009), para evaluar diferencias propias del proceso
de inoculación con el patógeno.
4.2.7. Análisis estadístico
El análisis estadístico se realizó para cada variable en los diferentes tratamientos
evaluados por triplicado. Los datos fueron reportados como medias + / - SD. El análisis
de varianza y las diferencias significativas entre las medias se analizaron mediante
ANOVA de una vía utilizando Statgraphics ® Software versión 5.1. La correlación de
Pearson se realizó para determinar las correlaciones entre las medias de las actividades
enzimáticas, niveles de lignina, de peróxido de hidrógeno y de mRNA para la proteína
DcPrx02, utilizando Microsoft Excel. La significancia de los coeficientes de correlación de
Pearson se realizó con un α = 0.005 según Azzimonti (2003).
Tabla No. 21. Cebadores usados para la cuantificación por PCR en tiempo real de los niveles de mRNA para los genes de peroxidasas en clavel
Nombre de
la proteína
GI de la
Secuencia
Nombre de
los
cebadores
Secuencia 5´ 3´ Tamaño
del
fragmento
DcPrx01 76445534 POD1dir
POD1rev
TTTCACGATTGTTTCGTCCA
TTAATTTGAGGTCGGCTTCG
316pbs
DcPrx02 76445535 POD2dir
POD2rev
TATTCGCAAAATCGACCACA
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191
4.3. Resultados y discusión
4.3.1. Evaluación de niveles constitutivos de las enzimas GPX y APX, en variedades de clavel con diferentes niveles de resistencia al marchitamiento vascular
En la determinación de los niveles constituvos de las enzimas objeto de estudio en esta
fase de la investigación, se determinó que no hay correlación entre los niveles de
actividad y la resistencia a la enfermedad marchitamiento vascular; algunas variedades
susceptibles presentan valores constitutivos mayores que los que presentan variedades
resistentes (figura No. 39). Los niveles de las actividades enzimáticas presentes en tallos
y raíces, se encuentran en el mismo rango de valores, siendo este para la APX, entre
0,08 y 0,31 micromol ácido ascórbico/ min* g material vegetal y para la GPX entre 0,7 y 7
micromol de guayacol/min* g material vegetal. Esto indica que estas enzimas hacen parte
de procesos fisiológicos constitutivos que son comunes en los órganos evaluados;
mecanismos como la regulación de EROs producto de procesos como la respiración son
comunes en todas las células vegetales (Breusegem et al. 2001; Agati et al. 2012).
Las raíces de la variedad Bellisima (S) y los tallos de las variedades Tasman (S) y
Topacio (R), presentaron los niveles más altos para la actividad APX, indicando que es
muy probable que asi como ha sido encontrado para diversas especies vegetales, estas
presenten características fenotípicas asociadas con una mejor adaptación a condiciones
de estrés abiótico (M Faize et al. 2011; Maruta et al. 2010).
Para el caso de la actividad GPX, se encontró que para 6 de las 9 variedades evaluadas,
los niveles de actividad enzimática constitutiva son mayores en raíces que en tallos. Esto
muestra que es muy probable que en este órgano de la planta, se presente, al menos a
nivel constitutivo, biosíntesis de ligninas o regulación de especies reactivas de oxigeno,
mayor que la encontrada en el tallo.
192
39Figura No. 39. Niveles de actividad enzimática constitutiva (A) Ascorbato peroxidasa y (B) Guayacol peroxidasa en tallos y raíces de clavel con diferentes niveles de resistencia al marchitamiento vascular.Se presentan los resultados promedio de tres extracciones independientes para cada tratamiento. Las letras diferentes muestran tratamientos diferentes significativamente (α= 0,05)
De acuerdo con estos resultados se determinó que no hay relación entre los niveles
constitutivos de las enzimas estudiadas y los mecanismos de defensa pasiva de la
planta. Esto indicó que estas enzimas en el clavel están asociadas a otras características
fenotípicas diferentes a la resistencia, al menos a nivel constitutivo, y difieren a lo
encontrado para algunas de las involucradas en la biosíntesis de flavonoides en raíces
(Ardila, S. T. Martinez, et al. 2013). Es probable por tanto, que la acción de la enzima
GPX en clavel, al menos a nivel constitutivo, no esté asociada con altos niveles de
flavonoides. Esta relación se consideró teniendo en cuenta algunos reportes en los que
se ha encontrado que GPXs ubicadas a nivel de las vacuolas, pueden actuar sobre
flavonoides glicosilados ubicados en este organelo con el fin de regular los niveles de
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0,35
0,4
TASMAN (S) STAR(S)
KOMASHI(R)
GIOELE (R) LP CANDY(R)
SPITFIRE (S) BELLISIMA(S)
TOPACIO(R)
ESPERIA (R)
Acti
vid
ad
asco
rba
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rom
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RAIZ
TALLO
0
1
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TASMAN (S) STAR(S)
KOMASHI(R)
GIOELE (R) LP CANDY(R)
SPITFIRE (S) BELLISIMA(S)
TOPACIO(R)
ESPERIA (R)
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abc
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a b
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b a
ab
bcd
b
bcd
ab
abc
abc
a
ab
A
B
193
peróxido de hidrógeno a nivel subcelular (Ferreres et al. 2011; Agati et al. 2012). Al
parecer, considerando los resultados de la presente investigación, este proceso no se
lleva a cabo a nivel constitutivo en tallos o raíces de clavel.
Con el fin de determinar el papel de estas enzimas en los mecanismos de defensa activa
de la planta, se determinaron los niveles de actividad APX y GPX en raíces y tallos
inoculadas con el patógeno y se compararon con los niveles de peróxido de hidrógeno.
De esta manera, se determinó si la activación de los mecanismos de defensa activa de la
planta, incluían un aumento en los niveles de EROS y/o cambios en la activación de
mecanismos antioxidantes enzimáticos que involucran estas enzimas.
4.3.2. Evaluación de los niveles de peróxido de hidrógeno, APX y GPX, durante la inoculación con el patógeno en tallos y raíces de clavel
a. Determinación de peróxido de hidrógeno en raíces
De acuerdo con los resultados de la presente investigación, se evidenció que un aumento
en los niveles de peróxido de hidrógeno en raíces, hace parte de la respuesta de defensa
activa en plantas resistentes a la enfermedad marchitamiento vascular (figura No. 40).
Este aumento que fue significativo a las 6, 24, 48 y 96 hpi, con respecto al
correspondiente control, se presentó con menor intensidad en la variedad susceptible, en
la que a las 6 y 96 hpi con el patógeno, se presentó un leve aumento con respecto a su
control no inoculado.
Este incremeto en los niveles de peróxido de hidrógeno observado por efecto de la
inoculación con el patógeno, ha sido ampliamente descrito en otras interacciones planta-
patógeno (Mellersh et al. 2002). Este fenómeno cumple un destacado papel en
señalización en los mecanismos de defensa vegetal, en las etapas más tempranas de la
interacción. Esta respuesta se puede activar por el reconocimiento de un amplio rango de
elicitores del tipo MAMPS (Microbial Associated Molecular Patterns) que se presentan de
manera común en microrganismos (Faulkner & Robatzek 2012; Gururani et al. 2012) y
que pueden ser reconocidos tanto por plantas resistentes como susceptibles (Michèle C
Heath 2000). Es por ello que la acumulación de H2O2 se puede dar tanto en interacciones
compatibles como incompatibles tal y como se presentó en este estudio.
194
Sin embargo, es importante destacar que la acumulación en la variedad susceptible, se
observó con menor intensidad que la presentada para la variedad resistente indicando
que, tal y como ha sido descrito en otras especies vegetales, la regulación temporal de la
acumulación de especies reactivas de oxígeno (EROs) como el peróxido de hidrógeno,
es determinante para el proceso de señalización en resistencia (C. Lamb & Dixon 1997;
Tománková et al. 2006; Heller & Tudzynski 2011). Se ha aceptado que dicho proceso
está relacionado principalmente a la activación de los Homólogos de Oxidasas de
Explosión Respiratoria Oxidativa (RBOH), las principales generadoras de EROs en
plantas (Sagi & R Fluhr 2001; Hancock et al. 2002; Sagi & Robert Fluhr 2006).
Fig 40.
40Figura No. 40. Niveles de peróxido de hidrógeno en raíces de clavel durante el ensayo in vivo de inoculación con el patógeno Fod raza 2. Se presentan los resultados promedio de tres extracciones independientes para cada tratamiento. Las letras diferentes muestran tratamientos diferentes significativamente (α= 0,05)
Al comparar los tiempos en los que se presentó este aumento en los niveles de peróxido
de hidrógeno, con respecto a los resultados obtenidos para fenoles y flavonoides totales
en la fase anterior de la investigación (Capitulo 3), se puede observar que en raíces de la
variedad resistente, el aumento de peróxido de hidrógeno tambien presenta el
comportamiento inducible en dos fases descrito para metabolitos (figura No. 15). Es
probable, por tanto, que estas variables se encuentren relacionadas y que altos niveles
de peróxido de hidrógeno encontrados de manera temprana a las 6 hpi estén asociados
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10
20
30
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50
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70
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e h
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no
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mate
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l
RESISTENTE CONTROL RESISTENTE INOCULADO
SUSCEPTIBLE CONTROL SUSCEPTIBLE INOCULADO
Tiempo posinoculación
b
a a
b
a
a
ab
b
b
a
b
a
b
a a
ab a
c
b b
a
c
195
a un aumento en los niveles de metabolitos a este mismo tiempo y que a su vez, el
aumento a las 24-96 hpi en el H2O2, esté asociado al aumento encontrado a las 48-96 hpi
para fenoles totales, flavonoides totales y actividad antioxidante.
De esta manera, es probable que en el clavel exista una relación entre los niveles de
peróxido de hidrógeno y la activación transcripcional de genes que están involucrados en
la biosíntesis de metabolitos de tipo flavonoide, tal y como ha sido propuesto para otras
especies vegetales (Agati et al. 2012). Dicho aumento se puede presentar por el efecto
que tienen los cambios en los niveles de EROs en la activación de factores de
transcripción MYB, los cuales, tal y como se mencionó anteriormente, están asociados a
la activación transcripcional de enzimas de la biosíntesis de flavonoides (Falcone
Ferreyra et al. 2010; Dubos et al. 2010; Heine et al. 2004). Así, altos niveles de peróxido
de hidrógeno encontrados en la variedad resistente inoculada (figura No. 40), pueden
estar asociados a la activación de este tipo de factores de transcripción y generar un
aumento en los niveles de mRNA para los genes que codifican las enzimas CHS y CHI a
las 12 y 24 hpi (figura No. 32 y 34).
Se ha encontado que altos niveles de peróxido están asociados tambien a la activación
de mecanismos de regulación postranscripcional durante la interacción con patógenos
(Mendoza 2011) y es probable por tanto, que la activación de la fosforilación y
desfosforilación de enzimas del metabolismo secundario mediado por cambios en los
niveles de Ca+2 citoplasmático (S. Cheng et al. 2001; Seelakshmri & R. Sharma 2008), se
pueda ver afectado tambien por cambios en los niveles de EROs. Así el aumento en los
niveles de H2O2, puede tambien estar asociado con la activación de la enzima PAL en
raíces resistentes de clavel durante su interacción con el patógeno causal de
marchitamiento vascular.
A pesar de que se requieren estudios funcionales con mutantes de clavel comprometidos
en la producción de peróxido para confirmar esta hipótesis, la presente investigación
permitió determinar que la reacción de defensa que se activa en raíces de esta especie
vegetal, involucra un aumento en los niveles de metabolitos de tipo flavonoide (figura No.
15), el cual muy probablemente, está asociado a la activación de los niveles de actividad
y mRNA para las enzimas involucradas en su biosíntesis (figuras No. 31-34). Este
aumento a su vez, probablemente se genera por el aumento en los niveles de peróxido
196
de hidrógeno que se presenta debido al reconocimiento del patógeno por parte de la
planta.
Es interesante comentar que en los tiempos en que la variedad susceptible presentó
aumento en los niveles de peróxido de hidrógeno (6,12, y 24 hpi), se observó aumento en
los niveles transcripcionales que fueron previamente descritos para la enzima PAL en
raíces para esta misma variedad (figura No. 32). Esto muestra que es probable que el
aumento registrado en los niveles de peróxido de hidrógeno, esté asociado con el
aumento en la transcripción de estos genes. Sin embargo, considerando que no existe
correlación con los niveles de actividad enzimática PAL (figura No. 31), es probable que
existan mecanismos de regulación postranscripcionales que no se activen en esta
interacción compatible o que se afecten por la acción de efectores que son secretados
por el patógeno durante la infección en la planta. Se han descrito a la fecha, efectores en
algunos patógenos del género Fusarium que pueden afectar la respuesta de defensa
vegetal (Houterman et al. 2008) y es posible que este mismo comportamiento se
presente en el caso de Fusarium oxysporum f. sp. dianthi.
El efecto que estos efectores puedan tener sobre la variedad resistente L.P Candy,
estaría asociado al correspondiente reconocimiento de los mismos por parte de proteínas
R. La presencia de este tipo de proteínas asociadas a resistencia a patógenos del género
Fusarium, ha sido previamente documentada en otras especies vegetales (Palomares-
Rius et al. 2011; Berrocal-Lobo & Molina 2008) y su acción depende claramente de la
especie vegetal involucrada. La presencia de estas proteínas en el clavel, se discute en
siguientes etapas de esta investigación, considerando las evidencias experimentales que
fueron encontradas en el estudio proteómico de esta interacción.
b. Determinación de actividad APX y GPX en raíces
Con respecto a los niveles de las actividades enzimáticas antioxidantes objeto de
estudio, se encontró que los niveles de actividad APX y GPX, no presentaron cambios
significativos entre controles e inoculados para ninguna de las variedades estudiadas a
nivel de la raíz (figura No. 41). Esto indica que en este órgano de la planta, en los
tiempos evaluados, no se han activado los mecanismos de regulación enzimática de
EROs que habían sido descritos en otras interacciones que involucran patógenos del
género Fusarium (Palomares-Rius et al. 2011; Mandal et al. 2008).
197
41Figura No. 41. Niveles de actividad (A) guayacol peroxidasa y (B) ascorbato peroxidasa en raíces de clavel durante el ensayo in vivo de inoculación con el patógeno Fod raza 2. Se presentan los resultados promedio de tres extracciones independientes para cada tratamiento. Las letras diferentes muestran tratamientos diferentes significativamente (α= 0,05)
Estos resultados difieren con lo encontrado en tomate (Solanum lycopersicum) por
Mandal et al (2008), quienes encontraron que la infección con el patógeno Fusarium
oxysporum f. sp lycopersici, generó un aumento en enzimas antioxidantes desde las 24
hpi a nivel de la raíz. Sin embargo, es probable que en la interacción clavel-Fod, la
respuesta de defensa en estos tiempos esté focalizada en mantener altos niveles de
EROs con el fin de activar las respuestas de defensa que han sido encontradas en este
modelo, como la activación transcripcional para genes codificantes para CHS y CHI que
se presenta a las 12 y 24 hpi o la activación de la posible fosforilación de la PAL para su
activación a las 96 hpi.
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l)
RESISTENTE CONTROL RESISTENTE INOCULADO
SUSCEPTIBLE CONTROL SUSCEPTIBLE INOCULADO
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0,4
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RESISTENTE CONTROL RESISTENTE INOCULADO
SUSCEPTIBLE CONTROL SUSCEPTIBLE INOCULADO
b
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b
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b b
a
a
a a
a a a
a
ab
b
a
a ab
a
a
a a
Tiempo posinoculación
A
B
198
En general, con los resultados que se encontraron en la presente investigación se puede
concluir que, al menos en los tiempos posinoculación evaluados, no existe una activación
de la maquinaria antioxidante enzimática en raíces de clavel, muy probablemente debido
a los requerimientos particulares de este órgano, en estos tiempos posinoculación. Sin
embargo, no se puede descartar la acción de otros métodos de regulación de especies
antioxidantes, como es el caso de la acción de compuestos flavonoides, que en raíz se
activan a las 6 y 96 hpi (figura No. 15).
c. Determinación de peróxido de hidrógeno en tallos
Con respecto al estudio de estos mismos mecanismos a nivel del tallo, se encontró que
la respuesta en este órgano en términos de la acumulación de peróxido de hidrógeno, es
semejante a la encontrada previamente en raíz. Se determinó que los niveles
aumentaron por efecto de la inoculación con el patógeno en la variedad resistente,
siendo superiores a las 12 y 24 hpi, al comparar con sus respectivos controles (figura No.
42).
42Figura No. 42. Niveles de peróxido de hidrógeno en tallos de clavel durante el ensayo in vivo de inoculación con el patógeno Fod raza 2. Se presentan los resultados promedio de tres extracciones independientes para cada tratamiento. Las letras diferentes muestran tratamientos diferentes significativamente (α= 0,05)
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RESISTENTE CONTROL RESISTENTE INOCULADO
SUSCEPTIBLE CONTROL SUSCEPTIBLE INOCULADO
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b
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a
ab
ab b
Tiempo posinoculación
b
199
Por otro lado, en la variedad susceptible, se presentó un aumento a un solo tiempo (12
hpi). Estos resultados indican que, tal y como ha sido descrito en raíces, la regulación
temporal de la acumulación de peróxido de hidrógeno, es determinante para el proceso
de señalización en resistencia y es probable que un aumento mantenido de esta especie
química, sea requerido para una correcta activación de las respuestas de defensa (C.
Lamb & Dixon 1997; Tománková et al. 2006; Heller & Tudzynski 2011).
En este órgano de la planta es tambien probable que el aumento en peróxido de
hidrógeno esté asociado a la activación de la respuesta basal de la planta por el
reconocmiento de MAMPs presentes en el patógeno, en ambas variedades estudiadas, y
por la activación de Homólogos de Oxidasas de Explosión Respiratoria Oxidativa
(RBOH), las principales generadoras de EROs en plantas (Sagi & R Fluhr 2001; Hancock
et al. 2002; Sagi & Robert Fluhr 2006), tal y como fue propuesto en raíz.
Es interesante recordar que el aumento previamente descrito para los niveles de mRNA
para la enzima CHS en este órgano de la planta, se presentó también a las 12 y 24 hpi
(Fig 37). Esto indicaría que así como se propuso en raíz, es muy probable que el
aumento de esta especie altamente oxidante, active el proceso de transcripción de los
genes asociados con la biosíntesis de flavonoides en este órgano (Agati et al. 2012;
Falcone Ferreyra et al. 2010; Dubos et al. 2010; Heine et al. 2004).
d. Determinación de actividad APX y GPX en tallos
Con respecto a las enzimas objeto de estudio a nivel del tallo, se encontró que no existen
diferencias significativas (α=0,05) en los niveles de actividad APX durante la interacción
con el patógeno (figura No. 43). Esto indica que no existen evidencias estadísticas que
permitan proponer la participación de esta enzima en los mecanismos de defensa que se
activan en los tallos resistentes.
b
c
200
43Figura No. 43. Niveles de actividad ascorbato peroxidasa en tallos de clavel durante el ensayo in vivo de inoculación con el patógeno Fod raza 2. Se presentan los resultados promedio de tres extracciones independientes para cada tratamiento. Las letras diferentes muestran tratamientos diferentes significativamente (α= 0,05)
Por otro lado, los niveles de actividad guayacol peroxidasa obtenidos al analizar los
extractos de tallos de clavel inoculados con Fusarium oxysporum f. sp. dianthi raza 2,
presentaron un comportamiento diferencial entre las dos variedades usadas en el
presente estudio, tal como se muestra en la Fig 44.
44Figura No. 44. Niveles de actividad guayacol peroxidasa en tallos de clavel durante el ensayo in vivo de inoculación con el patógeno Fod raza 2. Se presentan los resultados promedio de tres extracciones independientes para cada tratamiento. Las letras diferentes muestran tratamientos diferentes significativamente (α= 0,05)
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RESISTENTE CONTROL RESISTENTE INOCULADO
SUSCEPTIBLE CONTROL SUSCEPTIBLE INOCULADO
0
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0,35
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RESISTENTE CONTROL RESISTENTE INOCULADO
SUSCEPTIBLE CONTROL SUSCEPTIBLE INOCULADO
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b
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b
b
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b ab
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a
a
a
a a a a
a a
a a
Tiempo posinoculación
Tiempo posinoculación
c
201
La variedad resistente presentó niveles estadísticamente superiores (α=0.05) de
actividad enzimática, al comparar con los respectivos controles sin inocular y con la
variedad susceptible, a las 12, 24 y 48 hpi. Los niveles de la enzima en las muestras
controles de las dos variedades estudiadas, permanecieron aproximadamente constantes
hasta las 96 horas, tiempo en el que se presentó un aumento en la actividad. En este
mismo tiempo se presentó aumento en la actividad para la variedad susceptible
inoculada al comparar con el respectivo control no inoculado (α=0.05).
Es evidente, de acuerdo a los presentes resultados, que el proceso de inoculación con
Fusarium oxysporum f. sp dianthi raza 2, generó un aumento temprano de la actividad
GPX a nivel del tallo en el genotipo de clavel resistente al marchitamiento vascular (figura
No. 44). Resultado similar se había obtenido en el grupo de investigación con otra
variedad de clavel (Cuervo et al, 2009). Dicho aumento de actividad se presentó a 12, 24
y 48 hpi, tiempos tempranos en los se han evidenciado las primeras etapas de la
infección con este patógeno y en los que se presentan las primeras respuestas de
defensa en los genotipos resistentes de clavel (Van Pelt-Heerschap & Smit-Bakker 1999;
Ardila & Higuera 2005; Ardila et al. 2011). Para el caso de la variedad susceptible se
presentó aumento en la actividad enzimática sólo a las 96 hpi, el que, además de ser
tardío, es mucho menor que el presentado por la variedad resistente. Estos resultados
están de acuerdo con otros en los que se ha reportado un aumento temprano en la
actividad de esta enzima durante la interacción con patógenos del género Fusarium en
genotipos resistentes de otras especies (P. Prasad et al. 2003; L. Huang & Backhouse
2005; Mandal et al. 2008; Madadkhah et al. 2012). Se ha propuesto que estas enzimas
(GPX), las cuales hacen parte de la familia de peroxidasas de clase III, participan en
diversos fenómenos que han sido descritos como claves dentro del modelo de resistencia
de plantas a patógenos vasculares como Fusarium (Beckman, 2000), como son
lignificación (Jaiti et al. 2009), regulación de los niveles de peróxido de hidrógeno
(Mandal, 2008), generación de peróxido (Bindschedler et al. 2006) o generación de
especies químicas con actividad antifúngica (Morkunas & Gmerek 2007; A. Dihazi et al.
2011).
202
e. Determinación de niveles de lignina en tallos
Con el fin de determinar si el aumento que se había presentado en términos de esta
actividad enzimática estaba correlacionado con el aumento en los niveles de lignina se
determinó su contenido en tallos de clavel a los diferentes tiempos posinoculación
propuestos (figura No. 45). Se evidenció que la inoculación no afectó los niveles de
lignina en tallos de las dos variedades en estudio, para ninguno de los tiempos evaluados
(α=0.05). La variedad resistente presentó niveles constitutivos superiores de este
polímero al comparar con la variedad susceptible Tasman (α=0.05).
45Figura No. 45. Niveles de lignina en tallos de clavel durante el ensayo in vivo de inoculación con el patógeno Fod raza 2. Se presentan los resultados promedio de tres extracciones independientes para cada tratamiento. Las letras diferentes muestran tratamientos diferentes significativamente (α= 0,05)
Al comparar el contenido de este polímero con los de actividad enzimática GPX (figura
No. 44) se evidenció que no hay relación entre estos dos. Este resultado no coincide con
reportes previos realizados en este modelo en donde si se presentó una acumulación de
lignina a las 96 hpi en tallos de la variedad resistente Bárbara, inoculada con este
patógeno (Cuervo, et al. 2009). Es probable que la acumulación de este polímero se
inicie a tiempos posteriores para el caso de la variedad resistente usada en la presente
investigación (L.P Candy), considerando que diferencias propias de los genotipos, de la
virulencia del aislamiento del patógeno o de las condiciones ambientales propias del
ensayo, afectan la colonización y por tanto el tiempo al que se observan las respuestas
de defensa (Ben-Yephet & Shtienberg 1997). Otros procesos que tienen que ver con el
0
0,002
0,004
0,006
0,008
0,01
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RESISTENTE CONTROL RESISTENTE INOCULADO
SUSCEPTIBLE CONTROL SUSCEPTIBLE INOCULADO
b
a
a a
a
a
b ab
a a
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a a a
a
a
b
a
a
Tiempo posinoculación
203
fortalecimiento de paredes celulares y que han sido asociados con resistencia en este
modelo, que no fueron evaluados en el presente estudio como son la suberización y la
acumulación de material electrodenso (Higuera & Ebrahim-Nesbat 1999; Ouellette et al.
2004), pueden implicar también la participación de peroxidasas (Almagro et al. 2009; A.
Dihazi et al. 2011).
4.3.3. Zimogramas de peroxidasas usando SDS-PAGE e IEF
Teniendo en cuenta los mayores niveles de GPX obtenidos en el tallo, la comparación de
los perfiles electroforéticos se realizó usando los extractos obtenidos de tallos a 12, 24 y
48 hpi para la variedad resistente inoculada y sus respectivos controles. Se determinó
por SDS-PAGE en condiciones no reductoras y posterior tinción específica, que los
extractos presentan principalmente dos bandas con pesos moleculares aparentes de 101
y 62 kDa aproximadamente. La banda de 62 kDa presentó un evidente aumento en su
intensidad en la muestra correspondiente a 24 hpi, indicando que el aumento de los
niveles de actividad enzimática, observados a este mismo tiempo, puede asociarse con
un mayor contenido de peroxidasas que presentan este peso molecular aparente. Así
mismo, es probable que a las 48 hpi el aumento en la intensidad en la banda a 101 kDa
pueda estar asociado al aumento en la actividad enzimática que se presentó en este
tiempo posinoculación.
46Figura No. 46. Comparación de perfiles electroforéticos por SDS-PAGE de extractos de peroxidasas obtenidos a partir de tallos de la variedad resistente L.P. Candy. 1) Patrones de PM, 2) Control 12 hpi, 3) inoculado 12 hpi, 4) control 24 hpi, 5) inoculado 24 hpi, 6) Control 48 hpi, 7) Inoculado 48 hpi
66 kDa
45 kDa
29 kDa
24
36 kDa
24 kDa
24
62 kDa
101 kDa
1 2 3 4 5 6 7
204
La comparación de los perfiles de isoenzimas usando IEF se realizó para los extractos de
la variedad resistente a 12 y 24 hpi. Se pudo evidenciar que no existe la generación de
nuevas isoformas con actividad POD, sino el aumento en los contenidos de isoformas
pre-existentes que se observaron también en el control no inoculado (figura No. 47).
47Figura No 47. Comparación de perfiles electroforéticos por isoelectroenfoque de extractos de peroxidasas obtenidos a partir de tallos de clavel de la variedad resistente L.P. Candy. 1) Patrones de PM, 2) Control 12 hpi, 3) inoculado 12 hpi, 4) control 24 hpi, 5) inoculado 24 hpi. La tinción de los patrones (1) se realizó usando Comassie Coloidal y de los extractos enzimáticos (2-5) con tinción específica.
Este es el caso de una isoforma con un pI de 6.9, que a las 24 hpi presenta un
importante aumento en su intensidad. Así mismo, a las 12 hpi se observó un aumento en
la intensidad de bandas con pI de 5.2, 5.8 y 7.2, que puede asociarse con el aumento en
la actividad enzimática obtenido a dicho tiempo.
Las peroxidasas de clase III se encuentran codificadas por un amplio conjunto de genes
y existe alta diversidad de estas enzimas que difieren en pesos moleculares y puntos
isoeléctricos (Almagro et al. 2009; Mathé et al. 2010). Sin embargo, considerando que la
mayoría de los reportes han citado un peso molecular en el rango entre 25 y 40 kDa para
peroxidasas de plantas (Mathé et al. 2010), es probable que estos pesos moleculares
mas altos para el caso del clavel (62 y 101kDa) se deban a la presencia de
9,3
8,6
8,4
7,3
6,8
5,8
3,6
4,5
5,2
1 2 3 4 5
6,9
205
conglomerados constituidos principalmente por dímeros o tetrámeros. Dichas estructuras
multiméricas se pueden presentar, ya sea por la presencia de asociaciones funcionales
desde la planta (Lüthje et al. 2011) o por su generación durante la extracción mediante la
formación de puentes disulfuro intercatenarios entre las unidades monoméricas. La
presencia de varios puentes disulfuro ha sido reportada para esta enzima (Reading &
Aust 2001; Mathé et al. 2010) y podrían ser los responsables de la generación de dichas
estructuras. Considerando que el método de detección usado fue la tinción específica, no
se usaron agentes reductores con el fin de evitar pérdidas de actividad enzimática. Bajo
estas consideraciones, los resultados del presente estudio se pueden comparar con los
encontrados en Capsicum annuum L. chungok, en donde bajo las mismas condiciones de
electroforesis no reductoras, se presentan también dos bandas de actividad con pesos
moleculares aparentes de 114 y 53KDa solamente (H. Zheng et al. 2005).
De acuerdo a estos resultados, el aumento en la actividad enzimática GPX a las 24 hpi
en la variedad resistente a nivel del tallo, se debe, al parecer, principalmente al aumento
en los niveles de la peroxidasas pre-existentes. Esta observación se confirmó con
isoelectroenfoque en donde se encontró que el número de isoformas entre inoculados y
controles permanece constante y solo se presentó aumento en los niveles de
peroxidasas pre-existentes (figura No. 47). Lo obtenido está de acuerdo con lo reportado
previamente en clavel por Van Pelt-Heerschap, H and Smit-Bakker, O. (1999), en donde
se encontró que la inoculación con aislamientos de Fusarium oxysporum f. sp. dianthi, de
las razas 1 y 8 presentes en suelos europeos, no genera inducción de nuevas isoformas
de peroxidasas en líquido de lavado intercelular a nivel del tallo. Así mismo, coincide con
lo encontrado en otros modelos planta-patógeno (Sujeeth et al. 2010) como Girasol
(Helianthus annus L)-Plasmopara halstedii (Saftić-panković et al. 2006) o palma (Phoenix
dactylifera L) - Fusarium oxysporum f. sp. albendinis (Jaiti et al. 2009), en donde se
encontró que el aumento de la actividad GPX está asociada al aumento de isoformas
preexistentes de esta enzima.
206
4.3.4. Niveles transcripcionales de peroxidasas de clase III
Con el fin de conocer si la regulación de los niveles de estas enzimas se presentaba a
nivel transcripcional, se determinaron los niveles de mRNA para las diferentes isoformas
reportadas a la fecha de peroxidasas en clavel de acuerdo a las condiciones citadas en la
metodología (4.2.6). Se determinó que a las 12 hpi, la variedad resistente presentó un
aumento en la transcripción de los genes que codifican las proteínas DcPrx01, DcPrx02 y
DcPrx04 (figura No. 48), siendo casi 8 veces superiores en el caso de DcPrx02.
Gráfica No. 6. Comparación de niveles transcripcionales por cuantificación relativa de
peroxidasas a nivel del tallo a las 12 hpi con Fusarium oxysporum f. sp. dianthi raza 2.
Se usó como gen housekeeping actina. El valor reportado corresponde al promedio de
dos determinaciones.
48Figura No. 48. Comparación de niveles transcripcionales por cuantificación relativa de peroxidasas a nivel del tallo a las 12 hpi con Fusarium oxysporum f. sp. dianthi raza 2. Se usó como gen control actina. El valor reportado corresponde al promedio de dos determinaciones
De acuerdo a estos resultados, la presencia del patógeno generó cambios en los niveles
de mRNA para la proteína DcPrx02 a las 12 hpi, superiores a los presentados en las
otras proteínas evaluadas, usando como gen control β-actina. Esto está de acuerdo con
reportes en otras especies vegetales en donde se ha determinado que las peroxidasas
se encuentran codificadas por un conjunto de genes que presentan patrones de
expresión dependientes, entre otros factores, del tejido involucrado y del gen especifico
en estudio (Hiraga et al. 2000; Bakalovic et al. 2006; Baluška & Mancuso 2006; Mathé et
al. 2010). Estas diferencias han sido asociadas a la presencia de diferentes secuencias
promotoras en los genes codificantes para estas enzimas. Por ejemplo en Arabidopsis
thaliana, diferencias en elementos reguladores cis para los genes codificantes de las
enzimas Atprx33 y Atprx34, están asociados, al parecer, con las diferencias en
transcripción que se presentan en estos genes para tallos y hojas (Passardi et al. 2006).
Los resultados del presente estudio indican que en tallos de clavel se presenta, una
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
4,5
DcPrx01 DcPrx02 DcPrx03 DcPrx04 DcPrx05
Niv
ele
s tr
ansc
rip
cio
nal
es
rela
tivo
a β
-act
ina
CONTROL INOCULADO
207
estimulación diferencial de aquellos promotores asociados a la regulación de él o los
genes codificantes para la proteína Dcprx02, por efecto de la inoculación con el
patógeno, cuando se compara con las demás proteínas evaluadas. De acuerdo a análisis
realizados con los programas MEME (Multiple Em for Motif Elicitacion versión 3.5.3) y
MAST (Motif Aligment & Search Tool), la proteína Dcprx02 presenta motivos típicos de
peroxidasas de clase III, como son los asociados a los sitios de unión a grupo hemo y a
los sitios de unión a calcio (figura No. 49).
Motivo 1. Aminoácidos de unión a grupo hemo y catalíticos de peroxidasas de clase III presentes en proteínas como (gi|11514092| Chain A, Arabidopsis Thaliana Peroxidase A2).
Motivo 2. Aminoácidos de unión a calcio presentes en proteínas como (gi|7245406|pdb|1QGJ|A Chain A, Arabidopsis Thaliana Peroxidase N)
Motivo 3. Este motivo no tiene secuencias asociadas con un e-value adecuado.
49Figura No. 49. Motivos presentes en la proteína Dcprx 02 en Dianthus cayophyllus L encontrados con el programa MEME (Multiple Em for Motif Elicitacion versión 3.5.3). Se describe en la parte inferior la descripción correspondiente de los diferentes motivos de acuerdo al programa MAST (Motif Aligment & Search Tool)
Estos motivos al estar altamente conservados en peroxidasas extracelulares (Mathé et al.
2010), confirman su ubicación a nivel del apoplasto en donde se presentan los eventos
tempranos mas importantes durante la interacción con patógenos (Almagro et al. 2009;
Hammerschmidt 2011).
Con el fin de realizar una evaluación aun más exacta de los niveles de mRNA para esta
proteína, y considerando la necesidad de usar varios genes control de manera
simultánea cuando se trabaja con cuantificación relativa (Aoun, M. et. al. 2010), se optó
por realizar cuantificación absoluta en muestras de todos los tiempos posinoculación,
para los niveles de transcripción de la proteína DcPrx02, siendo expresados como No de
copias por pg de cDNA, tal y como ha sido recientemente propuesto en plantas, de
acuerdo a las consideraciones previamente discutidas en el capitulo 3 (Y. Lu et al. 2012).
En el ensayo no se presentaron diferencias en los valores de la eficiencia para patrones y
muestras de acuerdo al procedimiento sugerido por Ramakers C. et. al. 2003, indicando
que los resultados encontrados no están afectados por la presencia de contaminantes.
208
50Figura No. 50. Niveles de mRNA para la proteína DcPrx02 a nivel del tallo durante la inoculación con Fusarium oxysporum f. sp. dianthi raza 2. Variedad Resistente L.P Candy: A) Niveles transcripcionales por cuantificación absoluta, B) Niveles relativos del inoculado con respecto al control no inoculado. Variedad Susceptible Tasman: C) Niveles transcripcionales por cuantificación absoluta, D) Niveles relativos del inoculado con respecto al control no inoculado. Los resultados son el promedio de tres réplicas. Los tratamientos que presentan diferencias están asignados con letras diferentes (α=0,05)
Esta cuantificación confirmó que los niveles de transcriptos para la proteína Dcprx02
aumentan casi 8 veces con respecto al control para la variedad resistente a las 6 hpi
(figura No. 50 B). Dicho aumento se mantiene a las 12 horas y debe estar asociado a la
inducción de actividad enzimática que se presenta principalmente a las 12 y 24 hpi (figura
No. 43).
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
4000
4500
0 6 12 24 48 96
No
de
co
pia
s/p
g cD
NA
Resistente Control
Resistente Inoculado
0
2
4
6
8
10
12
0 6 12 24 48
Rela
ció
n n
ivele
s t
ran
scri
pc
ion
ale
s
ino
cu
lad
o/c
on
tro
l
0
2
4
6
8
10
12
0 6 12 24 48 96
Rela
ció
n n
ivele
s t
ran
scri
pc
ion
ale
s
ino
cu
lad
o/c
on
tro
l
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
4000
4500
0 6 12 24 48 96
No
de
co
pia
s/p
g c
DN
A
Susceptible Control
Susceptible Inoculado
Resistente
c
b
a
a
b
a
a
a
a a
a
Susceptible
b
a
a
a
a
a a
a
a
Tiempo posinoculación Tiempo posinoculación
A
D C
B
209
Considerando que para la variedad susceptible se presentó un aumento en los niveles de
transcripción para esta proteína de apenas 2 veces con respecto al control a las 12 hpi
(figura No. 50 D), sin aumento en la actividad enzimática, se postula que existe una
respuesta diferencial entre variedades R y S y que la activación transcripcional temprana
de este gen está posiblemente asociada con resistencia al patógeno. Resultados
similares se han encontrado en otros modelos, en los que se ha observado una inducción
a nivel transcripcional para esta enzima asociada con resistencia (Desmond et al. 2008;
Goswami & Punja 2008; F. C. L. Medeiros et al. 2009; Lanubile, Bernardi, Marocco, et al.
2012).
Con el fin de determinar si los niveles de mRNA de este gen estaban correlacionados con
los parámetros previamente evaluados en este mismo órgano, se compararon las
diferentes variables y se determinaron los coeficientes de correlación de Pearson (α=
0,05) (tabla No. 22). Se encontró que los niveles de actividad y transcripcionales no se
encontraban estadísticamente correlacionados (r=0.67), indicando que deben existir
mecanismos de regulación postranscripcionales para finalmente generar la enzima activa
en los tallos de la planta. De acuerdo a esta evidencia, primero se activa la transcripción
de este gen (6 y 12 hpi) para luego de unas horas, iniciar la síntesis de las enzimas que
participarán en los procesos de defensa mencionados (12 y 24 hpi).
Tabla No. 22. Análisis estadísticos de correlación de Pearson entre las variables evaluadas
mRNA DcPrx02 Peróxido de Hidrógeno
Actividad GPX Lignina
mRNA DcPrx02 1
Peroxido de Hidrógeno 0,82246682 1
Actividad GPX 0,676588427 0,89738239 1
Lignina 0,541985451 0,418178846 -0,014514981 1
De acuerdo a estos resultados era evidente que el aumento en los niveles de mRNA para
el gen que codifica para la peroxidasa de clase III Dcprx02 en la variedad resistente
(figura No. 49 A) debe estar asociado al aumento de actividad enzimática peroxidasa que
se presenta en esta variedad (figura No. 44). Esta regulación a nivel transcripcional de
las peroxidasas de plantas durante la interacción con patógenos, ha sido documentada
en otros modelos (Hao et al. 2009), y permite proponer que la activación de la
210
transcripción del gen codificante para la peroxidasa Dcprx02, es importante dentro de los
eventos tempranos de defensa en este modelo.
Por otro lado, de acuerdo a los análisis estadísticos realizados se presentó correlación
entre los niveles de peróxido de hidrógeno y los niveles de mRNA para esta proteína
(0.82). Esto coincide con el conocido papel del peróxido de hidrógeno para inducir la
expresión de genes de defensa (Kúzniak & Urbanek 2000; Almagro et al. 2009). De esta
manera, el aumento en los niveles de peróxido de hidrogeno en la variedad resistente,
desencadenaría una respuesta a nivel transcripcional del gen codificante para la
peroxidasa Dcprx02, la cual genera a su vez, un aumento en los niveles de esta enzima a
nivel del apoplasto, punto de localización de esta proteína y en donde se presentan
algunos de los eventos de defensa mas relevantes en esta interacción (Almagro et al.
2009; Hammerschmidt 2010).
Considerando que la inducción de peróxido de hidrógeno también se presentó en la
variedad susceptible de clavel (figura No. 42) y que no se presentó aumento en la
transcripción para el gen codificante de la proteína Dxprx02, en esta variedad, se hace
evidente que existen diferencias entre ambos genotipos, en términos de la acción de
mecanismos que actúan posteriores a la generación del peróxido de hidrógeno, en la
cascada de señalización. Estos pueden ser por ejemplo la acción de fosfatasas o MAP
kinasas y la activación de factores de transcripción que estimulan la expresión de genes
asociados con la defensa vegetal (Hancock et al. 2002). Es probable que tal y como se
propuso a nivel de la raíz, en el genotipo susceptible esta activación se vea afectada por
la acción de efectores del patógeno, los cuales actuarían sobre estas vías de
señalización afectando algún punto sensible en la transducción de la señal (Kamoun
2007; Pritchard & Birch 2011).
Se determinó que existe correlación significativa entre los niveles de H2O2 y los niveles de
actividad GPX para la variedad resistente (α= 0,05) Es bien sabido que las peroxidasas
de clase III participan en la regulación de los niveles de peróxido de hidrógeno en plantas
(Hancock et al. 2002; Almagro et al. 2009; Mathé et al. 2010). Dentro de estos estudios
se ha determinado que estas enzimas participan en su eliminación, asociada a la
oxidación de fenoles para la generación de quinonas que pueden ser usadas en el
proceso de defensa contra patógenos (Tománková et al. 2006; Mandal et al. 2008) y
211
también en su generación a nivel del apoplasto (Kawano 2003; Jacyn Baker et al. 2005;
Bindschedler et al. 2006). Muchas peroxidasas de clase III presentan dominios de unión
a membrana plasmática y se ha propuesto que varios de estos procesos regulatorios se
pueden llevar a cabo hacia el lado apoplástico de la membrana celular (Lüthje et al.
2011).
De acuerdo a los resultados del presente estudio, se propone que también en tallos de
clavel, la enzima peroxidasa estaría asociada a estos procesos de regulación, teniendo
en cuenta la correlación estadística que se presentó entre los niveles de peróxido y los
niveles de actividad enzimática para la variedad resistente inoculada (tabla No. 22).
Considerando que no existe correlación entre los niveles de peróxido de hidrógeno y la
actividad peroxidasa en la variedad susceptible, en donde la actividad permaneció sin
variaciones estadísticas a pesar de la acumulación de peróxido a las 12 hpi (Gráfica No.
42), es probable que durante la interacción con el patógeno participen principalmente
RBOHs para la generación de estas especies altamente oxidantes que se requieren para
los procesos iniciales de señalización en ambas variedades como un proceso de la
defensa basal, tal y como se propuso anteriormente en la raíz de la planta(Sagi & Robert
Fluhr 2006; Hancock et al. 2002).
En general, los resultados de este estudio muestran la complejidad de los procesos que
están involucrados en esta interacción planta-patógeno y evidencian la necesidad de
profundizar sobre los que eventualmente pueden estar asociados a mecanismos de
defensa que determinan la resistencia a la enfermedad. Es por ello que en la siguiente
etapa de la investigación, se abordó el estudio de la resistencia del clavel usando
herramientas proteómicas, con el fin de complementar la información sobre los
fenómenos hasta este punto estudiados y brindar un panorama aun más completo de los
mecanismos bioquímicos y moleculares asociados a la resistencia del clavel.
212
4.4. Conclusiones
Los niveles de peróxido de hidrógeno a nivel del tallo, aumentaron en la variedad
resistente por efecto de la inoculación con Fod a las 12 y 24 hpi, mientras que para la
variedad susceptible dicho aumento se presentó solamente a las 12 hpi, indicando que
diferencias en la regulación de los niveles de esta especie oxidante pueden estar
asociados con la resistencia a la enfermedad en este órgano.
Los niveles de GPX aumentaron de manera diferencial en tallos de la variedad resistente
al patógeno Fod, a las 12, 24 y 48 hpi y presentaron correlación estadística con los
niveles de H2O2 en este mismo órgano, indicando que en esta variedad, los niveles de
esta enzima pueden estar asociados con la regulación de los niveles de esta especie
reactiva de oxìgeno (ERO), de manera simultánea con la activación de los mecanismos
de defensa en que esta enzima participa.
La inoculación con el patógeno Fod, generó a nivel de la raíz un aumento significativo en
los niveles de H2O2 en la variedad resistente (L.P. Candy) a las 6, 24, 48 y 96 hpi,
mientras que en la variedad susceptible (Tasman), dicho aumento se presentó en una
proporción menor a las 6 y 96 hpi, indicando que diferencias en la intensidad de la
respuesta, está asociada con la correcta activación de los mecanismos de defensa que
se presentan en la planta a este nivel.
Como resultado de la inoculación con el patógeno, los niveles de las enzimas APX y GPX
se mantienen constantes en raíces de las dos variedades estudiadas, indicando que en
este órgano de la planta no se activan mecanismos enzimáticos de regulación de EROs
asociados a estas enzimas, durante tiempos tempranos de la interacción. Los niveles
constitutivos de estas enzimas en este órgano y en tallos, tampoco mostraron correlación
con los niveles de resistencia al marchitamiento vascular causado por Fod
El aumento en los niveles de actividad GPX que se presenta en tallos de la variedad L.P.
Candy (R) por efecto de la inoculación, está asociado con el aumento en los niveles de
isoformas preexistentes, las cuales presentan pesos moleculares aparentes de 62 y 101
kDa y puntos isoeléctricos de 5.2, 5.8, 6.9 y 7.2.
213
La inoculación con el patógeno Fod, genera a nivel del tallo un aumento diferencial en los
niveles de mRNA para peroxidasas de clase III, que depende del gen evaluado,
indicando que la regulación de la actividad está determinada por la activación
transcripcional diferencial de los genes codificantes para este tipo de enzimas.
Un aumento en los niveles transcripcionales del gen codificante para la enzima Dcprx02,
la cual presenta dominios asociados a localización extracelular, está asociada con los
mecanismos de defensa que a nivel del tallo, se activan para dar lugar a la resistencia del
clavel al patógeno causal del marchitamiento vascular.
La correlación observada entre los niveles de mRNA del gen Dcprx02 y los niveles de
peróxido de hidrógeno en tallos de la variedad L.P. Candy (Resistente), muestran que la
activación transcripcional de este gen puede estar mediado por los cambios en los
niveles de esta especie química, durante la activación de los mecanismos de defensa de
la planta
La correcta regulación espacio temporal de los niveles de peróxido de hidrógeno puede
ser un factor importante durante la activación de los mecanismos de defensa que se
activan en tallos y raíces de la variedad resistente L.P. Candy, probablemente asociado a
la activación de la defensa activa basal de las plantas de clavel. Sin embargo, otras
respuestas asociadas a esta respuesta como la activación de peroxidasas, depende
grandemente del órgano de la planta involucrado, indicando que existen diferencias entre
órganos, en términos de los fenómenos de reconocimiento, transducción de señal y
activación de los mecanismos de defensa vegetales contra el patógeno causal del
marchitamiento vascular.
214
215
5. Aproximación proteómica al estudio de los mecanismos de defensa del modelo clavel-Fusarium oxysporum f. sp dianthi
Resumen
Se investigaron los cambios en los proteomas de tallos y raíces de clavel infectados por
Fusarium oxysporum f. sp dianthi de dos variedades Tasman (Susceptible) y L.P Candy
(Resistente), mediante electroforesis monodimensional (1DE) y bidimensional (2DE) y
posterior identificación por espectrometría de masas (MALDI-TOF-TOF). Se seleccionó el
método (ATA/Acetona/fenol) para la extracción de proteínas totales y unas condiciones
de separación en 2DE que incluyen un gradiente de pH no lineal (NL) de 3 a 10 para la
separación en la primera dimensión. La visualización de proteínas se realizó mediante el
método de tinción combinado Sypro Rubi-Coomassie coloidal. Se encontró que a nivel de
la raíz, la variedad resistente presenta niveles constitutivos superiores de la enzima
málica, asociada con el metabolismo de carbohidratos y de una proteína que posee
dominio NB-ARC, altamente conservado en proteínas de resistencia. En este mismo
órgano, se encontró que la inoculación con el patógeno a las 6 hpi, generó un aumento
en proteínas asociadas a la biosíntesis de componentes de pared celular (α-1,4-glucan-
protein sintasa), de los aminoácidos serina y metionina (fosfoglicerato deshidrogenasa y
metionina sintasa) y de proteínas (factores de elongación EF1 Y EF2). Una disminución
en los niveles de enzimas asociadas con el ciclo de las pentosas fosfato (Glucosa-6-
fosfato deshidrogenasa y transaldolasa) y de rutas de actividad antioxidante
(monodehidroascorbato reductasa) muestran que como parte de la respuesta asociada a
resistencia, se encuentran respectivamente, una redirección del metabolismo del carbono
216
para la generación de energía y mantener altos niveles de peróxido de hidrógeno. A nivel
del tallo a las 24 hpi, se presenta por efecto de la inoculación con el patógeno, un
aumento en la ruta biosintética para la generación de etileno (metionina sintasa y
adenosilmetionin sintasa) y en los niveles de una proteína de choque térmico (HSP70),
chaperona asociada con el correcto plegamiento de las proteínas. Estos resultados
muestran la importancia que tienen procesos como la biosíntesis de proteínas y
componentes de la pared celular, así como la procesos de señalización en la resistencia
a Fusarium oxysporum f. sp. dianthi.
Abstract
The changes in proteomes of carnation stems and roots infected by Fusarium oxysporum
f. sp dianthi of Tasman (susceptible) and LP Candy (resistant), were evaluated by 1D
electrophoresis (SDS-PAGE) and 2D (IEF-SDS PAGE) and subsequent identification by
mass spectrometry (MALDI-TOF). The method ATA / acetone / phenol was selected for
total protein extraction, and a 3 to 10 NL gradient for IEF separation with a subsequent
detection method Sypro-colloidal Coomassie for 2D-electrophoresis. It was found that in
the roots, the resistant cultivar has higher constitutive levels malic enzyme involved with
the metabolism of carbohydrates and a protein with NB-ARC domain, which is highly
conserved in resistance proteins. At the same level, the pathogen inoculation at 6 hpi
caused an increase in proteins involved in biosynthetic process of cell wall components
(α-1,4-glucan-protein-synthase), of serine and methionine (Phosphoglycerate
dehydrogenase and methionine synthase ) and proteins (elongation factors EF1 and
EF2). A decrease in the levels of enzymes associated with the pentose phosphate cycle
(Glucose-6-phosphate dehydrogenase and transaldolase) and antioxidant activity
pathways, showed that metabolism carbon for energy generation and high levels of
hydrogen peroxide are part of the response associated with resistance. In the stems at
24 hpi, the patogen inoculation caused an increase in the biosynthetic pathway for
ethylene generation (methionine synthase and adenosilmetionin synthase) and levels of
heat shock protein (HSP70), chaperone associated with the correct folding of proteins.
These results show the importance of process and protein biosynthesis and cell wall
components, as well as the signaling processes in the resistance to Fusarium oxysporum
f. sp. dianthi.
217
5.1. Introducción
Los mecanismos de defensa que activan las plantas resistentes de clavel (Dianthus
caryophyllus L ) a la enfermedad marchitamiento vascular son de particular interés para
la comunidad científica interesada en el desarrollo de nuevas alternativas de control. Sin
embargo, el conocimiento sobre las proteínas y genes que están asociados a dichos
fenómenos, está limitado a algunas respuestas específicas (Van Pelt-Heerschap & Smit-
Bakker 1999; Ardila & Higuera 2005; Cuervo et al. 2009; Ardila et al. 2011), ya que los
estudios proteómicos y transcriptómicos que permiten realizar una evaluación global de
la respuesta son, a la fecha, inexistentes en este modelo planta-patógeno. A nivel
proteómico, la electroforesis bidimensional (2-DE) es una de las herramientas más
usadas para el análisis de proteomas en plantas permitiendo el estudio de un gran
número de procesos biológicos como, por ejemplo, las interacciones con microrganismos
patógenos (Thurston et al. 2005a; Quirino et al. 2010; Abdelbasset El Hadrami et al.
2012). De hecho, en los últimos años el análisis descriptivo de proteínas involucradas en
la interacción con patógenos, usando 2-DE y posterior identificación usando
espectrometría de masas, se ha convertido en una importante herramienta en
fitopatología para diferentes especies vegetales como arroz (Y.-Z. Lin et al. 2008; Koga et
al. 2012), Arabidopsis thaliana (Mukherjee et al. 2010), trigo (Ding et al. 2011), garbanzo
(Palomares-Rius et al. 2011), menta (Sinha & Chattopadhyay 2011), guisantes (Barilli et
al. 2012), uva (Milli et al. 2011) y fresa (Xianping Fang et al. 2012). Al respecto, muchos
de estos estudios se han abordado mediante aproximaciones de proteómica comparativa
en donde las respuestas bioquímicas de interés, se deducen al comparar el
comportamiento de variedades que presentan diferencias de resistencia ante la
enfermedad en estudio. Son varios los reportes que han permitido encontrar proteínas
asociadas a defensa en modelos que involucran patógenos del género Fusarium,
comparando la respuesta que presentan las variedades susceptibles y resistentes
durante su inoculación con el patógeno (Ding et al. 2011; Palomares-Rius et al. 2011; K.
Shin et al. 2011; Eggert et al. 2011; Asano et al. 2012).
218
Sin embargo, la aplicación de estas herramientas está limitada a la obtención de un
extracto de proteínas de calidad libre de contaminantes como polisacáridos y/o
polifenoles, que pueden reaccionar de manera inespecífica con las proteínas, afectando
su migración y por tanto la resolución en el sistema de separación. Teniendo en cuenta
que la presencia de dichos contaminantes está determinada en parte por la correcta
combinación tejido vegetal y método de extracción (A.M Maldonado et al. 2008; M. A. da
Silva et al. 2010; De La Fuente et al. 2011), es necesario realizar la evaluación de
distintos métodos que permitan encontrar las mejores condiciones de extracción de
proteínas, cuando se trabaja por primera vez con una especie vegetal. Así mismo, es
importante contar con unas metodologías que permitan obtener altos rendimientos
durante la extracción y alta sensibilidad durante la tinción. Esto considerando que
generalmente las proteínas asociadas a los mecanismos de defensa de las plantas se
encuentran en niveles bajos y requieren para su detección los más altos niveles de
sensibilidad posibles, conseguidos con tinciones alternativas a las comúnmente usadas
(López et al. 2000). En general, las condiciones de extracción, separación y detección,
son determinantes para el estudio de la respuesta de interés y deben ser puestas a punto
en función del órgano y de la especie vegetal objeto de estudio.
Bajo estas consideraciones, con el fin de profundizar sobre los mecanismos que se
activan en tallos y raíces de clavel durante la interacción con Fod, se seleccionaron en
primer lugar las condiciones para la extracción y separación de proteínas a partir de
dichos órganos, con el fin de llevar a cabo el análisis de proteomas usando las técnicas
de separación basadas en gel (1-DE y 2-DE). Posteriormente, bajo las condiciones
seleccionadas, se realizó un análisis comparativo tanto a nivel constitutivo como por
efecto de inoculación con el patógeno, de los proteomas presentes en las variedades L.P
Candy (R) y Tasman (S). La posterior identificación de aquellas proteínas que
presentaron un comportamiento de interés mediante el análisis MALDI-TOF/TOF,
evidenció posibles mecanismos que son de interés en esta interacción y permiten
complementar, en parte, el panorama que hasta este punto se había generado sobre la
bioquímica de la interacción clavel-Fod.
219
5.2. Materiales y métodos
5.2.1. Material Vegetal
Se usaron tallos y raíces de las variedades L.P Candy (Resistente) y Tasman
(Susceptible), provenientes del ensayo in vivo que se describe detalladamente en el
Capitulo 3 (3.2). Las extracciones y posteriores análisis, se realizaron por triplicado en
aquellos tiempos posinoculación en los que se habían presentado los mayores cambios
en el contenido de proteína total entre controles e inoculados (0, 6, 24, y 96 hpi).
5.2.2. Selección de condiciones de extracción
Con el fin de seleccionar las condiciones más favorables para la extracción de proteínas
a partir de tallos y raíces de clavel, se evaluaron tres procedimientos de extracción
previamente publicados para el análisis de proteomas en plantas y en estudios de
interacción planta patógeno (M. A. da Silva et al. 2010; De La Fuente et al. 2011;
Palomares-Rius et al. 2011). La selección de las mejores condiciones se realizó
comparando los rendimientos obtenidos expresados como mg proteína / g material
vegetal en base seca y la calidad de la separación en 1DE y 2DE usando geles
pequeños. Las metodologías aplicadas sobre tallos y raíces de clavel se presentan a
continuación y se encuentran de manera aún más detallada en (Ardila, González-
Fernández, et al. 2013).
Procedimiento A, basado en extracción, posterior precipitación y redisolución
Para este primer método se pesaron 20 mg de liofilizado de tallos o raíces de clavel de la
variedad Tasman en un tubo eppendorf nuevo de 2 mL y se adicionó 1 mL de buffer de
extracción de proteínas totales (Tris-HCl 0,5 M pH 8,0, SDS 5%, Glicerol 15%, DTT 100
mM, 1 mM PMSF). Esta mezcla se agitó por 30 min a 4oC. Luego de centrifugar a 16000
g por 10 min a 4oC y transferir el sobrenadante a un tubo nuevo de 2mL, se adicionó 1mL
de TCA al 100% (p/v). Después de homogenizar y mantener la muestra por 2 horas a
4oC, se centrifugó a 16000 g y se lavó el pellet (3 veces) con acetona con una
centrifugación final a 16000 g por 5 min. El pellet resultante se dejó secar al aire en una
cabina de extracción para eliminar la acetona remanente, se disolvió en 200µL del buffer
de solubilización (urea 9 M, tiourea 2 M, CHAPS 4% (p/v), Tritón X-100 0,5% (p/v) y DTT
20 mM) y se agitó por 4 horas a 4oC. La proteína total presente en este extracto se
220
determinó por el método de Bradford (Ramagli & Rodriguez 1985) usando BSA como
patrón y se guardó a -20ºC para posteriores análisis.
Procedimiento B, basado en extracción mediante precipitación con TCA-Acetona
Al igual que en el procedimiento anterior se pesaron 20 mg de tallos o raíces de la
variedad Tasman (S) previamente liofilizados, en un tubo eppendorf nuevo de 2 mL y se
adicionaron 500 μL de TCA al 10% (p/v) y DTT (0,07% w/v) en acetona. Esta mezcla se
sometió a ultrasonido (3 veces x 10 segundos a 50W, amplitud 60) a 4oC y se puso en
hielo por 1 min. Luego de mezclar vigorosamente usando vortex, se adicionó TCA al 10%
y DTT (0,07% w/v) en acetona hasta llenar el tubo y nuevamente se mezcló
vigorosamente. Después de precipitar toda la noche a -20oC, se centrifugó a 16000 g por
10 min y 4oC. El sobrenandante correspondiente se descartó y el pellet se lavó (3 veces)
con acetona mezclando con vortex en cada paso. Luego de centrifugar a 16000 g por 5
min a 4oC se eliminó la acetona por decantación y se dejó en la cabina de extracción
para eliminar el solvente remanente. El pellet en este punto se disolvió en el buffer de
solubilización previamente descrito y se agitó por 4h a 4ºC. Luego de cuantificar las
proteínas usando el método de Bradford, el extracto se guardó a -20ºC para posteriores
análisis.
Extracción C, basada en precipitación con TCA/acetona y posterior extracción con fenol
Se pesaron 20mg del mismo material vegetal liofilizado en un tubo eppendorf nuevo de
2mL y se adicionó TCA al 10% (p/v) en acetona hasta llenar el tubo. Esta mezcla se
sometió a ultrasonido (3 veces x10 segundos a 50W, amplitud 60) y se dejó en hielo por
1 min. Luego de mezclar vigorosamente, se centrifugó a 16000 g por 5 min y se descartó
el sobrenadante por decantación. Sobre el pellet se realizaron lavados con acetato de
amonio 0,1M en metanol al 80% y posteriormente con acetona al 80%, realizando
centrifugaciones en cada caso a 16000 g por 5 min a 4oC. En este punto al pellet se le
adicionó una mezcla (1:1) de fenol saturado y buffer de lisis (sacarosa 30 % p/v, SDS 2%
p/v y β-mercaptoetanol 5%) hasta llenar el tubo. Después de homogenizar vigorosamente
usando un pistilo e incubar por 5 min en hielo, se centrifugó a 16000 g por 5 min a 4oC.
La fase fenólica (superior) se transfirió a un tubo nuevo de 2mL y se le adicionó acetato
de amonio 0,1M en metanol. Luego de dejar precipitar toda la noche a -20oC, se
centrifugó a 16000 g por 5 min a 4oC para eliminar finalmente el sobrenadante por
221
decantación. El pellet resultante se lavó con metanol al 100% y posteriormente con
acetona al 80%, realizando centrifugaciones en cada caso a 16000 g por 5 min a 4oC. El
pellet se secó a temperatura ambiente para eliminar los residuos de acetona. Finalmente
el pellet libre de acetona se disolvó en 200µL del buffer de solubilización antés descrito y
se agitó por 4h a 4oC. Al igual que en los tratamientos anteriores, luego de cuantificar las
proteínas usando el método de Bradford, el extracto se guardó a -20oC para posteriores
análisis.
Criterio para la selección de condiciones de extracción para proteínas totales a partir de tallos y raíces de clavel
Con el fin de comparar los métodos de extracción propuestos, además del rendimiento
expresado como mg proteína/g material vegetal, se evaluó la calidad de la separación
por 1DE y posterior detección usando Stain-Free Criterion de Biorad ®, con geles
preteñidos y prefabricados con un gradiente continuo del 4 al 20%. El buffer de
electroforesis fue Tris-HCl 0.05M pH 8,3, Glicina 0.2M y SDS 0.1%. En cada pozo se
colocaron 15 µg de proteína (Ramagli & Rodriguez 1985), provenientes de extractos
obtenidos por los métodos previamente descritos. La separación se realizó a voltaje
constante de 150V. La asignación de pesos moleculares se efectuó usando los
marcadores Precision Plus Protein Standards Biorad®. La visualización se realizó usando
el equipo Criterion Stain Free de Biorad ®, capturando la imagen correspondiente. La
calidad de la separación se evaluó mediante el número de bandas obtenido para cada
uno de los tratamiento ensayados en cada órgano de la planta usando el programa
Quantity One de Biorad ®
Posteriormente, con el fin de constatar la calidad de los extractos obtenidos mediante el
método de extracción seleccionado, se realizaron electroforesis en 2D de diferentes
cantidades de proteína total, usando tiras de IPG (Inmovilized pH Gradient) de 11 cm en
el rango de pH entre 3 y 10, en el equipo PROTEAN IEF cell Biorad ®. Para la segunda
dimensión, se usaron al igual que en 1D, geles prefabricados del sistema Criterion de
Biorad ®. En la primera dimensión se usaron volúmenes de extracto equivalentes a 100 y
200 µg de proteína y se llevaron a 185 μL, usando para ello el buffer de hidratación de
tira que presentaba la composición: urea 7M, tiourea 2M, CHAPS 4%, azul de bromofenol
0,1%, 100 mM DTT y 0,2 % de anfolitos rango 3-10 Biorad®. Luego de realizar el
proceso correspondiente de hidratación activa a 50 V por 16 horas, se usó un programa
222
para la separación a 20oC y un voltaje final de 8000 V (30 000 V-h). La corriente máxima
por tira fue de 50 µA. Al finalizar esta separación, las tiras se dispusieron para el proceso
de equilibrio correspondiente mediante agitación por 15 min., en una solución de Tris-HCl
375 mM pH 8,8, urea 6 M, glicerol 20%, SDS 2% y 2% DTT por 15 min y posteriormente
por otros 15 min, con la misma solución sin DTT, pero complementada con
iodoacetamida al 2%.
Se realizó luego la separación en la segunda dimensión en geles prefabricados de
poliacrilamida con un gradiente de 8 al 20 % y usando el patrón de peso molecular antes
mencionado. Luego de posicionar las tiras previamente equilibradas sobre el gel evitando
la entrada de burbujas, se realizó el correspondiente sellado usando la solución
compuesta por agarosa 0,5% y 0,01% de azul de bromofenol. La separación
electroforética se realizó a un voltaje constante de 150V a T ambiente. La detección y
posterior obtención de imágenes de los geles se realizó en el equipo Stain-Free Criterion
de Biorad ®. Finalmente, se evaluó de manera visual la presencia de “striking” en los
diferentes geles obtenidos para extractos de tallos y raíces de clavel; la presencia de éste
es uno de los criterios que se usan para determinar la existencia de contaminantes no
proteicos.
5.2.3. Selección de condiciones de separación en geles grandes
Selección de condiciones para la tinción en geles de 1D
Durante la selección de condiciones para la separación en geles grandes de 20X20 cm,
se evaluó el método de tinción que presentaba una mayor sensibilidad en la detección de
proteínas. Para ello se usaron extractos obtenidos mediante el método de extracción
seleccionado (TCA/Acetona/Fenol), a partir de raíces de las variedades L.P. Candy y
Tasman a las 0 y 6 hpi con el patógeno y sus respectivos controles sin inocular. Con
estos se llevaron a cabo electroforesis en geles de poliacrilamida con SDS (SDS-PAGE),
usando el sistema PROTEAN II XL Cell de Biorad ®. El sistema de separación consistió
en un gel de poliacrilamida al 12% (p/v) para la separación de las proteínas y uno de
concentración al 5% (p/v). El buffer de corrido fue Tris-HCl 0,05M pH 8,3, SDS 1%(p/v).
En cada pozo se colocaron 100 µg de proteína previamente cuantificados y la separación
se desarrolló a un voltaje constante de 100V a 4oC. La asignación de pesos moleculares
se realizó mediante comparación con el marcador SDS-PAGE Standards 6,5-200 KDa
223
Biorad®. Una vez realizada la separación, se evaluaron los procedimientos de tinción
que se describen a continuación:
Tinción con Sypro Rubi
Los geles se dispusieron en recipientes plásticos independientes y se lavaron por 30 min
con la solución fijadora que contiene metanol 10% y ácido acético 7%. Esta solución se
retiró y se adicionó Sypro Ruby Biorad ® hasta cubrir todo el gel. Después de agitar en la
oscuridad por 18 horas, se retiró la solución de tinción y se adicionó nuevamente la
solución fijadora metanol 10% y ácido acético al 7%. Luego de agitar durante 30 a 60
min, se lavó con abundante agua destilada y se capturó la imagen en el equipo escáner
de fluorescencia (FX Pro Plus Multiimager, Bio-Rad).
Tinción con Sypro-Comassie
Cada gel luego de ser digitalizado, se lavó por 3 a 4 horas con la solución bicarbonato de
amonio 20mM y acetonitrilo al 50%, con el fin de eliminar el Sypro. Luego de lavar con
agua destilada-desionizada por 30 min, se adicionó suficiente Comassie coloidal (0.06M
(NH4)2SO4, 20% (v/v) metanol, 1.9 % (w/w) H3PO4, 0,1 % (w/v) Coomassie G-250) para
cubrir cada gel y se agitó durante 60 h. Cuando terminó el proceso de tinción, cada gel se
lavó por 3 min, en la solución para desteñir A (0.1 M Tris-H3PO4, pH 6.5) y luego por 1
min, en la solución para desteñir B (25% (v/v) metanol). Finalmente, los geles se
mantuvieron en solución de desteñir C (sulfato de amonio 20% p/v) por mínimo 24 horas
y se digitalizó la imagen usando el densitómetro calibrado GS-800 de Biorad ®.
La selección del método de tinción se realizó comparando la sensibilidad obtenida en
cada caso, evaluando el número de bandas para un mismo extracto con el programa
Quantity one de Biorad ®
Selección de condiciones de separación en geles de 2D
Selección de cantidad de proteína en electroforesis 2D y de gradiente de pH
En la selección de la cantidad de proteína para realizar la separación en la primera
dimensión en geles grandes, se adicionó en tubos independientes 200µg y 400µg de
proteína de los extractos obtenidos a partir de tallos y raíces liofilizados de clavel. Se
224
completó a 400 µL usando el buffer de rehidratación descrito anteriormente y se agitó
vigorosamente. En el porta tiras, se adicionó esta solución y una tira de IPG de 17 cm
con un rango lineal de pH de 3 a 10, por cada una de las muestras. Se realizó el proceso
de rehidratación activa colocando el electrodo porta tiras en el equipo de enfoque
(PROTEAN IEF Biorad ®) por 16 horas a 50V. La separación se realizó a 20oC y un
voltaje final de 10000 V (60000 V-h). La corriente máxima de 50µA/tira. Luego de realizar
la separación en la primera dimensión, se equilibraron las tiras con 5 mL de buffer de
equilibrio de tira que contiene DTT al 2% durante 15 minutos en agitador reciprocante.
Luego se retiró esta solución y se realizó el mismo procedimiento usando la misma
solución pero con iodoacetamida al 2%. Después de realizar un lavado final con buffer de
corrido para eliminar la solución de equilibrio remanente, se realizó la separación en la
segunda dimensión colocando la tira en la parte superior de un gel grande previamente
preparado de 20 x 20 cm y 12% de acrilamida para el sistema PROTEAN II XL Cell. Se
usó el marcador (SDS-PAGE Standards 6,5-200KDa Biorad®) al lado izquierdo de la tira.
Luego de sellar cuidadosamente con la solución de sellado previamente descrita, se
realizó la separación electroforética a 100V. La tinción se realizó de acuerdo a las
condiciones previamente seleccionadas (Sypro-Comassie) y la imagen se tomó usando
el densitómetro calibrado. La selección de la cantidad de proteína se realizó mediante la
comparación visual de la resolución de la separación y el número de manchas proteicas
presentes para las dos cantidades de proteínas evaluadas, en cada órgano de la planta.
Bajo las condiciones seleccionadas de cantidad de proteína, se evaluó el gradiente de pH
en las tiras de IPG para la primera dimensión. Para ello se usaron tiras de IPG de 17 cm,
con un rango lineal y otra con un rango no lineal para las muestras de tallo y raíz. Se
siguieron las condiciones de separación en la primera y segunda dimensión descritas
anteriormente. Finalmente, se compararon los diferentes geles obtenidos en términos de
la resolución obtenida en la primera dimensión. Considerando que los resultados
indicaban que las mejores condiciones se obtenían con el gradiente de 3 a 10 NL para
ambos órganos del clavel, se hicieron ensayos adicionales para la asignación de puntos
isoeléctricos. Se realizó la separación del patrón comercial (Specialty Standard IEF de
Biorad ®), usando tiras de estas mismas características, tomando 5 µL de estos patrones
y completando a un volumen final de 400 µL usando buffer de rehidratación, tal y como
se describe anteriormente. Luego se realizó la separación en la primera dimensión bajo
las condiciones previamente descritas: rehidratación activa por 16 horas a 50V y
225
separación a 20oC y un voltaje final de 10000 V (60000 V-h). Las tiras de IPG se tiñeron
directamente con una solución de Comassie-coloidal y se evaluó la posición de los
patrones sobre la tira. La asignación de los puntos isoeléctricos se realizó mediante la
evaluación del desplazamiento desde el punto de pH 3 para los patrones sobre la tira y el
valor de desplazamiento de algunas manchas proteicas características en el gel desde
este mismo punto. Mediante comparación con éstos, se asignaron los pI de otras
proteínas en el programa PDQuest Biorad ®.
5.2.4. Análisis comparativo entre tratamientos usando electroforesis en 1D
Con el fin de comparar los perfiles de proteínas en 1D para las diferentes tratamientos se
realizaron las extracciones de acuerdo al método seleccionado anteriormente
(ATA/Acetona/fenol) a partir de tallos y raíces a las 0, 6, 24 y 96 hpi. Con el fin de obtener
información consistente del fenómeno biológico en estudio, se usaron 3 réplicas
biológicas para cada tratamiento en cada tiempo posinoculación (Valledor & Jorrín 2011).
La separación mediante SDS-PAGE se realizó usando 100 µg de cada extracto, bajo las
condiciones de separación previamente descritas y usando la tinción previamente
seleccionada (Sypro-Comassie). La digitalización de los geles se realizó usando el
densitómetro calibrado) y la comparación correspondiente se realizó mediante el
programa Quantity One Bio-Rad ®. El análisis densitométrico correspondiente se realizó
para cada una de las bandas, con previa normalización con respecto a la banda de PM
84 kDa que presentaba una intensidad constante en la mayoría de los carriles. La
correspondiente comparación para cada banda se realizó usando los valores
previamente normalizados teniendo en cuenta las tres réplicas biológicas realizadas,
usando análisis ANOVA y posterior asignación de diferencias usando el programa
STATGRAFICS 5.1. El análisis de identificación para las bandas de interés se realizó tal
y como se describe en el ítem 5.2.7.
226
5.2.5. Análisis comparativo entre tratamientos usando electroforesis 2D
Teniendo en cuenta los análisis realizados en 1D, se pudo determinar que a las 6 hpi en
raíces y 96 hpi en tallo, se presentaban los cambios más importantes en los perfiles de
proteínas por efecto de la inoculación con el patógeno y en consecuencia, fueron los
tiempos seleccionados para realizar el análisis comparativo en 2D. Para ello, se hicieron
extracciones por triplicado a partir de tallos y raíces de la planta, en los 4 tratamientos
propuestos, de acuerdo a las condiciones antes descritas. Los análisis por electroforesis
en 2D, se llevaron a cabo bajo las condiciones previamente puestas a punto, en términos
de la cantidad de proteína (400µg) y el gradiente de pH para la primera dimensión (3-10
NL). Con el fin de generar la mayor homogeneidad posible en las condiciones
experimentales, se realizaron las electroforesis de manera simultánea para los diferentes
tratamientos, usando el sistema electroforético para doce geles de 20x20 cm Protean
Dodeca Cell Bio-Rad ®. La tinción se realizó mediante el método combinado Sypro-
Coomassie y las imágenes fueron adquiridas con el densitómetro calibrado. El análisis
comparativo en cada órgano se realizó usando el programa PD-Quest de Biorad ® y se
consideraron solamente aquellos manchas proteicas consistentes, presentes en las tres
réplicas evaluadas. Con el fin de normalizar para el análisis de componentes principales
(PCA), todos los datos se transformaron con la función (Log10 X). El análisis estadístico
correspondiente se realizó usando las herramientas estadísticas disponibles en la página
web NIA (http://lgsun.grc.nia.nih.gov/ANOVA/index.html).
5.2.6. Digestión de proteínas en gel e identificación de proteínas por MALDI-TOF/TOF
Los análisis correspondientes de identificación fueron realizados en el laboratorio del
Servicio Central de Apoyo a la Investigación (SCAI) de la Universidad de Córdoba
(España). Para ello, las proteínas de interés se picaron del gel automáticamente en una
estación Investigator ProPic (Genomic Solutions). Los fragmentos del gel resultantes se
digirieron con tripsina y se depositaron sobre la placa MALDI también de manera
automática en una estación ProPrep II (Diglab genomic Solutions Inc. U.K.) con las
siguientes condiciones: dos pasos de destinción de 30 min con una solución del 40%
(v/v) de acetonitrilo y 200mM de bicarbonato de amonio; dos lavados con bicarbonato de
amonio 25mM durante 5 min y nuevamente con una solución del 40% (v/v) acetonitrilo y
227
200mM de bicarbonato de amonio por 15 min. La muestra se deshidrató con acetonitrilo
al 100% durante 5 minutos y se secó, para posteriormente hidratar con 10 µL de tripsina
a 12,5 ng/ µL en bicarbonato de amonio 25 mM durante 10 min a T ambiente. La
digestión se realizó durante 12 h a 37oC y se detuvo adicionando a cada muestra 10 µL
de una solución de ácido trifluoroacetico al 0,5% en agua. Los péptidos resultantes de la
digestión con tripsina, se purificaron mediante una micro-columna de resina C-18 (ZipTip,
Milipore) con elución por adición de una solución de matriz (3 mg/mL de ácido α-ciano-4
hidroxicinamico en 70% de acetonitrilo y 0,1 % de ácido trifluoroacetico) sobre la placa de
MALDI en un volumen de 1 µL. Tras la co-cristalización sobre la placa, las muestras se
analizaron mediante espectrometría de masas MALDI-TOF/TOF para obtener la huella
peptídica (MS) en un espectrómetro 4800 Proteomics Analyzer (Applied Biosystems)
equipado con extracción retardada y reflector en modo positivo. Se realizó calibración
interna de los espectros utilizando las relaciones masa/carga (m/z) de los péptidos
resultantes de la autolisis de la tripsina porcina (M+H+ = 842.509, M+H+ = 2211.104),
obteniendo de esta manera precisión en la medida de +/- 20ppm. De cada muestra se
obtuvieron los espectros de fragmentación (MS/MS) para las m/z más intensas.
La identificación de proteínas se realizó combinando los espectros MS y sus respectivos
MS/MS, sobre la base de datos NCBInr, utilizando MASCOT (MatrixScience) como motor
de búsqueda y limitando la categoría taxonómica a plantas (Viridiplantae), con
carbamidometilación completa de los residuos de cisteína y oxidación parcial de los
residuos de metionina. El error máximo permitido en la búsqueda fue de 100 ppm y el
número máximo de errores en el corte de la proteasa fue de uno.
5.3. Resultados y Discusión
5.3.1. Selección de condiciones para la extracción y separación por electroforesis en 1D y 2D de proteínas presentes en tallos y raíces de clavel
De acuerdo a los resultados encontrados, se determinó que los tres métodos de
extracción evaluados, no presentaron diferencias en términos del rendimiento de la
extracción de proteínas en raíces, mientras que en tallo los métodos B y C presentaron
rendimientos superiores de extracción (tabla No. 23).
228
Tabla No. 23. Rendimiento para los diferentes métodos de extracción de proteínas totales en tallos y raíces de clavel
Rendimiento
(µg proteína/mg
material vegetal)
Procedimiento A
Extracción y posterior
precipitación
Prodecimiento B
TCA/Acetona
Procedimiento C
TCA/Acetona/Fenol
Raíz 15,3 +/- 2,6 14,5 +/- 2,2 14,0 +/- 1,8
Tallo 18,7 +/- 2,5 27,3 +/- 2,7 24,1 +/- 1,2
Los resultados se presentan como el promedio de tres determinaciones +/- la desviación estándar.
Estos resultados indican que bajo las condiciones evaluadas para el caso de las raíces,
cualquiera de estos puede ser usado con la misma eficiencia para la extracción de
proteínas totales. En el caso del tallo, los procedimientos B y C, eran los más indicados
para obtener la mayor cantidad de proteína por mg de material liofilizado. Estas
diferencias son probablemente debidas a características propias del tejido usado, a nivel
del tallo los métodos que incluyen el tratamiento previo con acetona y ATA (B y C), deben
eliminar en buena proporción las clorofilas presentes que pueden afectar la
determinación posterior de proteínas por métodos colorimétricos (Berges et al. 1993).
Además de esto, no hay que olvidar que el punto más importante que se debe evaluar
durante estos ensayos de selección, es la presencia de contaminantes no proteícos que
afectan la movilidad electroforética de las proteínas. Por esta razón, se evaluó la
separación de las proteínas presentes en los diferentes extractos obtenidos, mediante
electroforesis en 1D. De acuerdo a estos ensayos (figura No. 51), se determinó que los
extractos obtenidos a partir de tallo usando el procedimiento B, presentaban una
extracción de contaminantes que afectaban la calidad de la separación y la resolución de
las bandas de bajo peso molecular con pesos menores de 25 kDa. Este efecto no se
presentó para extractos obtenidos a partir de este mismo órgano mediante los
procedimientos A y C. Considerando que este último (C: ATA/acetona/fenol) también
presentaba un valor alto en la eficiencia de extracción (tabla No. 23), este se posicionaba
como el más conveniente para llevar a cabo la extracción de proteína en este órgano de
la planta.
229
51Figura No. 51. Electroforesis en 1D para los extractos obtenidos mediante los diferentes procedimientos de extracción de proteína evaluados a partir de tallos y raíces de clavel. A) Extracción y posterior precipitación, B) TCA/Acetona, C) TCA/Acetona/Fenol. En la parte inferior se encuentra el número de bandas por carril. Cantidad de
proteína en cada pozo 15 µg.
Para el caso de la raíz, los extractos obtenidos, presentaban algún tipo de
contaminantes, siendo mayores para el caso del procedimiento B, seguidos por el A y el
C. Esto indicaba que así como se había seleccionado en tallos, el procedimiento C
presentaba los mejores resultados en términos de la eliminación de contaminantes que
interfieren con la separación de las proteínas extraídas. Este procedimiento que incluye
la precipitación con TCA/Acetona y posterior tratamiento con fenol, se ha constituido en
el procedimiento usado con más frecuencia en la extracción de proteínas de tejidos
vegetales para estudios proteómicos permitiendo la obtención de una fracción
relativamente libre contaminantes no proteicos que afectan la separación electroforética
(Carpentier et al. 2005).
Estos resultados fueron corroborados usando electroforesis 1D con mayores cantidades
de proteína total (figura No. 52), en donde se encontró que los extractos obtenidos
usando TCA/Acetona/Fenol, presentan una muy buena resolución de separación para el
caso del tallo en todas las concentraciones de proteína evaluadas. Para el caso de la
raíz, el efecto de los contaminantes solo se evidenció en las concentraciones de
proteínas más altas (30-40µg). Los tejidos recalcitrantes que se caracterizan por ser
matrices complejas con presencia de altos niveles de compuestos fenólicos y
polisacáridos (Carpentier et al. 2005; A.M Maldonado et al. 2008), como es el caso de las
raíces del clavel, presentan inconvenientes para su estudio a nivel proteómico. Sin
Marcadores de PM
(KDa)
Tallo Raíz
200 150
100
75
50
37
25 20
15
10
Número de Bandas 42 32 41 41 31 40
A B C A B C
230
embargo, de acuerdo a las condiciones evaluadas, el procedimiento C, presentó buenos
resultados en términos de la separación electroforética a niveles de cantidad de proteína
adecuados.
52Figura No. 52. Electroforesis en 1D para los extractos obtenidos mediante el procedimiento TCA/Acetona/Fenol a partir de tallos y raíces de clavel, con diferentes cantidades de proteína total en cada pozo.
Con el fin de determinar si el procedimiento seleccionado (TCA/Acetona/fenol) permitía
obtener extractos proteicos que durante la separación en 2D tuviesen una buena
separación y por tanto una resolución adecuada, se hicieron ensayos en geles pequeños
usando diferentes cantidades de proteína. Los resultados que se encontraron (figura No.
53), permiten evidenciar que los extractos obtenidos usando tallos, presentan una
separación adecuada en 2D; se observa la presencia de manchas proteicas bien
definidas en los dos niveles de proteína evaluadas (100 y 200 µg). A su vez en raíces, si
bien a altas concentraciones de proteína (200 µg) se observa un efecto “striking” para
algunas de las señales, es evidente la presencia de manchas proteicas bien definidas
sobre todo a pHs ácidos para ambas concentraciones de proteína.
La presencia de contaminantes no proteicos a 200 µg de proteína total permite evidenciar
la importancia que tiene realizar la puesta a punto de condiciones con diferentes
cantidades de proteína. No siempre, la mayor cantidad de proteína permite la obtención
de los mejores resultados; aumentar la cantidad de proteína implica también un aumento
en los contaminantes no proteicos que puede afectar la separación en las dos
dimensiones y generar por tanto la presencia de “striking”.
5 10 20 30 40 μg 5 10 20 30 40 μg
Marcadores de PM
(KDa)
Tallo Raíz
200 150
100
75
50
37
25 20
15
10
231
53Figura No. 53. Electroforesis en 2D para los extractos obtenidos mediante el procedimiento TCA/Acetona/Fenol a partir de tallos y raíces de clavel, con diferentes cantidades de proteína total en cada pozo. A: raíz 100 µg, B: raíz 200 µg, C: tallo 100 µg y D: tallo 200 µg.
Estos experimentos permitieron también realizar una evaluación del rango en el cual se
encuentran los puntos isoeléctricos (pIs) de las proteínas de esta especie vegetal. Se
encontró que éstas se distribuyen principalmente en el rango de pH de 4 a 9. Esto
indicaba que el rango seleccionado para trabajar considerando los IPGs comercialmente
disponibles a la fecha, era de 3 a 10; el uso de un rango diferente como el de 5-8 no
permitiría la separación de proteínas con pIs en los rangos 4-5 y 8-9, en donde se
pueden encontrar, en plantas, proteínas que pueden participar en la interacción con
patógenos. Muchas proteínas PRs presentan pIs que se encuentran en estos rangos de
pH (Van Loon et al. 2006).
Con extractos obtenidos bajo las condiciones seleccionadas, se realizaron ensayos
usando geles grandes en el formato de 20x20 cm, esto con el fin de usar cantidades de
proteína superiores a las que se venían trabajando y detectar proteínas que se
encuentran en bajos niveles. Tal y como se citó previamente, muchas de las proteínas
pH3 pH10 pH3 pH10
100µg 200 µg
200 150
100 75
50
37
25 20 15 10
Marcadores de
PM (KDa)
Raíz
Tallo
pH3 pH10 pH3 pH10
200 150
100 75
50
37
25 20 15
10
232
que son de interés en los estudios proteómicos, se encuentran en bajas proporciones y
se deben realizar ensayos adicionales que permitan realizar su detección. Por ejemplo,
es necesario realizar la selección de condiciones de tinción que permitan obtener el
mayor número de bandas o manchas proteicas, en electroforesis 1D o 2D
respectivamente, de acuerdo a las condiciones particulares de trabajo (B. Chakravarti et
al. 2010; Chiangjong & Thongboonkerd 2009).
En ensayos preliminares se había encontrado que la tinción directa con Coomassie
coloidal presentaba baja sensibilidad y solo se detectaba en promedio de 15 a 20 bandas
en electroforesis en 1D para geles en este formato (Resultados no mostrados). Es bien
conocido que el uso de reactivos como el Sypro Ruby para la detección de proteínas en
gel mediante fluorescencia, tiene una mayor sensibilidad que la encontrada con otros
reactivos como el Coomassie Azul Brillante R250 (CBB-R250) o el CBB-G250; mientras
que la sensibilidad de este último se encuentra en el rango de ng, la del Sypro Ruby
puede llegar a los órdenes de los pg (Chiangjong & Thongboonkerd 2009). Sin embargo,
el uso de este reactivo se encuentra limitado grandemente por el acceso al sistema de
captura de imagen que requiere un sistema especializado y de la pérdida de la
fluorescencia con el tiempo, lo cual genera problemas en el almacenamiento de los
geles.
Bajo dichas limitaciones, en el presente estudio se quiso evaluar un método alternativo
que consiste en la tinción combinada Sypro-Coomassie, este procedimiento tiene una
tinción inicial de alta sensibilidad con Sypro Ruby y una posterior tinción con Coomassie
G-250. Para ello, se usaron geles de separación en 1D (SDS-PAGE) de extractos
obtenidos a partir de raíces de las variedades L.P Candy (R) y Tasman (S), a 0 y a 6 hpi,
y se comparó la sensibilidad en la detección de bandas de la tinción directa con Sypro-
Ruby Biorad ®, con respecto a la combinada con Coomassie Coloidal (figura No. 54).
233
54Figura No. 54. SDS-PAGE para la comparación de los métodos de tinción en extractos obtenidos a partir de raíces de clavel. A: Sypro-Ruby Biorad ® y B: Sypro-Ruby Biorad ®- Coomassie coloidal. Las muestras corresponden a 1: L.P. Candy (R) control 0 horas; 2: Tasman (S) control 0 horas; 3: R control 6 horas; 4: R inoculado 6 horas; 5: S control 6 horas; 6: S inoculado 6 horas. Cantidad de proteína en cada pozo 100 µg.
Se encontró que la sensibilidad que presentaban ambas técnicas era similar y que por
tanto, esta última podría ser usada para la tinción de geles en formato grande (20 x 20
cm), con las ventajas previamente mencionadas de sensibilidad y tiempo de
almacenamiento. De hecho, esta última tinción permite la obtención de geles más limpios
sin los interferentes que se presentan de manera frecuente debido a los sedimentos del
reactivo detectados mediante fluorescencia cuando solo se usa el reactivo Sypro Ruby
Biorad ®. Es importante comentar en este punto, que esta técnica combinada era
compatible con los análisis posteriores de identificación usando MALDI-TOF-TOF y fue
por tanto la tinción usada en experimentos posteriores en donde se compararon los
proteomas de las variedades en estudio durante la inoculación con el patógeno.
Con el fin de obtener la mayor información posible en los estudios comparativos que se
planeaban hacer usando geles en 2D, se evaluaron algunos parámetros que deben ser
tenidos en cuenta para su puesta a punto, tal y como se comentó en la parte
Marcadores de peso (KDa)
Marcadores de peso (KDa) 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6 200 116 97
66
45
31
22
14
6.5
200
11697
66
45
31
22
14
6.5
Número de
bandas 54 56 58 56 56 56
234
experimental. Los resultados correspondientes a la evaluación de cantidad de proteína y
el gradiente separación en la primera dimensión se resumen en la tabla No. 24.
Tabla No. 24. Resumen de los resultados de la puesta a punto de condiciones de análisis para la separación en 2D de proteínas obtenidas de tallos y raíces de clavel
Cantidad de proteína Gradiente primera dimensión
200 µg 400 µg 3-10 lineal 3-10 No lineal
Número
de
manchas
Resolución
Número
de
manchas
Resolución
Número
de
manchas
Resolución
Nùmero
de
manchas
Resolución
Raíz 231 Buena 450 Buena 469 Buena 566 Muy
buena
Tallo 270 Buena 502 Buena 509 Buena 541 Muy
buena
(1) Los valores encontrados de número de manchas son obtenidos mediante el programa PD-
Quest.
(2) La resolución se determinó mediante inspección visual y evaluando el enfoque de una misma
mancha proteica en los diferentes tratamientos evaluados
De acuerdo con estos resultados, se pudo determinar que al usar 400 µg de proteína en
geles grandes, usando para la primera dimensión IPGs con un gradiente lineal de 3 a 10,
se obtenía un número de manchas de proteínas que se encontraba entre 450 y 500 para
raíces y tallos respectivamente. Considerando que con esta cantidad de proteína, no se
presentaba striking en los geles y se obtenía una buena resolución durante la separación
en la primera y segunda dimensión, ésta fue la cantidad de proteína seleccionada para
los ensayos posteriores. Al usar cantidades de proteína superiores era probable que se
presentará stricking, tal y como se presentó en los geles pequeños con cantidades de
proteína de 200 µg (figura No. 53). Además de ello, el uso de una cantidad de proteína
superior requería de una mayor cantidad de material vegetal, lo cual podía afectar la
extracción donde el material liofilizado era limitado.
Con la cantidad de proteína seleccionada (400μg) se realizaron algunos ensayos con el
fin de comparar el tipo de gradiente que se usaría en la primera dimensión de la
separación. Se encontró que el uso de tiras con un gradiente no lineal de 3 a 10,
presentaba una mayor resolución que la encontrada para el gradiente lineal y un
aumento en el número de manchas proteicas resuelto para extractos obtenidos a partir
de ambos órganos de la planta. Esto fue una ventaja ya que permitió obtener mayor
235
información de los geles obtenidos en el momento del análisis de las muestras
provenientes del ensayo in vivo. Una muestra de la mejor separación encontrada para el
análisis de extractos obtenidos a partir de tallos y raíces del clavel, de las dos variedades
objeto de estudio, se presenta en la figura No. 55. De manera preliminar, es importante
anotar que algunas de las manchas proteicas se comparten en geles obtenidos de raíces
y tallos de la planta, sin importar la variedad, indicando que muchos de ellos deben
contener proteínas que participan en procesos conservados en las células vegetales. A
pesar de esto se evidencian también manchas proteicas que son particulares de cada
órgano, las cuales probablemente deben estar asociadas a otros procesos que se llevan
a cabo de manera tejido-dependiente.
L.P Candy (Resistente) Tasman (Susceptible)
Tallo
Raíz
55Figura No. 55. Geles 2D de extractos obtenidos a partir de tallos y raíces de clavel bajo las condiciones de separación seleccionadas (Gradiente 3-10 NL y 400 µg de proteína) con tinción sypro-Coomassie.
pH 3 10 pH 3 10 Marcador
(KDa) Marcador
(KDa) 200
116 97
66
45
31
22
14
6.5
200
116 97
66
45
31
22
14
6.5
Marcador
(KDa) Marcador
(KDa) pH 3 10 pH 3 10
200
116 97
66
45
31
22
14
6.5
200
116 97
66
45
31
22
14
6.5
236
En conclusión, las condiciones de separación (400 µg de proteína y gradiente 3-10 NL)
fueron las que finalmente se usaron para el análisis comparativo de proteínas de los
diferentes tratamientos del ensayo in vivo de inoculación con el patógeno. Dicho estudio
se inició con una comparación mediante 1DE en donde se evaluaron algunas diferencias
preliminares y se seleccionaron los tiempos correspondientes al ensayo in vivo que
fueron posteriormente analizados en geles 2D con el fin de encontrar proteínas
asociadas a los mecanismos bioquímicos de la interacción clavel-Fod.
5.3.2. Análisis comparativo entre tratamientos usando 1-DE
Durante el análisis comparativo entre los diferentes tratamientos del ensayo in vivo, se
determinó que usando las condiciones de separación que fueron previamente descritas
(numeral 5.2.4) y la tinción Sypro-Coomassie seleccionada, el número de bandas que se
obtienen para los diferentes extractos de tallos y raíces de clavel, variaba entre 57 y 60.
En la figura No. 56, se presenta una imagen de los geles obtenidos; para cada órgano de
la planta se tenían tres geles similares, obtenidos en cada caso con una réplica biológica
diferente para cada tratamiento y tiempo evaluado. El uso de mínimo 3 réplicas
biológicas en este tipo de estudios es necesaria para obtener información consistente del
fenómeno biológico en estudio (Valledor & Jorrín 2011).
El análisis comparativo de las bandas presentes en las diferentes muestras se realizó
mediante densitometría de acuerdo a las condiciones citadas previamente (numeral
3.2.4). Se usó para efectos de normalización la banda que presentaba un peso molecular
de 84 kDa y una intensidad similar para todos los tiempos de muestreo en ambos
órganos de la planta. La comparación entre tratamientos de los valores de intensidad
normalizados para las diferentes bandas detectadas, se realizó usando herramientas de
análisis multivariado. En general este tipo de aproximaciones estadísticas son las más
convenientes en el análisis de datos obtenidos mediante experimentos proteómicos,
permitiendo evaluar de manera conjunta los resultados y su relación con los tratamientos
objeto de estudio (Valledor & Jorrín 2011; Valero-Galván et al. 2011)
237
56Figura No. 56. Electroforesis 1D (SDS PAGE) en geles grandes 20x20cm de proteínas extraídas de raíces (A) y tallos (B) de clavel, usando el método TCA/Acetona/fenol. Se usaron 100 µg de proteína para cada pozo.1: T1 0hpi; 2: T3 0 hpi; 3: T1 6hpi; 4: T2 6hpi; 5: T3 6hpi; 6: T4 6 hpi; 7: T1 24hpi; 8: T2 24hpi; 9: T3 24hpi; 10: T4 24 hpi; 11: T1 96hpi; 12: T2 96hpi; 13: T3 96hpi; 14: T4 96 hpi. T1: resistente control, T2 resistente inoculado, T3 susceptible control, T4 susceptible inoculado. Al lado derecho del gel se encuentran señaladas las bandas de interés que serán discutidas en la tabla No. 25 y 28 respectivamente.
Análisis comparativo 1D en raíz
El análisis de los resultados obtenidos en este órgano de la planta, se realizó usando
PCA (figura No. 57) y permitió determinar que para este caso (figura No. 57 A), el primer
componente PC1 explicaba el 44 % de la variación y diferenciaba del resto de
tratamientos, aquellos ubicados en el lado derecho de la gráfica: los controles a cero
horas y los tratamientos de la variedad susceptible a las 6 y 24 hpi. Así mismo, para el
PC2 que explicaba el 32% de la variación, se encontró un comportamiento similar, en
donde se agrupaban en la parte inferior de la gráfica, los tratamientos a tiempo cero (T1-
0hpi y T3-0hpi) y los tratamientos de la variedad resistente inoculada a 6hpi (T1 y T2 hpi).
En general, el análisis de los componentes PC1 y PC2, coincidió en que la variación
encontrada (un 76% del total), se encuentra determinada por diferencias propias en los
perfiles de las variedades y a cambios asociados al tratamiento de inoculación y las
condiciones ambientales del ensayo in vivo. De hecho, este análisis multivariado permitió
agrupar y por tanto diferenciar, los tratamientos correspondientes de la variedad
Marcador
(KDa) Marcador
(KDa) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
200
116 97
66
45
31
22
14
6.5
200
116
97
66
45
31
22
14
6.5
32
39
55
51
238
resistente con respecto a los de la variedad susceptible (figura No. 57 B). Estos
resultados son de esperarse considerando que los cambios en los proteomas son
sensibles a las condiciones ambientales y al genotipo en estudio para diferentes especies
vegetales (Valero-Galván et al. 2011; Kosová et al. 2011).
57Figura No. 57. Análisis estadístico por PCA (A) y agrupamientos jerárquicos “hierarchical clustering” (B) para los resultados obtenidos en 1D a nivel de la raíz durante la infección con el patógeno. T1: resistente control, T2 resistente inoculado, T3 susceptible control, T4 susceptible inoculado
Los grupos encontrados mediante agrupación jerárquica de estos mismos resultados,
generaron información similar a la encontrada mediante PCA, en donde se definen
grupos en función de la variedad vegetal y el tiempo posinoculación (figura No. 57 B). Se
ha determinado por ejemplo, que esta misma herramienta en el estudio de la variabilidad
genética en bellota de encina (Quercus ilex subesp. ballota), permite agrupar y
diferenciar los genotipos de esta especie en función de su procedencia, de acuerdo a las
diferencias encontradas en sus perfiles en 1D (Valero-Galván et al. 2011).
De acuerdo a este análisis estadístico se encontró que la respuesta al patógeno no tenía
un efecto evidente en los perfiles electroforéticos para las variedades estudiadas; ningún
componente diferenciaba controles e inoculados para ninguno de los tiempos evaluados.
Sin embargo, el análisis estadístico comparativo para las diferentes bandas encontradas
(ANOVA) indicó que de las 60 bandas detectadas 13 presentaban diferencias
R
S
R
T1 y 2 6hpi
T1 y 2 96hpi
T1 0hpi
T3 0hpi
T1 y 2 24hpi
T 3 y 4 6hpi
T 3 y 4 24hpi
T 3 y 4 96hpi Susceptible
Resistente
T1 0hpi
T2 6hpi
T1 6hpi
T4 24hpi
T3 24hpi
T3 0hpi
T4 6hpi
T3 6hpi
T4 96hpi
T3 96hpi
T2 96hpi
T1 96hpi
T2 24hpi
T1 24hpi
A B
239
significativas entre al menos dos tratamientos y que entre éstas las bandas 33, 39 y 55,
aumentaban en la variedad resistente inoculada con el patógeno (tabla No. 25).
Tabla No. 25. Resumen de las bandas que presentaron aumento en su intensidad en la variedad resistente por efecto de la inoculación con el patógeno.
Número
de la
Banda
Peso
molecular
(kDa)
Banda y resultados de la densitometría
32 40,5
39 34,1
55 19,9
La intensidad normalizada se expresa como la relación porcentual de la banda de interés con respecto a la
intensidad de la banda control (Intensidad banda de interés/banda control)*100. T1: resistente control, T2
resistente inoculado, T3 susceptible control, T4 susceptible inoculado.
0
100
200
300
400
T1-0hpi T3-0 hpi T1-6 hpi T2-6 hpi T3- 6 hpi T4-6 hpi
Inte
ns
ida
d
no
rma
liza
da
0
20
40
60
80
100
120
140
160
T1-0hpi T3-0 hpi T1-6 hpi T2-6 hpi T3- 6 hpi T4-6 hpi
Inte
ns
ida
d
no
rma
liza
da
0
50
100
150
200
250
300
350
T1-0hpi T3-0 hpi T1-6 hpi T2-6 hpi T3- 6 hpi T4-6 hpi
Inte
ns
ida
d
no
rma
liza
da
240
El aumento diferencial de la intensidad de estas bandas en la variedad resistente por
efecto de la inoculación, permitió proponer que contenían proteínas que se inducen como
parte de los mecanismos de defensa de la planta. Con el fin de obtener información
sobre dichas proteínas, se realizó el análisis de identificación correspondiente mediante
MALDI-TOF/TOF, de acuerdo a las condiciones previamente descritas en la parte
experimental (Numeral 5.2.7). Considerando que estas bandas contenían probablemente
más de un tipo de proteína, se optó por realizar el correspondiente análisis de la banda
de interés, tanto en el tratamiento inoculado como en su correspondiente control. De esta
manera, al comparar los resultados obtenidos, aquellas proteínas que se encuentran
únicamente en el tratamiento inoculado (diferencias cualitativas), serían consideradas
proteínas candidatas para ser asociadas con los mecanismos de defensa que se activan
a nivel de raíz en la variedad resistente. Los resultados correspondientes a estos
cambios cualitativos, se presentan en la tabla No. 26.
Tabla No. 26 Resumen de las diferencias cualitativas encontradas para las bandas 32, 39 y 55 entre inoculados y controles a 6 hpi a nivel de la raíz
Número de la
banda
Peso molecular calculado por SDS-
PAGE
MASCOT Protein score
MASCOT Protein
score (%) Nombre de la proteína y fuente
PM (KDa)
Número de la accesión
32
40,5 67 99,3 Protein kinasa (Predicted protein) Physcomitrella patens sub. Patens 49
Gi 168005752
40,5 62 97,4 Factor de elongación Tu Nephroselmis olivácea
44 GI 11467799
39
34,1 65 98,8 Similar a Proteina Rica en
Hidroxyprolina Oryza sativa Grupo Japonica
119 GI 55297400
34,1 65 98,8 C2orf4 Extradiol dioxygenasa
Ricinus communis 33,8 GI
255548834
34,1 64 98,7 Ribokinasa (Predicted protein)
Vitus vinífera 78,2 GI
225440578
55
19,9 64 98,6 Estructural en mantenimiento de cromosomas (Predicted Protein)
Micromonas sp. 374
GI 255089032
19,9 61 96,8 Proteína relacionada con
patógenesis PR-10 Cicer arietinum
16,7 GI 499171
19,9 66 96,5 Proteína probablemente
relacionada con transporte vesicular Arabidopsis Thaliana
35,9 GI 21595428
Las proteínas que están marcadas con verde, presentan coincidencia con respecto al peso molecular reportado
para la accesión correspondiente identificada
241
De acuerdo a los resultados obtenidos, en ninguno de los casos se pudo realizar una
identificación 100% certera que permitiera confirmar la participación de dichas proteínas
en los mecanismos de defensa del clavel a nivel de la raíz; la búsqueda del MASCOT
considera significativos los “protein scores” > 71, y además que alguno de los péptidos
haya sido fragmentado, es decir, que se le haya hecho el MS/MS aparte de la huella
peptídica. Esta baja coincidencia se debe muy probablemente al bajo número de
secuencias que a la fecha han sido anotadas y publicadas para el caso del clavel, esto
disminuye la posibilidad de que el motor de búsqueda MASCOT encuentre coincidencias
con los puntajes adecuados. Otra posibilidad puede ser también que la calidad de la
mancha proteica no sea buena para obtener espectros de calidad; una baja
concentración de la proteína de interés puede generar problemas en la digestión y
posterior fragmentación para la identificación de péptidos.
A pesar de este panorama, la búsqueda realizada generó accesiones que además de
tener un “protein score” cercano a 71, presentaban pesos moleculares cercanos al
encontrado experimentalmente. Si bien es cierto que dichas proteínas no pueden ser
consideradas en el análisis final de este estudio, es interesante comentar que estas han
sido involucradas en los mecanismos de defensa que se activan en las plantas ante
diferentes tipos de patógenos. Este es el caso, por ejemplo, de la proteína PR-10 y las
proteínas quinasas, las cuales ha sido involucradas en defensa a patógenos del género
Fusarium (Katilé et al. 2010; Zambounis et al. 2012; Asano et al. 2012). La confirmación
del aumento de estas proteínas por efecto de la inoculación con el patógeno Fod en el
clavel, debe ser objeto de investigación en próximos estudios.
Para el caso de la banda 55 en los experimentos de raíz, es importante comentar que si
bien no se presentaron diferencias cualitativas entre el control y el correspondiente
inoculado con unos puntajes estadísticamente significativos, si se encontró en ambos
tratamientos la presencia de la ciclofilina (tabla No. 27), enzima que se encuentra a nivel
constitutivo y ha sido asociada con la correcta conformación tridimensional de las
proteínas considerando su actividad Peptidil prolil cis-trans isomerasa, la cual le permite
modificar estructuras tridimensionales durante diversos procesos celulares (Sekhar et al.
2010). Se ha determinado por ejemplo que el papel de estas enzimas puede estar
asociado con la mitigación de diferentes tipos de estrés biótico o abiótico, minimizando el
plegamiento de las proteínas por efecto del estrés, promoviendo la disociación de
242
agregados proteícos bajo las mismas condiciones y la correcta conformación de
proteínas relacionadas con patógenesis (PRs Pathogenesis Related) (Dwivedi et al.
2003; A. V Godoy et al. 2000; Fernández et al. 2012). Es probable que los cambios que
se presentan en esta banda (tabla No. 25), se deban a cambios cuantitativos en los
contenidos de esta proteína constitutiva de las raíces del clavel y que aumenta sus
niveles para llevar a cabo la correcta activación de la respuesta de defensa contra el
patógeno.
Tabla No. 27. Identificaciones realizadas para la banda 55 tanto en el inoculado como en el control no inoculado a las 6 hpi
Número de la
banda
Peso molecular calculado por SDS-
PAGE
MASCOT Protein score
MASCOT Protein
score (%)
Nombre de la proteína y fuente
Peso Molecular
(KDa)
Número de la accesión
55*
19,9 85 99.99 Ciclofilina A-1 de Triticum
aestivum 18,7 gi|13925731
19,9 77 99,93 Ciclofilina 2 de Dasypyrum
villosum 18,6 gi|156193311
19,9 77 99,93 Ciclofilina Gerbera hybrid
cultivar 18,3 gi|157272141
*Esta banda corresponde a la misma descrita en las tablas No. 25 y 26
Dentro de los resultados encontrados era evidente que el mayor cambio en los perfiles de
proteínas en 1D en raíces del clavel, se presentaba a las 6 hpi., por lo que se
seleccionaron dichas muestras para realizar los análisis en 2D, en donde se buscaba
conocer más sobre los cambios a nivel del proteoma en este órgano de la planta por
efecto de la inoculación con el patógeno causal del marchitamiento vascular.
Análisis comparativo en 1D en tallo
Con el fin de conocer los cambios que se presentaron en los perfiles de proteínas en
electroforesis en 1D, durante la inoculación con Fod a nivel del tallo, se realizaron los
análisis densitométricos con fines comparativos de los extractos obtenidos a partir de los
tejidos a 6, 24 y 96 hpi (figura No. 56). Se encontró, de acuerdo al análisis estadístico
multivariado realizado (figura No. 58), que la mayor parte de la variación (PC1 45% y
PC2 30%) estaba determinada por diferencias entre las variedades usadas y los tiempos
posinoculación, tal y como había sido encontrado previamente en raíces de la planta. La
distribución de los diferentes tratamientos en función de las variedades fue similar al
243
encontrado previamente en este otro órgano (figura No. 57 A). De la misma manera, los
agrupamientos jerárquicos encontrados para estos resultados (figura No. 57B), son
dependientes principalmente de la variedad objeto de estudio y del tiempo
posinoculación. Este resultado está de acuerdo con el conocido efecto que tienen las
condiciones ambientales en los proteomas vegetales y que ha sido previamente
discutido.
58Figura No. 58. Análisis estadístico por (A) PCA y (B) agrupamientos para los resultados obtenidos en 1D a nivel
del tallo durante la infección con el patógeno. T1: resistente control, T2 resistente inoculado, T3 susceptible control, T4 susceptible inoculado
Con respecto al análisis estadístico (ANOVA) de la intensidad de las diferentes bandas
encontradas, se encontró que de las 60 detectadas en este órgano de la planta, 17
presentaban diferencias significativas en al menos dos tratamientos comparados y dentro
de éstas, se detectó un aumento significativo en la banda No. 51 en la variedad
resistente (L.P Candy) inoculada a las 24 hpi. Esta banda que no fue detectada en el
correspondiente control a este tiempo posinoculación, presentó un aumento en sus
niveles en la misma variedad resistente a las 96 hpi en controles e inoculados (tabla No.
28)
S
R
S
R
T1 y 2 6hpi
T1 y 2 96hpi
T1 0hpi
T3 0hpi
T1 y 2 24hpi T 3 y 4 6hpi
T 3 y 4 24hpi
T 3 y 4 96hpi
Susceptible
Resistente
T4 24hpi
T3 24hpi
T3 0hpi
T4 6hpi
T3 6hpi
T1 0hpi
T2 6hpi
T1 6hpi
T2 24hpi
T1 24hpi
T4 96hpi
T3 96hpi
T2 96hpi
T1 96hpi
244
Tabla No. 28. Banda que presentó cambios asociados con resistencia en la variedad L.P Candy a nivel del tallo
Número
de la
Banda
Peso
molecular
(kDa)
Banda y resultados de la densitometría
51 17,5
Esta banda fue picada e identificada mediante MALDI-TOF-TOF y se determinó que
corresponde a una ciclofilina (tabla No. 29), proteína que había también sido asociada
previamente a los mecanismos de defensa que se activan en raíces de clavel (tabla No.
27). Este resultado era evidencia que un aumento en los niveles de esta proteína estaba
asociado a la resistencia al marchitamiento vascular a las 24 hpi, siendo un mecanismo
conservado para ambos órganos de la planta. El aumento encontrado en el control a 96
hpi indica que esta proteína también está asociada con la adaptación a las condiciones
ambientales en este tiempo, fenómeno que ha sido también descrito en otras especies
vegetales para mitigar los efectos asociados al estrés abiótico (Kambakam 2010).
Tabla No. 29 Identificaciones realizadas para la banda 51 en tallos de la variedad resistente L.P. Candy a las 24hpi con Fod
Número de la
banda
Peso molecular calculado por SDS-
PAGE
Protein score
Protein score
(%)
Nombre de la proteína y fuente
Peso Molecular
(KDa)
Número de la accesión
51
17,8 106 100 Ciclofilina putativa Ricinus communis 18,3 gi|255538956
17,8 105 100 Ciclofilina
Gerbera hybrid cultivar 18,3 gi|157272141
0
100
200
300
400
500
T1-0hpi
T3-0hpi
T1-6hpi
T2-6hpi
T3- 6hpi
T4-6hpi
T1-24hpi
T2-24hpi
T3- 24hpi
T4-24hpi
T1-96hpi
T2-96hpi
T3- 96hpi
T4-96hpi
Inte
nsid
ad
no
rmalizad
a
245
El mayor cambio en los perfiles de proteínas en 1D en tallos de clavel, se presenta a las
24 hpi por lo que este tiempo fue el seleccionado para realizar los análisis en 2D en
donde se buscaba conocer más sobre los cambios a nivel del proteoma, en este órgano
de la planta por efecto de la inoculación con el patógeno.
En general, los resultados obtenidos en el análisis comparativo por electroforesis en 1D
en tallos y raíces de la planta, permitieron realizar un acercamiento a aquellas proteínas
que durante la infección con Fod aumentan sus niveles en la variedad L.P. Candy y están
por tanto probablemente involucradas en los mecanismos asociadas a la resistencia a la
enfermedad. Sin embargo, la resolución limitada de este tipo de análisis no permite
evaluar cambios en algunas proteínas que se encuentran en bajas proporciones en los
extractos y genera la necesidad del uso de una técnica de mayor resolución como la
electroforesis 2D.
5.3.3. Análisis comparativo entre tratamientos usando electroforesis en 2D
Análisis en raíz usando 2D
Durante este estudio de proteómica comparativa mediante electroforesis 2D realizado en
raíces de clavel, es importante recordar que la selección del tiempo de análisis (6 hpi) se
realizó teniendo en cuenta la fase inmediatamente anterior y lo obtenido en trabajos
previos realizados en este modelo(Ardila & Higuera 2005; Cuervo et al. 2009; Ardila et al.
2011). Si bien es cierto que estudios llevados a cabo para otros modelos que involucran
patógenos del género Fusarium, han citado que los cambios a nivel de proteoma en
estos tiempos tempranos, son de menor intensidad y por tanto de mayor dificultad de
análisis si se comparan con los encontrados en fases posteriores de la interacción
(Palomares-Rius et al. 2011), el objetivo de este estudio era determinar precisamente
aquellos pequeños cambios tempranos que se presentan durante las primeras fases de
la interacción y que están asociados a la resistencia a patógenos vasculares (Beckman
2000).
246
En la figura No. 59 A se presenta el gel master, el cual incluye todas las manchas de
proteínas que fueron detectadas en todos los tratamientos evaluados (T1 0hpi, T3 0hpi,
T1 6hpi, T2 6hpi, T3 6hpi y T4 6hpi) usando el programa PD-Quest Biorad ® y dos
muestras de geles obtenidos con extractos de la variedad resistente a las 6 hpi control T1
6hpi (B) e inoculado T2 6hpi (C).
59Figura No. 59. Gel master definido por el programa PD-Quest para la comparación en raíz (A) y muestra de geles para los tratamientos T1 6hpi (B) y T2 6hpi (C). La separación se realizó según las condiciones descritas (numeral
5.2.5) usando 400 µg de proteína en cada caso.
Se encontró que el número de manchas proteicas consistentes en los tratamientos
evaluados (que se encontraban en las tres réplicas), varió de manera importante como
efecto del proceso de inoculación en las dos variedades estudiadas (tabla No. 30). Era
evidente de acuerdo a los resultados encontrados, que los cambios que se presentaron
entre dichos tratamientos fueron principalmente de tipo cualitativo (aparición de nuevas
manchas de proteínas) entre el control correspondiente a tiempo cero y los tratamientos
control e inoculado a las 6 hpi. Estos cambios muestran la sensibilidad que tiene el
proteoma del clavel al proceso de inoculación y siembra, el cual incluye cambios en
temperatura, humedad y condiciones de siembra.
Marcador
(KDa)
pH 3 10 pH 3 10 pH 3 10
200
116 97
66
45
31
22
14
6.5
C B A
247
Tabla No. 30 Resumen de la variación en el número de manchas electroforéticas para los diferentes tratamientos para el análisis comparativo en 2D a nivel de la raíz
Tratamientos
Número
de
manchas
de
proteínas
Manchas
consistentes
Cambios
cualitativos
“aparición”
Cambios
cualitativos
“desaparición”
Cambios
cuantitativos
aumento
Cambios
cuantitativos
disminución
T1 0hpi 469+/- 50 405 - - - -
T3 0hpi 566 +/- 3 537 - - - -
T1 6hpi 886+/- 23 798 470* 28* 1* 1*
T2 6hpi 831 +/- 5 788 437* 58* 1* 0*
T3 6hpi 732 +/- 5 689 262* 89* 3* 2*
T4 6hpi 763 +/- 20 689 297* 91* 4* 1*
Análisis realizado comparando el número de machas proteicas para cada tratamiento contra lo
encontrado en el control para cada variedad a 0 hpi. T1: resistente control, T2 resistente inoculado, T3
susceptible control, T4 susceptible inoculado
El análisis correspondiente de PCA (figura No. 60 A), confirmó el efecto que tuvo el
proceso de inoculación, al comparar los tratamientos a 6 hpi con el control a tiempo cero
para ambas variedades; mientras que el componente PC1 (41% de la variación) permitía
diferenciar los tratamientos de la variedad resistente a las 6hpi, el PC2 (32% de la
variación) hacia la misma diferenciación para el caso de la variedad susceptible. Estos
resultados indicaban que los cambios presentes en la aparición de manchas proteicas
por el proceso de inoculación, eran respuestas dependientes de la variedad en estudio.
Esto nos muestra que los cambios en el proteoma por efecto de condiciones de estrés
abiótico en el clavel, dependen del genotipo vegetal en estudio, tal y como ha sido
sugerido para otras especies vegetales (Kosová et al. 2011; X.-J. Liu et al. 2013).
Este análisis multivariado también permitió agrupar los tratamientos resistentes y
susceptibles en zonas diferentes en el diagrama de variación (PC1 vs PC2) indicando
que una parte de la variación está determinada por diferencias propias entre variedades.
Dichas diferencias en términos de la distribución de manchas proteicas, eran de
esperarse considerando la dependencia que tienen en función del genotipo vegetal
(Valero-Galván et al. 2011). En general, los resultados obtenidos por PCA fueron
corroborados usando herramientas de agrupamiento jerárquico, considerando que bajo
esta herramienta estadística, los diferentes tratamientos se agruparon de la manera muy
248
similar, primero en función del tiempo posinoculación y luego en función de la variedad
(figura No. 60 B).
60Figura No. 60. Análisis estadístico por (A) PCA y (B) agrupamientos para los resultados obtenidos en 2D a nivel de la raíz durante la infección con el patógeno. T1: resistente control, T2 resistente inoculado, T3 susceptible control, T4 susceptible inoculado
El análisis estadístico para los resultados obtenidos para todas las manchas
electroforéticas detectadas se realizó mediante ANOVA, teniendo en cuenta las
recomendaciones hechas para otros estudios cuando se trabaja con datos proteómicos
(Valledor & Jorrín 2011). El uso de ANOVA convencional tiene sus desventajas, ya que
cuando se trabaja con un nivel de significancia del 95% se presume un posible error del
5%, es decir que de 100 análisis de varianza es probable que se presenten 5 falsos
positivos, durante la negación de la hipótesis nula planteada. Cuando se trabajan con
1000 manchas de proteínas en un estudio proteómico, el error se puede cometer en 50
de estas; un número importante que exige el uso de herramientas estadísticas alternas.
Por esta razón se usan estadísticos como el FDR “False Discovery Rate” que permiten
controlar la proporción de las hipótesis nulas incorrectamente rechazadas permitiendo a
su vez evaluar de manera simultánea, múltiples hipótesis evitando hacer múltiples
comparaciones (Valledor & Jorrín 2011). Para esta investigación se pudo determinar que
de las 1108 manchas electroforéticas encontradas en el gel master, (este incluye todas
aquellas manchas que se encontraron en los diferentes tratamientos propuestos), 793
presentaban diferencias significativas en al menos dos de los tratamientos evaluados
(FDR<0,05). Dentro de estas manchas de proteína significativamente diferentes, se
S
R
T 2 6hpi
T1 0hpi
T3 0hpi T1 6hpi
T4 6hpi
Susceptible
Resistente
T3 6hpi
T3 0hpi
T1 0hpi
T4 6hpi
T3 6hpi
T2 6hpi
T1 0hpi
B A
249
incluían aquellas que variaban en función de la variedad, por efecto del proceso de
inoculación y por respuesta a la infección con el patógeno. La evaluación realizada
mostró una alta proporción de manchas de proteína variables, lo cual está de acuerdo
con el importante número de cambios a nivel cualitativo que se encontraron al comparar
los tratamientos a 6 hpi con respecto a los controles de cada variedad a 0 hpi (tabla No.
30).
No hay que olvidar que en el presente estudio eran de particular interés solamente
aquellas diferencias asociadas con resistencia a la enfermedad, es decir aquellas que
diferenciaban las dos variedades en estudio, ya sea a nivel constitutivo o durante su
respuesta a la infección con el patógeno. Por esta razón se compararon los tratamientos
inoculados y controles correspondientes usando un análisis dos a dos “parwise
comparation”, el cual permite comparar de manera específica dos de los tratamientos
objeto de estudio y encontrar aquellas manchas proteicas que determinan las diferencias
entre los mismos con un FDR<0,05. De esta manera se identificaron y seleccionaron
aquellas señales que presentaban diferencias significativas y eran por tanto interesantes,
desde el punto de vista de la interacción de la planta con el patógeno; las que varían
estadísticamente (aumento o disminución) en la variedad resistente inoculada (T2), con
respecto al control no inoculado (T1) a 6 hpi y aquellas que eran superiores a nivel
constitutivo (0hpi) en la variedad resistente (T1) con respecto a la susceptible (T3).
Estas manchas proteícas fueron comparadas en los demás tratamientos evaluados, para
posteriormente seleccionar aquellas que presentaban un patrón asociado con resistencia
y ser finalmente clasificadas en 3 grupos. Para el caso de las que presentaban
diferencias constitutivas (Grupo 1), se seleccionaron aquellas en donde dichas
diferencias se mantenían también a las 6 hpi en los tratamientos de la variedad resistente
y para el caso de las diferencias inducibles, en donde las diferencias encontradas en
términos de aumento (Grupo 2) o disminución (Grupo 3), no se presentaban o eran
menores en la variedad susceptible a este mismo tiempo. Esta selección disminuyó de
manera importante el número total de manchas que eran de interés en los diferentes
grupos (figuras No. 61, 62 y 63). En estas figuras se presenta también, la información
obtenida de los resultados de la densitometría obtenidas para las manchas proteicas
mediante el programa P.Quest Biorad ®.
250
61Figura No. 61. Gel máster con las manchas proteicas asociadas a diferencias a nivel constitutivo entre las variedades de clavel L.P. Candy (R) y Tasman (S) en raíces (Grupo I). Dentro del gel se señala el correspondiente número de identificación para cada una de las manchas de proteínas señaladas. Se presentan para cada uno de ellas, los resultados correspondientes a la densitometría, en gráficas de los promedios de tres replicas biológicas para cada tratamiento, de acuerdo al programa PD-Quest.
Intensidad
máxima
obtenida
ID mancha
proteica
Variedad Susceptible control 0hpi
Variedad Resistente control 0hpi
Variedad Resistente control 6hpi
Variedad Resistente inoculado 6hpi
Variedad Susceptible control 6hpi
Variedad Susceptible inoculado 6hpi
251
62Figura No. 62. Gel máster con las manchas proteicas que aumentaron en la variedad resistente inoculada a las 6hpi con el patógeno en raíces (Grupo 2). Dentro del gel se señala el correspondiente número de identificación para cada una de las manchas de proteínas señaladas. Se presenta para cada uno de ellas, los resultados correspondientes a la densitometría, en gráficas de los promedios de tres replicas biológicas para cada tratamiento, de acuerdo al programa PDquest. La correspondiente codificación de colores se encuentra descrita en la figura No. 61.
Considerando que las bandas de estos tres grupos, eran de interés particular para el
estudio de la interacción clavel-Fod, se realizó la identificación mediante análisis de
MALDI-TOF-TOF. Los resultados correspondientes se presentan en la tabla No. 32,
resumiendo algunas de las propiedades de aquellas manchas proteicas identificadas.
252
63Figura No. 63. Gel máster con las manchas proteicas que disminuyeron su intensidad en la variedad resistente inoculada a las 6 hpi con el patógeno en raíces (Grupo 3). Dentro del gel se señala el correspondiente número de identificación para cada una de las manchas de proteínas señaladas. Se presenta para cada uno de ellas, los resultados correspondientes a la densitometría, en gráficas de los promedios de tres replicas biológicas para cada tratamiento, de acuerdo al programa PD-Quest. La correspondiente codificación de colores se encuentra descrita en la figura No. 61.
La correspondiente discusión sobre la función biológica de las proteínas identificadas y
su posible papel a nivel de la raíz en la interacción clavel-Fod, se presenta en próximos
apartes de este estudio. A continuación se detallan los resultados y su discusión
obtenidos en la comparación realizada a nivel del tallo.
253
Análisis en tallo usando 2D
Durante el análisis proteómico realizado a nivel del tallo se compararon los controles a
cero horas posinoculación, con respecto a los tratamientos controles e inoculados a 24
hpi, bajo las mismas condiciones previamente descritas en raíz. Este tiempo
posinoculación fue seleccionado teniendo en cuenta los resultados del análisis en 1D en
donde se determinó, se presentaban los mayores cambios en términos de los perfiles de
proteínas. El gel máster obtenido para este análisis se presenta en la figura No. 64, en
conjunto con geles representativos al control e inoculado a las 24 hpi para la variedad
resistente L.P Candy.
64Figura No. 64. Gel máster definido por el programa PD-Quest para la comparación en raíz (A) y muestra de geles para los tratamientos T1 6hpi (B) y T2 6hpi (C). La separación se realizó usando las condiciones descritas (numeral
5.2.5) usando 400 µg de proteína en cada caso.
Al respecto se encontró usando el programa PD-Quest, que la variación del número de
manchas proteicas para los tratamientos a las 24 hpi (control e inoculado) con respecto al
control a cero horas en tallo, está determinado principalmente por cambios cualitativos de
manera similar a lo encontrado en raíz previamente. Por ejemplo, de las 597 y 656
manchas encontradas en los tratamientos para la variedad resistente control e inoculado
a 24 hpi respectivamente, entre 150 y 190 corresponden a nuevas señales que no se
encuentran en el control a 0 hpi. Sin embargo, la variación encontrada en este órgano es
mucho menor que la encontrada en raíces en donde los cambios cualitativos se
encuentran entre 430 y 470 (tabla No. 31). Esto es de esperarse considerando que sobre
este último órgano se realizó el proceso de inoculación y es donde se espera un mayor
efecto por el estrés que implica la inmersión durante el proceso de inoculación. En
general, los cambios por el tratamiento de inoculación implementado y la puesta de los
Marcador
(KDa) pH 3 10 pH 3 10 pH 3 10
200
116 97
66
45
31
22
14
6.5
A B C
254
esquejes en las condiciones del ensayo in vivo, tiene un efecto importante sobre el
proteóma de ambos órganos de la planta, tal y como ha sido propuesto para otras
especies vegetales (Kosová et al. 2011).
Tabla No. 31. Resumen de la variación en el número de manchas electroforéticas para los diferentes tratamientos encontrados para el análisis comparativo en 2D a nivel del tallo
Tratamientos
Número
de
manchas
de
proteínas
Manchas
consistentes
Cambios
cualitativos
“aparición”
Cambios
cualitativos
“desaparición”
Cambios
cuantitativos
aumento
Cambios
cuantitativos
disminución
T1 0hpi 541+/- 18 519 - - - -
T3 0hpi 574 +/- 6 458 - - - -
T1 24hpi 684+/- 11 656 187* 25* 7* 2*
T2 24hpi 624 +/- 3 597 149* 53* 2* 4*
T3 24hpi 618+/- 9 577 118* 67* 4* 3*
T4 24hpi 602 +/- 8 578 108* 79* 3* 9*
Análisis realizado comparando el número de manchas proteicas para cada tratamiento contra lo
encontrado en el control para cada variedad a 0 hpi. T1: resistente control, T2 resistente inoculado, T3
susceptible control, T4 susceptible inoculado
Mediante inspección visual se encontró que la distribución de las diferentes manchas de
proteína fue similar para la mayoría de los geles obtenidos de una misma variedad
(controles e inoculados) en cada tiempo de evaluación. Esto efectivamente se comprobó
estadísticamente de acuerdo a los resultados obtenidos en el análisis por PCA de los
datos obtenidos por densitometría, en donde se presenta una agrupación bastante
definida entre los tratamientos de una misma variedad a cada tiempo posinoculación
(figura No. 65 A). Se determinó que el componente PC1 que explica el 46% de la
variación, está determinado por diferencias propias entre variedades; los tratamientos
correspondientes a la variedad resistente se agrupan al lado derecho de la gráfica,
mientras que los susceptibles lo hacen al izquierdo, se manera similar a lo encontrado
previamente en las raíces de la planta (figura No. 60).
Así mismo, el efecto que tiene el tiempo posinoculación se evidencia en el componente
PC2 (33% de la variación), en donde los tratamientos a 0 hpi se encuentran en la parte
inferior de la gráfica, mientras que en la parte superior lo hacen los de 24 hpi. Estos
resultados están de acuerdo con el efecto previamente documentado sobre los cambios
en el proteoma debido a cambios en las condiciones ambientales (Kosová et al. 2011; X.-
255
J. Liu et al. 2013). Por otro lado, el análisis por agrupamiento jerárquico coincidió en
estos resultados y permitió generar grupos asociados a las dos variedades usadas y a
los tiempos posinoculación objeto de estudio (figura No. 65 B).
65Figura No. 65. Análisis estadístico por (A) PCA y (B) agrupamiento para los resultados obtenidos en 2D a nivel de la raíz durante la infección con el patógeno.
En general, es evidente que las herramientas estadísticas de análisis multivariado y
agrupamiento, coinciden en determinar que los cambios más importantes de los
resultados se presentan debido a las condiciones previamente mencionadas y que el
efecto que tiene la respuesta al patógeno es estadísticamente menor. A pesar de ello,
considerando que el objetivo del presente estudio era encontrar diferencias asociadas
con la resistencia a la enfermedad, se realizaron comparaciones pareadas “parwise
comparation” entre los tratamientos controles e inoculados en el caso de la variedad
resistente a las 24 hpi. Se encontraron de esta manera, manchas proteicas que
aumentaban o disminuían significativamente en el tratamiento inoculado y eran por tanto,
de interés para este estudio (FDR<0,05).
La posterior comparación de éstas con los demás tratamientos, permitió seleccionar
aquellas manchas proteicas que presentan un comportamiento que puede estar asociado
con la resistencia de la planta. Se encontraron 10 manchas proteicas con un aumento
diferencial en la variedad resistente inoculada (figura No. 66 y grupo 4), mientras que se
T 2 6hpi
T1 0hpi
T3 0hpi
T1 6hpi
T4 6hpi
Susceptible Resistente
T3 6hpi
T2 24 hpi
T1 24hpi
T3 0hpi
T1 0hpi
T4 24hpi
T3 24hpi
R
S
B A
256
encontraron solo 4 manchas proteicas en donde una disminución de su intensidad estaba
asociada con la resistencia de la planta (figura No. 67 y grupo 5)
66Figura No. 66. Gel máster con las manchas proteicas que aumentaron en la variedad resistente inoculada a las
6hpi en tallo (Grupo 4). Dentro del gel se indica el correspondiente número de identificación para cada una de las manchas de proteínas seleccionadas. Se presenta para cada uno de ellas, los resultados correspondientes a la densitometría, en gráficas que presentan los promedios de tres replicas biológicas para cada tratamiento, de acuerdo al programa PD-Quest. La correspondiente codificación de colores se encuentra descrita en la figura No. 61.
Se realizó la comparación pareada “pairwise comparation” entre la variedad resistente
(T1 0hpi) y la susceptible (T3 0hpi) a nivel constitutivo, con el fin de encontrar posibles
diferencias que estuviesen asociadas con mecanismos de defensa pasiva en este órgano
de la planta y se determinó que existían 36 manchas proteicas que presentaban una
intensidad superior en la variedad resistente. Sin embargo, dichas diferencias en ninguno
de los casos se mantenían a las 24 hpi; estas manchas proteicas no se encontraban para
la variedad resistente a este tiempo posinoculación o presentaban un aumento en alguno
de los tratamientos de la variedad susceptible. Se esperaba encontrar aquellas proteínas
257
constitutivas asociadas a la resistencia a la enfermedad, también a tiempos tempranos
de la interacción en donde se llevan a cabo los fenómenos de activación de las
respuestas de defensa de la planta. Estos resultados indicaban por tanto, que con las
condiciones de separación y detección trabajadas, no se encontraban entidades
proteicas asociadas con resistencia a la enfermedad en este órgano de la planta a nivel
constitutivo.
67Figura No. 67. Gel máster con las manchas proteicas que disminuyeron en la variedad resistente inoculada a las 6hpi en tallo (Grupo 5). Dentro del gel se indica el correspondiente número de identificación para cada una de las manchas de proteínas seleccionadas. Se presenta para cada uno de ellas, los resultados correspondientes a la densitometría, en gráficas que presentan los promedios de tres replicas biológicas para cada tratamiento, de acuerdo al programa PD-Quest. La correspondiente codificación de colores se encuentra descrita en la figura No. 61.
258
5.3.4. Resultados de la identificación de proteínas por MALDI-TOF/TOF
El paso final de esta secuencia de experimentos fue el correspondiente análisis de
identificación usando técnicas basadas en espectrometría de masas, tal y como se
describió previamente en el numeral 3.2.7. Es importante comentar que aunque el
análisis de identificación se realizó para todas las manchas proteicas de interés (Grupos
del 1 al 5), la identificación solo fue certera en algunas de ellas; la mayor parte de los
resultados generó identificaciones con scores no significativos debido a bajas
coincidencias en las bases de datos o a mala calidad en los espectros de masas
obtenidos. Esto último se puede presentar en ciertos casos, cuando la mancha proteica
de interés a pesar de ser detectada con los método de tinción, se encuentra a bajos
niveles y la cantidad de proteína que se requiere para los análisis de identificación, no se
alcanza a obtener del gel en el momento en que se pica con el sistema de estación
investigator ProPic (Genomic Solutions).
Por otro lado, es probable que los resultados de la búsqueda que realiza el motor de
búsqueda MASCOT esté limitada solamente a aquellas proteínas altamente
conservadas, cuando se trabaja con especies en donde el número de secuencias
anotadas es baja como es el caso del clavel. Para esta especie vegetal, apenas se está
generando información en masa sobre secuencias expresadas en diferentes órganos
(Tanase et al. 2012). En general estos factores hicieron que la identificación obtenida en
esta investigación sea baja y solamente se haya realizado la identificación de 14 de un
total de 48 análisis realizados de las muestras obtenidas de geles en 2D. A pesar de ello
se obtienen la identificación para algunos miembros de los grupos de interés en este
estudio, a excepción del grupo 5 (disminución en tallo en la variedad resistente
inoculada) en donde no se realizó ninguna identificación (tabla No. 32). La
correspondiente discusión sobre la función biológica de las proteínas identificadas y su
posible papel en la interacción clavel-Fod, a nivel del órgano que fueron encontrados, se
presenta en el siguiente aparte de este estudio 5.3.5.
Tabla No. 32. Datos identificación por MALDI-TOF-TOF de las proteínas presentes en las manchas proteicas de los grupos de interés
Datos experimentales Resultados de la identificación
Grupo ID PM PI Mascot Score
ProteinScore/ péptidos
coincidentes (% cobertura)/ secuencia péptidos por MS-MS (ion
score)
Nombre de la proteína y fuente Función biológica
PM PI Número de la accesión
1
5524 77,8 6,9 153 100/9 (15)/LLNDEFYIGLR (110) Putative Malic enzyme [Ricinus
communis]
Metabolismo de
carbohidratos 65,4 5,9 255546341
7216 41,8 8,2 120 100/3 (13)/ QCPGIVSCADILAFAAR
(109)
Predicted peroxidase [Physcomitrella patens subsp.
patens]
Respuesta a estrés
oxidativo 35,9 4,98 168019891
2412 60 5,9 71 99,7/13 (34) Predicted Resistance plant protein
(The NB-ARC domain) [Oryza sativa] Respuesta de
defensa 48,7 8,4 218185531
2
3208 44,1 6,1 147 100/8 (29)/ VPEGFDYELYNR (47),
GYPFSLR (30)
Alpha-1,4-glucan-protein synthase [UDP-forming]
[Ricinus communis]
Biosíntesis de pared cellular
41,5 5,82 255547137
5315 56,6 6,8 101 100/4 (13)/ SFTSEFPHVER (27), VPVLETPDGPVFESNAIAR (67)
Glutathione S-transferase Translation Elongation Factor EF1 [Medicago
truncatula]
Biosíntesis de proteínas
47,8 6,4 92893885
4507 72,6 6,4 78 99,9/8 (15)/
GIIEPISSSFINLVNADFTAK (51) Phosphoglycerate dehydrogenase hypothetical protein [Vitis vinifera]
Biosíntesis de aminoácidos
66,7 8,4 225443272
6737 97,2 7,2 114 100/8 (15)/ YGAGIGPGVYDIHSPR
(53), YLFAGVVDGR (34)
Cobalamine-independent methonine synthase
[Arabidopsis thaliana]
Biosíntesis de aminoácidos
84,6 6,0 47600741
5427 61,8 6,7 236 100/19 (27)/ VKFTAEELR (33),
VIYASQLTAKPR (29), NATLTNEKEVDAHPIR (76)
Eukaryotic translation elongation factor, putative EF2 [Ricinus
communis]
Biosíntesis de proteínas
95,0 5,7 255544686
260
3
1306 51,5 5 195 100/9 (29) / IGTPEALDLR (34),
VTSVASFFVSR (43), YEAVIDAYLDGLEASGLSDLSR (68)
Transaldolase [Solanum lycopersicum]
Metabolismo de
carbohidtratos “Ruta pentosas
fosfato “
48,0 5,6 32481059
4310 49,3 6,6 184 100/7(24)/ AYLFPEGTAR (44),
LPGFHVCVGSGGER (107) Monodehydroascorbate reductase
[Acanthus ebracteatus] Regulación
redox celular 46,6 5,3 117067068
5527 76 7 75 99.86/8 (18)/ YQGVVIPEAYER (45) Glucose-6-phosphate dehydrogenase
[Nicotiana tabacum]
Metabolismo de
carbohidtratos “Ruta pentosas
fosfato “
58,8 6,3 3021508
4
5427 50,8 6,4 117 100/7 (23)/ TIFHLNPSGR (33),
FVIGGPHGDAGLTGR (28) Adenosylmethionine synthase 1
[Solanum tuberosum] Metabolismo de un carbon
43,7 5,5 122211500
2737 80 4,3 168 100/12 (23)/ TTPSYVAFTDSER (28),
NAVVTVPAYFNDSQR (25), IINEPTAAAIAYGLDKK (60)
Heat shock protein [Spinacia oleracea]
Respuestas a estres
71,0 5,2 425194
6716 90,5 7,1 279
100/7 (11)/ WAVHSFR (30), YLFAGVVDGR (68),
AGINVIQIDEAALR (78), YGAGIGPGVYDIHSPR (71)
Cobalamin-independent methionine synthase isozyme
[Mesembryanthemum crystallinum]
Biosíntesis de aminoacidos
85,0 5,9 8134568
Las proteínas identificadas se clasificaron en las diferentes funciones biológicas de acuerdo a los términos generados en la búsqueda
en Gene Ontology. Los grupos correspondientes se encuentran clasificados de acuerdo a su comportamiento descrito anteriormente:
diferencias a nivel constitutivo en raíces (grupo 1), cambios en este mismo órgano a nivel inducible (aumento grupo 2) ó disminución
(grupo 3) y aumento asociado a la resistencia en tallo (Grupo 4). Se presentan primero los resultados obtenidos a nivel experimental y
luego los obtenidos durante la identificación correspondiente (Mascot score >71)
5.3.5. Análisis de los resultados de identificación
Las proteínas que fueron identificadas para los cuatro grupos de interés en este estudio
(tabla No. 32), fueron clasificadas de acuerdo a la terminología del Gene ontology, a
diferentes procesos biológicos como lo son: metabolismo de carbohidratos (3),
biosíntesis de aminoácidos (3), biosíntesis de proteínas (2), biosíntesis de pared celular
(1), respuesta a estrés oxidativo (1), respuestas de defensa (1), respuesta a estrés (1),
metabolismo de 1C (1) y regulación redox celular (1). La discusión correspondiente del
papel de estas proteínas se presentará para cada órgano y grupo de manera
independiente, con el fin de asociarlas con los diferentes mecanismos que actúan en la
variedad L.P Candy, resistente al patógeno causal del marchitamiento vascular.
Con respecto a los resultados encontrado a nivel de la raíz, se determinó que entre las
proteínas que se encuentran a nivel constitutivo y están posiblemente asociadas a la
resistencia (Grupo 1) se encuentran la enzima málica o NAD(P) malato deshidrogenasa
(ID 5524). Se ha determinado que la enzima NAD malato deshidrogenasa (E.C 1.1.1.39)
tiene un papel central en el metabolismo de carbohidratos a nivel mitocondrial ya que
permite la descarboxilación de malato para generar piruvato, el cual es finalmente
oxidado en el ciclo de Krebs (Jenner et al. 2001). Así mismo se ha encontrado que la
enzima NADP malato deshidrogenasa (E.C 1.1.1.40), se encuentra principalmente
asociada a diferentes procesos fisiológicos que ocurren a nivel del citoplasma y en
plastidos, como la generación de poder reductor NADPH para diversos procesos como la
biosíntesis de lípidos y metabolitos secundarios (Wheeler et al. 2005). La identificación
correspondiente de esta proteína en raíces de clavel de la variedad resistente, coincidió
de manera particular con una accesión correspondiente a esta última familia de enzimas
(GI 255546341), indicando que la identificada en clavel es probablemente una isoforma
NADP malato deshidrogenasa. Es interesante que esta última familia de proteínas haya
sido asociada a procesos de defensa en otras especies vegetales y se ha determinado
que participa en la generación de poder reductor y ácido pirúvico para la biosíntesis de
fenilalanina y flavonoides (Casati et al. 1999). Este resultado coincide con lo encontrado
previamente en el capítulo I de este estudio en donde se determinó que las variedades
resistentes de clavel presentan una biosíntesis más activa de flavonoides en este órgano
de la planta a nivel constitutivo. Es probable que altos niveles de las enzimas
biosintéticas como las CHS y CHI (Ardila, S. T. Martinez, et al. 2013) y de precursores
262
como la fenilalanina, estén asociados a una mayor biosíntesis de flavonoides y a la
resistencia al patógeno. Este resultado muestra nuevamente la importancia que a nivel
constitutivo tiene la biosíntesis de metabolitos secundarios para la generación de
fitoanticipinas a nivel de la raíz en este modelo.
Otra de las proteínas que fue encontrada a nivel constitutivo en la variedad resistente L.P
Candy, es una peroxidasa de clase III (ID 7216), la cual puede estar asociada a la
regulación de especies altamente oxidantes que se generan durante diversos procesos
fisiológicos de la planta, como puede ser la respuesta a patógenos (Almagro et al. 2009).
Sin embargo, este resultado no es consistente con lo encontrado previamente (Capitulo
4) en donde a nivel de la raíz, no se encontró asociación entre los niveles de la actividad
guayacol peroxidasa constitutiva y la resistencia a la enfermedad (Fig 39). Es probable
que la proteína que se encontró mediante herramientas proteómicas no se encuentre
activa y requiera procesos adicionales que le permitan realizar su activación; se ha
determinado que durante la biosíntesis de estas enzimas se requiere de diversos pasos
como la unión a cofactores y posterior localización para realizar sus funciones en la
planta (Huystee 1987). Así mismo, sí esta enzima se encuentra activa, otra posibilidad es
que no haya sido detectada en la fase anterior de esta investigación debido a una baja
afinidad por el guayacol usado como sustrato. La presencia de isoenzimas con afinidad a
sustratos diferentes a este compuesto, como pueden ser algunos flavonoides, es un
hecho que ha sido documentado en otras especies vegetales (Ferreres et al. 2011). En
general estos resultados muestran la necesidad de profundizar sobre los mecanismos
que involucran a las peroxidasas en este órgano de la planta.
Dentro de las diferencias que se encuentran asociadas con la resistencia a la
enfermedad a nivel constitutivo se encontró la presencia de una proteína (ID 2412) que
presenta un dominio del tipo NB-ARC, el cual es altamente conservado en proteínas de
diferentes organismos como el APAF-1 (Apoptotic protease activating factor 1), proteínas
R en plantas y CED-4 (Caenorhabditis elegans death-4 protein) (van der Biezen and
Jones 1998). Este dominio está definido por la presencia de un sitio de actividad kinasa
asociado a la unión de nucleótidos (NB Nucletotide Binding) ATP/GTP o dATP/dGTP,
además de otros dominios más cortos de función no determinada (Ellis & D. A. Jones
2003). Estas características estructurales propias de este tipo de proteínas se
263
constituyen como una de los dominios regulatorios de muchas de las proteínas de
resistencia en plantas (Gerben Van Ooijen et al. 2008). De acuerdo a estas evidencias,
esta proteína encontrada de manera constitutiva en raíces de la variedad resistente L.P
Candy, se constituiría en el primer reporte de una proteína candidata de resistencia en
clavel. Es probable que esta proteína haga parte del sistema de reconocimiento de Fod
por parte del hospedero y permita la activación de respuestas de defensa de la planta a
este nivel. Diferentes proteínas que presentan esta característica estructural, han sido
previamente identificadas en otras plantas como proteínas de resistencia a patógenos del
género Fusarium (Berrocal-Lobo & Molina 2008; Palomares-Rius et al. 2011).
Sin embargo, es necesario realizar otros estudios que permitan confirmar esta evidencia
experimental ya que de acuerdo al análisis bioinformático realizado sobre la proteína
hipotética de arroz (Oryza sativa) con la cual se realizó esta identificación (GI
218185531) no se encuentran otras características estructurales propias de las proteínas
R como lo son la presencia de dominios ricos en leucina LRR (Leucine-Rich Repeats). Es
por ello necesario profundizar sobre la secuencia completa de la proteína ID2412 para
conocer si presenta otros dominios característico de las proteínas de resistencia y
confirmar su papel como proteína que participa en los mecanismos de reconocimiento y
señalización durante la activación de la respuesta de defensa del clavel.
Con respecto a la respuesta diferencial que se presentó por parte de la variedad L.P
Candy a la inoculación con el patógeno (Grupo 2), se pudo determinar que dentro de la
respuesta a las 6 hpi se presenta un aumento en los niveles de la proteína ID 3208, que
corresponde a una α-1,4- glucano-proteína sintasa (E.C. 2.4.1.113), glicosiltransferasa
asociada a la biosíntesis de componentes hemicelulósicos de la pared celular (Dhugga et
al. 1991). El aumento encontrado en los niveles de esta proteína por efecto de la
inoculación del patógeno, demuestra que dentro de las respuestas de defensa a estos
tiempos tempranos se encuentra un aumento en las enzimas asociadas con la biosíntesis
de pared celular. Estos resultados están de acuerdo con lo encontrado en estudios
previos realizados en raíces clavel, en donde usando microcopia electrónica, se
determinaron cambios a nivel de la ultra estructura celular debidos a la inoculación con el
patógeno (Higuera, 2001). Así mismo, coincide con lo encontrado en otros estudios en
donde se ha descrito un aumento en los niveles de esta enzima, como respuesta al
264
tratamiento con fracciones elicitoras de levadura en células en suspensión de Mendicago
truncatula (Gokulakannan & Niehaus 2010) o en la inoculación con Trichoderma
harzianum en raíces de maíz (Shoresh & Harman 2008).
Dentro de las identificaciones realizadas para otros integrantes del grupo 2, se encontró
que la infección con el patógeno generó un aumento en las proteínas (ID5315 y 5427) las
cuales corresponden a los factores de traducción en eucariotas (eEFB1 y eEF2),
componentes básicos de la maquinaria de traducción en la biosíntesis de proteínas. El
aumento encontrado en los niveles de estos factores, es evidencia de la activación en la
traducción durante la generación de novo de cadenas polipeptídicas durante la respuesta
temprana de la variedad resistente L.P Candy. Así mismo, el aumento encontrado para
las proteínas (ID 4507 y 6737) que corresponden a las enzimas fosfoglicerato
deshidrogenasa (E.C. 1.1.1.95) y a metionina sintetasa independiente de cobalamina
(E.C. 2.1.1.14), está también asociado con la biosíntesis de proteínas considerando su
papel en la biosíntesis de los aminoácidos serina y metionina, respectivamente (Ho et al.
1999; Jean-Luc Ferrer et al. 2004). Para la proteína metionina sintasa, diversos estudios
proteómicos la han asociado con la adaptación a condiciones de estrés considerando
que la metionina es el precursor para la S-adenosil metionina (SAM), compuesto
considerado el principal precursor para procesos entre los que se destaca la biosíntesis
de fitoalexinas, precursores de lignificación y etileno (Roeder et al. 2009), esta última,
molécula señal que ha sido involucrada en la activación de diferentes respuestas a estrés
incluyendo la infección con patógenos a nivel de la raíz (Okubara & Paulitz 2005). En
general estos resultados indican que una activación temprana de la maquinaria celular
asociada a la biosíntesis de proteínas, aminoácidos y moléculas señal debe estar
asociada con el correcto reconocimiento del patógeno y posterior activación de los
mecanismos de defensa a nivel de la raíz del clavel durante su interacción con Fod.
Dentro de las proteínas clasificadas en el grupo 3, las cuales corresponden a aquellas
que disminuyeron en la variedad resistente por efecto de la inoculación con el patógeno,
se encuentran las enzimas transaldolasa ID 1306 (E.C 2.2.1.2) y glucosa 6-fosfato
deshidrogenasa ID 5527 (E.C. 1.1.1.49). Estas proteínas participan en la ruta de las
pentosas fosfato, encargada de suministrar pentosas y NADPH para diversos procesos
celulares. Es probable que la disminución en los niveles de estas enzimas a las 6 hpi
265
este asociado a la inactivación de esta ruta metabólica con el fin de dirigir el flujo de la
glucosa 6-fosfato citoplasmática, a la glicólisis y posteriormente al ciclo de Krebs para
favorecer la generación de energía, la cual se requiere para los diversos procesos
metabólicos que se activan como parte de la respuesta de defensa en estos tiempos
tempranos. Es probable que los niveles de estas enzimas, aumenten posteriormente con
el fin de activar nuevamente esta ruta y generar aquellos precursores que se requieren
para la biosíntesis de metabolitos de tipo fenólico (por ejemplo, ácido shikimico) y el
NADPH necesario para la generación de peróxido de hidrógeno como parte de la
respuesta de defensa por las RBOHs, tal y como ha sido encontrado a tiempos más
tardíos 24-96 hpi en otros modelos (F.-X. Wang et al. 2011; Xianping Fang et al. 2012).
Otra de las proteínas que disminuyó en raíces de la variedad resistente por efecto de la
inoculación con el patógeno corresponde a la monodehidroascorbato reductasa ID 4310
(E.C 1.6.5.4), oxidoreductasa que participa en el ciclo glutatión-ascorbato, el cual se
constituye en el mecanismo antioxidante de mayor importancia a nivel citosólico para las
células vegetales. Es importante comentar que la disminución en los niveles de esta
proteína encontrada a las 6 hpi, está probablemente asociada a una inactivación de esta
ruta antioxidante en las primeras horas posinoculación con el fin de mantener unos
niveles de peróxido de hidrógeno a nivel citosólico altos, para que de esta manera, se
presente la correspondiente activación de las respuestas de defensa vegetal. Estos
resultados están de acuerdo con lo encontrado en términos de las actividades
enzimáticas APX y GPX en este mismo órgano de la planta en donde se determinó, que
la inoculación con el patógeno, no afectan sus niveles de actividad y por tanto tampoco
los ciclos antioxidantes en los cuales participan.
Finalmente, entre las proteínas pertenecientes al grupo 4, que corresponden a aquellas
que presentaron un aumento en sus niveles a nivel del tallo a las 24 hpi para la variedad
resistente inoculada, se destacan las proteínas metionin sintasa independiente de
cobalamina ID 6716 (E.C. 2.1.1.14) y la adenosil metionina sintasa ID 5427 (E.C 2.5.1.6).
Esta última enzima participa en el metabolismo de un carbono y está involucrada en la
transmetilación de diferentes moléculas del metabolismo secundario. Estas dos enzimas
participan en la ruta biosintética para la generación de S-adenosil metionina (SAM), la
cual como se citó anteriormente, es un precursor para la biosíntesis de moléculas como
266
la hormona etileno (K. L. Wang et al. 2002; Roeder et al. 2009). Este resultado evidencia
la importancia que tiene para la planta a nivel de este órgano, la generación de esta
hormona, frecuentemente implicada en la activación de la resistencia a patógenos
necrotróficos (Mengiste 2012). Estudios asociados a la activación de esta ruta
biosintética han sido realizados en otros modelos planta patógeno usando acercamientos
proteómicos y transcriptómicos permitiendo proponer un papel para esta ruta en la
defensa vegetal (D.-M. Li et al. 2009; Palomares-Rius et al. 2011; Rodrigues et al. 2012)
El aumento encontrado para una proteína de choque térmico HSP70 (ID 2737) en tallos
de la variedad resistente inoculada, permite proponer que ésta se encuentra también
involucrada en los mecanismos de defensa que se activan en este órgano de la planta.
Las heat shock proteins (HSP) son un conjunto de proteínas altamente conservadas que
actúan como chaperonas protegiendo a la célula vegetal del efecto que pueden presentar
diferentes condiciones de estrés (Efeoğlu 2009). Se ha determinado por ejemplo, que la
inoculación con patógenos también tiene un efecto sobre los niveles de esta proteína
para diferentes patógenos (Byth et al. 2001; Rodrigues et al. 2012; Xianping Fang et al.
2012). Se ha propuesto que el papel de esta proteína en la respuesta de defensa vegetal,
está asociada al mantenimiento de las conformaciones adecuadas a las proteínas de
defensa que se sintetizan en la primera etapa de la interacción (Xianping Fang et al.
2012). Es probable que así como fue encontrado en los análisis en 1D iniciales para este
mismo órgano de la planta, el aumento detectado a las 24 hpi en los niveles de
ciclofilinas, el correcto plegamiento durante la síntesis de las proteínas que se generan
de novo por efecto de la infección es un factor importante que debe controlar la planta
para generar una respuesta efectiva contra el patógeno.
En general el estudio proteómico de los cambios a nivel de las proteínas que se
presentan a tiempos tempranos de la interacción con el patógeno en el clavel, permitió
ampliar el panorama actual sobre el conocimiento que se tiene de los mismos. Si bien es
cierto que considerando los resultados obtenidos en apartes anteriores de esta
investigación (Capítulos 2, 3 y 4), se esperaba encontrar proteínas asociadas con la
biosíntesis de flavonoides y algunas peroxidasas en esta aproximación proteómica, estas
no se encontraron bajo las condiciones experimentales de separación y detección
usadas en el presente estudio. Es probable que dichas condiciones no sean favorables
267
para el análisis en 2D de estas proteínas; una baja resolución en la separación de las
mismas puede enmascarar posibles cambios en sus niveles. No se puede descartar que
correspondan a algunas de aquellas manchas proteicas que presentaron cambios, pero
que no fueron identificadas. A pesar de ello, mediante ésta aproximación proteómica se
han identificado otras proteínas (ID 5524 y 4310) asociadas a procesos que están de
alguna manera relacionados con la biosíntesis de flavonoides y la regulación de especies
altamente oxidantes. Una discusión sobre estos mecanismos se presentará en el próximo
capítulo de esta investigación en donde se contrastarán todos los resultados obtenidos a
lo largo del estudio y permitirán plantear aquellos fenómenos que pueden ser claves en la
interacción entre el clavel y el agente causal del marchitamiento vascular.
5.4. Conclusiones
Las condiciones seleccionadas para análisis proteómicos en tallos y raíces de clavel
incluyen una extracción total de proteína mediante el método TCA/Acetona/fenol y para
los análisis en electroforesis en 2D, el uso de 400 µg de proteína en un gradiente de pH
no lineal de 3 a 10 para la separación en la primera dimensión y una posterior detección
usando el método de tinción combinado Sypro-Comassie.
En el análisis diferencial por 1-DE de extractos obtenidos a partir de tallos y raíces de
clavel durante la inoculación con el patógeno, se presentó la separación de
aproximadamente 60 bandas, de las cuales 13 presentaron diferencias significativas en
al menos dos tratamientos. El análisis estadístico correspondiente permitió determinar
que la variación encontrada está asociada principalmente a diferencias entre variedades
y al tiempo de muestreo.
La comparación entre controles e inoculados en los perfiles electroforéticos en 1D
permitió encontrar 3 bandas en raíces (32, 39 y 55) y 1 en tallo (51), que presentan
variaciones significativas en sus intensidades asociadas a respuestas de defensa. La
identificación realizada de éstas bandas permitió determinar que la banda No. 55 en
raíces y la 51 en tallo corresponden a la proteína ciclofilina, asociada al mantenimiento
de la estructura terciaria de proteínas.
268
El análisis comparativo usando 2-DE de extractos de plantas infectadas con el patógeno,
permitió resolver para raíces, 1108 manchas proteicas consistentes y 813 para tallo, de
las cuales 793 y 388 presentaron respectivamente, algún tipo de variación estadística en
al menos dos de los tratamientos evaluados.
Como parte de las proteínas que presentan niveles constitutivos superiores a nivel de la
raíz en la variedad resistente L.P. Candy (Grupo 1), se identificaron la enzima málica,
NADP malato deshidrogenasa (E.C 1.1.1.40), involucrada en el metabolismo de
carbohidratos y una proteína que presenta un dominio NB-ARC altamente conservado en
proteínas de resistencia en plantas.
Dentro de las proteínas que aumentaron de manera diferencial en raíces de la variedad
resistente a las 6 hpi con el patógeno (Grupo 2), se encuentran algunas asociadas con la
biosíntesis de moléculas importantes en la respuesta de defensa como: 1) componentes
de la pared celular (α-1,4-glucan-proteína sintasa E.C. 2.4.1.113), 2) de aminoácidos
(fosfoglicerato deshidrogenasa E.C. 1.1.1.95 y metionina sintasa E.C. 2.1.1.14) y 3) de
proteínas (factores de elongación eF1 Y eF2).
Como parte de las proteínas que en raíces de la variedad resistente L.P Candy,
disminuyen sus niveles por efecto de la inoculación (Grupo 3), se encontraron algunas
que participan en el ciclo de las pentosa fosfato (transaldolasa E.C 2.2.1.2 y glucosa 6-
fosfato deshidrogenasa E.C. 1.1.1.49) y con mecanismos de actividad antioxidante
(monodehidroascorbato reductasa E.C 1.6.5.4)
Se identificaron como proteínas que aumentan a nivel del tallo por efecto de la
inoculación en la variedad resistente (Grupo 4), a proteínas asociadas a la biosíntesis de
la hormona de etileno (metionin sintasa independiente de cobalamina E.C. 2.1.1.14 y la
adenosil metionina sintasa E.C 2.5.1.6) y la proteína de choque térmico (HSP70).
Se determinó mediante herramientas proteómicas que como parte de la respuesta de
defensa que se presenta en la variedad resistente al patógeno Fod se destaca un
aumento en proteínas que participan en la biosíntesis de proteínas, de componentes de
pared celular, aminoácidos y hormonas de señalización.
269
6. Discusión final
El presente estudio profundizó sobre algunos mecanismos que a nivel bioquímico y
molecular, están relacionados con respuestas de resistencia del clavel (Dianthus
caryophyllus L) al patógeno causal del marchitamiento vascular Fusarium oxysporum f.
sp. dianthi raza 2.
Para ello, se estudió desde diferentes aproximaciones experimentales, si la biosíntesis de
flavonoides y la actividad antioxidante, estaban asociadas a dicha expresión de
resistencia. La comparación que se realizó en la primera fase de esta investigación y
que buscó conocer si los compuestos fenólicos presentes de manera constitutiva estan
asociados a los mecanismos de defensa pasiva de la planta, se centró principalmente en
los compuestos flavonoides y permitió determinar que efectivamente estos metabolitos
en raíz están asociados con la resistencia de las variedades a la enfermedad (Capítulo
2). Las diferencias estadísticas encontradas tanto en el contenido de metabolitos,
actividades enzimáticas y niveles de mRNA, relacionadas con su síntesis en este órgano
de la planta y los análisis estadísticos multivariados, indicaron que la ruta de biosíntesis
de flavonoides, se encuentra más activa en raíces de variedades resistentes al comparar
con las susceptibles.
Se han planteado algunas inquietudes sobre el papel que en resistencia, cumplen los
flavonoides presentes en las raíces de las plantas; en algunas especies vegetales la
presencia de estos en exudados a nivel de la raíz, se han asociado con la estimulación
de la germinación de estructuras fúngicas y por tanto con susceptibilidad. (Steinkellner et
al. 2007). De acuerdo con la presente investigación, en el clavel altos niveles
constitutivos de estos metabolitos en las raíces, están asociados con resistencia al
marchitamiento vascular. Es probable que su presencia en este órgano, primer punto de
270
contacto natural entre la planta y el patógeno, retrase en alguna medida la entrada de
éste a los tejidos vasculares, más si se consideran las propiedades antifúngicas que han
sido previamente descritas para flavonoides aislados de este órgano de la planta (Curir et
al. 2001; Curir et al. 2005).
Estos resultados muestran relación con la evidencia encontrada a nivel proteómico
(Capítulo 5), en donde se determinó que al comparar con la variedad susceptible, la
variedad L.P Candy (R) en raíces presenta mayores niveles constitutivos de la enzima
málica (E.C 1.1.1.39), la cual participa en el metabolismo de carbohidratos para generar
ácido pirúvico y NADPH, a partir de ácido málico. Considerando que la generación de
poder reductor NADPH, es necesario para la acción de enzimas de la biosíntesis de
flavonoides (Casati et al. 1999), estos resultados muestran que las rutas del metabolismo
secundario asociadas con la resistencia a la enfermedad, requieren de la expresión de
diversos tipos de proteínas, lo que está de acuerdo con la naturaleza multigénica de la
resistencia a este patógeno.
Dentro de los resultados interesantes encontrados en la investigación de parámetros a
nivel constitutivo, se destaca la presencia de una proteína en raíces de la variedad
resistente, con un dominio conservado en proteínas de resistencia (NBS-ARC). Este se
constituye en el primer reporte de una proteína candidata de resistencia en clavel y
genera por tanto, la necesidad de próximos estudios que permitan profundizar sobre su
secuencia completa y función biológica. Es muy probable que ésta sea una de las varias
proteínas que pueden estar asociadas con reconocimiento, lo que debe confirmarse con
estudios adicionales, que permitan avanzar, con el apoyo de las evidencias acá
acumuladas, en la identificación de marcadores asociados con la resistencia a la
enfermedad.
La presente investigación también hizo un importante aporte sobre el conocimiento de
algunos componentes de la defensa activa de la planta. Entre ellos, se destaca el
hallazgo de que inoculación con el patógeno Fusarium oxysporum f. sp. dianthi raza 2,
genera un aumento en la biosíntesis de flavonoides en las variedades resistentes
(Capítulo 3). Se evidenció, además, que no existe generación de nuevos metabolitos de
tipo flavonoide en tallos y raíces durante la infección con el patógeno, sino cambios en
los niveles totales de metabolitos preexistentes.
271
Se había planteado en estudios previos, que la naturaleza química de los metabolitos
que se acumulan como parte de la respuesta de defensa en el clavel, dependía en gran
medida del órgano de la planta involucrado (Higuera 2001). Con los hallazgos del
presente estudio se propone que la acumulación de flavonoides es un mecanismo de
defensa común en ambos órganos de la planta (raíz y tallo), tal y como había sido
planteado previamente por Curir et al (2005). Es probable que las diferencias en los
perfiles de estos metabolitos encontradas entre tallos y raíces (Capitulo 3), estén
asociadas a diferencias en algunas enzimas que participan en la diversificación
estructural de estos compuestos. Esto se propone con base en los resultados obtenidos
de la aproximación estructural usando HPLC-MS, en donde se encontró que la variedad
resistente L.P Candy acumula probablemente en tallo el compuesto Kaemferol 3-O-β-D –
glucopiranosil (1→2)-O--L-ramnopiranosil-(1→6)- β-D–glucopiranosido, mientras que
en raíz lo hace su correspondiente derivado 3´metilado. Se presume por tanto, que la
acción de O-metil transferasas en este órgano estaría asociada con la diversificación
estructural de este tipo de compuestos.
Existe discusión si el papel de los flavonoides en defensa vegetal se limita solamente a
su actividad antifúngica o si también están asociados a otros procesos como la
regulación de los niveles de especies oxidantes (Agati 2012). En el caso del clavel, ya
sea a nivel constitutivo (Capitulo 2) o a nivel inducible (Capitulo 3), se encontró que los
niveles de estos metabolitos están también correlacionados positivamente con la
actividad antioxidante. Se ha encontrado que altos niveles constitutivos de actividad
antioxidante conseguidos no solo por el aumento en los niveles de flavonoides, sino
también de otros compuestos como los carotenoides (Boba et al. 2011), presentan
correlación positiva con la resistencia a la enfermedad. Esto permite plantear que la
actividad antioxidante es importante para la resistencia a este patógeno,
independientemente del tipo de moléculas involucradas en su generación. De acuerdo al
presente estudio, los flavonoides en el clavel pueden ser potenciales generadores de la
actividad antioxidante que se requiere para regular la acción adversa de aquellas
especies altamente oxidantes que se presentan a nivel subcelular durante la señalización
de la respuesta, además de su conocido papel inhibitorio sobre el crecimiento del
patógeno (Curir et al. 2001; Curir et al. 2005).
272
Las evidencias acumuladas permiten proponer además que un aumento en los niveles de
flavonoides durante la infección con el patógeno, está ocasionada en gran medida por el
aumento en los niveles de actividad y de transcripción para algunas de las enzimas
involucradas en su biosíntesis, como es el caso de las enzimas CHS y CHI en raíces y
CHS en tallos (Capítulo 3). Es importante anotar que esto no parece ser una regla a
todos los tiempos posinoculación y que es muy probable la acción de otros mecanismos
de regulación diferentes al transcripcional en el clavel. Este es el caso de las enzimas
PAL (96hpi) y CHS (6 hpi) en raíces de la planta donde el aumento de la actividad
enzimática y la posterior acumulación de metabolitos, estaría determinada por otros
mecanismos de regulación que, probablemente, se activan por efecto de la inoculación
con el patógeno. En general, la complejidad de la respuesta bioquímica asociada a la
biosíntesis de estos metabolitos durante la interacción, parece ser alta y requerir la
biosíntesis de novo de diferentes proteínas. Esto está de acuerdo con los resultados
observados a nivel proteómico en los que, a nivel de las raíces de variedad resistente, se
encontró a las 6 hpi un aumento importante en proteínas que están involucradas en
procesos, como la traducción (Factores de elongación eEFB1 y eEF2) y la biosíntesis de
aminoácidos como metionina y serina (Capitulo 5).
Es probable, teniendo en cuenta la evidencia acumulada, que el aumento en la
biosíntesis de flavonoides esté asociado a su regulación espacio-temporal durante la
activación de la respuesta basal de la planta, la cual se caracteriza por ser
multicomponente, altamente coordinada que se puede activar como parte del
reconocimiento de patrones moleculares conservados en microorganismos (Kröner et al.
2012). Esto estaría de acuerdo con la resistencia multigénica que ha sido descrita para
esta raza de patógeno (Baayen et al. 1991) y con lo encontrado en otros modelos
(Lorenc-Kukuła et al. 2007; Morkunas et al. 2011; R. S. Sekhon et al. 2006; Arfaoui et al.
2007; A. Dihazi et al. 2011); un aumento en la biosíntesis de estos metabolitos se
presenta al parecer, como parte de una respuesta común a patógenos del género
Fusarium.
En esta investigación se logró tambien tener evidencias significativas del papel del
peróxido de hidrógeno y de algunos mecanismos de regulación enzimática antioxidante,
en el modelo clavel-Fod (Capítulo 4). De acuerdo con los resultados obtenidos, es
probable que al menos en los tiempos tempranos después de la inoculación, la
273
acumulación de H2O2 en el clavel, esté de alguna manera asociada a procesos de
señalización. Esto considerando que el aumento encontrado en sus niveles, se pudo
relacionar con la activación de otras respuestas de defensa en las plantas resistentes,
como lo fue el aumento general de la biosíntesis de flavonoides a nivel de la raíz y de los
niveles de mRNA para la peroxidasa Dcprx02 en tallo. Cabe resaltar que no hay
consenso en el papel que cumplen las EROs en las interacciones con patógenos del
género Fusarium, considerando que en algunos casos se ha propuesto que facilitan la
colonización de estos patógenos necrotróficos y que en otros, pueden participar en la
activación de los mecanismos de defensa de la planta (Berrocal-Lobo & Molina 2008).
A pesar del aumento en los niveles de peróxido de hidrógeno observado en la variedad
susceptible, no se evidenció una activación de las respuestas de defensa estudiadas.
Esto se puede explicar teniendo en cuenta la probable presencia de efectores por parte
del patógeno Fod, que pueden interferir con la activación de las respuestas de defensa,
después de que se lleva a cabo su reconocimiento por parte de la planta susceptible. La
presencia de efectores en patógenos del género Fusarium ha sido descrita y se ha
encontrado que puede afectar de manera importante la respuesta de señalización de
defensa en genotipos susceptibles (Houterman et al. 2008; Houterman et al. 2009). Por
ejemplo, en el caso de Fusarium oxysporum f. sp. licopersici, el efector Avr2 además de
aumentar la incidencia en genotipos susceptibles de tomate (Lycopersicum esculentum),
se ha encontrado que sus blancos pueden estar a nivel citoplasmático en donde se
presenta la transducción de la señal para la activación de genes asociados a la defensa
vegetal (Houterman et al. 2009).
Para el caso de las variedades resistentes, estos mismos efectores pueden ser factores
de avirulencia, que al ser reconocidos por la maquinaria propia del genotipo resistente,
finalmente desencadenan respuestas de defensa asociadas, tal y como ha sido
propuesto para este tipo de patógenos (Houterman et al. 2008; Houterman et al. 2009).
Es probable que dentro de los mecanismos relacionados con el reconocimiento de estas
moléculas efectoras en la variedad resistente a nivel de la raíz, se encuentre la candidata
a proteína de resistencia que presenta dominios NB-ARC detectada en este órgano
mediante la aproximación proteómica utilizada en la presente investigación.
274
Es importante mencionar que los niveles del peróxido de hidrógeno que se requieren
inicialmente para la señalización de respuestas de defensa, pueden posteriormente
afectar el correcto funcionamiento celular y favorecer la acción de patógenos
necrotróficos (Heller & Tudzynski 2011). Según los resultados obtenidos en el modelo
clavel-Fod, al menos en los tiempos más tempranos de la interacción (0-96 hpi), a nivel
de la raíz los mecanismos antioxidantes enzimáticos evaluados en este estudio (APX y
GPX), parecen mantenerse constantes, con el fin de permitir que esta especie reactiva
de oxígeno, actúe como molécula señal en la activación de la respuesta de defensa
vegetal (Capítulo 4). Esto coincide también con los resultados a nivel proteómico que
mostraron que en este órgano de la planta, se presenta una disminución por efecto de la
inoculación con el patógeno, en los niveles de la proteína monodehidroascorbato
reductasa, enzima que participa en el ciclo glutatión-ascorbato que regula a nivel
citoplasmático los niveles de H2O2.
En tallo por el contrario, es probable que la acción de la enzima GPX, tenga un efecto
regulatorio de los niveles de peróxido de hidrógeno a los tiempos tempranos evaluados.
Esta enzima aumentó sus niveles de manera significativa en la variedad resistente
inoculada mientras que no se presentaron cambios en la variedad susceptible. Esto está
de acuerdo con lo encontrado en otros modelos, como es el caso de la interacción
tomate - Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici, en la que la infección genera un aumento
en la actividad GPX a partir de las 24 hpi, que ha sido atribuido a la capacidad de regular
los niveles de peróxido que se acumulan a partir de este mismo tiempo (Mandal, et al.
2008). Otro ejemplo lo constituye la interacción Lycopersicon spp. y Oidium
neolycopersici en donde se ha propuesto que la actividad Guayacol-peroxidasa no
asociada a la pared celular, juega un papel muy importante en la regulación de los
niveles de peróxido de hidrógeno en la planta (Tománková, K. et al 2006).
El consumo de esta especie oxidante por parte de las enzimas GPX, estaría asociada
con resistencia a la enfermedad considerando, además, que la reacción que dicha
enzima cataliza, conduce a la generación de productos de oxidación con notable
actividad antifúngica, los cuales pueden tener un potencial efecto sobre Fusarium
oxysporum f. sp. dianthi (Mayorga & Higuera 2007). Estos productos pueden unirse a
paredes celulares con el fin de fortalecerlas y hacerlas más resistentes al ataque inicial
275
de las enzimas pécticas que el patógeno Fod secreta en presencia de pared celular de
clavel (Gomez & S. Martinez 2005).
Con las evidencias encontradas, se puede proponer que el aumento en los niveles de
peróxido de hidrógeno que se presentó en tallos de la variedad resistente, genera un
aumento en los niveles de mRNA para el gen Dcprx02, que al ser finalmente traducidos a
proteína, pueden participar en la regulación de los niveles de peróxido de hidrógeno y
generar una respuesta de defensa en contra del patógeno (Capítulo 4). La no correlación
con la inducción de la actividad APX y la posible ubicación de la proteína Dcprx02 a nivel
del apoplasto, muestra que es probable que la regulación de dichas especies altamente
oxidantes se presente principalmente en este órgano de la planta, a nivel extracelular y
que la regulación a nivel citoplasmático, mediada principalmente por las APX, no se
active a dichos tiempos para generar respuestas de defensa como puede ser la
activación transcripcional de la enzima CHS (figura No. 37). Es recomendable realizar
estudios adicionales a nivel funcional que permitan confirmar el papel de la enzima GPX
en tallos de clavel durante la interacción con el patógeno. La evaluación de estos
procesos en mutantes de clavel afectados en la producción de peroxidasas, se plantea
como una herramienta para confirmar la participación de la peroxidasa en estos procesos
tal y como se ha realizado en otras especies vegetales (Bindschedler et al. 2006;
Schweizer 2008).
La aproximación proteómica, realizada por primera vez en el estudio de esta interacción
planta-patógeno (Capítulo 5), permitió evidenciar la activación de algunos procesos
asociados con la resistencia en ambos órganos de la planta, los cuales en parte, han sido
descritos y analizados a lo largo de esta discusión final. Se encontró además, que dentro
de los procesos que pueden ser también importantes a nivel de la raíz durante la
interacción con el patógeno, se encuentra un aumento en la biosíntesis de polímeros
estructurales que se acumulan al nivel de las paredes celulares para fortalecerlas y
darles mayor resistencia al ataque de las enzimas secretadas por el patógeno. Es
probable que el aumento encontrado en la proteína α-1,4- glucano-proteina sintasa (E.C.
2.4.1.113) a las 6hpi en raíces, inicie un proceso de fortalecimiento temprano que se
presentará fenotípicamente a tiempos más tardíos, así como fue encontrado para este
276
órgano usando herramientas como microscopia electrónica (Higuera & Ebrahim-Nesbat
1999).
Los resultados encontrados en tallos de la variedad resistente usando esta misma
aproximación (Capítulo 5), permiten proponer que la activación de la expresión de la
respuesta de defensa involucra la biosíntesis de etileno. Esta hormona central en la
expresión de diferentes mecanismos de defensa de las plantas, ya sea por su papel
directo como activador de factores de transcripción de respuesta a etileno (ERFs de su
nombre en inglés Ethylene Response Factors) o por su interacción con otras hormonas
como el ácido jasmónico o el ácido salicílico (Broekaert et al. 2006), podría acumularse a
nivel de este órgano y cumplir algún papel en la señalización de la respuesta de defensa
en la planta. Esta evidencia es de importancia si se tiene en cuenta que a la fecha, no se
conocía ninguna hormona componente de las vías de señalización que están
involucradas en la activación de las respuestas de defensa en esta planta durante su
interacción con Fod.
Dentro de los resultados que se presentaron particular interés en el estudio proteómico
(Capítulo 5), también se encuentra que la expresión de resistencia implica la acumulación
de proteínas que participan en la correcta conformación tridimensional de las proteínas.
Este fue el caso del aumento en los niveles de ciclofilinas en raíces (6 hpi) y tallos (24
hpi), y de una proteína de choque térmico en tallos de la planta (HSP 70) (24 hpi). Este
proceso al parecer puede jugar un papel central en condiciones de estrés en donde se
pueden presentar cambios a nivel conformacional de proteínas y se requiere de
mecanismos que les permitan mantener su estructura tridimensional y por tanto su
funcionalidad. Así mismo, durante la biosíntesis de proteínas, se requiere de este tipo de
procesos que permitan generar las conformaciones adecuadas de las proteínas de
defensa que se sintetizan en estos tiempos tempranos de la interacción.
Considerando la evidencia acumulada a lo largo de este estudio sobre los componentes
de defensa consititutiva (capítulo 2) y las respuestas inducibles de la planta (Capítulos 3-
5), se presenta un resumen de aquellos mecanismos bioquimicos y moleculares que
están asociados con resistencia al marchitamiento vascular (Figura No. 68 y 69). Es
probable considerando estudios en otras plantas, que procesos como el aumento en la
biosíntesis de compuestos flavonoides y de los niveles de peróxido de hidrógeno, se
277
presenten como parte de la respuesta activa asociada a la inmunidad basal conocida
como MTI en raíces (figura No. 68) y tallos de la planta (figura No. 69).
68 Fig. 68. Resumen de algunos de los mecanismos de defensa propuestos en células de raíces de clavel durante la interacción con Fod. Se presentan mecanismos asociados a defensa constitutiva (1), como una mayor biosíntesis de flavonoides mediada por altos niveles de mRNA y actividad de la enzimas chalcona sintasa (CHS), chalcona isomerasa (CHI) (capítulo 2) y la enzima malato deshidrogenasa (ID 5524) (capítulo 5). La presencia de la proteína de resistencia candidata (ID 2412) (capítulo 5), puede probablemente estar asociada a fenómenos de reconocimiento de efectores del patógeno a nivel citoplasmático (2) y activar respuestas de defensa asociadas con ETI (Effector Targered Inmunity). Sin embargo, la mayor parte de las respuestas encontradas en esta investigación se enmarcan dentro de las respuestas de defensa activa asociadas al reconocimiento de MAMPs (Microbial Associated Molecular Paterns), durante la activación de la MTI (MAMPs Targered Inmunity). Este tipo de respuestas ha sido asociado con procesos de señalización en los que participan MAPK (Mitogen-Activated Protein Kinases) y CDPK (Calmodulin-Dependent Protein Kinase). El aumento en los niveles de peróxido de hidrógeno (3) (capitulo 3), ha sido asociado con estas últimas quinasas y se puede presentar tanto a nivel citoplasmático como a nivel extracelular, para finalmente generar la activación de transcripción de genes de defensa mediado por el complejo RNA pol II (4). Dentro de los genes que aumentan su transcripción se presentan los codificantes para las enzimas fenilalanina amonio liasa (PAL), CHS y CHI (capítulo 4). El aumento en la traducción de mRNA mediado por los complejos ribosomales, debe involucrar los factores eIF1 y eIF2 (capítulo 5). Así mismo este proceso requiere de la biosíntesis de aminoácidos como serina y metionina en donde intervienen las proteínas fosfogliceraldehido deshidrogenasa (ID 4507) y la metionin sintasa (ID 6737). La participación de proteínas como las ciclofilinas, se requiere para el correcto plegamiento de las proteínas sintetizadas. Finalmente, un aumento en las actividades enzimáticas de PAL, CHS y CHI (5), que en ciertos tiempos debe estar asociado a mecanismos de regulación postranscripcional (P ejm CHS 6hpi y PAL 96hpi), genera un aumento en los metabolitos de tipo flavonoide y de actividad antioxidante (6) (capítulo 4). Fenomenos como el fortalecimiento de paredes celulares (7), mediado por proteínas como la α 1,4 glucano-proteina sintasa (ID 3208) hace parte de la respuesta multigénica reportada contra este patógeno. Esta propuesta está basada en los resultados obtenidos en el presente estudio y por lo descrito por autores como (Muthamilarasan & M. Prasad 2013; Bent & Mackey 2007).
278
La propuesta sobre los fenomenos de señalización y activación de la respuesta a Fod
que ha sido ampliamente discutida a lo largo de este escrito, ha sido tambien planteada
para otras formas especiales de Fusarium oxysporum (Berrocal-Lobo & Molina 2008), y
es consistente con la resistencia multigénica descrita para esta planta a la raza 2 de este
patógeno.
69 Figura No. 69. Resumen de algunos de los mecanismos de defensa propuestos en células de tallos de clavel durante la interacción con Fod. Se presentan mecanismos de defensa activa como aquellas mediadas por el reconocimiento de MAMPs (Microbial Associated Molecular Patterns) involucrada en la activación de la MTI (MAMPs Targered Immunity), tal y como ha sido previamente descrito en la figura No. 68 para raíces. Para este órgano el aumento en los niveles de peróxido de hidrógeno (3) (capítulo 4), puede estar asociado con las quinasas CDPK y la activación de las proteinas RBOHs (Respiratory Burst Oxidase Homologs) (1). La acumulación de esta molécula señal parece estar asociada a la activación de transcripciòn de los genes chs y dcprx02 (2) (capítulo 3 y 4). Se presume que el aumento en la biosíntesis del aminoácido metionina por acción de la metionina sintasa (ID 6716) puede estar involucrada tanto en el aumento de los nivel citroplasmaticos de este a.a. para procesos como la síntesis de proteínas y para la biosíntesis de etileno (3) mediante la acción de otras enzimas como la adenosilmetionina sintasa (ID 5427). Un aumento en los niveles de ciclofílina y de la proteína de choque térmico HSP70, se requiere para el correcto plegamiento de proteínas durante su síntesis (capítulo 5). El aumento en la actividad enzimática de las POD y CHS (4), debe estar asociado respectivamente, a procesos como, la regulación de peroxido a nivel extracelular (5) y el aumento en los niveles de flavonoides (6). Es probable que para el aumento en los niveles de estos metabolitos a tiempos más tempranos (6, 12 hpi), se presenten otros mecanismos como la liberación a partir de reservas constitutivas localizadas en las vacuolas. El aumento en los niveles de la enzima peroxidasa, puede estar asociado con la regulaciòn de EROs a nivel extracelular y con la correspondiente generación de quinonas antifúngicas que han sido descritas en esta modelo vegetal.
279
Es importante comentar que la acción de otras enzimas que no fueron evaluadas en el
presente estudio, debe jugar también un papel importante en la respuesta de defensa de
la planta. Estudios recientes, le han otorgado a proteínas asociadas a procesos de
localización en vacuolas o apoplasto, un papel relacionado con resistencia, como es el
caso de los transportadores ABC o transportadores MATE (De sus siglas en ingles
Multidrug and toxic compound extrusion (MATE) transporters) (Naoumkina et al. 2007;
Agati et al. 2012; Banasiak et al. 2013). Considerando que estos metabolitos y enzimas
asociadas con su biosíntesis han sido encontrados a nivel nuclear, se ha discutido su
papel como factores de transcripción y/o reguladores de especies altamente oxidantes en
este organelo (Agati et al. 2012). Es por ello que es de particular interés, considerando
los resultados de la presente investigación, evaluar la localización celular de metabolitos
en raíces y tallos de la planta usando herramientas histoquímicas y así mismo, estudiar
los procesos de transporte involucrados en los que participan este tipo de proteínas. El
conocimiento de la ubicación de estos metabolitos a nivel subcelular, permitirá obtener
más información sobre su función en los mecanismos asociados a la resistencia al
patógeno causal del marchitamiento vascular.
La presente investigación permitió aumentar de manera importante la elucidación de los
mecanismos asociados con la resistencia del clavel al marchitamiento vascular causado
por Fod, mediante la comprobación de las diferentes hipótesis que se plantearon al inicio
del estudio. Se evidenció que la complejidad en los diferentes mecanismos asociados
con la resistencia a la enfermedad es alta, e involucra un conjunto de respuestas que se
deben activar de manera espacio y temporalmente coordinada para expresar finalmente
la resistencia al patógeno. La información que ha sido obtenida en la presente
investigación, ha ampliado de manera significativa el conocimiento bioquímico y
molecular de esta interacción, permitiendo plantear a los niveles de flavonoides y a las
enzimas involucradas en su biosíntesis, como potenciales marcadores bioquímicos de
selección de resistencia. El conocimiento aca generado se requiere para el futuro
desarrollo de nuevas alternativas de control al marchitamiento vascular, una evidente
necesidad para el fortalecimiento del sector productor de claveles a nivel mundial.
280
281
Bibliografía
Abdel-farid, I. B., Jahangir, M., Hondel, C. A. M. J. J. Van Den, Kim, H. K., Choi, Y. H., & Verpoorte, R. (2009). Fungal infection-induced metabolites in Brassica rapa. Plant Science, 176, 608–615. doi:10.1016/j.plantsci.2009.01.017
Abd-elsalam, K. A., Aly, I. N., Abdel-satar, M. A., Khalil, M. S., & Verreet, J. A. (2003). PCR identification of Fusarium genus based on nuclear ribosomal-DNA sequence data. African Journal of Biothecnology, 2, 82–85.
Agati, G., Azzarello, E., Pollastri, S., & Tattini, M. (2012). Flavonoids as antioxidants in plants: location and functional significance. Plant Science, 196, 67–76. doi:10.1016/j.plantsci.2012.07.014
Agati, G., Biricolti, S., Guidi, L., Ferrini, F., Fini, A., & Tattini, M. (2011). The biosynthesis of flavonoids is enhanced similarly by UV radiation and root zone salinity in L. vulgare leaves. Journal of Plant Physiology, 168(3), 204–212. doi:10.1016/j.jplph.2010.07.016
Agrios, N. (1995). Fitopatología (Ed Limusa ., pp. 64–120). Mexico.
Aguirre-Hernández, E., González-Trujano, M. E., Martínez, A. L., Moreno, J., Kite, G., Terrazas, T., & Soto-Hernández, M. (2010). HPLC/MS analysis and anxiolytic-like effect of quercetin and kaempferol flavonoids from Tilia americana var. mexicana. Journal of Ethnopharmacology, 127(1), 91–97. doi:10.1016/j.jep.2009.09.044
Ahuja, I., Kissen, R., & Bones, A. M. (2012). Phytoalexins in defense against pathogens. Trends in Plant Science, 17(2), 73–90. doi:10.1016/j.tplants.2011.11.002
Albes, H. S., Da Silva, R., Halfeld, B., Bacarat, M. C., & Mounteer, A. (2004). Rhizobacterial induction of systemic resistance in tomato plants: non specific protection and increase in enzyme activities. Biological Control, 29, 288–295.
Alessandra, L., Luca, P., & Adriano, M. (2010). Differential gene expression in kernels and silks of maize lines with contrasting levels of ear rot resistance after Fusarium verticillioides infection. Journal of Plant Physiology, 167(16), 1398–406. doi:10.1016/j.jplph.2010.05.015
282
Ali, K., Maltese, F., Figueiredo, A., Rex, M., Fortes, A. M., Zyprian, E., Pais, M. S., et al. (2012). Alterations in grapevine leaf metabolism upon inoculation with Plasmopara viticola in different time-points. Plant Science, 191-192, 100–7. doi:10.1016/j.plantsci.2012.04.014
Almagro, L., Gómez Ros, L. V, Belchi-Navarro, S., Bru, R., Ros Barceló, A., & Pedreño, M. A. (2009). Class III peroxidases in plant defence reactions. Journal of Experimental Botany, 60(2), 377–90. doi:10.1093/jxb/ern277
Almeida, J. R. M., D’Amico, E., Preuss, A., Carbone, F., De Vos, C. H. R., Deiml, B., Mourgues, F., et al. (2007). Characterization of major enzymes and genes involved in flavonoid and proanthocyanidin biosynthesis during fruit development in strawberry (Fragaria xananassa). Archives of biochemistry and biophysics, 465(1), 61–71. doi:10.1016/j.abb.2007.04.040
Ambawat, S., Sharma, P., Yadav, N. R., & Yadav, R. C. (2013). MYB transcription factor genes as regulators for plant responses: an overview. Physiology and Molecular Biology of Plants, DOI: 10.1007/s12298–013–0179–1. doi:10.1007/s12298-013-0179-1
Arbeláez, G. (2006). Fungal disease on cut flowers in Colombia. XLVI Annual Meeting American Phytopathological Society Caribbean Division. Cartagena: Phytopathological Society Caribbean Division.
Ardila, H. D. (2006). Evaluación de algunas respuestas Bioquímicas y moleculares relacionadas con el metabolismo de los fenoles en el modelo (Dianthus caryophyllus L.) - Fusarium oxysporum f. sp. dianthi raza 2. Tesis Maestría en Ciencias Bioquímica. Facultad de Ciencias. Universidad Nacional de Colombia.
Ardila, H. D., Baquero, B., & Martinez, S. T. (2007). Inducción de la actividad de la enzima fenilalanina amonio liasa en clavel (Dianthus caryophyllus L) por elicitores del hongo Fusarium oxysporum f. sp. dianthi raza 2. Revista Colombiana de Química, 36(2), 151–167.
Ardila, H. D., González-Fernández, R., Higuera, B. L., Redondo, I., & Martínez, S. T. (2013). Protein extraction and gel-based separation methods to analyze responses to pathogens in carnation (Dianthus caryophyllus L). Methods in Plant Proteomics. (2a ed.). New York, NY: Humana Press. New York. 2013.
Ardila, H. D., & Higuera, B. L. (2005). Inducción diferencial de polifenoloxidasa y β-1,3-glucanasa en clavel (Dianthus caryophyllus) durante la infección por Fusarium oxysporum f. sp. dianthi raza 2. Acta Biologica Colombiana, 10(2), 61–74.
Ardila, H. D., Martinez, S. T., & Higuera, B. L. (2011). Regulación espacio-temporal de fenilalanina amonio liasa en clavel (Dianthus caryophyllus L) durante su interacción con el patógeno Fusarium oxysporum f. sp. dianthi. Revista Colombiana de Química, 40(1), 7–24.
283
Ardila, H. D., Martinez, S. T., & Higuera, B. L. (2013). Levels of constitutive flavonoid biosynthetic enzymes in carnation (Dianthus caryophyllus L.) cultivars with differential response to Fusarium oxysporum f. sp. dianthi. Acta Physiologiae Plantarum, 35, 1233–1245. doi:10.1007/s11738-012-1162-0
Arfaoui, A., El Hadrami, A., Mabrouk, Y., Sifi, B., Boudabous, A., El Hadrami, I., Daayf, F., et al. (2007). Treatment of chickpea with Rhizobium isolates enhances the expression of phenylpropanoid defense-related genes in response to infection by Fusarium oxysporum f. sp. ciceris. Plant Physiology and Biochemistry, 45(6-7), 470–9. doi:10.1016/j.plaphy.2007.04.004
Asano, T., Kimura, M., & Nishiuchi, T. (2012). The defense response in Arabidopsis thaliana against Fusarium sporotrichioides. Proteome Science, 10, 1–11.
Assis, J. S., Maldonado, R., Muñoz, T., Merodio, C., & Escribano, M. I. (2001). Effect of high carbon dioxide concentration on PAL activity and phenolic contents in ripening cherimoya fruit. Postharvest Biology and Technology, 23, 33–39.
Austin, M. B., & Noel, J. P. (2003). The chalcone synthase superfamily of type III polyketide synthases. Natural Product Reports, 20(1), 79–110. doi:10.1039/b100917f
Avila, M. C., Patiño, Ó. J., Prieto, J. A., Delgado, W. A., & Cuca, L. E. (2011). Flavonoides con actividad antifúngica aislados de Piper septuplinervium (Miq.) C. DC. (Piperaceae). Revista Colombiana de Química, 40(1), 25–33.
Azevedo, H., Dias, A., & Tavares, R. M. (2010). Analysis on the Role of Phenylpropanoid Metabolism in the Pinus pinaster-Botrytis cinerea Interaction. Journal of Phytopathology, 646, 641–646. doi:10.1111/j.1439-0434.2010.01673.x
Azzimonti, J. C. (2003). Biostatistics applied to Biochemistry and Pharmacy (Ed Univers., p. 22.2 to 22.8). Buenos Aires.
Baayen, R. P., Eijk, C., & Elgersma, D. M. (1989). Histology of roots of resistant and susceptible carnation cultivars from soil infested with Fusarium oxysporum f.sp. dianthi. Netherlands Journal of Plant Pathology, 95(1), 3–13. doi:10.1007/BF02000875
Baayen, R. P., & Elgersma, D. M. (1985). Colonization and histopathology of susceptible and resistant carnation cultivars infected with Fusarium oxysporum f . sp. dianthi. Netherlands Journal of Plant Pathology, 91, 119–135.
Baayen, R. P., Elgersma, D. M., Demminsk, J. F., & Sparnaaij, L. D. (1988). Differences in pathogenesis observed among susceptible interactions of carnation with four races of Fusarium oxysporum f . sp. dianthi. Netherlands Journal of Plant Pathology, 94, 81–94.
284
Baayen, R. P., & Maat, A. L. D. E. (1987). Passive transport of microconidia of Fusarium oxysporum f. sp. dianthi in carnation after root inoculation. Netherlands Journal of Plant Pathology, 93, 3–13.
Baayen, R. P., & Niemann, G. P. (1989). Correlations between accumulation of diantramides, dianthalexin and unknown compounds, and partial resistance to Fusarium oxysporum f. sp. dianthi in eleven carnation cultivars. Journal Phytopathology, 126, 281–292.
Baayen, R. P., Ouellette, G. B., & Rioux, D. (1996). Compartimentalization of decay in carnations resistant to Fusarium oxysporum f. sp. dianthi. Phytopathology, 86, 1018–1031.
Baayen, R. P., & Plas, C. H. (1992). Localization ability, latent period and wilting rate in eleven carnation cultivars with partial resistance to Fusarium wilt. Euphytica, 59(2-3), 165–174. doi:10.1007/BF00041269
Baayen, R. P., Sparnaaij, L. D., Jansen, J., & Niemann, G. J. (1991). Inheritance of resistance in carnation against Fusarium oxysporum f. sp. dianthi races 1 and 2, in relation to resistance components. Netherlands Journal of Plant Pathology, 97, 73–86.
Bailey, B. a., Crozier, J., Sicher, R. C., Strem, M. D., Melnick, R., Carazzolle, M. F., Costa, G. G. L., et al. (2013). Dynamic changes in pod and fungal physiology associated with the shift from biotrophy to necrotrophy during the infection of Theobroma cacao by Moniliophthora roreri. Physiological and Molecular Plant Pathology, 81, 84–96. doi:10.1016/j.pmpp.2012.11.005
Bakalovic, N., Passardi, F., Ioannidis, V., Cosio, C., Penel, C., Falquet, L., & Dunand, C. (2006). PeroxiBase: a class III plant peroxidase database. Phytochemistry, 67(6), 534–9. doi:10.1016/j.phytochem.2005.12.020
Baker, C. J., Roberts, D. P., Mock, N. M., Whitaker, B. D., Deahl, K. L., & Aver’yanov, A. (2005). Apoplastic redox metabolism: Synergistic phenolic oxidation and a novel oxidative burst. Physiological and Molecular Plant Pathology, 67, 296–303.
Baldridge, G. D., Neill, N. R. O., & Samac, D. A. (1998). Alfalfa (Medicago sativa L.) resistance to the root-lesion nematode, Pratylenchus penetrans : defense-response gene mRNA and isoflavonoid phytoalexin levels in roots. Plant Molecular Biology, 38, 999–1010.
Ballester, A. R., Lafuente, M. T., & Gonzalez-Candelas, L. (2006). Spatial study of antioxidant enzymes, peroxidase and phenylalanine ammonia-lyase in the citrus fruit - Penicillium digitatum interaction. Postharvest Biology and Technology, 39, 115–128.
Ballizany, W. L., Hofmann, R. W., Jahufer, M. Z. Z., & Barrett, B. a. (2012). Genotype×environment analysis of flavonoid accumulation and morphology in white
285
clover under contrasting field conditions. Field Crops Research, 128, 156–166. doi:10.1016/j.fcr.2011.12.006
Baluška, F., & Mancuso, S. (2006). Signaling in Plants. (Springer-Verlag, Ed.) (Signaling., pp. 155–171). Berlin.
Banasiak, J., Biała, W., Staszków, A., Swarcewicz, B., Kępczyńska, E., Figlerowicz, M., & Jasiński, M. (2013). A Medicago truncatula ABC transporter belonging to subfamily G modulates the level of isoflavonoids. Journal of Experimental Botany, 64(4), 1005–1015. doi:10.1093/jxb/ers380
Barilli, E., Rubiales, D., & Castillejo, M. Á. (2012). Comparative proteomic analysis of BTH and BABA-induced resistance in pea (Pisum sativum) toward infection with pea rust (Uromyces pisi). Journal of Proteomics, 75(17), 5189–205. doi:10.1016/j.jprot.2012.06.033
Barna, B., Fodor, J., Harrach, B. D., Pogány, M., & Király, Z. (2012). The Janus face of reactive oxygen species in resistance and susceptibility of plants to necrotrophic and biotrophic pathogens. Plant Physiology and Biochemistry, 59, 37–43. doi:10.1016/j.plaphy.2012.01.014
Barrera, A. J., & Gómez, S. (1995). Determinación de razas Fisiológicas de Fusarium oxysporum f. sp. dianthi de clavel en 8 fincas del grupo Chia localizadas en la sabana de Bogotá. Tesis Agronomía. Universidad Nacional de Colombia, sede Bogotá.
Barrett, L. G., Bergelson, J., Kniskern, J. M., Bodenhausen, N., & Zhang, W. (2009). Continua of specificity and virulence in plant host – pathogen interactions : causes and consequences. New Phytologist, 183, 513–529. doi:10.1111/j.1469-8137.2009.02927.x
Barros, H. R. D. M., Ferreira, T. A. P. D. C., & Genovese, M. I. (2012). Antioxidant capacity and mineral content of pulp and peel from commercial cultivars of citrus from Brazil. Food Chemistry, 134(4), 1892–1998. doi:10.1016/j.foodchem.2012.03.090
Barros, L., Baptista, P., & Ferreira, I. C. F. R. (2007). Effect of Lactarius piperatus fruiting body maturity stage on antioxidant activity measured by several biochemical assays. Food and chemical toxicology, 45(9), 1731–1737. doi:10.1016/j.fct.2007.03.006
Bate, N. J., Orr, J., Ni, W., Meromi, A., Nadler-Hassar, T., Doerner, P, W., Dixon, R. A., et al. (1994). Quantitative relationship between phenylalanine ammonia-lyase levels and phenylpropanoid accumulation in transgenic tobacco identifies a rate-determining step in natural product synthesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 91, 7608–7612.
286
Beckman, C. H. (2000). Phenolic-storing cells: keys to programmed cell death and periderm formation in wilt disease resistance and in general defence responses in plants? Physiological and Molecular Plant Pathology, 57(3), 101–110. doi:10.1006/pmpp.2000.0287
Bell, A. (1981). Biochemical mechanisms of disease resistance. Annual review plant Physiology, 32, 21–81.
Bellés, J. M., López-Gresa, M. P., Fayos, J., Pallás, V., Rodrigo, I., & Conejero, V. (2008). Induction of cinnamate 4-hydroxylase and phenylpropanoids in virus-infected cucumber and melon plants. Plant Science, 174(5), 524–533. doi:10.1016/j.plantsci.2008.02.008
Bent, A. F., & Mackey, D. (2007). Elicitors, Effectors and R Genes : The New Paradigm and a Lifetime Supply of Questions. Annual review of phytopathology, 45, 399–436. doi:10.1146/annurev.phyto.45.062806.094427
Ben-Yephet, Y., Reuven, M., & Shtienberg, D. (1997). Complete Resistance by Carnation cultivars to Fusarium wilt induced by Fusarium oxysporum f. sp. dianthi raza 2. Plant Disease, 81(7), 777–780.
Ben-Yephet, Y., & Shtienberg, D. (1997). Effects of the Host, the pathogen, the environment and their interaction, on Fusarium Wilt in carnation. Phytoparasitica, 25(3), 207–216.
Berges, J. A., Fisher, A. E., & Harrison, P. J. (1993). A comparison of Lowry, Breadford and Smith protein assays using different protein standard and protein isolated from the marine diatom Thalassiosirva pseudona. Marine Biology, 115, 187–193.
Bernaert, N., De Paepe, D., Bouten, C., De Clercq, H., Stewart, D., Van Bockstaele, E., De Loose, M., et al. (2012). Antioxidant capacity, total phenolic and ascorbate content as a function of the genetic diversity of leek (Allium ampeloprasum var. porrum). Food Chemistry, 134(2), 669–77. doi:10.1016/j.foodchem.2012.02.159
Berrocal-Lobo, M., & Molina, A. (2008). Arabidopsis defense response against Fusarium oxysporum. Trends in Plant Science, 13(3), 145–50. doi:10.1016/j.tplants.2007.12.004
Biglari, F., AlKarkhi, A. F. M., & Easa, A. M. (2008). Antioxidant activity and phenolic content of various date palm (Phoenix dactylifera) fruits from Iran. Food Chemistry, 107(4), 1636–1641. doi:10.1016/j.foodchem.2007.10.033
Bindschedler, L. V, Dewdney, J., Blee, K. a, Stone, J. M., Asai, T., Plotnikov, J., Denoux, C., et al. (2006). Peroxidase-dependent apoplastic oxidative burst in Arabidopsis required for pathogen resistance. The Plant Journal, 47(6), 851–63. doi:10.1111/j.1365-313X.2006.02837.x
287
Bishop, D. (2002). Gene expression of a vacuolar peroxidase with stress-induced pathogenesis in wheat sheaths. Physiological and Molecular Plant Pathology, 61(1), 65–71. doi:10.1006/pmpp.2002.0417
Blount, J. W., Korth, K. L., Masoud, S. a, Rasmussen, S., Lamb, C., & Dixon, R. a. (2000). Altering expression of cinnamic acid 4-hydroxylase in transgenic plants provides evidence for a feedback loop at the entry point into the phenylpropanoid pathway. Plant Physiology, 122(1), 107–16.
Boava, L. P., Cristofani-Yaly, M., Stuart, R. M., & Machado, M. A. (2011). Expression of defense-related genes in response to mechanical wounding and Phytophthora parasitica infection in Poncirus trifoliata and Citrus sunki. Physiological and Molecular Plant Pathology, 76(2), 119–125. doi:10.1016/j.pmpp.2011.07.004
Boba, A., Kulma, A., Kostyn, K., Starzycki, M., Starzycka, E., & Szopa, J. (2011). The influence of carotenoid biosynthesis modification on the Fusarium culmorum and Fusarium oxysporum resistance in flax. Physiological and Molecular Plant Pathology, 76(1), 39–47. doi:10.1016/j.pmpp.2011.06.002
Boddu, J., Svabek, C., Ibraheem, F., Jones, A. D., & Chopra, S. (2005). Characterization of a deletion allele of a sorghum Myb gene yellow seed1 showing loss of 3-deoxyflavonoids. Plant Science, 169(3), 542–552. doi:10.1016/j.plantsci.2005.05.007
Boddu, J., Svabek, C., Sekhon, R., Gevens, A., Nicholson, R. L., Jones, a. D., Pedersen, J. F., et al. (2004). Expression of a putative flavonoid 3′-hydroxylase in sorghum mesocotyls synthesizing 3-deoxyanthocyanidin phytoalexins. Physiological and Molecular Plant Pathology, 65(2), 101–113. doi:10.1016/j.pmpp.2004.11.007
Bolwell, G. P., & Daudi, A. (2009). Reactive Oxygen Species in Plant Signaling. In L. A. Rio & A. Puppo (Eds.), Signaling and Communication in Plants (pp. 113–133). Berlin, Heidelberg: Springer Berlin Heidelberg. doi:10.1007/978-3-642-00390-5
Bonanomi, G., Vinale, F., & Scala, F. (2009). Plant-derived Natural Products. (A. E. Osbourn & V. Lanzotti, Eds.), 301–320. doi:10.1007/978-0-387-85498-4
Borregaard, N., Elsbach, P., Ganz, T., Garred, P., & A., S. (2000). Innate immunity: from plants to humans. Trends Immunology Today, 21, 68–70.
Borrero, C., Trillas, I., & Avilés, M. (2008). Carnation Fusarium wilt suppression in four composts. European Journal of Plant Pathology, 123(4), 425–433. doi:10.1007/s10658-008-9380-4
Bosland, P. W. (1988). Fusarium oxysporum, A pathogen of many plant species. Advance in Plant Pathology, 6, 281–289.
Bradford, M. (1976). A rapid and sensitivity method for detection of binding-dye proteins. Analytical biochemistry, 72, 248–254.
288
Breusegem, F. Van, Vranova, E., Dat, J. F., & Inze, D. (2001). The role of active oxygen species in plant signal transduction. Plant Science, 161, 405–414.
Broekaert, W. F., Delauré, S. L., De Bolle, M. F. C., & Cammue, B. P. a. (2006). The role of ethylene in host-pathogen interactions. Annual review of phytopathology, 44, 393–416. doi:10.1146/annurev.phyto.44.070505.143440
Broun, P. (2005). Transcriptional control of flavonoid biosynthesis: a complex network of conserved regulators involved in multiple aspects of differentiation in Arabidopsis. Current Opinion in Plant Biology, 8, 272–279.
Bruce, R. J., & West, C. A. (1989). Elicitation of Lignin Biosynthesis and Isoperoxidase Activity by Pectic Fragments in Suspension Cultures of Castor Bean. Plant Physiology, 91, 889–897.
Byth, H., Kuun, K. G., & Bornman, L. (2001). Virulence-dependent induction of Hsp70 / Hsc70 in tomato by Ralstonia solanacearum. Plant Physiology and Biochemistry, 39(2001), 697–705.
Calderon, A. A., Zapata, J. M., Muñoz, R., Pedreño, M. A., & Barcelo, A. R. (1993). Resveratrol Production as a part of the hypersensitive-like response of grapevine cells to an elicitor from Trichoderma viride. New Phytologist, 124(3), 455-463.
Campos, Â. D., Ferreira, A. G., Maria, M., Hampe, V., Antunes, I. F., Brancão, N., Silveira, E. P., et al. (2003). Induction of chalcone synthase and phenylalanine ammonia-lyase by salicylic acid and Colletotrichum lindemuthianum in common bean. Brazilian Journal of Plant Physiology, 15(3), 129–134.
Carpentier, S. C., Witters, E., Laukens, K., Deckers, P., Swennen, R., & Panis, B. (2005). Preparation of protein extracts from recalcitrant plant tissues: an evaluation of different methods for two-dimensional gel electrophoresis analysis. Proteomics, 5(10), 2497–507. doi:10.1002/pmic.200401222
Casati, P., Drincovich, F., Edwards, G. E., & Andreo, C. S. (1999). Malate metabolism by NADP-malic enzyme in plant defense. Photosynthesis Research, 61, 99–105.
Castellanos, O., Fonseca, S., & Buriticá, S. (2009). Agenda prospectiva de investigación y desarrollo tecnológico para la cadena productiva de flores y follajes con enfasis en clavel. Bogotá. Retrieved from http://www.minagricultura.gov.co/06docypresent/06g_publi_agend.aspx
Céspedes, T. ., & Sánchez, D. (2000). Algunos aspectos sobre el estrés oxidativo, el estado antioxidante y la terapia de suplementación. Revista Cubana de Cardiologia, 14, 55–60.
Chakravarti, B., Fathy, P., Sindicich, M., Mallik, B., & Chakravarti, D. N. (2010). Comparison of SYPRO Ruby and Flamingo fluorescent stains for application in
289
proteomic research. Analytical biochemistry, 398(1), 1–6. doi:10.1016/j.ab.2009.07.055
Chang, P. L. A., Hsu, C. A., Lin, Y. A., Chen, K. B., Huang, J. A., & Liou, T. B. (2008). Histopathology comparison and phenylalanine ammonia lyase ( PAL ) gene expressions in Fusarium wilt infected watermelons. Australian Journal of Agricultural Research, 59, 1146–1155.
Cheng, S., Sheen, J., Gerrish, C., & Bolwell, G. P. (2001). Molecular identification of phenylalanine ammonia-lyase as a substrate of a specific constitutively active Arabidopsis CDPK expressed in maize protoplasts. FEBS letters, 503, 185–188.
Chiangjong, W., & Thongboonkerd, V. (2009). A comparative study of different dyes for the detection of proteomes derived from Escherichia coli and MDCK cells: sensitivity and selectivity. Journal of chromatography. B, 877(14-15), 1433–9. doi:10.1016/j.jchromb.2009.03.012
Chiocchetti, A., Bernardo, I., Daboussi, M. J., Garibaldi, A., Gullino, L., Langin, T., & Migheli, Q. (2009). Detection of Fusarium oxysporum f. sp. dianthi in Carnation Tissue by PCR Amplification of Transposon Insertions. Phytopathology, 89, 1169–1175.
Choi, J. J., Klosterman, S. J., & Hadwiger, L. A. (2001). A Comparison of the Effects of DNA-Damaging Agents and Biotic Elicitors on the Induction of Plant Defense Genes, Nuclear Distortion, and Cell Death. Plant Physiology, 125(February), 752–762.
Cikos, S., & Koppel, J. (2009). Transformation of real-time PCR fluorescence data to target gene quantity. Analytical biochemistry, 384(1), 1–10. doi:10.1016/j.ab.2008.08.031
Claudot, A. C., Ernst, D., Sandermann, H., & Drouet, A. (1997). Chalcone synthase activity and polyphenolic compounds of shoot tissues from adult and rejuvenated walnut trees. Planta, 203, 275–282.
Claudot A. C., Ernst, D., Sandermann, H., & Drouet, A. (1999). Cloning and characterization of two members of the chalcone synthase gene family from walnut. Plant Physiology and Biochemistry, 37(10), 721–730. doi:10.1016/S0981-9428(00)86685-1
Clematis, F., Tedeschini, J., Dolci, M., Lanzotti, V., Cangelosi, B., Fascella, S., & Curir, P. (2011). Phenol Composition and Susceptibility to Fusarium oxysporum f. sp. dianthi in Carnation. Journal of Life Sciences, 5, 921–925.
Cochrane, F. C., Davin, L. B., & Lewis, N. G. (2004). The Arabidopsis phenylalanine ammonia lyase gene family : kinetic characterization of the four PAL isoforms. Phytochemistry, 65, 1557–1564. doi:10.1016/j.phytochem.2004.05.006
290
Cools, H. J., & Ishii, H. (2002). Pre-treatment of cucumber plants with acilbenzolar-S methyl sistemically primees a phenylalaninne ammonia lyase gene (PAL1) for enhanced expression upon attack with a pathogenic fungus. Physiological and Molecular Plant Pathology, 61, 273–280.
Cruickshank, I. A. M., & Perrin, D. R. (1960). Isolation of a phytoalexin from Pisum sativum. Nature, 187, 799–800.
Cuervo, C., Martinez, S. T., Ardila, H., & Higuera, B. L. (2009). Inducción diferencial de la enzima peroxidasa y su relación con lignificación en los mecanismos de defensa del clavel (Dianthus caryophyllus L) durante su interacción con Fusarium oxysporum f. sp. dianthi. Revista Colombiana de Química, 38(3), 379–393.
Cui, Y., Bell, A. A., Joost, O., & Magill, C. (2000). Expression of potential defense response genes in cotton. Physiological and Molecular Plant Pathology, 56, 25–31.
Curir, P., Danieli, B., Dolci, M., Pasini, C., Guglieri, L., & Sacco, M. (2000). Reductive detoxification of the acetophenone skeleton of the carnation phytoanticipin by Fusarium oxysporum f. sp. dianthi. Plant Pathology, 49, 742–747.
Curir, P., Dolci, M., Dolci, P., Lanzotti, V., & De Cooman, L. (2003). Fungitoxic phenols from carnation (Dianthus caryophyllus) effective against Fusarium oxysporum f. sp. dianthi. Phytochemical Analysis : PCA, 14(1), 8–12. doi:10.1002/pca.672
Curir, P., Dolci, M., & Galeotti, F. (2005). A phytoalexin-like flavonol involved in the carnation (Dianthus caryophyllus L)-Fusarium oxysporum f. sp. dianthi pathosystem. Journal of Phytopathology, 153, 65–67.
Curir, P., Dolci, M., Lanzotti, V., & Taglialatela-scafati, O. (2001). Kaempferide triglycoside : a possible factor of resistance of carnation (Dianthus caryophyllus L) to Fusarium oxysporum f. sp. dianthi. Phytochemistry, 56, 717–721.
Curtis, H., Noll, U., Störmann, J., & Slusarenko, A. J. (2004). Broad-spectrum activity of the volatile phytoanticipin allicin in extracts of garlic (Allium sativum L.) against plant pathogenic bacteria, fungi and oomycetes. Physiological and Molecular Plant Pathology, 65(2), 79–89. doi:10.1016/j.pmpp.2004.11.006
Cushnie, T. P. T., & Lamb, A. J. (2011). Recent advances in understanding the antibacterial properties of flavonoids. International Journal of Antimicrobial Agents, 38(2), 99–107. doi:10.1016/j.ijantimicag.2011.02.014
Czemmel, S., Heppel, S. C., & Bogs, J. (2012). R2R3 MYB transcription factors: key regulators of the flavonoid biosynthetic pathway in grapevine. Protoplasma, 249, S109–18. doi:10.1007/s00709-012-0380-z
D’Ippólito, S., Martín, M. L., Salcedo, M. F., Atencio, H. M., Casalongué, C. A., Godoy, A. V., & Fiol, D. F. (2010). Transcriptome profiling of Fusarium solani f. sp. eumartii -infected potato tubers provides evidence of an inducible defense response.
291
Physiological and Molecular Plant Pathology, 75(1-2), 3–12. doi:10.1016/j.pmpp.2010.09.002
Da Silva, M. A., Garcia, J. S., De Souza, G. H. M. F., Eberlin, M. N., Gozzo, F. C., & Arruda, M. A. Z. (2010). Evaluation of sample preparation protocols for proteomic analysis of sunflower leaves. Talanta, 80(4), 1545–51. doi:10.1016/j.talanta.2009.06.016
Dai, G. H., Nicole, M., Andary, C., Martinez, C., Bresson, E., Boher, B., Daneil, J. F., et al. (1996). Flavonoids accumulate in cell walls, middle lamellae and callose-rich papillae during an incompatible interaction between Xanthomonas campestris pv . malvacearum and cotton. Physiological and Molecular Plant Pathology, 49, 285–306.
Dakora, F. D., & Phillips, D. A. (1996). Diverse functions of isoflavonoids in legumes transcend anti-microbial definitions of phytoalexins. Physiological and Molecular Plant Pathology, 49, 1–20.
Dao, T. T. H., Linthorst, H. J. M., & Verpoorte, R. (2011). Chalcone synthase and its functions in plant resistance. Phytochemistry Reviews : Proceedings of the Phytochemical Society of Europe, 10(3), 397–412. doi:10.1007/s11101-011-9211-7
De La Fuente, M., Borrajo, A, Bermúdez, J., Lores, M., Alonso, J., López, M., Santalla, M., et al. (2011). 2-DE-based proteomic analysis of common bean (Phaseolus vulgaris L.) seeds. Journal of proteomics, 74(2), 262–7. doi:10.1016/j.jprot.2010.10.004
Depicker, A., & Montagu, M. (1997). Post-transcriptional gene silencing in plants. Current Opinion In Cell Biology, 9(3), 373–382.
Desmond, O. J., Manners, J. M., Schenk, P. M., Maclean, D. J., & Kazan, K. (2008). Gene expression analysis of the wheat response to infection by Fusarium pseudograminearum. Physiological and Molecular Plant Pathology, 73(1-3), 40–47. doi:10.1016/j.pmpp.2008.12.001
Dhaubhadel, S., Gijzen, M., Moy, P., & Farhangkhoee, M. (2007). Transcriptome analysis reveals a critical role of CHS7 and CHS8 genes for isoflavonoid synthesis in soybean seeds. Plant Physiology, 143(1), 326–38. doi:10.1104/pp.106.086306
Dhugga, K. S., Ulvskovs, P., Gallagherf, S. R., & Rayt, P. M. (1991). Plant Polypeptides Reversibly Glycosylated by UDP-Glucose. The Journal of Biological Chemistry, |(32), 21977–21984.
Di pietro, A., Madrid, M. P., Caracuel, Z., Delgado, J., & Roncero, M. (2003). Fusarium oxysporum: exploring the molecular arsenal of a vascular wilt fungus. Molecular Plant Pathology, 4(5), 315–325.
292
Die, J. V., González Verdejo, C. I., Dita, M. a, Nadal, S., & Román, B. (2009). Gene expression analysis of molecular mechanisms of defense induced in Medicago truncatula parasitized by Orobanche crenata. Plant Physiology and Biochemistry, 47(7), 635–41. doi:10.1016/j.plaphy.2009.02.016
Dihazi, A., Serghini, M. A., Jaiti, F., Daayf, F., Driouich, A., Dihazi, H., & El Hadrami, I. (2011). Structural and Biochemical Changes in Salicylic-Acid-Treated Date Palm Roots Challenged with Fusarium oxysporum f. sp. albedinis. Journal of Pathogens, 2011, 280481. doi:10.4061/2011/280481
Ding, L., Xu, H., Yi, H., Yang, L., Kong, Z., Zhang, L., Xue, S., et al. (2011). Resistance to hemi-biotrophic F. graminearum infection is associated with coordinated and ordered expression of diverse defense signaling pathways. Plos One, 6(4), e19008. doi:10.1371/journal.pone.0019008
Dinis, L., Peixoto, F., Zhang, C., Martins, L., Costa, R., & Gomes-Laranjo, J. (2011). Physiological and biochemical changes in resistant and sensitive chestnut (Castanea) plantlets after inoculation with Phytophthora cinnamomi. Physiological and Molecular Plant Pathology, 75(4), 146–156. doi:10.1016/j.pmpp.2011.04.003
Dixon, R. A., & Lamb, C. J. (1990). Molecular communication in interactions between plants and microbial pathogens. Annual review plant Physiology Plant and Molecular Biology, 41, 339–367.
Dixon, Richard A, Achnine, L., Kota, P., Liu, C.-J., Srinivasa, M., & Wang, L. (2002). The phenylpropanoid pathway and plant defence - a genomics perspective. Molecular Plant Pathology, 3(5), 371–390.
Dixon, Richard A, & Paiva, N. L. (1995). Stress-lnduced Phenylpropanoid Metabolism. The Plant Cell, 7(July), 1085–1097.
Dodds, P. N., & Rathjen, J. P. (2010). Plant immunity: towards an integrated view of plant–pathogen interactions. Nature Reviews, 11(8), 539-48. doi:10.1038/nrg2812
Dubos, C., Stracke, R., Grotewold, E., Weisshaar, B., Martin, C., & Lepiniec, L. (2010). MYB transcription factors in Arabidopsis. Trends in Plant Science, 15(10), 573–581. doi:10.1016/j.tplants.2010.06.005
Dwivedi, R. S., Breiman, A., & Herman, E. M. (2003). Differential distribution of the cognate and heat-stress-induced isoforms of high Mr cis-trans prolyl peptidyl isomerase (FKBP) in the cytoplasm and nucleoplasm. Journal of Experimental Botany, 54(393), 2679–89. doi:10.1093/jxb/erg307
Efeoğlu, B. (2009). Heat Shock Proteins and Heat Shock Response in Plants. G.U. Journal Of Science, 22(2), 67–75.
293
Eggert, K., Zörb, C., Mühling, K. H., & Pawelzik, E. (2011). Proteome analysis of Fusarium infection in emmer grains (Triticum dicoccum). Plant Pathology, 60(5), 918–928. doi:10.1111/j.1365-3059.2011.02442.x
El Hadrami, A., El-Bebany, A. F., Yao, Z., Adam, L. R., El Hadrami, I., & Daayf, F. (2012). Plants versus Fungi and Oomycetes: Pathogenesis, Defense and Counter-Defense in the Proteomics Era. International Journal Of Molecular Sciences, 13(6), 7237–59. doi:10.3390/ijms13067237
Ellis, J. G., & Jones, D. A. (2003). Plant Disease Resistance Genes. In R. . Ezekowitz & J. . Hoffmann (Eds.), Infectious Disease: Innate Immunity (Humana Pre., pp. 27–45). Totowa, New Jersey.
Engstrom, K. (1998). Post-infectional metabolites from infected potato tubers. Phytochemistry, 49(6), 1585–1587.
Faize, M, Burgos, L., Faize, L., Piqueras, A., Nicolas, E., Barba-Espin, G., Clemente-Moreno, M. J., et al. (2011). Involvement of cytosolic ascorbate peroxidase and Cu / Zn-superoxide dismutase for improved tolerance against drought stress. Journal of Experimental Botany, 62(8), 2599–2613. doi:10.1093/jxb/erq432
Faize, Mohamed, Faize, L., Ishizaka, M., & Ishii, H. (2004). Expression of potential defense responses of Asian and European pears to infection with Venturia nashicola. Physiological and Molecular Plant Pathology, 64(6), 319–330. doi:10.1016/j.pmpp.2004.09.009
Falcone Ferreyra, M. L., Rius, S., Emiliani, J., Pourcel, L., Feller, A., Morohashi, K., Casati, P., et al. (2010). Cloning and characterization of a UV-B-inducible maize flavonol synthase. The Plant Journal, 62(1), 77–91. doi:10.1111/j.1365-313X.2010.04133.x
Fang, X., Chen, W., Xin, Y., Zhang, H., Yan, C., Yu, H., Liu, H., et al. (2012). Proteomic analysis of strawberry leaves infected with Colletotrichum fragariae. Journal of Proteomics, 75(13), 4074–90. doi:10.1016/j.jprot.2012.05.022
Farnochi, M. C., Torres, A. M., Magan, N., & Chulze, S. N. (2005). Effect of antioxidants and competing mycoflora on Fusarium verticillioides and F. proliferatum populations and fumonisin production on maize grain. Journal of Stored Products Research, 41(2), 211–219. doi:10.1016/j.jspr.2004.03.004
Faulkner, C., & Robatzek, S. (2012). Plants and pathogens : putting infection strategies and defence mechanisms on the map. Current Opinion In Plant Biology. doi:10.1016/j.pbi.2012.08.009
Fernández, M. B., Pagano, M. R., Daleo, G. R., & Guevara, M. G. (2012). Hydrophobic proteins secreted into the apoplast may contribute to resistance against
294
Phytophthora infestans in potato. Plant Physiology and Biochemistry, 60, 59–66. doi:10.1016/j.plaphy.2012.07.017
Ferrer, Jean-Luc, Ravanel, S., Robert, M., & Dumas, R. (2004). Crystal structures of cobalamin-independent methionine synthase complexed with zinc, homocysteine, and methyltetrahydrofolate. The Journal of Biological Chemistry, 279(43), 44235–8. doi:10.1074/jbc.C400325200
Ferrer, J-L, Austin, M. B., Stewart, C., & Noel, J. P. (2008). Structure and function of enzymes involved in the biosynthesis of phenylpropanoids. Plant Physiology and Biochemistry, 46(3), 356–370. doi:10.1016/j.plaphy.2007.12.009
Ferreres, F., Figueiredo, R., Bettencourt, S., Carqueijeiro, I., Oliveira, J., Gil-Izquierdo, A., Pereira, D. M., et al. (2011). Identification of phenolic compounds in isolated vacuoles of the medicinal plant Catharanthus roseus and their interaction with vacuolar class III peroxidase: an H2O2 affair? Journal of Experimental Botany, 62(8), 2841–54. doi:10.1093/jxb/erq458
Fico, G., Bilia, A. R., Morelli, I., & Tome, F. (2000). Flavonoid distribution in Pyracantha coccinea plants at diferent growth phases. Biochemical Systematics and Ecology, 28, 673–678.
Flor, H. H. (1971). Current status of the gene for gene concept. Annual review of phytopathology, 78, 275–298.
Flores-Sánchez, I. J., & Verpoorte, R. (2008). PKS Activities and Biosynthesis of Cannabinoids and Flavonoids in Cannabis sativa L. Plants. Plant & Cell Physiology, 49(12), 1767–1782.
Fofana, B., McNally, D. J., Labbé, C., Boulanger, R., Benhamou, N., Séguin, A., & Belanger, R. (2002). Milsana-induced resistance in powdery mildew-infected cucumber plants correlates with the induction of chalcone synthase and chalcone isomerase. Physiological and Molecular Plant Pathology, 61, 121–132. doi:10.1006/pmpp.2002.0420
Forlani, G. (2010). Differential in vitro responses of rice cultivars to Italian lineages of the blast pathogen Pyricularia grisea. 2. Aromatic biosynthesis. Journal of Plant Physiology, 167(11), 928–32. doi:10.1016/j.jplph.2010.01.013
Frank, S. A. (1992). Models of Plant-pathogen co evolution. Trends in Genetics, 8(213-219).
Franken, A. C. W., Lokman, B. C., Ram, A. F. J., Punt, P. J., Van den Hondel, C. A M. J. J., & De Weert, S. (2011). Heme biosynthesis and its regulation: towards understanding and improvement of heme biosynthesis in filamentous fungi. Applied microbiology and biotechnology, 91(3), 447–60. doi:10.1007/s00253-011-3391-3
295
Fukui, Y., Tanaka, Y., Kusumi, T., Iwashita, T., & Nomoto, K. (2003). A rationale for the shift in colour towards blue in transgenic carnation flowers expressing the flavonoid 3′,5′-hydroxylase gene. Phytochemistry, 63(1), 15–23. doi:10.1016/S0031-9422(02)00684-2
Gaige, A. R., Ayella, A., & Shuai, B. (2010). Methyl jasmonate and ethylene induce partial resistance in Medicago truncatula against the charcoal rot pathogen Macrophomina phaseolina. Physiological and Molecular Plant Pathology, 74, 412–418. doi:10.1016/j.pmpp.2010.07.001
Galeotti, F., Barile, E., Curir, P., Dolci, M., & Lanzotti, V. (2008). Flavonoids from carnation (Dianthus caryophyllus L) and their antifungal activity. Phytochemistry Letters, 1(1), 44–48. doi:10.1016/j.phytol.2007.10.001
Galeotti, F., Barile, E., Lanzotti, V., Dolci, M., & Curir, P. (2008). Quantification of Major Flavonoids in Carnation Tissues. Z Naturforsch, 63, 161–168.
Gális, I., Simek, P., Narisawa, T., Sasaki, M., Horiguchi, T., Fukuda, H., & Matsuoka, K. (2006). A novel R2R3 MYB transcription factor NtMYBJS1 is a methyl jasmonate-dependent regulator of phenylpropanoid-conjugate biosynthesis in tobacco. The Plant Journal : For Cell and Molecular Biology, 46(4), 573–92. doi:10.1111/j.1365-313X.2006.02719.x
Gara, L. De, Pinto, M. C. De, & Tommasi, F. (2003). The antioxidant systems vis-à-vis reactive oxygen species during plant – pathogen interaction. Plant Physiology and Biochemistry, 41, 863–870. doi:10.1016/S0981-9428(03)00135-9
Garcia-Limones, C., Hervas, A., Navas-Cortés, J., Jimenez-Diaz, R., & Tena, M. (2003). Induction of an antioxidant enzyme system and other oxidative stress markers associated with compatible and incompatible interactions between chickpea (Cicer arietinum L.) and Fusarium oxysporum f. sp. ciceris. Physiological and Molecular Plant Pathology, 61(2002), 325–337. doi:10.1006/pmpp.2003.0445
Ge, Y., Bi, Y., & Guest, D. I. (2013). Defence responses in leaves of resistant and susceptible melon (Cucumis melo L.) cultivars infected with Colletotrichum lagenarium. Physiological and Molecular Plant Pathology, 81, 13–21. doi:10.1016/j.pmpp.2012.09.002
Giberti, S., Bertea, C. M., Narayana, R., Maffei, M. E., & Forlani, G. (2012). Two phenylalanine ammonia lyase isoforms are involved in the elicitor-induced response of rice to the fungal pathogen Magnaporthe oryzae. Journal of Plant Physiology, 169(3), 249–54. doi:10.1016/j.jplph.2011.10.008
Godard, S., Slacanin, I., Viret, O., & Gindro, K. (2009). Induction of defence mechanisms in grapevine leaves by emodin- and anthraquinone-rich plant extracts and their conferred resistance to downy mildew. Plant Physiology and Biochemistry, 47(9), 827–37. doi:10.1016/j.plaphy.2009.04.003
296
Godoy, A. V, Lazzaro, A. S., Casalongue, C. A., & San Segundo, B. (2000). Expression of a Solanum tuberosum cyclophilin gene is regulated by fungal infection and abiotic stress conditions. Plant Science, 152, 123–134.
Gokulakannan, G. G., & Niehaus, K. (2010). Characterization of the Medicago truncatula cell wall proteome in cell suspension culture upon elicitation and suppression of plant defense. Journal of plant physiology, 167(18), 1533–41. doi:10.1016/j.jplph.2010.06.023
Gómez, L., & Martinez, S. (2005). Inducción de dos enzimas pectolíticas en el modelo Fusarium oxysporum f.sp. dianthi-clavel. Revista Colombiana de Química, 34, 25–34.
Gómez-Gómez, L. (2004). Plant perception for pathogen recognition and defense. Molecular Immunology, 41, 1055–1062.
Gómez-Vásquez, R., Day, R., Buschmann, H., Randles, S., Beeching, J. R., & Cooper, R. M. (2004). Phenylpropanoids, phenylalanine ammonia lyase and peroxidases in elicitor-challenged cassava (Manihot esculenta) suspension cells and leaves. Annals of botany, 94(1), 87–97. doi:10.1093/aob/mch107
González, A., & Sarmiento, Z. (2013). Boletín Económico Mayo de 2013. Asocolflores. Retrieved from http://www.asocolflores.org/
González, J. F., Degrassi, G., Devescovi, G., De Vleesschauwer, D., Höfte, M., Myers, M. P., & Venturi, V. (2012). A proteomic study of Xanthomonas oryzae pv. oryzae in rice xylem sap. Journal of Proteomics, 75(18), 5911–9. doi:10.1016/j.jprot.2012.07.019
González-Lamothe, R., Mitchell, G., Gattuso, M., Diarra, M. S., Malouin, F., & Bouarab, K. (2009). Plant antimicrobial agents and their effects on plant and human pathogens. International Journal Of Molecular Sciences, 10(8), 3400–19. doi:10.3390/ijms10083400
Goswami, R. S., & Punja, Z. K. (2008). Molecular and biochemical characterization of defense responses in ginseng (Panax quinquefolius) roots challenged with Fusarium equiseti. Physiological and Molecular Plant Pathology, 72(1-3), 10–20. doi:10.1016/j.pmpp.2008.04.006
Goyal, S., Lambert, C., Cluzet, S., Mérillon, J. M., & Ramawat, K. G. (2012). Plant Defence: Biological Control. (J. M. Mérillon & K. G. Ramawat, Eds.). doi:10.1007/978-94-007-1933-0
Grant, J. J., & Loake, G. J. (2000). Update on Signaling Role of Reactive Oxygen Intermediates and Cognate Redox Signaling in Disease Resistance 1. Plant Physiology, 124, 21–29.
Grayer, R. J., & Kokubun, T. (2001). Plant-fungal interactions : the search for phytoalexins and other antifungal compounds from higher plants. Phytochemistry, 56, 253–263.
297
Großkinsky, D. K., Van der Graaff, E., & Roitsch, T. (2012). Phytoalexin transgenics in crop protection--fairy tale with a happy end?. Plant Science, 195, 54–70. doi:10.1016/j.plantsci.2012.06.008
Gryczka, U., Ptaszek, M., Midgal, W., & Orlikowski, L. (2010). Application of electron beam irradiation for inhibition of Fusarium oxysporum f. sp dianthi activity. Nukleonica, 55, 359–362.
Gullino, M. L., Minuto, A., Giraldi, G., & Garibaldi, A. (2002). Efficacy of azoxystrobin and other strobulins against Fusarium wilts of carnation, cyclamen and Paris daisy. Crop Protection, 21, 57–61.
Gunnaiah, R., Kushalappa, A. C., Duggavathi, R., Fox, S., & Somers, D. J. (2012). Integrated metabolo-proteomic approach to decipher the mechanisms by which wheat QTL (Fhb1) contributes to resistance against Fusarium graminearum. Plos One, 7(7), e40695. doi:10.1371/journal.pone.0040695
Gururani, M., Venkatesh, J., Prakash, C., Nookaraju, A., Kumar, S., & Won, S. (2012). Plant disease resistance genes : Current status and future directions. Physiological and Molecular Plant Pathology, 78, 51–65. doi:10.1016/j.pmpp.2012.01.002
Hammerschmidt, R. (1999). PHYTOALEXINS : What Have We Learned After 60 years? Annual review of phytopathology, 37(22), 285–306.
Hammerschmidt, R. (2005). Antioxidants and the regulation of defense. Physiological and Molecular Plant Pathology, 66(6), 211–212. doi:10.1016/j.pmpp.2005.11.001
Hammerschmidt, R. (2010). The dynamic apoplast. Physiological and Molecular Plant Pathology, 74(3-4), 199–200. doi:10.1016/j.pmpp.2010.05.003
Hammerschmidt, R. (2011). Phytoalexins at the right place and time. Physiological and Molecular Plant Pathology, 76(3-4), iii–iv. doi:10.1016/S0885-5765(11)00122-6
Han, Y. Y., Wang, J. W., Han, N., Liu, Q. J., Liu, T. M., Guan, F. M., & Ming, F. (2009). Duplication and sequence divergence of rice chalcone synthase genes. Russian Journal of Plant Physiology, 56(3), 417–422. doi:10.1134/S1021443709030169
Hanawa, F., Yamada, T., & Nakashima, T. (2001). Phytoalexins from Pinus strobus bark infected with pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus. Phytochemistry, 57, 223–228.
Hancock, J. T., Desikan, R., Clarke, A., Hurst, R. D., & Neill, S. J. (2002). Cell signalling following plant / pathogen interactions involves the generation of reactive oxygen and reactive nitrogen species. Plant Physiology and Biochemistry, 40, 611–617.
Hansberg, T. W. (2002). Biología de las especies reactivas de oxigeno. Mensaje Bioquímico, 26, 19–54.
298
Hao, Z. N., Wang, L. P., & Tao, R. X. (2009). Expression patterns of defence genes and antioxidant defence responses in a rice variety that is resistant to leaf blast but susceptible to neck blast. Physiological and Molecular Plant Pathology, 74(2), 167–174. doi:10.1016/j.pmpp.2009.11.003
Harborne, J. B. (1999). The comparative biochemistry of phytoalexin induction in plants. Biochemical Systematics and Ecology, 27.
Harborne, J. B., Mabry, T. J., & Mabry, H. (1975). The Flavonoids (Chapman and Hall.). Londres.
Harborne, J. B., & Williams, C. A. (2000). Advances in flavonoid research since 1992. Phytochemistry, 55(6), 481-504.
Hassan, M. A. E., & Abo-elyousr, K. A. M. (2013). Activation of tomato plant defence responses against bacterial wilt caused by Ralstonia solanacearum using DL-3-aminobutyric acid (BABA). European Journal of Plant Pathology, 136, 145–157. doi:10.1007/s10658-012-0149-4
Heath, M. C. (2000). Nonhost resistance and nonspecific plant defenses. Current Opinion In Plant Biology, 3, 315–319.
Heine, G. F., Hernandez, J. M., & Grotewold, E. (2004). Two cysteines in plant R2R3 MYB domains participate in REDOX-dependent DNA binding. The Journal of Biological Chemistry, 279(36), 37878–85. doi:10.1074/jbc.M405166200
Heller, J., & Tudzynski, P. (2011). Reactive oxygen species in phytopathogenic fungi: signaling, development, and disease. Annual review of phytopathology, 49(c), 369–90. doi:10.1146/annurev-phyto-072910-095355
Hernández, I., Alegre, L., Van Breusegem, F., & Munné-Bosch, S. (2009). How relevant are flavonoids as antioxidants in plants? Trends in Plant Science, 14(3), 125–132. doi:10.1016/j.tplants.2008.12.003
Higuera, B. L. (2001). Contribución al estudio de la participación de los compuestos fenólicos en los mecanismos de la interacción Clavel Dianthus caryophyllus L Fusarium oxysporum f. sp. dianthi. Tesis de Doctorado en Química. Facultad de Ciencias. Universidad Nacional de Colombia.
Higuera, B. L., & Ebrahim-Nesbat, F. (1999). Study of vascular root responses as defense mechanisms in carnation resistance or susceptible to Fusarium oxysporum f. sp. dianthi by transmission electron microscopy. Acta Horticulturae, 482, 101–108.
Higuera, B. L., & Montes de Gómez, V. (1996). Contribution of HPLC to the study of the defence mechanisms acting in carnation (Dianthus caryophyllus L.) roots on infection with Fusarium oxysporum f. sp. dianthi. Journal Of High Resolution Chromatography, 19, 706–708.
299
Hinderer, W., & Seitz, H. U. (1985). Chalcone synthase from cell suspension cultures of Daucus carota L. Archives of Biochemistry and Biophysics, 240, 265–272.
Hiraga, S., Yamamoto, K., Ito, H., Sasaki, K., Matsui, H., Honma, M., Nagamura, Y., et al. (2000). Diverse expression profiles of 21 rice peroxidase genes. FEBS letters, 471, 245–250.
Ho, C.-L., Noji, M., Saito, M., & Saito, K. (1999). Regulation of Serine Biosynthesis in Arabidopsis. Crucial role of plastidic 3-phosphoglycerate dehydrogenase in non-photosynthetic tissue. Journal of Biological Chemistry, 274(1), 397–402. doi:10.1074/jbc.274.1.397
Hong, L., Qian, Q., Tang, D., Wang, K., Li, M., & Cheng, Z. (2012). A mutation in the rice chalcone isomerase gene causes the golden hull and internode 1 phenotype. Planta, 236(1), 141–51. doi:10.1007/s00425-012-1598-x
Hossain, M. B., Patras, A., Barry-Ryan, C., Martin-Diana, A. B., & Brunton, N. P. (2011). Application of principal component and hierarchical cluster analysis to classify different spices based on in vitro antioxidant activity and individual polyphenolic antioxidant compounds. Journal of Functional Foods, 3(3), 179–189. doi:10.1016/j.jff.2011.03.010
Houterman, P. M., Cornelissen, B., & Rep, M. (2008). Suppression of Plant Resistance Gene-Based Immunity by a Fungal Effector. PLoS Pathog 4(5): e1000061. doi:10.1371/journal.ppat.1000061
Houterman, P. M., Ma, L., Van Ooijen, G., De Vroomen, M., Coornelissen, B. J., Takken, F. L., & Rep, M. (2009). The effector protein Avr2 of the xylem-colonizing fungus Fusarium oxysporum activates the tomato resistance protein I-2 intracellularly. Plant Journal, 58, 970–978.
Huang, L., & Backhouse, D. (2005). Induction of Defence Responses in Roots and Mesocotyls of Sorghum Seedlings by Inoculation with Fusarium thapsinum and F. proliferatum, Wounding and Light. Journal Phytopathology, 153, 522–529.
Huckelhoven, R. H. (2007). Cell Wall – Associated Mechanisms of Disease Resistance and Susceptibility. Annual review of phytopathology, 45, 101–127.
Hussain, A. I., Anwar, F., Hussain Sherazi, S. T., & Przybylski, R. (2008). Chemical composition, antioxidant and antimicrobial activities of basil (Ocimum basilicum) essential oils depends on seasonal variations. Food Chemistry, 108(3), 986–995. doi:10.1016/j.foodchem.2007.12.010
Hutcheson, S, W. (1998). Current concepts of active defence in plants. Annual review of phytopathology, 36, 59–90.
300
Huystee, R. B. Van. (1987). Some molecular aspects of plant peroxidase biosynthetic studies. Annual review plant Physiol, 38(67).
Hyun, M. W., Yun, Y. H., Kim, J. Y., & Kim, S. H. (2011). Fungal and Plant Phenylalanine Ammonia-lyase. Mycobiology, 39(4), 257–265.
Ito, M., Ichinose, Y., Kato, H., Shiraishi, T., & Yamada, T. (1997). Molecular evolution and functional relevance of the chalcone synthase genes of pea. Molecular & General Genetics, 225, 28–37.
Ito, S.-I., Ihara, T., Tamura, H., Tanaka, S., Ikeda, T., Kajihara, H., Dissanayake, C., et al. (2007). alpha-Tomatine, the major saponin in tomato, induces programmed cell death mediated by reactive oxygen species in the fungal pathogen Fusarium oxysporum. FEBS letters, 581(17), 3217–22. doi:10.1016/j.febslet.2007.06.010
Jabeen, N., Ahmed, N., Ghani, M. Y., & Sofi, P. A. (2009). Role of phenolic compounds in resistance to chilli wilt. Communications In Biometry And Crop Science, 4(2), 52–61.
Jacyn Baker, C., Roberts, D. P., Mock, N. M., Whitaker, B. D., Deahl, K. L., & Aver’yanov, A. a. (2005). Apoplastic redox metabolism: Synergistic phenolic oxidation and a novel oxidative burst. Physiological and Molecular Plant Pathology, 67(6), 296–303. doi:10.1016/j.pmpp.2006.04.005
Jaiti, F., Verdeil, J. L., & El Hadrami, I. (2009). Effect of jasmonic acid on the induction of polyphenoloxidase and peroxidase activities in relation to date palm resistance against Fusarium oxysporum f. sp. albedinis. Physiological and Molecular Plant Pathology, 74(1), 84–90. doi:10.1016/j.pmpp.2009.09.005
James, J. T., & Dubery, I. A. (2009). Pentacyclic triterpenoids from the medicinal herb, Centella asiatica (L.) Urban. Molecules, 14(10), 3922–41. doi:10.3390/molecules14103922
Jenner, H. L., Winning, B. M., Millar, a H., Tomlinson, K. L., Leaver, C. J., & Hill, S. A. (2001). NAD malic enzyme and the control of carbohydrate metabolism in potato tubers. Plant Physiology, 126(3), 1139–49.
Jez, J. M., Bowman, M. E., & Noel, J. P. (2002). Role of Hydrogen Bonds in the Reaction Mechanism of Chalcone Isomerase. Biochemistry, 41, 5168–5176.
Jez, J. M., & Noel, J. P. (2002). Reaction mechanism of chalcone isomerase. The Journal of Biological Chemistry, 277(2), 1361–9. doi:10.1074/jbc.M109224200
Jia, Z., Tang, M., & Wu, J. (1999). The determination of flavonoid contents in mulberry and their scavenging effects on superoxide radicals. Food Chemistry, 64, 555–559.
Jones, A. M., Chattopadhyay, A., Shukla, M., Zoń, J., & Saxena, P. K. (2012). Inhibition of phenylpropanoid biosynthesis increases cell wall digestibility, protoplast isolation, and facilitates sustained cell division in American elm (Ulmus americana ) Inhibition
301
of phenylpropanoid biosynthesis increases cell wall digestibility. BMC Plant Biology, 12, 75.
Jones, J. D. G., & Dangl, J. L. (2006). The plant immune system. Nature, 444, 323–329. doi:10.1038/nature05286
Jorrín-Novo, J. V., Calvete, J. J., & Maldonado, A. M. (2008). Proteómica: Conceptos y metodologías. In V. Pallás, C. Escobar, P. Rodríguez-Palenzuela, & J. F. Marcos (Eds.), Herramientas Biotecnológicas en Fitopatología (Sociedad E., pp. 75–93). Madrid.
Kahkonen, M. P., Hopia, A. I., Vuorela, H. J., Rauha, J. P., Pihlaja, K., Kujala, T. S., & Heinonen, M. (1999). Antioxidant activity of plant extracts containing phenolic compounds. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 47, 3954–3962.
Kamoun, S. (2007). Groovy times: filamentous pathogen effectors revealed. Current Opinion In Plant Biology, 10, 358–365.
Kangatharalingam, N., Pierce, M. L., Bayles, M. B., & Essenberg, M. (2002). Epidermal anthocyanin production as an indicator of bacterial blight resistance in cotton. Physiological and Molecular Plant Pathology, 61(3), 189–195. doi:10.1006/pmpp.2002.0434
Kao, Y. Y., Harding, S. A., & Tsai, C. J. (2002). Differential expression of two distinct Phenylalanine Ammonia-Lyase genes in condensed tannin-accumulating and lignifying cells of quaking aspen. Plant Physiology, 130, 796–807.
Kasai, A., Watarai, M., Yumoto, S., Akada, S., Ishikawa, R., Harada, T., Niizeki, M., et al. (2004). Influence of PTGS on Chalcone Synthase Gene Family in Yellow Soybean Seed Coat. Breeding Science, 54(4), 355–360. doi:10.1270/jsbbs.54.355
Katilé, S. O., Perumal, R., Rooney, W. L., Prom, L. K., & Magill, C. W. (2010). Expression of pathogenesis-related protein PR-10 in sorghum floral tissues in response to inoculation with Fusarium thapsinum and Curvularia lunata. Molecular Plant Pathology, 11, 93–103. doi:10.1111/J.1364-3703.2009.00580.X
Kawamata, S., Shimoharai, K., Imura, Y., Osaki, M., Ichinose, Y., Shiraishi, T., Kunoh, H., et al. (1997). Temporal and spatial pattern of expression of the pea Phenylalanine ammonio-lyase gene1 promoter in transgenic tobacco. Plant Cell Physiology, 38(7), 792–803.
Kawano, T. (2003). Roles of the reactive oxygen species-generating peroxidase reactions in plant defense and growth induction. Plant Cell Reports, 21(9), 829–37. doi:10.1007/s00299-003-0591-z
Kim, B. G., Lee, E. R., & Ahn, J. H. (2012). Analysis of flavonoid contents and expression of flavonoid biosynthetic genes in Populus euramericana Guinier in response to
302
abiotic stress. Journal of the Korean Society for Applied Biological Chemistry, 55(1), 141–145. doi:10.1007/s13765-012-0025-0
Kim, H. G., Kim, G.-S., Lee, J. H., Park, S., Jeong, W. Y., Kim, Y.-H., Kim, J. H., et al. (2011). Determination of the change of flavonoid components as the defence materials of Citrus unshiu Marc. fruit peel against Penicillium digitatum by liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry. Food Chemistry, 128(1), 49–54. doi:10.1016/j.foodchem.2011.02.075
Knogee, W. (1996). Fungal infection of plants. Plant Cell, 8, 1711–1722.
Kodama, O., Miyakawa, J., Akatsuka, T., & Kiyosawa, S. (1992). Sakuranetin, a flavanone phytoalexin from ultraviolet-irradiated rice leaves. Phytochemistry, 31, 3807–3809.
Koes, R. E., & Spelt, C. E. (1989). The chalcone synthase multigene family of Petunia hybrida (V30): differential, light regulated expression during flower development and UV light induction. Plant Molecular Biology, 12, 213–225.
Koga, H., Dohi, K., Nishiuchi, T., Kato, T., Takahara, H., Mori, M., & Komatsu, S. (2012). Proteomic analysis of susceptible rice plants expressing the whole plant-specific resistance against Magnaporthe oryzae: Involvement of a thaumatin-like protein. Physiological and Molecular Plant Pathology, 77(1), 60–66. doi:10.1016/j.pmpp.2011.12.001
Kosová, K., Vítámvás, P., Prášil, I. T., & Renaut, J. (2011). Plant proteome changes under abiotic stress--contribution of proteomics studies to understanding plant stress response. Journal of Proteomics, 74(8), 1301–22. doi:10.1016/j.jprot.2011.02.006
Kostekamp, A. (2006). Expression analysis of defense-related genes in grapevine leaves after inoculation with a host and a non-host pathogen. Plant Physiology and Biochemistry, 44, 58–67.
Kostyn, K., Czemplik, M., Kulma, A., Bortniczuk, M., Skała, J., & Szopa, J. (2012). Genes of phenylpropanoid pathway are activated in early response to Fusarium attack in flax plants. Plant Science, 190, 103–15. doi:10.1016/j.plantsci.2012.03.011
Kreuzaler, F., & Hahlbrock, K. (1975). Synthesis of Aromatic Compounds in higuer plants. Archives of Biochemistry and Biophysics, 90(6), 84–90.
Kröner, A., Marnet, N., Andrivon, D., & Val, F. (2012). Nicotiflorin , rutin and chlorogenic acid : phenylpropanoids involved differently in quantitative resistance of potato tubers to biotrophic and necrotrophic pathogens. Plant Physiology and Biochemistry, 57, 23–31. doi:10.1016/j.plaphy.2012.05.006
Kroymann, J. (2011). Natural diversity and adaptation in plant secondary metabolism. Current Opinion In Plant Biology, 14(3), 246–51. doi:10.1016/j.pbi.2011.03.021
303
Kunradi, F. G., Campelo, G. D. S., Copetti, C., Di Pietro, P. F., Nunes, E. D. C., & Fett, R. (2011). Phenolic compounds and antioxidant activity of the apple flesh and peel of eleven cultivars grown in Brazil. Scientia Horticulturae, 128(3), 261–266. doi:10.1016/j.scienta.2011.01.032
Kuroda, K., Sasaki, K., Iwai, T., Yazaki, Y., Hiraga, S., Seo, S., Mitsuhara, I., et al. (2006). Rapid defense gene expression in both resistant and susceptible rice cultivars by elicitor(s) originating from conidia of blast fungus—Basal resistance response before fungal penetration into host cells. Physiological and Molecular Plant Pathology, 69(1-3), 13–25. doi:10.1016/j.pmpp.2006.12.003
Kúzniak, E., & Urbanek, H. (2000). The involvement of hydrogen peroxide in plant responses to stresses. Acta Physiologiae Plantarum, 22, 195–203.
Lamb, C., & Dixon, R. (1997). The oxidative burst in plant disease resistance. Annual review plant Physiology, 48, 251–75.
Lanubile, A., Bernardi, J., Battilani, P., Logrieco, A., & Marocco, A. (2012). Resistant and susceptible maize genotypes activate different transcriptional responses against Fusarium verticillioides. Physiological and Molecular Plant Pathology, 77(1), 52–59. doi:10.1016/j.pmpp.2011.12.002
Lanubile, A., Bernardi, J., Marocco, A., Logrieco, A., & Paciolla, C. (2012). Differential activation of defense genes and enzymes in maize genotypes with contrasting levels of resistance to Fusarium verticillioides. Environmental and Experimental Botany, 78, 39–46. doi:10.1016/j.envexpbot.2011.12.006
Lea, U. S., Slimestad, R., Smedvig, P., & Lillo, C. (2007). Nitrogen deficiency enhances expression of specific MYB and bHLH transcription factors and accumulation of end products in the flavonoid pathway. Planta, 225(5), 1245–53. doi:10.1007/s00425-006-0414-x
Lecomte, M., Berruyer, R., Hamama, L., Boedo, C., Hudhomme, P., Bersihand, S., Arul, J., et al. (2012). Inhibitory effects of the carrot metabolites 6-methoxymellein and falcarindiol on development of the fungal leaf blight pathogen Alternaria dauci. Physiological and Molecular Plant Pathology, 80, 58–67. doi:10.1016/j.pmpp.2012.10.002
Lewis, N. G., & Yakamoto, E. (1990). Lignin: Ocurrence, biogénesis and biodegradation. Annual review plant Physiology Plant Molecular Biology, 41, 455–496.
Li, D.-M., Staehelin, C., Zhang, Y.-S., & Peng, S.-L. (2009). Identification of genes differentially expressed in Mikania micrantha during Cuscuta campestris infection by suppression subtractive hybridization. Journal of Plant Physiology, 166(13), 1423–35. doi:10.1016/j.jplph.2009.02.002
304
Li, F.-X., Jin, Z.-P., Zhao, D.-X., Cheng, L.-Q., Fu, C.-X., & Ma, F. (2006). Overexpression of the Saussurea medusa chalcone isomerase gene in S. involucrata hairy root cultures enhances their biosynthesis of apigenin. Phytochemistry, 67(6), 553–60. doi:10.1016/j.phytochem.2005.12.004
Lin, J.-T., Liu, S.-C., Tsay, G., & Yang, D.-J. (2010). Composition of flavonoids and phenolic acids in Glycin tomentella Hayata cultivated in various soils. Food Chemistry, 121(3), 659–665. doi:10.1016/j.foodchem.2010.01.004
Lin, Y.-Z., Chen, H.-Y., Kao, R., Chang, S.-P., Chang, S.-J., & Lai, E.-M. (2008). Proteomic analysis of rice defense response induced by probenazole. Phytochemistry, 69(3), 715–28. doi:10.1016/j.phytochem.2007.09.005
Little, C. R., & Magill, C. W. (2003). Elicitation of defense response genes in sorghum floral tissues infected by Fusarium thapsinum and Curvularia lunata at anthesis. Physiological and Molecular Plant Pathology, 63(5), 271–279. doi:10.1016/j.pmpp.2004.02.001
Liu, X.-J., Kang, L.-Q., Liu, Y.-J., Li, H., & Peng, X. (2013). Characterization of the Edwardsiella tarda proteome in response to different environmental stresses. Journal of Proteomics, 80, 320–33. doi:10.1016/j.jprot.2013.01.022
Lizcano, L. J., Bakkali, F., Begoña Ruiz-Larrea, M., & Ignacio Ruiz-Sanz, J. (2010). Antioxidant activity and polyphenol content of aqueous extracts from Colombian Amazonian plants with medicinal use. Food Chemistry, 119(4), 1566–1570. doi:10.1016/j.foodchem.2009.09.043
López, M. ., Berggren, K., Chernokalskaya, E., Lazarev, A., Robinson, M., & Patton, W. (2000). A comparison of silver stain and SYPRO Ruby protein gel stain with respect to protein detection in two-dimensional gels and identification by peptide mass profiling. Electrophoresis, 20, 3673–3683.
Lorenc-Kukuła, K., Wróbel-Kwiatkowska, M., Starzycki, M., & Szopa, J. (2007). Engineering flax with increased flavonoid content and thus Fusarium resistance. Physiological and Molecular Plant Pathology, 70(1-3), 38–48. doi:10.1016/j.pmpp.2007.05.005
Louime, C., Lu, J., Onokpise, O., Vasanthaiah, H. K. N., Kambiranda, D., Basha, S. M., & Yun, H. K. (2011). Resistance to Elsinoë ampelina and expression of related resistant genes in Vitis rotundifolia michx. Grapes. International Journal Of Molecular Sciences, 12(6), 3473–88. doi:10.3390/ijms12063473
Loureiro, A., Nicole, M. R., Várzea, V., Moncada, P., Bertrand, B., & Silva, M. C. (2012). Coffee resistance to Colletotrichum kahawae is associated with lignification, accumulation of phenols and cell death at infection sites. Physiological and Molecular Plant Pathology, 77(1), 23–32. doi:10.1016/j.pmpp.2011.11.002
305
Lozovaya, V. V, Lygin, A. V, Zernova, O. V, Ulanov, A. V, Li, S., Hartman, G. L., & Widholm, J. M. (2007). Modification of phenolic metabolism in soybean hairy roots through down regulation of chalcone synthase or isoflavone synthase. Planta, 225(3), 665–79. doi:10.1007/s00425-006-0368-z
Lu, Y., Xie, L., & Chen, J. (2012). A novel procedure for absolute real-time quantification of gene expression patterns. Plant Methods, 8(1), 9. doi:10.1186/1746-4811-8-9
Lüthje, S., Meisrimler, C.-N., Hopff, D., & Möller, B. (2011). Phylogeny, topology, structure and functions of membrane-bound class III peroxidases in vascular plants. Phytochemistry, 72(10), 1124–35. doi:10.1016/j.phytochem.2010.11.023
Mabry, T. J., Harborne, J. B., & Marby, H. (1980). The flavonoid (Chapman Hall.). Londres.
Mackay, V. L., Li, X., Flory, M. R., Turcott, E., Law, G. L., Serikawa, K. A., Xu, X. L., et al. (2004). Gene expression analyzed by high-resolution state array analysis and quantitative proteomics. Molecular and Cellular Proteomics, 478–489. doi:10.1074/mcp.M300129-MCP200
Madadkhah, E., Lotfi, M., Nabipour, A., Rahmanpour, S., Banihashemi, Z., & Shoorooei, M. (2012). Enzymatic activities in roots of melon genotypes infected with Fusarium oxysporum f. sp. melonis race 1. Scientia Horticulturae, 135, 171–176. doi:10.1016/j.scienta.2011.11.020
Maldonado, A. ., Echevarría-Zomeño, S., Jean-Baptiste, S., Hernandez, M., & Jorrín-Novo, J. V. (2008). Evaluation of three different protocols of protein extraction for Arabidopsis thaliana leaf proteome analysis by two-dimensional electrophoresis. Journal Proteomics, 71, 461–72.
Mandal, S., & Mitra, A. (2007). Reinforcement of cell wall in roots of Lycopersicon esculentum through induction of phenolic compounds and lignin by elicitors. Physiological and Molecular Plant Pathology, 71(4-6), 201–209. doi:10.1016/j.pmpp.2008.02.003
Mandal, S., Mitra, A., & Mallick, N. (2008). Biochemical characterization of oxidative burst during interaction between Solanum lycopersicum and Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici. Physiological and Molecular Plant Pathology, 72(1-3), 56–61. doi:10.1016/j.pmpp.2008.04.002
Marjamaa, K., Kukkola, E. M., & Fagerstedt, K. V. (2009). The role of xylem class III peroxidases in lignification. Journal of Experimental Botany, 60(2), 367–76. doi:10.1093/jxb/ern278
Maruta, T., Tanouchi, A., Tamoi, M., Yabuta, Y., Yoshimura, K., Ishikawa, T., & Shigeoka, S. (2010). Arabidopsis chloroplastic ascorbate peroxide isoenzymes play a dual role
306
in photoprotection and gene regulation under photooxidative stress. Plant & Cell Physiology, 51(2), 190–200. doi:10.1093/pcp/pcp177
Matern, U., & Kneusel, R. E. (1988). Phenolic compounds in plant disease resistance. Phytoparasitica, 16, 153–170.
Mathé, C., Barre, A., Jourda, C., & Dunand, C. (2010). Evolution and expression of class III peroxidases. Archives of biochemistry and biophysics, 500(1), 58–65. doi:10.1016/j.abb.2010.04.007
Mato, M., Onozaki, T., Ozeki, Y., Higeta, D., Itoh, Y., Yoshimoto, Y., Ikeda, H., et al. (2000). Flavonoid biosynthesis in white-flowered Sim carnations (Dianthus caryophyllus L). Scientia Horticulturae, 84, 333–347.
Mayorga, R., & Higuera, B. L. (2007). Aislamiento y caracterización de una polifenoloxidasa relacionada con la tolerancia del clavel (Dianthus caryophyllus L) a Fusarium oxysporum f. sp. dianthi raza 2. Acta Biologica Colombiana, 12, 83–96.
Mcdonald, B. A., & Linde, C. (2002). Pathogen populations genetics, evolutionary potencial, and durable resisteance. Annual Review of Pphytopathology, 40. doi:10.1146/annurev.phyto.40.120501.101443
McNally, D. J., Wurms, K. V, Labbé, C., & Bélanger, R. R. (2003). Synthesis of C-glycosyl flavonoid phytoalexins as a site-specific response to fungal penetration in cucumber. Physiological and Molecular Plant Pathology, 63(6), 293–303. doi:10.1016/j.pmpp.2004.03.005
Medeiros, F. C. L., Resende, M. L. V., Medeiros, F. H. V., Zhang, H. M., & Paré, P. W. (2009). Defense gene expression induced by a coffee-leaf extract formulation in tomato. Physiological and Molecular Plant Pathology, 74(2), 175–183. doi:10.1016/j.pmpp.2009.11.004
Mehrtens, F., Kranz, H., Bednarek, P., & Weisshaar, B. (2005). The Arabidopsis transcription factor MYB12 is a flavonol-specific regulator of phenylpropanoid biosynthesis. Plant Physiology, 138(2), 1083–1096.
Melero-Vara, J. M., López-Herrera, C. J., Prados-Ligero, a. M., Vela-Delgado, M. D., Navas-Becerra, J. a., & Basallote-Ureba, M. J. (2011). Effects of soil amendment with poultry manure on carnation Fusarium wilt in greenhouses in southwest Spain. Crop Protection, 30(8), 970–976. doi:10.1016/j.cropro.2011.03.022
Mellersh, D. G., Foulds, I. V, Higgins, V. J., & Heath, M. C. (2002). H2O2 plays different roles in determining penetration failure in three diverse plant-fungal interactions. The Plant Journal, 29, 257–268.
Mendgen, K., & M., H. (2000). Plant infection and establishment of fungal biotrophy. Trends in Plant Science, 1360–1365.
307
Mendoza, M. (2011). Oxidative burst in plant-pathogen interaction. Biotecnología Vegetal, 11(2), 67–75.
Mengiste, T. (2012). Plant immunity to necrotrophs. Annual review of phytopathology, 50, 267–294. doi:10.1146/annurev-phyto-081211-172955
Mikulič Petkovšek, M., Slatnar, A., Veberic, R., Stampar, F., & Solar, A. (2011). Phenolic response in green walnut husk after the infection with bacteria Xanthomonas arboricola pv. juglandis. Physiological and Molecular Plant Pathology, 76(3-4), 159–165. doi:10.1016/j.pmpp.2011.09.006
Mikulič Petkovšek, M., Štampar, F., & Veberič, R. (2009). Accumulation of phenolic compounds in apple in response to infection by the scab pathogen, Venturia inaequalis. Physiological and Molecular Plant Pathology, 74(1), 60–67. doi:10.1016/j.pmpp.2009.09.003
Miles, T. D., Vandervoort, C., Nair, M. G., & Schilder, A. C. (2013). Characterization and biological activity of flavonoids from ripe fruit of an anthracnose-resistant blueberry cultivar. Physiological and Molecular Plant Pathology, 83(March), 8–16. doi:10.1016/j.pmpp.2013.02.004
Milli, A., Cecconi, D., Bortesi, L., Persi, A., Rinalducci, S., Zamboni, A., Zoccatelli, G., et al. (2011). Proteomic analysis of the compatible interaction between Vitis vinifera and Plasmopara viticola. Journal of Proteomics, 75(4), 1284–302. doi:10.1016/j.jprot.2011.11.006
Miranda, M., Ralph, S. G., Mellway, R., White, R., Heath, M. C., Bohlmann, J., & Constabel, C. P. (2007). The transcriptional response of hybrid Poplar (Populus trichocarpa x P. deltoides) to infection by Melampsora medusae leaf rust involves induction of flavonoid pathway genes leading to the accumulation of proanthocyanidins. Molecular Plant-Microbe Interactions, 20(7), 816–831.
Mitchell-Ods, T., & Bergelson, J. (2000). Biotic interactions genomics and coevolution. Current Opinion In Plant Biology, 3, 273–277.
Mittler, R., Vanderauwera, S., Gollery, M., & Van Breusegem, F. (2004). Reactive oxygen gene network of plants. Trends in Plant Science, 9(10), 490–8. doi:10.1016/j.tplants.2004.08.009
Modafar, C. El, Tantaoui, A., & Boustani, E. El. (2001). Differential induction of phenylalanine ammonia-lyase activity in date palm roots in response to inoculation with Fusarium oxysporum f. sp. albedinis and to elicitation with fungal wall elicitor. Journal of Plant Physiology, 158, 715–722.
Morkunas, I., & Bednarski, W. (2008). Fusarium oxysporum-induced oxidative stress and antioxidative defenses of yellow lupine embryo axes with different sugar levels. Journal of plant physiology, 165(3), 262–77. doi:10.1016/j.jplph.2007.01.020
308
Morkunas, I., & Gmerek, J. (2007). The possible involvement of peroxidase in defense of yellow lupine embryo axes against Fusarium oxysporum. Journal of Plant Physiology, 164(2), 185–94. doi:10.1016/j.jplph.2005.11.005
Morkunas, I., Narożna, D., Nowak, W., Samardakiewicz, S., & Remlein-Starosta, D. (2011). Cross-talk interactions of sucrose and Fusarium oxysporum in the phenylpropanoid pathway and the accumulation and localization of flavonoids in embryo axes of yellow lupine. Journal of Plant Physiology, 168(5), 424–33. doi:10.1016/j.jplph.2010.08.017
Morkunas, I., Stobiecki, M., Marczak, Ł., Stachowiak, J., Narożna, D., & Remlein-Starosta, D. (2010). Changes in carbohydrate and isoflavonoid metabolism in yellow lupine in response to infection by Fusarium oxysporum during the stages of seed germination and early seedling growth. Physiological and Molecular Plant Pathology, 75(1-2), 46–55. doi:10.1016/j.pmpp.2010.08.005
Mukherjee, A. K., Carp, M.-J., Zuchman, R., Ziv, T., Horwitz, B. A, & Gepstein, S. (2010). Proteomics of the response of Arabidopsis thaliana to infection with Alternaria brassicicola. Journal of Proteomics, 73(4), 709–20. doi:10.1016/j.jprot.2009.10.005
Muthamilarasan, M., & Prasad, M. (2013). Plant innate immunity : An updated insight into defense mechanism. Journal of Biosciences, 38(2), 1–17. doi:10.1007/s12038-013-9302-2
Naoumkina, M., Farag, M. A, Sumner, L. W., Tang, Y., Liu, C.-J., & Dixon, R. A. (2007). Different mechanisms for phytoalexin induction by pathogen and wound signals in Medicago truncatula. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 104(46), 17909–15. doi:10.1073/pnas.0708697104
Naoumkina, M., Zhao, Q., Gallego-giraldo, L., Dai, X., Zhao, P. X., & Dixon, R. A. (2010). Genome-wide analysis of phenylpropanoid defence pathways. Molecular Plant Pathology, 11, 829–846. doi:10.1111/J.1364-3703.2010.00648.X
Niemann, G. J. (1990). A Carnation´s defence against fungal invation: A combined effort. Med. Fac. Landbouww. Rijksuniv. Gent., 54(2a), 435–438.
Niemann, G. J. (1992). The mechanism of resistance of carnation to wilt diseases. Acta Horticulturae, 307, 29–36.
Niemann, G. J., & Baayen, R. P. (1988). Involvement of phenol metabolism in resistance of Dianthus caryophyllus to Fusarium oxysporum f.sp. dianthi. Netherlands Journal of Plant Pathology, 94, 289–301.
Niemann, G. J., Liem, J., Van Der Kerk, A., & Niessen, W. M. . (1992). Phytoalexins, benzoxazinonas, N-aroilantrhanilates and N-aroylanilinas, from Fusarium-infected carnation stems. Phytochemistry, 31(11), 3761–3767.
309
Niemann, G. J., Van Der Kerk, A., Niessen, W. M., & Versluis, K. (1991). Free and wall-bound phenolics and other constituents from healthy and fungus infected carnation Dianthus caryophyllus L stems. Physiological and Molecular Plant Pathology, 38, 417–432.
Nikraftar, F., Taheri, P., Rastegar, M. F., & Tarighi, S. (2013). Tomato partial resistance to Rhizoctonia solani involves antioxidative defense mechanisms. Physiological and Molecular Plant Pathology, 81, 74–83. doi:10.1016/j.pmpp.2012.11.004
Okubara, P. A., & Paulitz, T. C. (2005). Root defense responses to fungal pathogens: A molecular perspective. Plant and Soil, 274, 215–226. doi:10.007/s11104-004-7328-9
Osbourn, A. E. (1996). Preformed Antimicrobial Compounds and Plant Defense against Fungal Attack. The Plant Cell, 8(October), 1821–1831.
Ouellette, G. B., Rioux, D., Simard, M., & Baayen, R. P. (2004). Occurrence of paracrystalloids and their particles in resistant and susceptible carnation plants Occurrence of paracrystalloids and their particles in resistant and susceptible carnation plants infected with Fusarium oxysporum f. sp. dianthi race 2. Phytoprotection, 85(3), 139–151.
Palomares-Rius, J. E., Castillo, P., Navas-Cortés, J. A, Jiménez-Díaz, R. M., & Tena, M. (2011). A proteomic study of in-root interactions between chickpea pathogens: the root-knot nematode Meloidogyne artiellia and the soil-borne fungus Fusarium oxysporum f. sp. ciceris race 5. Journal of Proteomics, 74(10), 2034–51. doi:10.1016/j.jprot.2011.05.026
Paniwnyk, L., Beaufoy, E., Lorimer, J. P., & Mason, T. J. (2001). The extraction of rutin from flower buds of Sophora japonica. Ultrasonics sonochemistry, 8(3), 299–301. Retrieved from http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11441614
Panka, D., Piesik, D., Jeske, M., & Baturo-Ciesniewska, A. (2013). Production of phenolics and the emission if volatile organic compounds by perennial ryegrass (Lolium perenne L.) Neotyphodium lolii association as a response to infection by Fusarium poae. Journal of Plant Physiology. doi:10.1016/j.jplph.2013.02.009
Panstruga, R. (2003). Establishing compatibility between plants and obligate pathogens. Current Opinion In Plant Biology, 6, 320–326.
Paparu, P., Dubois, T., Coyne, D., & Viljoen, A. (2007). Defense-related gene expression in susceptible and tolerant bananas (Musa spp.) following inoculation with non-pathogenic Fusarium oxysporum endophytes and challenge with Radopholus similis. Physiological and Molecular Plant Pathology, 71(4-6), 149–157. doi:10.1016/j.pmpp.2007.12.001
Paparu, P., Dubois, T., Coyne, D., & Viljoen, A. (2013). Differential gene expression in east african highland bananas (Musa spp.): Interactions between non-pathogenic
310
Fusarium oxysporum V5w2 and Radopholus similis. Physiological and Molecular Plant Pathology, 82, 56–63. doi:10.1016/j.pmpp.2012.10.003
Park, N. Il, Xu, H., Li, X., & Kim, S. (2011). Enhancement of flavone levels through overexpression of chalcone isomerase in hairy root cultures of Scutellaria baicalensis. Functional & integrative genomics, 11, 491–496. doi:10.1007/s10142-011-0229-0
Päsold, S., Siegel, I. N. A., Seidel, C., & Ludwig-müller, J. (2010). Flavonoid accumulation in Arabidopsis thaliana root galls caused by the obligate biotrophic pathogen Plasmodiophora brassicae. Molecular Plant Pathology, 11, 545–562. doi:10.1111/J.1364-3703.2010.00628.X
Passardi, F., Tognolli, M., De Meyer, M., Penel, C., & Dunand, C. (2006). Two cell wall associated peroxidases from Arabidopsis influence root elongation. Planta, 223(5), 965–74. doi:10.1007/s00425-005-0153-4
Paxton, J. D. (1981). Phytoalexins — A Working Redefinition. Phytopathologische Zeitschrift, 101, 106–209.
Pedras, M. S. C., & Ahiahonu, P. W. K. (2005). Metabolism and detoxification of phytoalexins and analogs by phytopathogenic fungi. Phytochemistry, 66(4), 391–411. doi:10.1016/j.phytochem.2004.12.032
Pedras, M. S. C., Chumala, P. B., & Suchy, M. (2003). Phytoalexins from Thlaspi arvense, a wild crucifer resistant to virulent Leptosphaeria maculans: structures, syntheses and antifungal activity. Phytochemistry, 64(5), 949–956. doi:10.1016/S0031-9422(03)00441-2
Peters, A., Schneider-Poetsch, H. D., Schwarz, H., & Weissenbo¨ck, G. (1988). Biochemical and immunological characterization of chalcone synthase from rye leaves. Journal of Plant Physiology, 133, 178–182.
Peters, R. J. (2006). Uncovering the complex metabolic network underlying diterpenoid phytoalexin biosynthesis in rice and other cereal crop plants. Phytochemistry, 67(21), 2307–17. doi:10.1016/j.phytochem.2006.08.009
Petriccione, M., Di Cecco, I., Arena, S., Scaloni, A., & Scortichini, M. (2013). Proteomic changes in Actinidia chinensis shoot during systemic infection with a pandemic Pseudomonas syringae pv. actinidiae strain. Journal of Proteomics, 78, 461–76. doi:10.1016/j.jprot.2012.10.014
Pinzón, A., Rodriguez-R, L. M., Bernal, A., & Restrepo, S. (2010). Targeted metabolic reconstruction : a novel approach for the characterization of plant-pathogen interactions. Briefings in Bioinformatics, 12(2), 151–162. doi:10.1093/bib/bbq009
Pizano de M, M. (2000). Clavel (Dianthus caryophyllus L) (Editorial Hortitecnia Ltda.). 1a ed. Bogotá.
311
Polkowska-Kowalczyk, L., Wielgat, B., & Maciejewska, U. (2007). Changes in the antioxidant status in leaves of Solanum species in response to elicitor from Phytophthora infestans. Journal of Plant Physiology, 164(10), 1268–77. doi:10.1016/j.jplph.2006.08.012
Ponce, M. A, Bompadre, M. J., Scervino, J. M., Ocampo, J. a, Chaneton, E. J., & Godeas, A. M. (2009). Flavonoids, benzoic acids and cinnamic acids isolated from shoots and roots of Italian rye grass (Lolium multiflorum Lam.) with and without endophyte association and arbuscular mycorrhizal fungus. Biochemical Systematics and Ecology, 37(4), 245–253. doi:10.1016/j.bse.2009.03.010
Prasad, P., Reddy, N. P. E., Anandam, R. J., & Reddy, G. L. (2003). Isozymes variability among Fusarium udum resistant cultivars of pigeonpea (Cajanus cajan (L.) (Millsp)*. Acta Physiologiae Plantarum, 25(3), 221–228.
Prasain, J. K., Wang, C.-C., & Barnes, S. (2004). Mass spectrometric methods for the determination of flavonoids in biological samples. Free Radical Biology & Medicine, 37(9), 1324–50. doi:10.1016/j.freeradbiomed.2004.07.026
Pritchard, L., & Birch, P. (2011). A systems biology perspective on plant – microbe interactions : Biochemical and structural targets of pathogen effectors. Plant Science, 180(4), 584–603. doi:10.1016/j.plantsci.2010.12.008
Quirino, B. F., Candido, E. S., Campos, P. F., Franco, O. L., & Krüger, R. H. (2010). Proteomic approaches to study plant-pathogen interactions. Phytochemistry, 71(4), 351–62. doi:10.1016/j.phytochem.2009.11.005
Rahman, M., & Punja, Z. K. (2005). Biochemistry of ginseng root tissues affected by rusty root symptoms. Plant Physiology and Biochemistry, 43(12), 1103–14. doi:10.1016/j.plaphy.2005.09.004
Rahnama, H., Razi, Z., Dadgar, M. N., & Hasanloo, T. (2012). Enhanced production of flavonolignans in hairy root cultures of Silybum marianum by over-expression of chalcone synthase gene. Journal of Plant Biochemistry and Biotechnology, 22(1), 138–143. doi:10.1007/s13562-012-0122-5
Ramagli, L. S., & Rodriguez, L. V. (1985). Quantitation of microgram amounts of protein in two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis sample buffer. Electrophoresis, 6, 559–563.
Ramakers, C., Ruijter, J. M., Deprez, R. H. L., & Moorman, A. F. . (2003). Assumption-free analysis of quantitative real-time polymerase chain reaction (PCR) data. Neuroscience Letters, 339(1), 62–66. doi:10.1016/S0304-3940(02)01423-4
Rasoul, S. R., Bagheri, F., & Assad, M. T. (2012). Evaluation of Some Biochemical Responses in Resistance of Fifteen Bread Wheat (Triticum aestivum L.) Genotypes
312
to Wheat streak mosaic virus. Journal of Agricultural Science, 4(5), 75–83. doi:10.5539/jas.v4n5p75
Re, R., Pellegrini, N., Proteggente, A., Pannala, A., Yang, M., & Rice-Evans, C. (1999). Antioxidant activity applying an improved ABTS radical cation decolorization assay. Free Radical Biology & Medicine, 26, 1231–1237.
Reading, N. S., & Aust, S. D. (2001). Role of Disulfide Bonds in the Stability of Recombinant Manganese Peroxidase. Biochemistry, 40, 8161–8168.
Reuber, S., Jende-Strid, B., Wray, V., & Weissenbock, G. (1997). Accumulation of the chalcone isosalipurposide in primary leaves of barley flavonoid mutants indicates a defective chalcone isomerase. Physiologia Plantarum, 101, 827–832.
Rice-Evans, C., Miller, N. J., & Paganga, G. (1996). Structure-Antioxidant activity relationships of flavonoids and phenolic acids. Free Radical Biology & Medicine, 20(7), 933–956.
Rodrigues, S. P., Ventura, J. A, Aguilar, C., Nakayasu, E. S., Choi, H., Sobreira, T. J. P., Nohara, L. L., et al. (2012). Label-free quantitative proteomics reveals differentially regulated proteins in the latex of sticky diseased Carica papaya L. plants. Journal of Proteomics, 75(11), 3191–8. doi:10.1016/j.jprot.2012.03.021
Roeder, S., Dreschler, K., Wirtz, M., Cristescu, S. M., Van Harren, F. J. M., Hell, R., & Piechulla, B. (2009). SAM levels, gene expression of SAM synthetase, methionine synthase and ACC oxidase, and ethylene emission from N. suaveolens flowers. Plant Molecular Biology, 70(5), 535–46. doi:10.1007/s11103-009-9490-1
Roncero, M. I., Hera, C., Ruiz-Rubio, M., Garcia, M., Madrid, M., Caracuel, Z., Calero, F., et al. (2003). Fusarium as a model for studing virulence in soliborne plant pathogens. Physiological and Molecular Plant Pathology, 62, 87–98.
Rosler, J., Krekel, F., Amrhein, N., & Schmid, J. (1997). Maize phenylalanine ammonia-lyase has tyrosine ammonia-lyase activity. Plant Physiology, 113, 175–179.
Ryan, K. G., Swinny, E. E., Markham, K. R., & Winefield, C. (2002). Flavonoid gene expression and UV photoprotection in transgenic and mutant Petunia leaves. Phytochemistry, 59(1), 23–32. Retrieved from http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11754940
Sá, R. A, Argolo, A. C. C., Napoleão, T. H., Gomes, F. S., Santos, N. D. L., Melo, C. M. L., Albuquerque, A. C., et al. (2009). Antioxidant, Fusarium growth inhibition and Nasutitermes corniger repellent activities of secondary metabolites from Myracrodruon urundeuva heartwood. International Biodeterioration Biodegradation, 63(4), 470–477. doi:10.1016/j.ibiod.2009.01.002
313
Sacristán, S., & García-Arenal, F. (2008). The evolution of virulence and pathogenicity in plant pathogen populations. Molecular Plant Pathology, 9(3), 369–384. doi:10.1111/J.1364-3703.2007.00460.X
Saftić-panković, D., Veljović-jovanović, S., Pucarević, M., Radovanović, N., & Mijić, A. (2006). Phenolic compounds and peroxidases in sunflower near-isogenic lines after downy mildew infection. HELIA, 29, 33–42.
Sagi, M., & Fluhr, R. (2001). Superoxide production by plant homologues of the gp91-phox NADPH oxidase. Modulation of activity by calcium and by tobacco mosaic virus infection. Plant Physiology, 126, 1281–1290.
Sagi, M., & Fluhr, R. (2006). Production of Reactive Oxygen Species by Plant. Plant Physiology, 141(June), 336–340. doi:10.1104/pp.106.078089.336
Saito, K., Yonekura-Sakakibara, K., Nakabayashi, R., Higashi, Y., Yamazaki, M., Tohge, T., & Fernie, A. R. (2013). The flavonoid biosynthetic pathway in Arabidopsis: Structural and genetic diversity. Plant Physiology and Biochemistry, 1–14. doi:10.1016/j.plaphy.2013.02.001
Sánchez-Rodríguez, E., Moreno, D. A, Ferreres, F., Rubio-Wilhelmi, M. D. M., & Ruiz, J. M. (2011). Differential responses of five cherry tomato varieties to water stress: changes on phenolic metabolites and related enzymes. Phytochemistry, 72(8), 723–9. doi:10.1016/j.phytochem.2011.02.011
Sandrock, R. W., & VanEtten, H. D. (2001). The relevance of tomatinase activity in pathogens of tomato: disruption of the β2-tomatinase gene in Colletotrichum coccodes and Septoria lycopersici and heterologous expression of the Septoria lycopersici β2-tomatinase in Nectria haematococca. Physiological and Molecular Plant Pathology, 58(4), 159–171. doi:10.1006/pmpp.2001.0324
Sant, D., Casanova, E., Segarra, G., Avilés, M., Reis, M., & Trillas, M. I. (2010). Effect of Trichoderma asperellum strain T34 on Fusarium wilt and water usage in carnation grown on compost-based growth medium. Biological Control, 53(3), 291–296. doi:10.1016/j.biocontrol.2010.01.012
Santiago, R., & Armas, R. De. (2009). Changes in soluble and cell wall-bound hydroxycinnamic and hydroxybenzoic acids in sugarcane cultivars inoculated with Sporisorium scitamineum sporidia. European Journal of Plant Pathology, 124, 439–450. doi:10.1007/s10658-009-9431-5
Sarowar, S., Nam, E., Jin, Y., Han, S., Deok, K., Kook, B., & Sheop, J. (2005). Overexpression of a pepper ascorbate peroxidase-like 1 gene in tobacco plants enhances tolerance to oxidative stress and pathogens. Plant Science, 169, 55–63. doi:10.1016/j.plantsci.2005.02.025
314
Sarrocco, S., Falaschi, N., Vergara, M., Nicoletti, F., & Vannacci, G. (2007). Use of Fusarium oxysporum f. sp. dianthi transformed with marker genes to follow colonization of carnation roots. Journal of Plant Pathology, 89(1), 47–54.
Saslowsky, D., & Winkel-shirley, B. (2001). Localization of flavonoid enzymes in Arabidopsis roots. The Plant Journal, 27(1), 37–48.
Sato, T., Takabe, K., & Fujita, M. (2004). Immunolocalization of phenylalanine ammonialyase and cinnamate-4-hydroxylase in differentiating xylem of poplar. Plant Pathology & Biology, 327, 827–836.
Schijlen, E., Ric De Vos, C. H., Jonker, H., Van Den Broeck, H., Molthoff, J., Van Tunen, A., Martens, S., et al. (2006). Pathway engineering for healthy phytochemicals leading to the production of novel flavonoids in tomato fruit. Plant Biotechnology Journal, 4(4), 433–444. doi:10.1111/j.1467-7652.2006.00192.x
Schijlen, E., Ric De Vos, C. H., Van Tunen, A. J., & Bovy, A. G. (2004). Modification of flavonoid biosynthesis in crop plants. Phytochemistry, 65(19), 2631–2648. doi:10.1016/j.phytochem.2004.07.028
Schlaeppi, K., Abou-Mansour, E., Buchala, A., & Mauch, F. (2010). Disease resistance of Arabidopsis to Phytophthora brassicae is established by the sequential action of indole glucosinolates and camalexin. The Plant Journal, 62(5), 840–51. doi:10.1111/j.1365-313X.2010.04197.x
Schlangen, K., Miosic, S., Topuz, F., Muster, G., Marosits, T., Seitz, C., & Halbwirth, H. (2009). Chalcone 3-hydroxylation is not a general property of flavonoid 3′-hydroxylase. Plant Science, 177(2), 97–102. doi:10.1016/j.plantsci.2009.04.002
Schwab, W. (2003). Metabolome diversity: too few genes, too many metabolites? Phytochemistry, 62(6), 837–849. doi:10.1016/S0031-9422(02)00723-9
Schweizer, P. (2008). Tissue-specific expression of a defence-related peroxidase in transgenic wheat potentiates cell death in pathogen-attacked leaf epidermis. Molecular Plant Pathology, 9, 45–57. doi:10.1111/J.1364-3703.2007.00446.X
Seelakshmri, Y., & Sharma, R. (2008). Differential regulation of phenylalanine ammonia lyase activity and protein level by light in tomato seedlings. Plant Physiology and Biochemistry, 46(4), 444–51. doi:10.1016/j.plaphy.2008.02.001
Sekhar, K., Priyanka, B., Reddy, V. D., & Rao, K. V. (2010). Isolation and characterization of a pigeonpea cyclophilin (CcCYP) gene, and its over-expression in Arabidopsis confers multiple abiotic stress tolerance. Plant, Cell & Environment, 33(8), 1324–38. doi:10.1111/j.1365-3040.2010.02151.x
Sekhon, R. S., Kuldau, G., Mansfield, M., & Chopra, S. (2006). Characterization of Fusarium-induced expression of flavonoids and PR genes in maize. Physiological and Molecular Plant Pathology, 69(1-3), 109–117. doi:10.1016/j.pmpp.2007.02.004
315
Sels, J., Mathys, J., Coninck, B. M. A. De, Cammue, B. P. A., & Bolle, M. F. C. De. (2008). Plant pathogenesis-related ( PR ) proteins : A focus on PR peptides. Plant Physiology and Biochemistry, 46, 941–950. doi:10.1016/j.plaphy.2008.06.011
Senda, M., Masuta, C., Ohnishi, S., Goto, K., Kasai, A., Sano, T., Jin-Sung, H., et al. (2004). Patterning of virus-infected glycine max seed coat Is associated with suppression of endogenous silencing of chalcone synthase genes. The Plant Cell, 16(April), 807–818. doi:10.1105/tpc.019885.is
Shadle, G. L., Wesley, S. V., Korth, K. L., Chen, F., Lamb, C., & Dixon, R. A. (2003). Phenylpropanoid compounds and disease resistance in transgenic tobacco with altered expression of L-phenylalanine ammonia-lyase. Phytochemistry, 64(1), 153–161. doi:10.1016/S0031-9422(03)00151-1
Shafer, W. (1994). Molecular Mechanisms of fungal patogenicity to plants. Annual Review of Phytopathology, 32, 461–477.
Shaw, L. J., Morris, P., & Hooker, J. E. (2006). Perception and modification of plant flavonoid signals by rhizosphere microorganisms. Environmental Microbiology, 8(11), 1867–1880. doi:10.1111/j.1462-2920.2006.01141.x
Shaw, N. M., Bolwell, G. P., & Smith, C. (1990). Wound-induced phenylalanine ammonia-lyase in potato (Solanum tuberosum) tuber discs. Significance of glycosylation and immunolocalization of enzyme subunits. The Biochemical Journal, 267(1), 163–70.
Shin, K., Hena, Abu Kamal, M., Cho, K., Choi, J., Yu, J., Paek, N.-C., Lee, Y. W., et al. (2011). Defense proteins are induced in wheat spikes exposed to Fusarium graminearum. Plant Omics Journal, 4(5), 270–277.
Shoresh, M., & Harman, G. E. (2008). The molecular basis of shoot responses of maize seedlings to Trichoderma harzianum T22 inoculation of the root: a proteomic approach. Plant Physiology, 147(4), 2147–63. doi:10.1104/pp.108.123810
Simmonds, M. S. J. (2003). Flavonoid–insect interactions: recent advances in our knowledge. Phytochemistry, 64(1), 21–30. doi:10.1016/S0031-9422(03)00293-0
Simonetti, E., Alba, E., Montes, M. J., Delibes, A., & López-Braña, I. (2010). Analysis of ascorbate peroxidase genes expressed in resistant and susceptible wheat lines infected by the cereal cyst nematode, Heterodera avenae. Plant Cell Reports, 29(10), 1169–78. doi:10.1007/s00299-010-0903-z
Singleton, V., & Rossi Jr JA. (1965). Colorimetry of total phenolics with phosphomolybdic-phosphothungstic acid reagents. American Journal of Enology & Viticulture, 16, 144–158.
316
Sinha, R., & Chattopadhyay, S. (2011). Changes in the leaf proteome profile of Mentha arvensis in response to Alternaria alternata infection. Journal of Proteomics, 74(3), 327–36. doi:10.1016/j.jprot.2010.11.009
Stahl, F. A., & Bishop, J. G. (2000). Plant-pathogen arms races at the molecular level. Current Opinion In Plant Biology, 3, 299–304.
Steffensen, S. K., Rinnan, Å., Mortensen, A. G., Laursen, B., De Troiani, R. M., Noellemeyer, E. J., Janovska, D., et al. (2011). Variations in the polyphenol content of seeds of field grown Amaranthus genotypes. Food Chemistry, 129(1), 131–138. doi:10.1016/j.foodchem.2011.04.044
Steinkellner, S., Lendzemo, V., Langer, I., Schweiger, P., Khaosaad, T., Toussaint, J.-P., & Vierheilig, H. (2007). Flavonoids and strigolactones in root exudates as signals in symbiotic and pathogenic plant-fungus interactions. Molecules, 12(7), 1290–1306. Retrieved from http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17909485
Stevens, J. F., & Page, J. E. (2004). Xanthohumol and related prenylflavonoids from hops and beer: to your good health! Phytochemistry, 65(10), 1317–1330. doi:10.1016/j.phytochem.2004.04.025
Subramaniam, S., Maziah, M., Sariah, M., Puad, M. P., & Xavier, R. (2006). Bioassay method for testing Fusarium wilt disease tolerance in transgenic banana. Scientia Horticulturae, 108(4), 378–389. doi:10.1016/j.scienta.2006.02.028
Sujeeth, N., Deepak, S., Shailasree, S., Kini, R. K., Shetty, S. H., & Hille, J. (2010). Hydroxyproline-rich glycoproteins accumulate in pearl millet after seed treatment with elicitors of defense responses against Sclerospora graminicola. Physiological and Molecular Plant Pathology, 74, 230–237. doi:10.1016/j.pmpp.2010.03.001
Tameling, W., & Joosten, M. H. A. J. (2008). The diverse roles of NB-LRR proteins in plants. Physiological and Molecular Plant Pathology, 71, 126–134. doi:10.1016/j.pmpp.2007.12.006
Tanase, K., Nishitani, C., Hirakawa, H., Isobe, S., Tabata, S., Ohmiya, A., & Onozaki, T. (2012). Transcriptome analysis of carnation (Dianthus caryophyllus L.) based on next-generation sequencing technology. BMC Genomics, 13, 1–11.
Tapio, E., Thtiharju, S., Tamminen, I., Puhakainen, T., Laitinen, R., Svensson, J., Helenius, E., et al. (2002). Biological mechanisms of low temperature stress response: Cold acclimation and development of freezing tolerance in plants. JIRCAS Working Report, 9–15.
Tattini, M., Galardi, C., Pinelli, P., Massai, R., Agati, G., Tattinil, M., & Remorini, D. (2010). Differential accumulation of flavonoids and hydroxycinnamates in leaves of Ligustrum vulgare under excess light and drought stress. New Phytologist, 163(3), 547–561.
317
Taylor, L. P., & Grotewold, E. (2005). Flavonoids as developmental regulators. Current Opinion In Plant Biology, 8(3), 317–323. doi:10.1016/j.pbi.2005.03.005
Terry, L. A, Joyce, D. C., Adikaram, N. K. ., & Khambay, B. P. . (2004). Preformed antifungal compounds in strawberry fruit and flower tissues. Postharvest Biology and Technology, 31(2), 201–212. doi:10.1016/j.postharvbio.2003.08.003
Thill, J., Regos, I., Farag, M. A, Ahmad, A. F., Kusek, J., Castro, A., Schlangen, K., et al. (2012). Polyphenol metabolism provides a screening tool for beneficial effects of Onobrychis viciifolia (sainfoin). Phytochemistry, 82, 67–80. doi:10.1016/j.phytochem.2012.05.030
Thipyapong, P., Joel, D. M., & Steffens, J. C. (1995). Systemic wound induction of potato (Solanum tuberosum) polyphenol oxidase. Phytochemistry, 40, 673–676.
Thurston, G., Regan, S., Rampitsch, C., & Xing, T. (2005). Proteomic and phosphoproteomic approaches to understand plant–pathogen interactions. Physiological and Molecular Plant Pathology, 66(1-2), 3–11. doi:10.1016/j.pmpp.2005.03.004
Tománková, K., Luhová, L., Petřivalský, M., Peč, P., & Lebeda, A. (2006). Biochemical aspects of reactive oxygen species formation in the interaction between Lycopersicon spp. and Oidium neolycopersici. Physiological and Molecular Plant Pathology, 68(1-3), 22–32. doi:10.1016/j.pmpp.2006.05.005
Tomasi, N., Weisskopf, L., Renella, G., Landi, L., Pinton, R., Varanini, Z., Nannipieri, P., et al. (2008). Flavonoids of white lupin roots participate in phosphorus mobilization from soil. Soil Biology and Biochemistry, 40(7), 1971–1974. doi:10.1016/j.soilbio.2008.02.017
Treutter, D. (2006). Significance of flavonoids in plant resistance: a review. Environmental Chemistry Letters, 4(3), 147–157. doi:10.1007/s10311-006-0068-8
Trhall, P. H., & Burdon, J. J. (2003). Evolution of virulence in a Plant Host-Pathogen Metapopulation. Science, 299, 1735–1739.
Trillas, M. I., Cotxarrera, L., Casanova, E., & Cortadellas, N. (2000). Ultrastructural changes and localization of chitin and callose in compatible and incompatible interactions between carnation callus and Fusarium oxysporum. Physiological and Molecular Plant Pathology, 56, 107–116.
Troncoso-Rojas, R., Sánchez-Estrada, A., Carvallo, T., González-León, A., Ojeda-Contreras, J., Aguilar-Valenzuela, A., & Tiznado-Hernández, M.-E. (2012). A fungal elicitor enhances the resistance of tomato fruit to Fusarium oxysporum infection by activating the phenylpropanoid metabolic pathway. Phytoparasitica, 41(2), 133–142. doi:10.1007/s12600-012-0271-z
318
Truchado, P., Ferreres, F., & Tomas-Barberan, F. a. (2009). Liquid chromatography-tandem mass spectrometry reveals the widespread occurrence of flavonoid glycosides in honey, and their potential as floral origin markers. Journal of Chromatography A, 1216(43), 7241–7248. doi:10.1016/j.chroma.2009.07.057
Turner, E. M. (1960). The nature of resistance of oats to take-all fungus. Journal of Experimental Botany, 4, 264–271.
Upchurch, R. G., & Ramirez, M. E. (2010). Defense-related gene expression in soybean leaves and seeds inoculated with Cercospora kikuchii and Diaporthe phaseolorum var. meridionalis. Physiological and Molecular Plant Pathology, 75(1-2), 64–70. doi:10.1016/j.pmpp.2010.08.007
Valero-Galván, J., Valledor, L., Navarro Cerrillo, R. M., Gil Pelegrín, E., & Jorrín-Novo, J. V. (2011). Studies of variability in Holm oak (Quercus ilex subsp. ballota [Desf.] Samp.) through acorn protein profile analysis. Journal of Proteomics, 74(8), 1244–55. doi:10.1016/j.jprot.2011.05.003
Valledor, L., & Jorrín, J. (2011). Back to the basics: Maximizing the information obtained by quantitative two dimensional gel electrophoresis analyses by an appropriate experimental design and statistical analyses. Journal of Proteomics, 74(1), 1–18. doi:10.1016/j.jprot.2010.07.007
Van Loon, L.C., Bakker, P. A. H. M., & Pieterce, C. M. J. (1998). Sistemic resistance induced by rizosphere bacteria. Annual Review of Phytopathology, 36, 453–483.
Van Loon, L C, Rep, M., & Pieterse, C. M. J. (2006). Significance of Inducible Defense-related Proteins in Infected Plants. Annual Review of Phytopathology, 44. doi:10.1146/annurev.phyto.44.070505.143425
Van Ooijen, G., Mayr, G., Kasiem, M. M. a, Albrecht, M., Cornelissen, B. J. C., & Takken, F. L. W. (2008). Structure-function analysis of the NB-ARC domain of plant disease resistance proteins. Journal of Experimental Botany, 59(6), 1383–97. doi:10.1093/jxb/ern045
Van Peer, R., Niemann, G. J., & Schippers, B. (1990). Induced resistance and phytoalexin accumulation in biological control of Fusarium wilt of carnation by Pseudomonas sp. strain WCS417r. Phytopathology, 81.
Van Pelt-Heerschap, H., & Smit-Bakker, O. (1999). Analysis of defense-related proteins in stem tissue of carnation inoculated with a virulent and avirulent race of Fusarium oxysporum f. sp. dianthi. European Journal of Plant Pathology, 105, 681–691.
Vanetten, H. D., Temporini, E., & Wasmann, C. (2001). Phytoalexin (and phytoanticipin) tolerance as a virulence trait: why is it not required by all pathogens? Physiological and Molecular Plant Pathology, 59(2), 83–93. doi:10.1006/pmpp.2001.0350
319
Vasconsuelo, A., & Boland, R. (2007). Molecular aspects of the early stages of elicitation of secondary metabolites in plants. Plant Science, 172(5), 861–875. doi:10.1016/j.plantsci.2007.01.006
Veljanovski, V., & Constabel, C. P. (2013). Molecular cloning and biochemical characterization of two UDP-glycosyltransferases from poplar. Phytochemistry. doi:10.1016/j.phytochem.2012.12.012
Verdier, J., Zhao, J., Torres-jerez, I., Ge, S., Liu, C., He, X., Mysore, K. S., et al. (2011). MtPAR MYB transcription factor acts as an on switch for proanthocyanidin biosynthesis in Medicago truncatula. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 1–6. doi:10.1073/pnas.1120916109
Vogel, S., Ohmayer, S., Brunner, G., & Heilmann, J. (2008). Natural and non-natural prenylated chalcones: synthesis, cytotoxicity and anti-oxidative activity. Bioorganic & Medicinal Chemistry, 16(8), 4286–4293. doi:10.1016/j.bmc.2008.02.079
Vogt, T. (2010). Phenylpropanoid biosynthesis. Molecular Plant, 3(1), 2–20. doi:10.1093/mp/ssp106
Vom Endt, D., Kijne, J. W., & Memelink, J. (2002). Transcription factors controlling plant secondary metabolism : what regulates the regulators ? Phytochemistry, 61, 107–114.
Wang, F.-X., Ma, Y.-P., Yang, C.-L., Zhao, P.-M., Yao, Y., Jian, G.-L., Luo, Y.-M., et al. (2011). Proteomic analysis of the sea-island cotton roots infected by wilt pathogen Verticillium dahliae. Proteomics, 11(22), 4296–309. doi:10.1002/pmic.201100062
Wang, K. L., Li, H., & Ecker, J. R. (2002). Ethylene biosynthesis and signaling networks. The Plant Cell, 131–151. doi:10.1105/tpc.001768.S-
Wang, P., Sandrock, R. W., & Vanetten, H. D. (1999). Disruption of the cyanide hydratase gene in Gloeocercospora sorghi increases its sensitivity to the phytoanticipin cyanide but does not affect its pathogenicity on the cyanogenic plant Sorghum. Fungal Genetics and Biology, 28(2), 126–134.
Wang, W., Wang, H., Wan, S., Zhang, J., Zhang, P., Zhan, J., & Huang, W. (2012). Chalcone isomerase in grape vine : gene expression and localization in the developing fruit. Biologia Plantarum, 56(3), 545–550.
Wang, Y., Gao, L., Wang, Z., Liu, Y., Sun, M., Yang, D., Wei, C., et al. (2012). Light-induced expression of genes involved in phenylpropanoid biosynthetic pathways in callus of tea (Camellia sinensis (L.) O. Kuntze). Scientia Horticulturae, 133, 72–83. doi:10.1016/j.scienta.2011.10.017
Weisshaar, B., & Jenkins, G. (1998). Phenylpropanoid biosinthesis and its regulation. Current Opinion In Plant Biology, 1, 251–257.
320
Weston, L. A, & Mathesius, U. (2013). Flavonoids: their structure, biosynthesis and role in the rhizosphere, including allelopathy. Journal of Chemical Ecology, 39(2), 283–97. doi:10.1007/s10886-013-0248-5
Wheeler, M. C. G., Drincovich, F. M., Andreo, C. S., Flugge, U., Tronconi, M. A., & Maurino, V. G. (2005). A comprehensive analysis of the NADP-Malic enzyme gene family of Arabidopsis. Plant Physiology, 139, 39–51. doi:10.1104/pp.105.065953.1
Wildermuth, M. C. (2006). Variations on a theme: synthesis and modification of plant benzoic acids. Current Opinion In Plant Biology, 9(3), 288–96. doi:10.1016/j.pbi.2006.03.006
Winkel-shirley, B. (2001). Flavonoid biosynthesis. A colorful model for genetics, biochemistry , cell biology, and biotechnology. Plant Physiology, 126, 485–493.
Winkel-Shirley, B. (2002). Biosynthesis of flavonoids and effects of stress. Current Opinion in Plant Biology, 5(3), 218–223.
Wise, R. P., Moscou, M. J., Bogdanove, A. J., & Whitham, S. a. (2007). Transcript profiling in host-pathogen interactions. Annual review of phytopathology, 45, 329–69. doi:10.1146/annurev.phyto.45.011107.143944
Wong, M. L., & Medrano, J. F. (2005). Real-time PCR for mRNA quantitation. BioTechniques, 39(1), 1–11.
Wrolstad, R. E., Acree, T. E., Decker, E. A., Penner, M. H., Reid, D. S., Schwartz, S. J., Shoemaker, D. F., et al. (2005). Handbook of Food Analytical Chemistry, Pigments, Colorants, Flavors, Texture and Bioactive food components. (Wiley, Ed.) (vol 1., pp. 463–468). New York.
Wu, L. S., Si, J. P., Yuan, Y. Q., & Shi, X. R. (2009). Quantitative variation of flavonoids in Houttuynia cordata from different geographic origins in china. Chinese Journal of Natural Medicines, 7(1), 40–46.
Wu, S., & Chappell, J. (2008). Metabolic engineering of natural products in plants; tools of the trade and challenges for the future. Current Opinion In Biotechnology, 19(2), 145–152. doi:10.1016/j.copbio.2008.02.007
Xu, C., Zhang, Y., Cao, L., & Lu, J. (2010). Phenolic compounds and antioxidant properties of different grape cultivars grown in China. Food Chemistry, 119(4), 1557–1565. doi:10.1016/j.foodchem.2009.09.042
Yamaguchi, T., Kurosaki, F., Suh, D. Y., Sankawa, U., Nishioka, M., Akiyama, T., Shibuya, M., et al. (1999). Cross-reaction of chalcone synthase and stilbene synthase overexpressed in Escherichia coli. FEBS letters, 460(3), 457–61. Retrieved from http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10556516
321
Yang, C.-Q., Fang, X., Wu, X.-M., Mao, Y.-B., Wang, L.-J., & Chen, X.-Y. (2012). Transcriptional regulation of plant secondary metabolism. Journal of Integrative Plant Biology, 54(10), 703–12. doi:10.1111/j.1744-7909.2012.01161.x
Yang, D., Liu, Y., Sun, M., Zhao, L., Wang, Y., Chen, X., Wei, C., et al. (2012). Differential gene expression in tea (Camellia sinensis L.) calli with different morphologies and catechin contents. Journal of plant physiology, 169(2), 163–75. doi:10.1016/j.jplph.2011.08.015
Yang, R. Y., Tsou, S. C. S., Lee, T. C., Wu, W. J., Hanson, P. M., Kuo, G., Engle, L. M., et al. (2006). Distribution of 127 edible plant species for antioxidant activities by two assays. Journal of the Science of Food & Agriculture, 86, 2395–2403.
Yi, Z., Yu, Y., Liang, Y., & Zeng, B. (2008). In vitro antioxidant and antimicrobial activities of the extract of Pericarpium Citri Reticulatae of a new Citrus cultivar and its main flavonoids. LWT Food Science and Technology, 41(4), 597–603. doi:10.1016/j.lwt.2007.04.008
Yoo, K. M., Lee, C. H., Moon, B., & Lee, C. Y. (2008). Relative antioxidant and cytoprotective activities of common herbs. Food Chemistry, 106, 929–936.
Yoshida, H., Itoh, Y., Ozeki, Y., Iwashina, T., & Yamaguchi, M. (2004). Variation in chalcononaringenin 2′-O-glucoside content in the petals of carnations (Dianthus caryophyllus L) bearing yellow flowers. Scientia Horticulturae, 99(2), 175–186. doi:10.1016/S0304-4238(03)00093-1
Zagrobelny, M., Bak, S., & Møller, B. L. (2008). Cyanogenesis in plants and arthropods. Phytochemistry, 69(7), 1457–68. doi:10.1016/j.phytochem.2008.02.019
Zambounis, A. G., Kalamaki, M. S., Tani, E. E., Paplomatas, E. J., & Tsaftaris, A. S. (2012). Expression analysis of defense-related genes in cotton (Gossypium hirsutum) after Fusarium oxysporum f. sp. vasinfectum infection and following chemical elicitation using a salicylic acid analog and methyl jasmonate. Plant Molecular Biology Reporter, 30(1), 225–234. doi:10.1007/s11105-011-0335-0
Zámocký, M., Furtmüller, P. G., & Obinger, C. (2010). Evolution of structure and function of Class I peroxidases. Archives of biochemistry and biophysics, 500(1), 45–57. doi:10.1016/j.abb.2010.03.024
Zhao, H., Fan, W., Dong, J., Lu, J., Chen, J., Shan, L., Lin, Y., et al. (2008). Evaluation of antioxidant activities and total phenolic contents of typical malting barley varieties. Food Chemistry, 107(1), 296–304. doi:10.1016/j.foodchem.2007.08.018
Zhao, J., Davis, L. C., & Verpoorte, R. (2005). Elicitor signal transduction leading to production of plant secondary metabolites. Biotechnology advances, 23(4), 283–333. doi:10.1016/j.biotechadv.2005.01.003
322
Zhao, J., & Dixon, R. A. (2010). The “ins” and “outs” of flavonoid transport. Trends in Plant Science, 15(2), 72–80. doi:10.1016/j.tplants.2009.11.006
Zheng, H., Cui, C., Zhang, Y., Wang, D., Jing, Y., & Kim, K. Y. (2005). Active changes of lignification-related enzymes in pepper response to Glomus intraradices and/or Phytophthora capsici. Journal of Zhejiang University. Science. B, 6(8), 778–86. doi:10.1631/jzus.2005.B0778
Zhou, X., & Wu, F. (2009). Differentially expressed transcripts from cucumber (Cucumis sativus L.) root upon inoculation with Fusarium oxysporum f. sp. cucumerinum Owen. Physiological and Molecular Plant Pathology, 74(2), 142–150. doi:10.1016/j.pmpp.2009.10.005
Zhuang, X., Mcphee, K. E., Coram, T. E., Peever, T. L., & Chilvers, M. I. (2012). Rapid transcriptome characterization and parsing of sequences in a non-model host-pathogen interaction ; pea-Sclerotinia sclerotiorum. BMC Genomics, 13, 1–19.
Zor, T., & Sellinger, Z. (1996). Linearization of the Bradford protein assay increases its Sensitivity: Theorical and experimental studies. Analytical biochemistry, 236, 302.