CONTRIBUCIÓN AL ESTUDIO DE ALGUNOS COMPONENTES …

CONTRIBUCIÓN AL ESTUDIO DE ALGUNOS COMPONENTES

BIOQUÍMICOS Y MOLECULARES DE LA RESISTENCIA DEL CLAVEL (Dianthus

caryophyllus L) AL PATÓGENO Fusarium oxysporum f. sp. dianthi.

Harold Duban Ardila Barrantes

Universidad Nacional de Colombia

Facultad de Ciencias, Departamento de Química

Bogotá, Colombia

2013

CONTRIBUCIÓN AL ESTUDIO DE ALGUNOS COMPONENTES

BIOQUÍMICOS Y MOLECULARES DE LA RESISTENCIA DEL CLAVEL (Dianthus

caryophyllus L) AL PATÓGENO Fusarium oxysporum f. sp. dianthi.

Harold Duban Ardila Barrantes Ms Sc

Tesis de investigación presentada como requisito parcial para optar al título de Doctor en

Ciencias-Química

Directora:

Dra. Blanca Ligia Higuera Mancipe

Codirectora:

Ms Sc. Sixta Tulia Martínez Peralta

Línea de Investigación:

Bioquímica de las interacciones hospedero-patógeno

Grupo de Investigación:

Estudio de Actividades Metabólicas Vegetales

Universidad Nacional de Colombia

Facultad de Ciencias, Departamento de Química

Bogotá, Colombia

2013

Contribución al estudio de algunos mecanismos bioquímicos y moleculares de la

resistencia del clavel a Fusarium oxysporum f. sp. dianthi raza 2

A mis padres Gilberto y Ana

A mis hermanas Diana y Maria Isabel

A mis sobrinos Laura Valentina, Sara Daniela

y Andres Felipe

Contenido V

Agradecimientos

A DIOS, porque me ha mostrado el camino correcto y ha permitido que culmine con éxito ésta

importante etapa profesional y personal.

A MIS PADRES, quienes siempre me han acompañado en los momentos fáciles y difíciles,

brindándome siempre todo su apoyo. Lo que soy en este momento se lo debo completamente.

A mis hermanas Diana y Maria Isabel y sobrinos Laura Valentina, Sara Daniela y Andrés Felipe,

por estar conmigo de manera incondicional

A LA UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA, Por permitir mi formación al más alto nivel y

darme un sinnúmero de oportunidades para crecer personal y profesionalmente. Muchas gracias

alma mater!! Siempre buscare tu bienestar y contarás con mi más profunda lealtad. A LA

FACULTAD DE CIENCIAS Y AL DEPARTAMENTO DE QUÍMICA, por la comisión de estudios

otorgada y permitir terminar esta importante etapa académica y personal.

A COLCIENCIAS Y A LA DIVISIÓN DE INVESTIGACIONES DE LA UNIVERSIDAD NACIONAL,

Por la financiación de los diferentes proyectos que permitieron llevar este trabajo a buen término y

la financiación de mi pasantía de investigación

A LA PROFESORA BLANCA HIGUERA, mi maestra, solo tengo palabras de agradecimiento y

estima. Muchas gracias por su acompañamiento, dirección y asesoría de este trabajo. Muchas

gracias por enseñarme que se puede ser un académico con altas virtudes profesionales, sin

olvidar las personales.

A LA PROFESORA SIXTA TULIA, no solo por su dedicación, asesoria y acertados consejos,

sino por su apoyo incondicional personal y profesional en todo este largo proceso.

AL GRUPO DE INVESTIGACIÓN ESTUDIO DE CAMBIOS QUÍMICOS y BIOQUÍMICOS EN

ALIMENTOS FRESCOS Y PROCESADOS, dirigido por la profesora Patricia Restrepo, por

facilitarme el uso del equipo HPLC-UV. A Mauricio Espinal, por sus valiosos consejos



AL GRUPO DE INVESTIGACIÓN ESTUDIO QUÍMICO Y DE ACTIVIDAD DE RUTÁCES Y

MIRISTICACEAS COLOMBIANAS, dirigido por el profesor Enrique Cuca, por facilitarme el uso

del equipo HPLC-DAD. A Wilman Delgado por sus observaciones

AL ÁREA DE BIOQUÍMICA, por el uso de los diferentes equipos que hacen parte del programa

de Doctorado en Ciencias-Bioquímica. AL IBUN (Instituto de Biotecnología de la Universidad

Nacional de Colombia), en especial al profesor Fabio Aristizabal e Ivonne García por el apoyo al

inicio de esta investigación en los experimentos de realtime PCR

AL LABORATORIO DE HPLC-MS DEL DEPARTAMENTO DE QUÍMICA, en especial a Angélica

Urrea por su asesoría.

AL GRUPO DE INVESTIGACIÓN DE BIOQUÍMICA Y PROTEÓMICA VEGETAL Y AGRÍCOLA

de la Universidad de Córdoba en España, por todo lo que aprendí durante la estancia que

realice. En especial al profesor Jesús, Raquel, José, Inma, Ana, Maricarmen y Lyudmila, por

permitirme integrarme al grupo y hacerme parte de la familia. AL SCAI Servicio Central de

Apoyo a la Investigación de la Universidad de Córdoba (España) por los análisis de huella

peptídica

A LOS INTEGRANTES DEL GRUPO DE INVESTIGACIÓN ESTUDIO DE ACTIVIDADES

METABÓLICAS VEGETALES, que pasaron por estos años y brindarme su apoyo y amistad:

Roquesa Mayorga, Obradith Caicedo, Patricia Martínez, Angélica Torres, Mayra Arrieta, María

Mercedes Arias, Katherine León, Jenny Martín, Carolina Cuellar, Edilene Ramírez y Alejandra

Castro

A Enrique Gómez y Juliana Barrios, por el apoyo en correcciones de forma y formato del escrito

final

A Mónica Avila, Carolina Chegwin y Nohora Vega, por su constante e incondicional amistad.

A las profesoras Laura Ortiz y Constanza López por la voz de aliento constante y apoyo durante

este tiempo

A Enrique Gómez, Sergio Acevedo, Jonb García, Laura Cerón, Olga Avila, Juliana Barrios, por su

gran apoyo, colaboración y amistad.

Resumen y Abstract IX

Resumen

En esta investigación se abordó el estudio de algunos fenómenos bioquímicos y moleculares que

demostraron tener participación en las características de resistencia, tanto pasiva como activa, de

variedades de clavel (Dianthus caryophyllus L.) al patógeno Fusarium oxysporum f. sp. dianthi,

causante del marchitamiento vascular, la enfermedad más limitante en este cultivo. Los hallazgos

obtenidos, después de realizar diversos estudios comparativos referentes a metabolitos

secundarios fenólicos, a las actividades de enzimas que participan en su biosíntesis, así como de

sus niveles de mRNA cuantificados por PCR en tiempo real, permitieron establecer que la

biosíntesis de flavonoides es un proceso bioquímico que está correlacionado positivamente con la

resistencia del clavel. Aumentos observados en los niveles de H2O2, molécula señal de particular

importancia en defensa vegetal, se asociaron con la activación de la transcripción de genes de

chalcona sintasa, chalcona isomerasa y de una peroxidasa de clase III, indicando un papel

importante de estas enzimas y de esta especie reactiva en este modelo. Adicional a esta dinámica

encontrada en procesos del metabolismo secundario, se plantea la participación de diversas

proteínas involucradas en diversos procesos celulares, las cuales, a través de la evaluación

proteómica realizada, mostraron incrementos en la variedad resistente como es el caso de las que

intervienen en metabolismo de carbohidratos, mantenimiento estructural de proteínas, biosíntesis

de etileno y traducción de mRNA para la síntesis de proteínas. Se destaca además a nivel

constitutivo, la presencia de una candidata a proteína de resistencia que presenta un dominio NB-

ARC, altamente conservado en proteínas de este tipo. La elucidación de estos fenómenos en esta

interacción planta-patógeno permitió comprobar la hipótesis de una regulación compleja espacio-

temporal de las respuestas de defensa y da fundamento para la postulación de los niveles de

flavonoides y enzimas como la chalcona sintasa y chalcona isomerasa, como probables

marcadores de resistencia en esta especie de particular importancia económica para Colombia.

Palabras claves: clavel, Fusarium oxysporum, flavonoides, proteómica, enzimas de la biosíntesis de flavonoides, transcripción de genes, resistencia vegetal.



Abstract

This research was conducted to study some biochemical and molecular involved in the resistance

characteristics, both passive and active, of carnation (Dianthus caryophyllus L.) cultivars to the

pathogen Fusarium oxysporum f. sp. dianthi, causal agent of vascular wilting, the most limiting

disease in this crop. The findings obtained after performing various comparative studies

concerning secondary metabolites, particulary phenolics, the activities of enzymes involved in their

biosynthesis, as well as mRNA levels quantified by real-time PCR, it was established that the

biosynthesis of flavonoids is a biochemical process positively correlated with the pathogen

resistance of carnation. An increase in the levels of H2O2, particularly important signaling molecule

in plant defense, is associated with activation of gene transcription of chalcone synthase, chalcone

isomerase and a class III peroxidase, indicating an important role of these enzymes and this

reactive species in this model. Additional to this dynamic processes found in secondary

metabolism, it is proposed the participation of several proteins involved in various cellular

processes, which, through proteomics evaluation performed, showed increases in the resistant

cultivar, as those involved in carbohydrate metabolism, protein structural maintenance, ethylene

biosynthesis and translation of mRNA to protein synthesis. It is established at constitutive level,

the presence of a candidate resistance protein with a NB-ARC domain, highly conserved in this

kind of proteins. The elucidation of these phenomena in this plant-pathogen interaction, allowed

proving the hypothesis of a complex spatio-temporal regulation of defense responses and allows

us to postulate that levels of flavonoids and enzymes such as chalcone synthase and chalcone

isomerase, could be probable resistance markers in this particular specie of economic significance

for Colombia.

Key words: carnation, Fusarium, flavonoide, proteomic, flavonoide biosynthesis enzymes, gene transcription, resistance

XI

Contenido

CONTENIDO XI

LISTA DE FIGURAS XVI

LISTA DE TABLAS XX

LISTA DE SÍMBOLOS Y ABREVIATURAS XXII

INTRODUCCIÓN 25

Objetivo General 31

Objetivos Específicos 31

1. ESTADO ACTUAL DEL TEMA 33

1.1. Interacción planta-patógeno 33

1.2. Resistencia y susceptibilidad 36

1.3. Reconocimiento y señalización 38

1.4. Mecanismos de defensa vegetal 41

1.4.1. Defensa vegetal pasiva o preexistente 41

1.4.2. Defensa vegetal dinámica o inducible 44

1.5. Metabolismo secundario y defensa vegetal 47

1.5.1. Ruta fenilpropanoide 48

1.5.2. Flavonoides 51

1.6. Actividad antioxidante 57

1.7. Estudios de niveles transcripcionales en modelos planta-patógeno 60

XII Contribución al estudio de algunos mecanismos bioquímicos y moleculares de la


Título de la tesis o trabajo de investigación

1.8. Estudios proteómicos comparativos en modelos de interacción planta-

patógeno 61

1.9. Modelo experimental Dianthus caryophyllus L - Fusarium oxysporum f. sp.

dianthi raza 2 62

1.9.1. El hospedero: Clavel Dianthus caryophyllus L. 62

1.9.2. El patógeno: Fusarium oxysporum f. sp. dianthi 62

1.9.3. El marchitamiento vascular del clavel 63

1.9.4. Resistencia al marchitamiento vascular 65

2. BIOSÍNTESIS CONSTITUTIVA DE FLAVONOIDES EN EL CLAVEL Y SU

RELACIÓN CON RESISTENCIA A Fusarium oxysporum f. sp. dianthi 71

Resumen 71

Abstract 72

2.1. Introducción 72

2.2. Materiales y métodos 75

2.2.1. Material vegetal 75

2.2.2. Selección de condiciones de extracción de compuestos polifenólicos a partir de

tallos y raíces de clavel 75

2.2.3. Contenido de fenoles totales 76

2.2.4. Determinación de flavonoides totales 77

2.2.5. Inactivación del radical ABTS 77

2.2.6. Captación del radical DPPH 77

2.2.7. Preparación de extractos enzimáticos 78

2.2.8. Determinaciones de actividad enzimática 79

2.2.9. Cuantificación por PCR en tiempo real 80

2.2.10. Análisis estadístico 82

2.3. Resultados y Discusión 82

2.3.1. Selección de condiciones de extracción de compuestos polifenólicos a partir de

tallos y raíces de clavel 82

2.3.2. Determinación de niveles constitutivos de fenoles, flavonoides y actividad

antioxidante en diferentes variedades de clavel 84

2.3.3. Niveles constitutivos en raíces de clavel de enzimas involucradas en biosíntesis

de flavonoides 88

2.3.4. Análisis de correlación de Pearson 92

2.3.5. Análisis de componentes principales PCA 94

2.4. Conclusiones 97

Contenido XIII

3. BIOSÍNTESIS DE METABOLITOS FENÓLICOS EN CLAVEL DURANTE SU

INTERACCIÓN CON Fusarium oxysporum f. sp. dianthi 99

Resumen 99

Abstract 100


3.2. Materiales y Métodos 103

3.2.1 Material biológico 103

3.2.2. Evaluación de parámetros asociados con la biosíntesis de flavonoides durante la

infección con el patógeno 103

3.2.3 Proceso de Inoculación 104

3.2.4. Evaluación de compuestos fenólicos, flavonoides y actividad antioxidante 105

3.2.5. Comparación de perfiles cromatográficos por HPLC 106

3.2.6. Aproximación a la estructura química de algunos compuestos de interés. 107

3.2.7. Evaluación de actividades enzimáticas 107

3.2.8. Evaluación de niveles transcripcionales 108


3.3.1 Evaluación de incidencia del marchitamiento vascular causado por Fusarium

oxysporum f. sp. dianthi raza 2 en las dos variedades de clavel 110

3.3.2. Evaluación de niveles de fenoles, flavonoides y actividad antioxidante durante la

interacción con el patógeno 113

3.3.3. Comparación de perfiles obtenidos por HPLC y análisis cuantitativo de

compuestos tipo flavonoide en raíces de clavel, durante la infección con Fod 125

3.3.4. Aproximación a la estructura química para compuestos probablemente

asociados a la resistencia del clavel 141

3.3.5. Evaluación de los niveles de actividad y transcripcionales para las enzimas PAL,

CHS y CHI, en raíces y tallos de clavel durante la interacción con Fod 155


4. EVIDENCIAS BIOQUÍMICAS Y MOLECULARES DE LA PARTICIPACIÓN DE

PEROXIDASAS EN LA RESISTENCIA DEL CLAVEL (Dianthus caryophyllus L) A

Fusarium oxysporum f. sp. dianthi 181

Resumen 181

Abstract 182


4.2. Materiales y Métodos 185

4.2.1. Material biológico y ensayo in vivo 185

XIV Contribución al estudio de algunos mecanismos bioquímicos y moleculares de la



4.2.2. Extracción y determinación de las actividades Guayacol-peroxidasa (GPX) y

Ascorbato-peroxidasa (APX) 186

4.2.3 Determinación de peróxido de hidrógeno 187

4.2.4. Determinación de lignina 187

4.2.5 Zimogramas de peroxidasas 187

4.2.6. Niveles transcripcionales de peroxidasas de clase III 189

4.2.7. Análisis estadístico 190

4.3. Resultados y discusión 191

4.3.1. Evaluación de niveles constitutivos de las enzimas GPX y APX, en variedades

de clavel con diferentes niveles de resistencia al marchitamiento vascular 191

4.3.2. Evaluación de los niveles de peróxido de hidrógeno, APX y GPX, durante la

inoculación con el patógeno en tallos y raíces de clavel 193

4.3.3. Zimogramas de peroxidasas usando SDS-PAGE e IEF 203

4.3.4. Niveles transcripcionales de peroxidasas de clase III 206


5. APROXIMACIÓN PROTEÓMICA AL ESTUDIO DE LOS MECANISMOS DE

DEFENSA DEL MODELO CLAVEL-Fusarium oxysporum f. sp dianthi 215

Resumen 215

Abstract 216


5.2. Materiales y métodos 219

5.2.1. Material Vegetal 219

5.2.2. Selección de condiciones de extracción 219

5.2.3. Selección de condiciones de separación en geles grandes 222

5.2.4. Análisis comparativo entre tratamientos usando electroforesis en 1D 225

5.2.5. Análisis comparativo entre tratamientos usando electroforesis 2D 226

5.2.6. Digestión de proteínas en gel e identificación de proteínas por MALDI-TOF/TOF

226


5.3.1. Selección de condiciones para la extracción y separación por electroforesis en

1D y 2D de proteínas presentes en tallos y raíces de clavel 227

5.3.2. Análisis comparativo entre tratamientos usando 1-DE 236

5.3.3. Análisis comparativo entre tratamientos usando electroforesis en 2D 245

5.3.4. Resultados de la identificación de proteínas por MALDI-TOF/TOF 258

5.3.5. Análisis de los resultados de identificación 261

Contenido XV


6. DISCUSIÓN FINAL 269

BIBLIOGRAFÍA 281

272

281

272

281

XVI Contribución al estudio de algunos mecanismos bioquímicos y moleculares de la



Lista de figuras

Figura No. 1. Representación esquemática de la ruta fenil propanoide y la vía de los

flavonoides. 50

Figura No. 2. Estructura del flavano (2-fenilbenzopirano) 51

Figura No. 4. Evaluación de diferentes métodos para la extracción de metabolitos a partir

de tallos y raíces de clavel. 83

Figura No. 5. Niveles de fenoles y flavonoides constitutivos en raíces y tallos de clavel de

variedades de dos fincas productoras ubicadas en diferentes municipios de la

sabana de Bogotá. 85

Figura No. 6. Niveles de actividad antioxidante constitutiva en raíces y tallos de clavel de

variedades de dos fincas productoras ubicadas en diferentes municipios de la

sabana de Bogotá. 87

Figura No. 7. Niveles de actividades enzimáticas a nivel de raíz en variedades de clavel

de dos fincas productoras ubicadas en diferentes municipios de la sabana de

Bogotá. 89

Figura No. 8. Niveles transcripcionales de genes codificantes para CHS y CHI a nivel de

raíz en variedades de clavel de dos fincas productoras ubicadas en diferentes

municipios de la sabana de Bogotá. 91

Figura No. 9. Análisis de componentes principales para metabolitos, actividades

enzimáticas y niveles transcripcionales para el metabolismo de flavonoides en raíces

de clavel. 95

Figura No. 10. Diagrama de flujo general para el estudio de parámetros asociados a la

biosíntesis de flavonoides en clavel durante la infección con el patógeno fod 104

Figura No. 11. Distribución de esquejes en el arreglo experimental completamente

aleatorizado planteado en el estudio de parámetros asociados a la biosíntesis de

fenólicos en clavel durante la infección con Fod 105

Figura No. 12. Fotografías del ensayo in vivo a las 2 horas posinoculación. 110

Figura No. 13. Incidencia del marchitamiento vascular causado por fod durante el ensayo

in vivo con las variedades estudiadas. 112

Figura No.14. Efecto de la inoculación del patógeno Fod en los niveles de compuestos

fénolicos totales y flavonoides totales presentes en raíces de clavel. 114

Contenido XVII

Figura No. 15. Efecto de la inoculación del patógeno fod en los niveles de actividad

antioxidante presente en raíces de clavel. 119

Figura No. 16. Efecto de la inoculación del patógeno Fod en los niveles de compuestos

fénolicos totales y flavonoides totales presentes en tallos de clavel. 121

Figura No. 17. Efecto de la inoculación del patógeno Fod en los niveles de capacidad

inactivación ABTS y capacidad inactivación DPPH. 123

Figura No. 18. Perfiles cromatográficos para extractos obtenidos a partir de raíces de

clavel de las variedades L.P.Candy y Tasman. 126

Figura No. 19. Perfiles cromatográficos por HPLC para extractos obtenidos a partir de

raíces de clavel de la variedad L.P. Candy. 129

Figura No. 20. Analisis de componentes principales para los resultados obtenidos durante

la separación de compuestos de tipo flavonoide en raíces de clavel inoculados con el

patógeno causal del marchitamiento vascular. 133

Figura No. 21. Variación en el contenido de los componentes F2, F3, F9 y F10 durante la

infección con el patógeno en las variedades resistente y susceptible. 134

Figura No. 22. Perfiles cromatográficos por HPLC con detección a 350 nm para extractos

obtenidos a partir de tallos de clavel de las variedades L.P. Candy y Tasman. 135

Figura No. 23. Análisis de componentes principales para los resultados obtenidos durante

la separación de compuestos de tipo flavonoide en tallos de clavel inoculados con el

patógeno causal del marchitamiento vascular. 140

Figura No. 24. Variación en el contenido de los componentes FT2 y FT6 durante la

infección con el patógeno en las variedades resistente y susceptible. 141

Figura No. 25. Comparación de la separación cromatografica obtenida mediante los

diversos tipos de análisis realizados HPLC-MS, HPLC.DAD y HPLC-UV. 142

Figura No. 26. Comparación del perfil de elución y el TIC para el análisis por HPLC-MS

de los extractos obtenidos de raíces de clavel. 148

Figura No. 27. Comparación del perfil de elución del ión m/z= 769 y el perfil de elución a

350nm para extractos obtenidos de raíces de clavel. 150

Figura No. 28. Especto de masas en modo SCAN para el compuesto FT6 presente en

tallos de clavel. 152

Figura No. 29. Niveles de actividad fenilalanina amonio liasa en raíces de clavel durante

el ensayo in vivo de inoculación con el patógeno Fod raza 2. 158

Figura No. 30. Niveles transcripcionales para genes codificantes para la enzima PAL en

raíces de clavel durante el ensayo in vivo de inoculación con el patógeno

Fod raza 2. 159

Figura No. 31. Niveles de actividad chalcona sintasa en raíces de clavel durante el

ensayo in vivo de inoculación con el patógeno Fod raza 2. 163

Figura No. 32. Niveles transcripcionales para genes codificantes para la enzima CHS en


Fod raza 2. 164

Figura No. 33. Niveles de actividad chalcona isomerasa en raíces de clavel durante el


XVIII Contribución al estudio de algunos mecanismos bioquímicos y moleculares de la



Figura No. 34. Niveles transcripcionales para genes codificantes para la enzima CHI en


Fod raza 2. 169

Figura No. 35. Niveles de actividad fenilalanina amonio liasa en tallos de clavel durante el


Figura No. 36. Niveles de actividad chalcona sintasa en tallos de clavel durante el ensayo

in vivo de inoculación con el patógeno Fod raza 2. 174

Figura No. 37. Niveles transcripcionales para genes codificantes para la enzima CHS en


Fod raza 2. 175

Figura No. 38. Niveles de actividad chalcona isomerasa en tallos de clavel durante el


Figura No. 39. Niveles de actividad enzimática constitutiva ascorbato peroxidasa y

guayacol peroxidasa en tallos y raíces de clavel con diferentes niveles de resistencia

al marchitamiento vascular. 192

Figura No. 40. Niveles de peróxido de hidrógeno en raíces de clavel durante el ensayo in

vivo de inoculación con el patógeno Fod raza 2. 194

Figura No. 41. Niveles de actividad guayacol peroxidasa y ascorbato peroxidasa en


Fod raza 2. 197

Figura No. 42. Niveles de peróxido de hidrógeno en tallos de clavel durante el ensayo in

vivo de inoculación con el patógeno Fod raza 2. 198

Figura No. 43. Niveles de actividad ascorbato peroxidasa en tallos de clavel durante el


Figura No. 44. Niveles de actividad guayacol peroxidasa en tallos de clavel durante el


Figura No. 45. Niveles de lignina en tallos de clavel durante el ensayo in vivo de

inoculación con el patógeno Fod raza 2. 202

Figura No. 46. Comparación de perfiles electroforéticos por SDS-PAGE de extractos de

peroxidasas obtenidos a partir de tallos de la variedad resistente L.P.Candy. 203

Figura No. 47. Comparación de perfiles electroforéticos por isoelectroenfoque de

extractos de peroxidasas obtenidos a partir de tallos de clavel de la variedad

resistente L.P. Candy. 204

Figura No. 48. Comparación de niveles transcripcionales por cuantificación relativa de

peroxidasas a nivel del tallo. 206

Figura No. 49. Motivos presentes en la proteína Dcprx 02 en Dianthus cayophyllus L. 207

Figura No. 50. Niveles de mRNA para la proteína Dcprx02 a nivel del tallo durante la

inoculación con Fusarium oxysporum f. sp. dianthi raza 2. 208

Figura No. 51. Electroforesis en 1D para los extractos obtenidos mediante los diferentes

procedimientos de extracción de proteína evaluados a partir de tallos y raíces de

clavel. 229

Figura No. 52. Electroforesis en 1D para los extractos obtenidos mediante el

procedimiento TCA/acetona/fenol a partir de tallos y raíces de clavel. 230

Contenido XIX

Figura No. 53. Electroforesis en 2D para los extractos obtenidos mediante el

procedimiento TCA/acetona/fenol a partir de tallos y raíces de clavel, con diferentes

cantidades de proteína total. 231

Figura No. 54. SDS-PAGE para la comparación de los métodos de tinción en extractos

obtenidos a partir de raíces de clavel. 233

Figura No. 55. Geles 2D de extractos obtenidos a partir de tallos y raíces de clavel bajo

las condiciones de separación seleccionadas. 235

Figura No. 56. Electroforesis 1D (SDS-PAGE) en geles grandes 20x20cm de proteínas

extraídas de raíces y tallos de clavel, usando el método TCA/acetona/fenol 237

Figura No. 57. Análisis estadístico por PCA y agrupamientos jerárquicos “hierarchical

clustering” para los resultados obtenidos en 1D a nivel de la raíz durante la infección

con el patógeno. 238

Figura No. 58. Análisis estadístico por PCA y agrupamientos para los resultados

obtenidos en 1D a nivel del tallo durante la infección con el patógeno. 243

Figura No. 59. Gel master definido por el programa PD-Quest para la comparación en

raíz y muestra de geles para los tratamientos T1 6hpi y T2 6hpi. 246

Figura No. 60. Análisis estadístico por PCA y agrupamientos para los resultados

obtenidos en 2D a nivel de la raíz durante la infección con el patógeno. 248

Figura No. 61. Gel máster con las manchas proteicas asociadas a diferencias a nivel

constitutivo entre las variedades de clavel L.P Candy y Tasman en raíces

(Grupo I). 250

Figura No. 62. Gel máster con las manchas proteicas que aumentaron en la variedad

resistente inoculada a las 6hpi con el patógeno en raíces (Grupo 2). 251

Figura No. 63. Gel máster con las manchas proteicas que disminuyeron su intensidad en

la variedad resistente inoculada a las 6 hpi con el patógeno en raíces (Grupo 3). 252

Figura No. 64. Gel máster definido por el programa PD-Quest para la comparación en

raíz y muestra de geles para los tratamientos T1 6hpi y T2 6hpi. 253

Figura No. 65. Análisis estadístico por PCA y agrupamiento para los resultados obtenidos

en 2D a nivel de la raíz durante la infección con el patógeno. 255

Figura No. 66. Gel máster con las manchas proteicas que aumentaron en la variedad

resistente inoculada a las 6hpi en tallo (Grupo 4). 256

Figura No. 67. Gel máster con las manchas proteicas que disminuyeron en la variedad

resistente inoculada a las 6hpi en tallo (Grupo 6). 257

Figura No. 68. Resumen de algunos de los mecanismos de defensa en células de raíces

de clavel durante la interacción con Fod. 277

Figura No. 69. Resumen de algunos de los mecanismos de defensa en células de raíces

de clavel durante la interacción con Fod. 278

XX Contribución al estudio de algunos mecanismos bioquímicos y moleculares de la



Lista de tablas

Tabla No. 1. Algunas fitoanticipinas encontradas en plantas de diversas especies

vegetales 43

Tabla No. 2. Presencia de algunas fitoalexinas reportadas en diversas familias de

plantas 46

Tabla No. 3. Ejemplo de algunos flavonoides involucrados en respuestas de defensa

activa 53

Tabla No. 4. Compuestos caracterizados en clavel (Dianthus caryophyllus L.) con

probable relación en los mecanismos de defensa ante Fusarium oxysporum f. sp.

dianthi. 67

Tabla No. 5. Condiciones evaluadas para la extracción de metabolitos a partir de tallos y

raíces de clavel. 76

Tabla No. 6. Lista de cebadores usados para la cuantificación por pcr en tiempo real de

los niveles de mRNA para los genes de biosíntesis de flavonoides. 82

Tabla No. 7. Coeficientes de correlación de pearson 93

Tabla No. 8. Lista de cebadores usados para la cuantificación por pcr en tiempo real de

los niveles de mRNA para los genes codificantes para fenilalanina amonio liasa 108

Tabla No. 9. Cortes transversales de tallos para las variedades de clavel estudiadas,

controles e inoculados a las 8 semanas posinoculación con Fod 113

Tabla No. 10. Comparación del contenido total inicial de compuestos con absorción a 350

nm, presentes en extractos obtenidos a partir de raíces de clavel de variedades

resistente y susceptible 127

Tabla No. 11. Variación del contenido total de “compuestos probablemente flavonoides”

(HPLC con detección a 350nm), en raíces de clavel a diferentes tiempos

posinoculación con el patógeno Fod raza 2. 130

Tabla No. 12. Variación del contenido de “compuestos probablemente flavonoides”

especificos (HPLC con detección a 350nm), en raíces de clavel a diferentes tiempos

posinoculación con el patógeno Fod raza 2. 131

Tabla No. 13. Comparación del contenido total inicial de compuestos con absorción a 350

nm, presentes en extractos obtenidos a partir de tallos de clavel de variedades

resistente y susceptible 136

Contenido XXI

Tabla No. 14. Comparación del contenido total inicial de compuestos de tipo flavonoide

en extractos obtenidos a partir de tallos de clavel de variedades resistente y

susceptible mediante método espectrofotométrico y HPLC 137

Tabla No. 15. Variación del del contenido total de compuestos tipo flavonoide (HPLC a

350nm), en tallos de clavel a diferentes tiempos posinoculación con el patógeno Fod

raza 2. 138

Tabla No. 16. Variación del contenido de compuestos tipo flavonoide especificos (HPLC a

350nm), en tallos de clavel a diferentes tiempos posinoculación con el patógeno Fod

raza 2. 139

Tabla No. 17. Resumen de los espectros UV (250-500nm) para los compuestos del grupo

I presentes en raíces de clavel, obtenidos mediante HPLC-DAD 143

Tabla No. 18. Resumen de formula molecular, estructura y absorción UV, para

flavonoides aislados de clavel 145

Tabla No. 19. Información obtenida de los análisis por HPLC-MS modo SCAN, de

extractos obtenidos a partir de raíces de clavel 149

Tabla No. 20. Resumen de los espectros UV (250-500nm) para los compuestos del grupo

II presentes en tallos de clavel, obtenidos mediante HPLC-DAD 151

Tabla No. 21. Cebadores usados para la cuantificación por pcr en tiempo real de los

niveles de mRNA para los genes de peroxidasas en clavel 190

Tabla No. 22. Análisis estadísticos de correlación de pearson entre las variables

evaluadas 209

Tabla No. 23. Rendimiento para los diferentes métodos de extracción de proteínas totales

en tallos y raíces de clavel 228

Tabla No. 24. Resumen de los resultados de la puesta a punto de condiciones de análisis

para la separación en 2D de proteínas obtenidas de tallos y raíces de clavel 234

Tabla No. 25. Resumen de las bandas que presentaron aumento en su intensidad en la

variedad resistente por efecto de la inoculación con el patógeno. 239

Tabla No. 26. Resumen de las diferencias cualitativas encontradas para las bandas 32,

39 y 55 entre inoculados y controles a 6 hpi a nivel de la raíz 240

Tabla No. 27. Identificaciones realizadas para la banda 55 tanto en el inoculado como en

el control no inoculado a las 6 hpi 242

Tabla No. 28. Banda que presentó cambios asociados con resistencia en la variedad L.P.

Candy a nivel del tallo 244

Tabla No. 29. Identificaciones realizadas para la banda 51 en tallos de la variedad

resistente L.P. Candy a las 24hpi con Fod 244

Tabla No. 30. Resumen de la variación en el número de manchas electroforéticas para

los diferentes tratamientos para el análisis comparativo en 2D a nivel de la raíz 247

Tabla No. 31. Resumen de la variación en el número de manchas electroforéticas para

los diferentes tratamientos encontrados para el análisis comparativo en 2D a nivel

del tallo 254

XXII Contribución al estudio de algunos mecanismos bioquímicos y moleculares de la



Lista de símbolos y abreviaturas

En este escrito se emplearon extensivamente siglas en ingles debido a su uso

generalizado en la literatura especializada.

4CH 4-cumarato hidroxilasa

4CL p-cumarato:CoA ligasa

ABTS 2,2´-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid) diammonium salt

ANOVA Analysis of Variance

ANR Antocianidina Reductasa

ANS Antocianidina Sintasa

APAF-1 Apoptotic Protease Activating Factor 1

APX Ascorbato Peroxidasa

ATP Adenosine-5'-triphosphate

bHLH Basic-Helix-Loop-Helix

BSA Bovine Serum Albumine

CC Coiled Coil

CDPK Calmodulin-like Domain Protein Kinase

CE Cathequin Equivalent

Ced-4 Caenorhabditis elegans death-4 protein

CFT Contenido de Fenoles Totales

CHAPS Ácido 3-[(3-colamidopropil)dimetilamonio]-1-propano sulfónico

CHI Chalcona Isomerasa

CHS Chalcona Sintasa

CoA Coenzyme A

DAD Detector de Arreglo de Diodos

Contenido XXIII

DEPC Dietil Pirocarbonato

DNA Deoxyribonucleic acid

DPPH 2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl

DTT Ditio Treitol

EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid

EM Espectrometria de Masas

ERN Especies Reactivas de Nitrógeno

EROs Especies Reactivas de Oxígeno

ESI Electrospray

ETI Effector-Triggered Immunity

FDR False Discovery Rate

Fod Fusarium oxysporum f. sp. dianthi

GAE Gallic Acid Equivalents

GPX Guayacol Peroxidasa

GTP Guanosine-5'-triphosphate

GUS Beta- Glucuronidasa

HPLC High Performance Liquid Chromatography

HR Hypersensitive Response

HSP Heat Shock Protein

IE Impacto Electrónico

IEF Isoelectric Focusing Electrophoresis

LRR Leucine Rich-Repeats

MALDI Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization

MAMPs Microbial Associated Molecular Patterns

MATE Multidrug and Toxic Compound Extrusion Transporters

NAD Nicotinamida Adenina Dinucleótido

NADP Nicotinamida Adenina Dinucleótido Fosfato

NBS Nucleotide Binding Site

PAL Phenylalanine Ammonium Liase

PAMPs Pathogen-Associated Molecular Patterns

PCA Principal Component Analysis

PCR Polymerase Chain Reaction

PDA Potato Dextrose Agar

PGPR Plant Growth-Promoting Rhizobacteria

XXI

V




PMSF Phenylmethylsulfonyl Fluoride

POD Enzima Peroxidasa

PRPs Patogen-Recognition Receptors

PTI PAMP-triggered immunity

PVPP Polyvinylpolypyrrolidone

QTLs Quantitative Trait Loci

RNA Ribonucleic Acid

RSI Resistencia Sistémica Inducida

RT-PCR Retrotranscription- Polymerase Chain Reaction

SAM S-adenosil metionina

SDS Sodium Dodecyl Sulfate

SDS-PAGE Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis

SIM Single Ion Mode

TE Trolox Equivalents

TEMED N,N,N,N'-tetrametiletilendiamina

TIR Toll and Interleukine Receptor

TOF Time of Flight

Trolox 6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2- carboxylic acid

UV Ultravioleta

Introducción

Para Colombia la exportación de flor fresca cortada se constituye como una de las

actividades económicas de mayor relevancia económica, considerando que para el año

2012, generó más de 1200 millones de dólares de divisas y casi 130 mil empleos directos

e indirectos (A. González & Sarmiento 2013). Dentro de este sector, el clavel (Dianthus

caryophyllus L), se ha posicionado como uno de los productos de mayor importancia,

representando el 19% del total de la producción generada por más de 8000 hectáreas

cultivadas principalmente en la sabana de Bogotá, Antioquia y el Valle del Cauca. Estas

condiciones han generado que nuestro país se posicione como el principal productor

mundial de clavel estándar y como el segundo productor de flores frescas cortadas,

superado únicamente por Holanda (Castellanos et al. 2009). Aun cuando en los últimos

años flores como las rosas han tenido un importante repunte dentro del gusto de los

consumidores, actualmente el cultivo de clavel en Colombia se constituye, dentro de este

sector, como una de las actividades de más importancia teniendo en cuenta la

significativa participación de esta flor dentro de la producción total (Arbeláez 2006;

Castellanos et al. 2009).

Sin embargo, a pesar de la importancia de la producción del clavel para nuestro país,

ésta ha presentado una notable disminución en los últimos años, debida principalmente

al alto costo que conlleva el manejo de enfermedades de tipo infeccioso, en especial del

marchitamiento vascular causado por Fusarium oxysporum f. sp. dianthi (Fod)

(Castellanos et al. 2009). Este patógeno que se encuentra ampliamente distribuido en los

cultivos de clavel, presenta diversas razas fisiológicas, dentro de las cuales la raza 2 es

la más agresiva y de mayor distribución en Colombia (Barrera & Gómez 1995). Con el fin

de controlar esta enfermedad, se han desarrollado un conjunto de estrategias, basadas

principalmente en prevenir la entrada del patógeno a los cultivos con medidas higiénicas

que evitan la contaminación de esquejes sanos durante las etapas de propagación y

producción.

26

Considerando que estas medidas tan solo generan un control aceptable de la

enfermedad, aumentan los costos de producción y pueden afectar el medio ambiente, la

investigación para encontrar otras alternativas de control de la enfermedad continua

(Sant et al. 2010; Melero-Vara et al. 2011). En la búsqueda de los mecanismos

bioquímicos y moleculares que permitan sustentar y agilizar la búsqueda de dichas

alternativas, se han realizado diferentes investigaciones con el fin de determinar aquellas

respuestas que se presentan como efecto de la infección del hospedero y de los

mecanismos que usa el patógeno para lograr una colonización exitosa de la planta. A

pesar de ello, a la fecha, el conocimiento bioquímico y molecular que se tiene al respecto

es poco y las bases que determinan la activación de estos procesos están lejos de estar

completamente elucidados. Particular interés han generado para el desarrollo y selección

de variedades resistentes a la enfermedad en los programas de mejoramiento, los

mecanismos de defensa que presentan las variedades que no desarrollan la enfermedad

y que generalmente determinan la resistencia al patógeno. La investigación sobre dichos

mecanismos, además de suministrar información básica para la futura generación de

variedades resistentes, apoya los programas de mejoramiento, los cuales actualmente

están limitados por la falta de marcadores moleculares o bioquímicos que permitan hacer

una selección de variedades resistentes, antes de realizar costosas pruebas de campo.

Entre los estudios realizados están los que han buscado determinar el efecto que tiene la

inoculación con el patógeno en el metabolismo secundario de la planta. Al respecto, se

ha encontrado que tanto a nivel de la raíz, como del tallo, se producen cambios

cualitativos y cuantitativos en los metabolitos especialmente fenólicos, algunos de ellos

con propiedades antifúngicas hacia Fusarium oxysporum f. sp. dianthi (Baayen et al.

1989; Niemann et al. 1991; Higuera 2001). Es interesante destacar que dentro de los

compuestos fenólicos encontrados, se cuentan algunos flavonoides, compuestos

ubicuamente distribuidos en plantas superiores, que cumplen en la misma una amplia

diversidad de funciones fisiológicas (Curir et al. 2005; Galeotti, Barile, Lanzotti, et al.

2008). De manera particular, el papel de estos compuestos ha sido de interés en las

interacciones que involucran patógenos del género Fusarium, considerando que,

estudios funcionales realizados con mutantes de lino (Linum usitatissimum) que

presentan mayores niveles de las enzimas involucradas en la producción de estos

metabolitos, han mostrado una mayor resistencia a los patógenos Fusarium oxysporum

y Fusarium culmorum (Lorenc-Kukuła et al. 2007).

27

En el clavel, los estudios realizados sobre las enzimas involucradas en la biosíntesis de

fenólicos y su papel en resistencia vegetal es incipiente. Se ha determinado que la

infección con el patógeno causal del marchitamiento vascular, tiene un efecto en los

niveles de la enzima fenilalanina amonio liasa (PAL, por sus siglas en inglés), en raíces

de plantas resistentes a la enfermedad (Ardila et al. 2011). De acuerdo con dicha

investigación, se propone que las respuestas de defensa asociadas al metabolismo

secundario para este modelo, además de ser dependientes del órgano que se encuentre

involucrado en la interacción, pueden incluir la participación de otras enzimas asociadas

a esta ruta biosintética. Este podría ser el caso por ejemplo, de la chalcona sintasa (CHS)

y la chalcona isomerasa (CHI), enzimas claves para la biosíntesis de flavonoides,

metabolitos que como se mencionó anteriormente, son de particular interés en estudios

de resistencia a patógenos del género Fusarium.

El interés sobre la biosíntesis de flavonoides y su participación en la resistencia del clavel

aumenta si se considera que muchos de estos compuestos pueden presentar actividad

antioxidante, la cual puede estar asociada con la resistencia a patógenos necrotróficos

como Fusarium oxysporum. Esto se debe a que altos niveles de especies oxidantes,

producto del metabolismo de la planta, pueden generar la muerte celular vegetal y

favorecer la obtención de nutrientes por parte de este tipo de patógenos (Barna et al.

2012). Por ello, la eliminación de estas especies ya sea por la acción de moléculas

antioxidantes o de otros mecanismos enzimáticos, puede ser parte de la respuesta

asociada con resistencia de la planta. Se ha aceptado que dentro de estos procesos,

enzimas como las peroxidasas cumplen un papel central, considerando que además de

eliminar el peróxido de hidrógeno en la planta, pueden estar involucradas de manera

simultánea, en procesos como la lignificación y suberización, fenómenos que de acuerdo

con estudios realizados usando técnicas como microscopia electrónica, son también

parte de la respuesta multi-componente asociada a la expresión de resistencia en el

clavel (Ouellette et al. 2004; Higuera & Ebrahim-Nesbat 1999).

En este modelo, la alta complejidad en la respuesta al patógeno, está de acuerdo con la

naturaleza multigénica de la resistencia a la enfermedad y evidencian la participación de

un amplio número de rutas metabólicas que deben estar reguladas, a su vez, por la

correcta activación y localización de las enzimas involucradas. Es por ello que los

mecanismos que participan en la regulación de los niveles de enzimas asociadas a la

defensa, son de interés en el estudio de la resistencia del clavel, si se quiere aprovechar

28

el potencial científico para obtener variedades resistentes o generar nuevos marcadores

de selección en los procesos de cruzamiento tradicionales.

Bajo estas consideraciones, con el fin de profundizar en los mecanismos involucrados en

la resistencia del clavel y determinar si la biosíntesis de flavonoides está relacionada con

la resistencia a la enfermedad, en la presente investigación se planteó la siguiente

hipótesis: La regulación espacio temporal de los niveles de actividad enzimática y de

transcripción para las enzimas fenilalanina amonio liasa, chalcona sintasa, chalcona

isomerasa y peroxidasa, enzimas involucradas en la biosíntesis y el metabolismo de

fenoles y flavonoides, así como la acumulación de algunos metabolitos secundarios

provenientes de las rutas metabólicas en que dichas enzimas participan, está relacionada

con la resistencia al marchitamiento vascular.

Con el fin de validar esta hipótesis, se evaluó si dichos parámetros asociados a la

regulación de la biosíntesis de flavonoides y la actividad antioxidante, estaban asociados

a la expresión de resistencia del clavel al marchitamiento vascular. Para ello, se optó por

un análisis comparativo entre variedades resistentes y susceptibles, de los niveles de

metabolitos, actividades enzimáticas y niveles de transcripción de las enzimas

mencionadas. Considerando que esta comparación se realizó tanto a nivel constitutivo

como a nivel inducible, se pudo evaluar la participación de los mismos tanto en los

mecanismos de defensa pasiva, como en la defensa activa.

La alta complejidad de las respuestas inducibles en este modelo y su especificidad de

acuerdo al órgano de la planta involucrado, generó la necesidad de realizar el estudio en

tallos y raíces de la planta de manera independiente. Esto, además de presentar un

panorama global de cómo se presenta la expresión de resistencia en toda la planta,

permitió estudiar los posibles puntos de regulación espacio-temporal de la respuesta.

Esta investigación se complementó con el estudio de otras respuestas de defensa

asociadas, realizando una comparación entre variedades resistentes y susceptibles

usando herramientas proteómicas. Esta última aproximación permitió encontrar algunos

procesos metabólicos asociados que complementan el panorama de los mecanismos de

defensa que fueron objeto de estudio.

El conocimiento generado en el presente estudio ha ampliado el escenario de los

fenómenos bioquímicos y moleculares asociados a la resistencia en este modelo, no solo

desde el punto de vista de los mecanismos de defensa que se activan en la planta, sino

también en fenómenos de reconocimiento y señalización asociados a dicha respuesta.

29

Considerando la evaluación simultánea de las respuestas en diferentes órganos de la

planta, se realizó un acercamiento a la compleja activación de los mecanismos de

defensa en toda la planta y evidenció la importancia en la regulación espacio-temporal

para la expresión de resistencia del clavel.

Estudios básicos como el que se presenta a continuación, proporcionan el conocimiento

bioquímico y molecular necesario para avanzar en el futuro desarrollo de marcadores de

selección de genotipos resistentes y de nuevas alternativas de control al marchitamiento

vascular, una evidente necesidad si se quiere fortalecer el sector productor de claveles

no solo en Colombia, sino a nivel mundial.

Los resultados de este estudio se presentan a continuación en forma de capítulos

independientes, tratando de abarcar los aspectos más relevantes de las diferentes fases

de la investigación. Considerando que la mayor parte de este estudio siguió la misma

secuencia en la que se presenta, los resultados en cada una de las fases se concatenan

unos con otros y se discuten en la parte final del escrito.

La divulgación parcial de los resultados de la presente investigación a la comunidad

científica, se ha realizado hasta la fecha, mediante la publicación de un artículo en revista

internacional, de un capítulo de libro y de diversas presentaciones en eventos, así como

de la preparación de otros artículos científicos, tal como se describe a continuación:

Articulos científicos

Ardila, H.D., Martínez S.T., Higuera B.L. (2013) Levels of constitutive flavonoid

biosynthetic enzymes in carnation (Dianthus caryophyllus L) cultivars with differential

response to Fusarium oxysporum f. sp. dianthi. Acta physiologiae plantarum. 35: 1233-

1245

Ardila, H.D., Torres, A.M., Martínez S.T., Higuera B.L. (2013) Biochemical and

molecular evidences of class III peroxidases participation in resistance to Fusarium

oxysporum f. sp. dianthi in carnation. Sometido a la revista Plant Physiology and

Biochemistry

Ardila, H.D., Martínez S.T., Higuera B.L. (2013) Flavonoid biosynthesis as a response

associated to resistance in carnation´s roots during infection with Fusarium oxysporum f.

sp. dianthi. En preparación.

30

Capítulo de Libro

Ardila H.D., González-Fernández R., Higuera BL, Redondo I, Martínez ST. Protein

extraction and gel-based separation methods to analyze responses to pathogens in

carnation (Dianthus caryophyllus L) Chapter 39. Methods in Plant Proteomics. 2ª Ed.

Humana Press. New York. 2013

Presentación en eventos científicos

XXIX CONGRESO COLOMBIANO DE FITOPATOLOGIA. Medellin (Colombia). Junio de

2008. Niveles transcripcionales de la enzima chalcona sintasa en clavel (Dianthus

caryophyllus L.) y su relación con los mecanismos de defensa ante la infección con

Fusarium oxysporum f. sp. dianthi raza 2

XXIX CONGRESO LATINOAMERICANO DE QUÍMICA. Cartagena (Colombia). Octubre

de 2010. Parámetros bioquímicos constitutivos en clavel y su correlación con tolerancia al

marchitamiento vascular.

XVI CONGRESO LATINOAMERICANO DE FITOPATOLOGÍA Y XXX CONGRESO

COLOMBIANO DE FITOPATOLOGÍA. Bogotá (Colombia). Agosto de 2011 Inducción

diferencial de peroxidasas en tallos de clavel (Dianthus caryophyllus L.) y su asociación

con la tolerancia al marchitamiento vascular

XVI CONGRESO LATINOAMERICANO DE FITOPATOLOGÍA Y XXX CONGRESO

COLOMBIANO DE FITOPATOLOGÍA. Bogotá (Colombia). Agosto de 2011. Regulación

espacio temporal de la biosíntesis de fenoles y flavonoides durante la interacción clavel

(Dianthus caryophyllus L.) y Fusarium oxysporum f. sp. dianthi

XIV CONGRESO INTERNACIONAL Y XXXIV CONGRESO NACIONAL DE

FITOPATOLOGÍA. Puerto Vallarta (México). Junio de 2012. Biochemical and molecular

parameters associated to flavonoid biosynthesis and its relation to resistance in carnation

(Dianthus caryophyllus L) – Fusarium oxysporum f. sp. dianthi

V CONGRESO DE LA SOCIEDAD ESPAÑOLA DE PROTEÓMICA. Barcelona

(España). Febrero de 2013. Proteomics approach to study early biochemical events in

Carnation (Dianthus caryophyllus L.)-Fusarium oxysporum f. sp. dianthi interaction

31

Objetivo General

Aportar al conocimiento de la regulación espacio-temporal de algunas respuestas

bioquímicas y moleculares relacionadas con resistencia en el modelo huésped-patógeno

clavel - Fusarium oxysporum f. sp. dianthi raza 2.

Objetivos Específicos

Evaluar si existen diferencias significativas en los niveles constitutivos de actividad

enzimática y de transcripción de los genes codificantes para las enzimas Fenilalanina

Amonio Liasa, Chalcona Sintasa y Chalcona Isomerasa, entre variedades de clavel con

diferentes niveles de resistencia en campo a Fusarium oxysporum f. sp. dianthi raza 2.

Comparar los niveles constitutivos con los inducidos, de compuestos fenólicos totales y

de flavonoides totales en variedades de clavel con diferentes niveles de resistencia al

marchitamiento vascular, durante el proceso de infección con Fusarium oxysporum f. sp.

dianthi raza 2.

Determinar si hay inducción de los niveles de actividad enzimática y de transcripción de

los genes codificantes para las enzimas Fenilalanina Amonio Liasa, Chalcona Sintasa y

Chalcona Isomerasa en variedades de clavel con diversos niveles de resistencia, durante

el proceso de infección con Fusarium oxysporum f. sp. dianthi raza 2.

Determinar si existen diferencias significativas en los niveles constitutivos de actividad

antioxidante, así como en los niveles de actividad enzimática para la enzima Peroxidasa,

entre variedades de clavel con diferentes niveles de resistencia a Fusarium oxysporum f.

sp. dianthi raza 2.

Establecer el efecto sobre los niveles de actividad antioxidante y los niveles de actividad

enzimática y de transcripción de los genes codificantes para la enzima peroxidasa, en

variedades de clavel con diversos niveles de resistencia al marchitamiento vascular,

durante el proceso de infección con Fusarium oxysporum f. sp. dianthi raza 2.

Evaluar los cambios en los niveles de otras proteínas asociadas a la resistencia del

clavel, mediante un análisis proteómico comparativo entre variedades de clavel con

diversos niveles de resistencia al marchitamiento vascular, durante el proceso de

infección con Fusarium oxysporum f. sp. dianthi raza 2.

33

1. Estado actual del tema

1.1. Interacción planta-patógeno

Las plantas son organismos complejos que perciben estímulos y se adaptan a los

mismos de manera rápida y eficiente. Esto se debe a que durante su proceso evolutivo

han desarrollado diversos mecanismos que les permite convivir en aquellas condiciones

adversas a las que eventualmente pueden estar expuestas. Dicho proceso se ha dado

por miles de años y ha estado determinado, entre otros mecanismos, por la generación

de nuevos genotipos dentro de una población ya sea por la presencia de genes

polimórficos o por la migración de genes entre organismos (Frank 1992). Factores

abióticos como la temperatura, la húmedad y la disponibilidad de nutrientes (Tapio et al.

2002) y/o factores bióticos, como la presencia de herbívoros, insectos y

microorganismos; son algunos ejemplos de condiciones que pueden afectar de alguna

manera el ciclo normal de vida de las plantas y para las cuales éstas han desarrollado

mecanismos específicos de adaptación, supervivencia y defensa.

Dentro de los factores bióticos, existen tanto microrganismos benéficos con los que

puede establecer una relación de mutua cooperación, como microrganismos con los que

dicha relación simbiótica es inexistente y que por el contrario, interfieren en las funciones

normales de la planta, generando problemas en su desarrollo, y en ciertos casos

ocasionando su muerte. Organismos como las bacterias promotoras de crecimiento

(Plant Growt-Promoting Rhizobacteria PGPR) son un ejemplo de organismos benéficos

que pueden llegar a cumplir un importante papel en la defensa de la planta, considerando

su potencial como inductoras de Resistencia Sistémica Inducida (RSI), un complejo

fenómeno que le permite a la planta estar preparada ante la posible infección de un

amplio espectro de microorganismos fitopatógenos (Albes et al. 2004; Van Loon et al.

1998) A su vez, organismos como algunos virus, bacterias y hongos pueden actuar como

34

patógenos penetrando, infectando y colonizando la planta, llegando a interferir en sus

funciones fisiológicas normales y siendo fatal en muchos de los casos

Las interacciones que se establecen entre las plantas y los microorganismos son tan

antiguas como ellas mismas, por lo que dentro de su co-evolución, las plantas han

desarrollado sistemas sensibles de quimiopercepción que les permite diferenciar las

moléculas propias de las extrañas y dentro de estas últimas, identificar cuales provienen

de potenciales patógenos para, de esta manera, desarrollar en su contra una respuesta

de defensa (Dixon & C. Lamb 1990; Mitchell-Ods & J. Bergelson 2000; Trhall & Burdon

2003). Estos sistemas de percepción permiten que una vez se presente la interacción

entre la planta y el microorganismo, se reconozcan por parte de la planta, ciertas

moléculas relacionadas con la presencia de éste. Aunque dichas moléculas pueden

variar de un modelo planta-patógeno a otro, muchas de ellas se caracterizan por tener

patrones altamente conservados asociados a moléculas fundamentales para el

funcionamiento de los microorganismos. Dichos patrones moleculares son conocidos

como MAMPs (Microbial Associated Molecular Patterns) (Gómez-Gómez 2004;

Muthamilarasan & M. Prasad 2013) y le permiten a la planta reconocer a los potenciales

patógenos en una línea inicial de defensa. Otras moléculas conocidas como efectores,

no son tan conservadas y son específicas en muchos casos del patógeno en estudio.

Dichas moléculas, que fueron desarrolladas por el patógeno para favorecer su

colonización, pueden llegar a ser detectadas por sistemas de reconocimiento específicos

en la planta. (J. D. G. Jones & Dangl 2006; Pritchard & Birch 2011). El reconocimiento de

cualquiera de estas moléculas genera respuestas de defensa en la planta a diferentes

niveles, las cuales tienen como objetivo limitar la infección y evitar la propagación del

patógeno por los tejidos no infectados (J. D. G. Jones & Dangl 2006; Muthamilarasan &

M. Prasad 2013). La distribución ubicua de estos sistemas especializados de

reconocimiento en los tejidos vegetales y su efectividad en contra de la mayoría de los

microorganismos potencialmente patógenos, convierte a la enfermedad en la excepción y

no en la regla.

En aquellos casos en donde el microorganismo patógeno logra evadir o afectar los

sistemas de reconocimiento vegetales, este coloniza la planta afectando sus funciones

normales y genera una sintomatología propia del estado patológico asociado. Entre las

enfermedades infecciosas de mayor impacto económico para la mayoría de las especies

comerciales cultivadas alrededor del mundo, se encuentran las causadas por hongos

35

fitopatógenos (Knogee 1996). Desde el siglo XIX, cuando el botánico Mont de Bary

sugirió que la causa de la devastación de los cultivos que originó la hambruna en Irlanda

para finales de ese siglo, era una enfermedad infecciosa causada por un hongo

fitopatógeno, el estudio de los mecanismos moleculares involucrados durante la infección

y la colonización de plantas por parte de estos organismos, ha sido de particular interés

para la comunidad científica. Diversos estudios han determinado que la capacidad que

tiene un parásito para infectar y causar una enfermedad en una planta, conocida como

patogenicidad (Sacristán & García-Arenal 2008), se expresa de manera selectiva sólo

frente a algunos hospederos y puede estar determinada, entre otras razones, porque no

tienen aquellos factores que son necesarios para el reconocimiento por parte de la

planta, o porque afectan los procesos de señalización posteriores y por tanto la

activación de las respuestas de defensa (Bent & Mackey 2007; Dodds & Rathjen 2010;

Pritchard & Birch 2011). Algunos reportes han mostrado que para ciertos patógenos, la

capacidad para causar enfermedad aumenta bajo ciertas condiciones ambientales

ampliando el rango de hospederos a los que puede parasitar (L. G. Barrett et al. 2009).

Considerando que para que un patógeno logre infectar y colonizar a su huésped, son

necesarios procesos como adhesión a su superficie, penetración de barreras físicas,

liberación de toxinas y eliminación o evasión de las defensas que se inducen durante

este proceso (Shafer 1994), se han realizado diferentes estudios que han evidenciado

algunos de los mecanismos moleculares que le permiten realizar cada una de estas

etapas (Stahl & J. G. Bishop 2000). Es bien sabido que la expresión génica regulada por

el complejo intercambio de señales entre ambos organismos durante la interacción,

involucra la transcripción de muchos genes en el hongo, teniendo en cuenta la

complejidad de las estructuras que desarrolla durante el proceso infectivo (Dixon & C.

Lamb 1990). Aunque hongos biotrofos, hemibiotrofos y necrótrofos no difieren mucho en

las primeras fases de la patogénesis, adhiriéndose, penetrando e infectando la célula

vegetal (Mendgen & M. 2000), los hongos biotrofos y algunos hemibiotrofos desarrollan

estructuras bastante especializadas conocidas como haustorios, los cuales les permiten

tomar nutrientes directamente del citoplasma de la célula vegetal, sin causar su muerte

(Panstruga 2003). En general, las estructuras especializadas que le permiten al patógeno

penetrar el hospedero, en conjunto con enzimas degradadoras de cutina, celulosa y

pectinas, eliminan la primera barrera física que constituye la pared celular y le permiten

entrar en contacto directo con la célula vegetal. La secreción de estas enzimas que

36

degradan la pared celular y la liberación de toxinas, son usadas en el caso de los

patógenos necrótrofos para generar la muerte celular de la célula vegetal, obtener los

nutrientes de la planta y finalmente propagarse en la misma (Mengiste 2012).

Para sortear los mecanismos de defensa vegetales, muchos patógenos han desarrollado

un conjunto de procesos que les permite evitar el reconocimiento de la planta o modificar

a su beneficio los mecanismos de señalización involucrados durante el mismo (Bent &

Mackey 2007). Esto lo realiza mediante la secreción de moléculas conocidas como

efectores, las cuales pueden tener diferentes funciones entre las que se encuentran

afectar las vías de señalización en diferentes puntos, interfiriendo en procesos de

reconocimiento, señalización y defensa (Pritchard & Birch 2011). El continuo intercambio

de señales que involucran la acción de estos efectores y el correcto reconocimiento del

patógeno por la planta, determinaran si ésta será infectada y colonizada de manera

efectiva por el hongo fitopatógeno, o si por el contrario se defenderá desencadenando

una respuesta adecuada (Dodds & Rathjen 2010). Considerando que estos procesos se

ven ampliamente afectados por factores, como el genotipo vegetal implicado, el patógeno

y las condiciones ambientales, el panorama se hace más complejo y obliga a que cada

modelo de interacción planta-patógeno sea estudiado de manera independiente

considerando las condiciones particulares de cada caso.

Con el fin de generar un panorama general de los aspectos centrales que se deben

considerar en el estudio de las respuestas de defensa vegetal, punto central de estudio

en la presente investigación, se presenta a continuación una revisión de algunos

conceptos fundamentales del reconocimiento, señalización y de algunas de las

respuestas bioquímicas, celulares e histopatológicas que componen la expresión de

defensa vegetal. Es importante resaltar que en esta revisión no se pretende tocar todos

los temas asociados a los mismos, sino aquellos que pueden estar asociados al objeto

de estudio en la presente investigación y que pueden ser mencionados por tanto, más

adelante durante el desarrollo del escrito.

1.2. Resistencia y susceptibilidad

El término resistencia ha sido comúnmente usado para describir la habilidad del

hospedero para prevenir o reducir el crecimiento del patógeno (L. G. Barrett et al. 2009),

la cual está generalmente asociada a la inhibición, restricción o aletargamiento del

37

crecimiento de éste, fundamentada en la activación efectiva de una reacción de defensa

multicomponente en la planta resistente (A. Bell 1981). En estos casos se hace

referencia a una interacción hospedero-patógeno incompatible, en donde la enfermedad

no se presenta debido a que el genotipo vegetal es resistente y por lo tanto el patógeno,

avirulento. A su vez, en la interacción compatible la enfermedad se presenta debido al

genotipo susceptible del hospedero y a la virulencia del patógeno. Dentro de este

contexto, el término virulencia hace referencia al grado de daño que causa el patógeno

en el hospedero (propiedad cuantitativa) y que está negativamente relacionado con la

productividad de la planta (Sacristán & García-Arenal 2008). De la misma manera, se ha

definido la patogenicidad como una propiedad cualitativa que describe si el parásito es

capaz o no, de causar la enfermedad en el hospedero. La susceptibilidad se puede

definir entonces, como el fenómeno donde la activación de la respuesta defensiva no se

presenta, o si se presenta, es inefectiva para aletargar o inhibir el crecimiento del

patógeno, conduciendo al establecimiento de un sistema hospedero-patógeno

compatible.

Diversos estudios a nivel genético de las enfermedades de tipo infeccioso en plantas,

han demostrado que en algunos sistemas hospedero-patógeno, la resistencia y

susceptibilidad se pueden explicar con el modelo del gen por gen elicitores-raza

específico, descrito por (Flor 1971). En este modelo, la resistencia o susceptibilidad de

las variedades de una especie hospedera a una raza fisiológica de un patógeno está

determinada por pares correspondientes de genes en el hospedero y en el patógeno. De

esta manera, en estas interacciones “gen por gen” un gen de resistencia presente en una

variedad en particular confiere resistencia contra las razas fisiológicas del patógeno que

expresen el correspondiente gen de avirulencia; dicha incompatibilidad genética se refleja

en muchos modelos planta-patógeno por la HR “Hypersensitive Response”, la cual se

caracteriza por una rápida muerte celular de las primeras células infectadas e involucra la

elaboración de un importante número de defensas inducibles (Dixon & C. Lamb 1990). A

pesar que actualmente este concepto es válido en ciertos modelos planta-patógeno, no

permite explicar modelos en donde al parecer dicha relación gen por gen no se presenta

y se necesita la presencia de más de un par de genes para que se presente la resistencia

en la planta. La resistencia poligénica u horizontal está relacionada con la activación de

mecanismos de defensa no específicos que le permite a la planta superar la infección de

todas las razas de un patógeno particular o en general a un amplio rango de patógenos.

38

Sin embargo, dicha resistencia raza no específica, es cuantitativa y está limitada por las

condiciones ambientales a las cuales puede estar sujeta la planta; su naturaleza

inespecífica determina además, que se relacione con el reconocimiento de moléculas

altamente conservadas asociadas a respuestas poco específicas que generalmente

pueden ser poco efectivas para ciertos patógenos altamente virulentos (Mcdonald &

Linde 2002; Agrios 1995). En general, todos estos fenómenos se enmarcan dentro de

procesos específicos de reconocimiento y señalización que determinan que en la planta

se activen respuestas relacionadas con defensa vegetal y por tanto se presente la

expresión de resistencia. Estos fenómenos se describen a continuación.

1.3. Reconocimiento y señalización

Es bien sabido que las plantas cuentan con un sistema de vigilancia eficaz, que les

permite realizar un reconocimiento a tiempo de la amenaza que constituye el patógeno

para, de esta manera, desarrollar un proceso defensivo específico en su contra (Hahn, M.

G., 1996). Bajo esta premisa, diversos estudios se han desarrollado para establecer

cómo dichos sistemas de reconocimiento se aplican a los diferentes modelos planta

patógeno. Un punto central en el conocimiento actual de los mecanismos de

reconocimiento, hace referencia a que los microorganismos potencialmente patógenos

pueden ser percibidos por una primera línea de receptores que hacen parte del sistema

de reconocimiento no específico, en donde algunos motivos estructurales, altamente

conservados en la mayoría de los microorganismos (MAMPs Microbial Pathogen

Associated Molecular Patterns) pueden ser reconocidos por un sistema sensible de

vigilancia ubicuamente distribuido en el reino vegetal (Gómez-Gómez 2004; Bent &

Mackey 2007; Tameling & Joosten 2008; Faulkner & Robatzek 2012). Este

reconocimiento desencadena una respuesta no específica conocida como PTI (PAMP-

triggered immunity) la cual determina la resistencia basal asociada generalmente a

resistencia no hospedero y en algunos casos a resistencia hospedero (Dodds & Rathjen

2010; Muthamilarasan & M. Prasad 2013). Este fenómeno activa un conjunto de

fenómenos en la planta como el aumento en el flujo de Ca+2 a través de la membrana

plasmática, la síntesis de especies altamente reactivas de oxígeno (EROs) y la

acumulación de carbohidratos como la calosa a nivel de la pared (Muthamilarasan & M.

Prasad 2013). Estas respuestas de defensa no específicas, que se activan ante el

ataque de muchos organismos patógeno de la planta, está determinada por la presencia

39

de los receptores a nivel de membrana (PRPs Patogen-Recognition Receptors), los

cuales además de ser altamente conservados en éstas, son determinantes en estos

procesos de reconocimiento que regulan la inmunidad innata vegetal (Tameling &

Joosten 2008; Dodds & Rathjen 2010).

Sin embargo, muchos microorganismos fitopatógenos dentro de su proceso de

evolución, se han adaptado a estos sistemas de reconocimiento y han desarrollado

factores de virulencia que suprimen partes de este sistema de reconocimiento, facilitando

su infección al hospedero (Bent & Mackey 2007). Dichos factores conocidos como

efectores, permiten que el microorganismo pueda infectar de manera exitosa la planta,

debido principalmente a su capacidad para perturbar de forma determinante los procesos

de defensa de la planta, ya sea a nivel del reconocimiento, en la transducción de la señal

o a nivel de los mecanismos de defensa que se activan debido a su presencia en los

tejidos de la planta (Bent & Mackey 2007; Pritchard & Birch 2011). Sin embargo, dentro

del mismo contexto evolutivo muchas plantas han desarrollado receptores que permiten

reconocer estos factores y generar una respuesta de defensa (Bent & Mackey 2007;

Tameling & Joosten 2008). De esta manera, los efectores que actuaban inicialmente

como factores de virulencia ahora son de avirulencia y permiten un reconocimiento en la

planta del patógeno potencialmente virulento. Estos receptores específicos generalmente

conocidos como proteínas R, (Proteínas que confieren Resistencia) pueden actuar de

diversas maneras, ya sea por interacción directa con el factor avirulento a nivel de la

membrana plasmática o a nivel citoplasmático, o por interacción indirecta reconociendo

algunas moléculas que se generan debido a la presencia del patógeno en la planta (Bent

& Mackey 2007). Este reconocimiento es la base de la ETI (Effector-Triggered Immunity),

la cual está constituida con por un conjunto de respuestas de defensa similares a las

presentadas por la PTI, pero activadas de manera espacio y temporalmente coordinada

diferente, siendo más rápidas y efectivas que esta última (Dodds & Rathjen 2010;

Muthamilarasan & M. Prasad 2013).

A nivel estructural de estas proteínas R, es importante citar que algunos dominios de

receptores del complejo responsable de la inmunidad innata en mamíferos e insectos,

son similares a los encontrados en proteínas R de diferentes especies vegetales

(Borregaard et al. 2000). El reporte de proteínas R tanto en la membrana plasmática

como a nivel del citoplasma, indica que algunas son especialistas en la detección de

ligandos presentes en los espacios intercelulares y otras lo son para el reconocimiento de

40

moléculas que se generan al interior de la célula del hospedero. A la fecha se han

descrito varios dominios funcionales y estructurales en muchos de los genes R

reportados para diferentes fuentes vegetales. Teniendo en cuenta los dominios, se ha

realizado una clasificación de las proteínas R en varios grupos. El grupo predominante

presenta un dominio de unión a nucleótidos (NBS: Nucleotide Binding Site) para la

interacción con ATP ó GTP, así como un dominio de repeticiones de Leucina (LRR:

Leucine Rich-Repeats). Este grupo de proteínas R se encuentra en el citoplasma y tiene

una arquitectura similar a la encontrada en las proteínas encargadas del reconocimiento

de infección intracelular; el dominio NBS es altamente conservado en las proteínas Apaf-

1 de mamíferos, R de plantas y Ced-4 de nemátodos y debido a esto la familia de

proteínas que lo contienen conforman la familia NBS-ARC. (Gerben Van Ooijen et al.

2008). Dentro de las proteínas que presentan los dominios NBS-LRR se encuentran dos

subgrupos, en el primero proteínas con extremo N-terminal presentan un dominio del tipo

coiled coil (CC) y son conocidas como la subfamilia CC-LRR-NBS; el otro subgrupo

presenta un dominio N terminal homólogo al receptor de interleukina y Toll (Toll and

Interleukine Receptor: TIR) y es conocida como la subfamilia TIR-NBS-LRR. Otro Grupo

importante de proteínas R se encuentra anclada a la membrana plasmática, presentando

una hélice transmembranal y dominios LRR extracelulares. Adicionalmente presenta un

dominio del tipo serina-treonina quinasa intracelular que interacciona con otras proteínas

en la transducción del estímulo. La estructura de este tipo de proteínas R sugiere que

hacen parte de un complejo de receptores encargados de reconocer un estímulo

extracelular y desencadenar procesos intracelulares relacionados con la transducción de

la señal (Gómez-Gómez 2004). En general, las diferentes combinaciones de estos

dominios característicos permiten clasificar a las proteínas R en diferentes familias, que

son conservadas en diferentes familias vegetales (Gururani et al. 2012).

Diversos estudios han reportado una mayor complejidad en el reconocimiento del factor

avirulento, por parte de las proteínas R. En dichos casos, la interacción con las proteínas

R en la planta, no se presenta directamente con el producto del gen de avirulencia del

patógeno. Por ejemplo, teniendo en cuenta que diversos genes avr del patógeno

codifican para proteasas, se ha propuesto que la acción de estas enzimas sobre

proteínas del hospedero pueden generar productos de proteólisis que a su vez pueden

tener un efecto elicitor directo al unirse con proteínas R en la planta (Gómez-Gómez

2004). La “hipótesis del guardián” propone que algunas proteínas R vigilan la integridad

41

de proteínas particulares en el hospedero que se pueden ver afectadas por acción de las

proteínas del patógeno. En este modelo la interacción de la proteína R con los

componentes del hospedero modificados por la presencia del patógeno, generarían una

respuesta de defensa específica en su contra (J. D. G. Jones & Dangl 2006; Dodds &

Rathjen 2010). Sin embargo, actualmente se conoce que en muchos casos la resistencia

determinada por el reconocimiento específico de estos efectores por parte de las

proteínas R en la planta, se puede perder debido a que el patógeno puede modificar

estos efectores ya reconocibles o generar nuevos que no son reconocido por las plantas

antes resistentes. Este fenómeno que ha sido relacionado con la pérdida de resistencia o

“quiebre de resistencia”, está determinado por la evolución del microorganismo agresor

(Mcdonald & Linde 2002; Bent & Mackey 2007). Así mismo, la presencia de estos nuevos

efectores en el patógeno, puede generar selección natural en las plantas hospederas,

favoreciendo aquellas que contengan nuevas proteínas R que permitan el reconocimiento

de estos nuevos factores de virulencia. Este modelo en el que se presentan finalmente

tres líneas de defensa vegetal, ha sido descrito por varios autores como el modelo zig-

zag (J. D. G. Jones & Dangl 2006; Dodds & Rathjen 2010)

Tal y como se puede evidenciar en esta revisión, el fenómeno de reconocimiento es

central en el proceso de interacción planta-patógeno. Sin embargo, otro aspecto

fundamental que puede determinar la resistencia vegetal, es la acción de los

mecanismos de defensa que presenta la planta. A continuación, se presentan algunos de

los mecanismos que se abordaron en esta investigación.

1.4. Mecanismos de defensa vegetal

1.4.1. Defensa vegetal pasiva o preexistente

Son aquellos mecanismos que se encuentran de manera preexistente en la planta antes

de la infección con el patógeno. Dentro de estos encontramos barreras estructurales y

químicas que forman la primera línea de defensa que deben sortear los patógenos para

poder infectar exitosamente la planta. Dentro de estos encontramos algunas barreras

físicas, como la cera y la cutícula que cubren las células epidérmicas, la estructura de las

paredes celulares de estas últimas y en general los tejidos protegidos por paredes

celulares gruesas que obstaculizan el avance del patógeno (Agrios 1995). Además,

42

encontramos ciertas sustancias químicas que forman reservorios estratégicamente

localizados, los cuales pueden cumplir un papel determinante en ciertos sistemas

hospedero-patógeno. Dentro de estas se destacan, ciertos compuestos con actividad

fungitóxica secretados a nivel radicular por algunas especies vegetales y algunos

compuestos antifúngicos entre los que se encuentran varios compuestos fenólicos y

algunos taninos, denominados inhibidores preinfeccionales o fitoanticipinas (González-

Lamothe et al. 2009; Agrios 1995; Osbourn 1996).

Fitoanticipinas

Las plantas dentro de su proceso evolutivo han desarrollado la capacidad de sintetizar

una alta diversidad de compuestos orgánicos, conocidos como metabolitos secundarios,

los cuales no son necesarios para el funcionamiento celular y le otorgan a la planta

ventajas adaptativas que generalmente determinan su supervivencia en un ambiente

cambiante y muchas veces adverso. Dentro de los estudios realizados a la fecha sobre

estos compuestos se ha encontrado que muchos de ellos pueden presentar actividad

antimicrobiana directa sobre microorganismos patógenos y por ello han sido objeto de

investigación en diversos modelos hospedero-patógeno (Goyal et al. 2012). Muchos de

estos compuestos antimicrobianos que se encuentran a nivel constitutivo, se presentan

como formas activas listas para actuar sobre el organismo patógeno o como precursores

que liberan las moléculas antimicrobianas una vez se presenta la interacción con el

microorganismo potencialmente patógeno. En este último grupo se destacan por ejemplo,

los compuestos conocidos como cianogénicos, los cuales son precursores de ácido

cianhídrico en ciertas plantas cuando son atacadas por insectos u hongos fitopatógenos

(Vanetten et al. 2001; Osbourn 1996; Zagrobelny et al. 2008)

Por otro lado, es bien sabido que estos compuestos se encuentran compartimentalizados

en las vacuolas de células especializadas, localizadas estratégicamente en las capas

externas de los órganos de la planta (Osbourn 1996; Beckman 2000). De esta manera la

extensión del daño causado durante la infección, determina la liberación de estos

compuestos de la planta y su acción sobre el patógeno. Este es el caso de los patógenos

biotrofos, los cuales al evitar el daño celular, generalmente no ocasionan la liberación de

las fitoanticipinas durante el evento de la interacción. Caso contrario sucede con

organismos necrotrofos o hemibiotrofos en donde el daño celular ocasionado por la

infección, libera los compuestos constitutivos involucrados con defensa (Osbourn 1996).

43

El efecto que sobre el metabolismo del patógeno causan las fitoanticipinas, es bastante

diverso y depende del modelo planta-patógeno involucrado. Por ejemplo, en el modelo

Tomate- Fusarium oxsysporum f. sp. lycopersici, la inducción de muerte celular en el

patógeno debida a la acción de la α-tomatina, fitoanticipina presente en la planta, ha sido

relacionada con muerte celular programada con afección del metabolismo oxidativo y

depolarización del potencial de membrana a nivel de la mitocondria (S.-I. Ito et al. 2007).

En la actualidad existen un número importante de reportes en diferentes especies

vegetales, en los que se han encontrado fitoanticipinas efectivas para muchos

microorganismos fitopatógenos. Con el fin de dar un panorama general de aquellos

estudios que involucran patógenos del tipo fúngico, y sin buscar mostrar todos los

reportes que a la fecha se han realizado, se citan en la tabla No. 1, algunas de las

fitoanticipinas que han sido caracterizadas y para las que ha sido establecido el efecto

sobre el fitopatógeno.

A pesar de la presencia de este tipo de compuestos a nivel constitutivo, ciertos

patógenos pueden lograr infectar los tejidos del hospedero, gracias a la presencia de

enzimas que les permite detoxificar dichos compuestos y generar sustancias que no

afectan su metabolismo. La presencia de este tipo de mecanismos son determinantes de

virulencia en muchos modelos planta-patógeno (P. Wang et al. 1999; Sandrock &

VanEtten 2001; Vanetten et al. 2001; Hammerschmidt 2010).

Tabla No. 1. Algunas fitoanticipinas encontradas en plantas de diversas especies vegetales

Compuesto Planta hospedera Patógeno Referencias

Saponinas

(Avenacina A1, B1, A-

2 y B2)

Avena (Avena sp.) Gaeumannomyces

graminis (Turner 1960)

Saponina

(α-Tomatina)

Tomate (Licopersicum

esculentum)

Fusarium oxsysporum f.

sp. lycopersici (S.-I. Ito et al. 2007)

44

Allicina(S-alil-L-cistein

sulfóxido)

Allium sativum L.

Hongos de diferentes

especies (Curtis et al. 2004)

Proantocianidinas

(dímeros de Flavan 3-

ol y oligómeros

correspondientes)

Catequinas

Fresa

Fragaria ananassa

Botrytis cinerea,

Cladosporium

cladosporioides,

(Terry et al. 2004)

Glicósidos de

flavonoides, diversos

compuestos fenólicos

(Detalles en la tabla

No.4 )

Clavel (Dianthus

caryophyllus)

Fusarium oxysporum f.

sp. dianthi

(Higuera 2001; Curir et al.

2001; Curir et al. 2003)

Centelloides

Saponinas

triterpenoides

Centella asiatica Amplio especto de

patógenos (James & Dubery 2009)

Glucosinolatos

indolicos

4-metil-sulfinil butil

glucosinolato

Arabidopsis thaliana Phytophthora brassicae (Schlaeppi et al. 2010)

Cumarinas 6-metoxi

melleina

Zanahoria (Daucus

carota) Alternaria Dauci (Lecomte et al. 2012)

1.4.2. Defensa vegetal dinámica o inducible

Una vez la planta reconoce la presencia de un microorganismo potencialmente patógeno,

no se comporta como huésped pasivo, sino al contrario, la planta induce un conjunto de

45

mecanismos que le permite responder y defenderse de dicha amenaza. Estas defensas

se denominan activas porque son en respuesta a un patógeno invasor y requieren del

metabolismo del hospedero. Las células de la mayoría de los órganos vegetales parecen

ser capaces de mostrar respuesta de defensa activa, característica de las interacciones

incompatibles, asociadas con la resistencia a la enfermedad (Hutcheson, S 1998) Una

vez se lleva a cabo el proceso de reconocimiento y de transducción de la señal, se

presentan los cambios a nivel bioquímico, celular e histológico que componen dicha

respuesta activa. Dentro de dichos mecanismos de defensa activa vegetal se encuentran

las modificaciones de pared celular implicadas en su fortalecimiento durante el evento de

la interacción, como la lignificación y la deposición de polisacáridos (Huckelhoven 2007),

la síntesis de proteínas relacionadas con patogénesis (PRs Pathogen Related) (Van

Loon, Rep & Pieterse, 2006; Sels, Mathys, Coninck, Cammue, & Bolle, 2008) y la

estimulación del metabolismo secundario para la síntesis de fitoalexinas (Harborne 1999;

Grayer & Kokubun 2001; González-Lamothe et al. 2009; Ahuja et al. 2012)

Considerando que este último es objeto de particular atención en la presente

investigación, a continuación se presentan algunos de los aspectos más relevantes

relacionados con el mismo.

Fitoalexinas

Las fitoalexinas han sido definidas como: “compuestos de bajo peso molecular con

actividad antimicrobiana que son sintetizados y acumulados por las células de la planta

después de la exposición a microorganismos” (Paxton 1981). Los compuestos que son

clasificados como fitoalexinas deben ser sintetizados “de novo” y ser acumulados a

concentraciones antimicrobianas en el sitio de infección, requiriendo una expresión

temprana para las diferentes enzimas involucradas en su biosíntesis. En ciertos casos

es difícil determinar si un compuesto relacionado con defensa es constitutivo o inducido,

ya que ciertas fitoalexinas se pueden encontrar a niveles indetectables a nivel

constitutivo, pero aumentar su concentración de manera importante cuando se presenta

la interacción con el patógeno. (Grayer & Kokubun 2001).

Desde que en el año 1960 fue aislada y caracterizada químicamente la primera

fitoalexina, la (+)- pisatina en tejidos de Pisum sativum (Cruickshank & Perrin 1960), se

ha encontrado que la mayoría de fitoalexinas presentan actividad antimicrobiana sobre

más de un tipo de microorganismos patógenos. Sin embargo, esta inespecificidad de

acción contrasta con la alta especificidad que presentan las rutas involucradas en la

46

biosíntesis de dichos metabolitos, la cual se evidencia cuando se evalúa la naturaleza

química de dichos compuestos y se encuentra que muchas veces está relacionada con la

familia de la planta como se presenta en la tabla No. 2 (Harborne 1999; Ahuja et al.

2012). Esto a su vez ha permitido que estos compuestos sean usados como marcadores

taxonómicos (Hammerschmidt 1999). En este aspecto, es importante citar que

actualmente se han reportado un gran número de fitoalexinas, con estructuras químicas

relacionadas en una misma familia o en un mismo género de plantas (Ahuja et al. 2012).

Particular atención ha generado la obtención de cultivares transgénicos en la producción

de fitoalexinas para aumentar la resistencia a patógenos, considerando los problemas y

limitaciones que tienen en este momento los programas de mejoramiento por métodos

tradicionales (Großkinsky et al. 2012).

Tabla No. 2. Presencia de algunas fitoalexinas reportadas en diversas familias de plantas

Familia Tipo de molécula Ejemplo específico Referencias

Caryophyllaceae

Acidos antranílicos Diantalexinas en

Clavel.

(Niemann et al. 1992;

Curir et al. 2005)

Cruciferae

Alcaloides Indólicos Caulexinas A, B. C. en

Coliflor (Pedras et al. 2003)

Ehrhartoideae

Diterpenos Momilactonas y

oryzalexinas en Arroz (R. J. Peters 2006)

Leguminosae

Isoflavonoides Faseolina en Frijol

(Dakora & Phillips 1996)

Solanaceae

Sesquiterpenos Risitina en Papa (Engstrom 1998)

Vitaceae Estilbenos Resveratrol en uvas (Calderon et al. 1993)

47

Un aspecto central que debe ser considerado cuando se estudian las fitoalexinas y su

papel en defensa de las plantas, está relacionado con la capacidad que presentan

algunos patógenos para detoxificarlas una vez éstos han infectado los tejidos de la

planta. En este aspecto, son muchos los reportes en los que enzimas secretadas por el

patógeno degradan estos compuestos y favorecen su virulencia en la infección (Vanetten

et al. 2001; Pedras & Ahiahonu 2005)

1.5. Metabolismo secundario y defensa vegetal

Es bien sabido que el metabolismo secundario en plantas comprende una enorme

diversidad de compuestos y enzimas y un amplio espectro de procesos relacionados con

la regulación de genes y fenómenos de transporte celular. Debido a esto su papel en los

mecanismos de defensa vegetal ha llamado la atención, desde hace varias décadas, la

comunidad científica ha generado muchas investigaciones enfocadas a su estudio.

Actualmente se conoce que existe una alta diversidad de compuestos que cumplen

papeles determinantes en los mecanismos de defensa vegetal, ya sea por su papel como

fitoanticipinas, fitoalexinas o moléculas señal (Harborne 1999; Grayer & Kokubun 2001;

González-Lamothe et al. 2009).

La estimulación de diversas rutas biosintéticas del metabolismo secundario en plantas

ante la presencia de ciertos microorganismos fitopatógenos, ha sido estudiada en

muchas especies vegetales y es claro que existe una alta diversidad estructural para los

compuestos que son sintetizados durante estos procesos de interacción planta-patógeno

(Hammerschmidt 1999; Bonanomi et al. 2009). Tal diversidad de compuestos ha sido

relacionada, por estudios en metabolómica, con el papel poco específico que al parecer

pueden cumplir ciertas enzimas del metabolismo secundario. Esta propuesta contrasta

con el papel altamente específico que se le ha otorgado a las enzimas, pero permite

explicar el por qué de la existencia de un número tan importante de metabolitos en

plantas, a pesar de la existencia de un número al parecer limitado de enzimas

relacionadas con biosíntesis (Schwab 2003; Kroymann 2011). Muchas de estas enzimas

se encuentran asociadas generalmente en complejos multi-enzimáticos que permiten que

la biosíntesis se lleve a cabo rápidamente en cada uno de sus pasos secuenciales, sin la

necesidad de realizar transporte de los intermediarios a través del citoplasma (Saslowsky

& Winkel-shirley 2001). Este modelo también propone que en muchos casos dicha

48

biosíntesis se realiza cerca del retículo endoplasmático, para que los metabolitos

sintetizados sean translocados para su ubicación celular o extracelular específica. Dichos

procesos involucran cambios en los potenciales de las membranas internas, afección en

el tráfico vesicular, acción de transportadores ABC y en general procesos relacionados

con la exportación de componentes al apoplasto y vacuolas (Agati et al. 2012; J. Zhao &

Dixon 2010), en aquellos tejidos en donde se expresa la respuesta de defensa por la

presencia de patógenos (Huckelhoven 2007). Muchos de los estudios que a la fecha se

han realizado sobre el metabolismo secundario y su relación con defensa vegetal, se han

llevado a cabo sobre la ruta fenilpropanoide. Considerando el papel que puede cumplir

esta ruta en la generación de algunos metabolitos de defensa en el clavel, a continuación

se presentan algunos aspectos de la misma.

1.5.1. Ruta fenilpropanoide

La ruta fenilpropanoide genera un diverso conjunto de compuestos de naturaleza

fenólica, que participan en procesos metabólicos claves para la planta. Todos los

compuestos generados por esta ruta son derivados del ácido cinámico, el cual se forma a

partir de fenilalanina por la enzima fenilalanina amonio liasa, conocida como PAL, por las

siglas de su nombre en inglés (Phenylalanine Ammonia-Lyase). Esta enzima permite

transformar la fenilalanina, un compuesto proveniente del metabolismo primario, en ácido

cinámico, un precursor que se diversifica en un amplio rango de compuestos en plantas

(N. G. Lewis & Yakamoto 1990; Hyun et al. 2011). A partir de este compuesto, por

ejemplo, se generan por reacciones de hidroxilación, metilación, deshidratación, entre

otras, los ácidos p-cumárico, cafeico, ferúlico y sinápico. Estos metabolitos a su vez

participan en diferentes procesos como la lignificación, fortalecimiento de paredes

celulares por formación de ésteres con carbohidratos de ésta y en general la biosíntesis

de otros compuestos más complejos (Dixon & N. L. Paiva 1995; Vogt 2010)

Considerando el papel central que muchos de estos compuestos juegan en la adaptación

de la planta bajo condiciones de estrés, se le ha otorgado a esta ruta biosintética un

papel determinante para la supervivencia vegetal. Dicho papel está relacionado con

condiciones de estrés como: la deficiencia de algunos nutrientes, las bajas temperaturas,

la exposición a luz U.V, entre otros (Dixon & N. L. Paiva 1995; Dixon et al. 2002; Vogt

2010).

49

Dentro de los productos de mayor interés para la ruta fenilpropanoide se destacan

aquellos que se generan con la participación de compuestos provenientes de otras rutas,

como es el caso de los flavonoides. En la ruta de los flavonoides, el p-cumaroil coA

proveniente de la ruta fenilpropanoide, reacciona con malonilCoA, proveniente del

metabolismo primario, para generar la naringerina, gracias a la acción conjunta de las

enzimas Chalcona Sintasa y Chalcona Isomerasa (Harborne et al. 1975). A partir de este

punto, la diversificación de la naringerina gracias a la acción de un importante número de

enzimas, genera una alta diversidad de compuestos con múltiples funciones en la planta,

entre los cuales se destacan las flavononas, los flavonoles, las flavonas, las

proantocianidinas y las antocianinas (Figura No. 1). Muchas de las enzimas involucradas

en esta ruta han sido purificadas, y sus genes han sido caracterizados en varias especies

vegetales (T. Yamaguchi et al. 1999; Boddu et al. 2004; J. R. M. Almeida et al. 2007;

Bellés et al. 2008; Y. Y. Han et al. 2009; K. Saito et al. 2013). Se ha encontrado que, a

pesar que la mayoría de dichas enzimas se encuentran codificadas por familias de genes

regulados de manera diferencial en función del tejido vegetal en estudio (Naoumkina et

al. 2010), se presentan factores de transcripción comunes que regulan su expresión

génica (Dixon et al. 2002; Vom Endt et al. 2002; Agati et al. 2012; K. Saito et al. 2013).

Uno de los aspectos de mayor interés para el estudio de los flavonoides en plantas, es el

de su aplicación en campos como la farmacéutica, los alimentos y la misma fitopatología.

De esta manera se han creado un importante número de líneas de investigación que han

estudiado sus diferentes aplicaciones y ha generado interés por los mecanismos

bioquímicos y moleculares que determinan la biosíntesis de estos compuestos, tanto a

nivel de su estimulación, usando diferentes técnicas de elicitación (Vasconsuelo & Boland

2007; Troncoso-Rojas et al. 2012) o mediante sobreexpresión generando genotipos

recombinantes que presentan altos niveles constitutivos de estos compuestos (Schijlen et

al. 2004; S. Wu & Chappell 2008; Rahnama et al. 2012).

50

1Figura No. 1. Representación esquemática de la ruta fenil propanoide y la vía de los flavonoides. Se muestran las enzimas que actúan en cada uno de los pasos. 4CL, p-cumarato:CoA ligasa; ANR, Antocianidin Reductasa; ANS, Antocianidin Sintasa; C3H, p-cumaroil-CoA 3-hidroxilasa, C4H, Cinamato 4-hidroxilasa; CHI, Chalcona Isomerasa; CHS, Chalcona Sintasa; DFR, Dihidroflavonol 4-reductasa; FGTs, Glicosiltranseferasas para flavonoides, FHT, Flavanona 3β-hidroxilasa; FLS, Flavonol Sintasa; FNS, Flavanona Sintasa; LAR, Leucoantocianidin Reductasa; PAL, Fenilalanina Amonio Liasa.

PAL

CHS CHS

CHI

51

1.5.2. Flavonoides

Los flavonoides son compuestos polifenólicos, ubicuamente distribuidos en plantas, que

cumplen con funciones muy importantes, generalmente relacionadas con procesos como

la atracción de polinizadores, la protección contra la luz ultravioleta, la señalización

celular y la interacción con otros organismos como los insectos y microrganismos

benéficos o patógenicos (Harborne & Williams 2000; L. J. Shaw et al. 2006). La

estructura básica de los flavonoides es el núcleo flavano que consta de 15 átomos

de carbono en tres anillos C6-C3-C6 (difenilpropano) que son nombrados A, B y C

(figura No. 2). Las diferentes clases de flavonoides difieren en su nivel de oxidación

y su patrón de sustitución sobre oxígeno y carbono en los anillos A y B. Las clases

más comunes son flavonoles, flavonas, flavanonas, catequinas, antocianidinas,

isoflavonas, dihidroflavonoles, proantocianidinas y chalconas

O

A

B

C

4'

1'

2'

104

3

2

1

3'

5'

6'

8

7

6

5

9

Figura 6. Estructura del Flavano (2 fenilbenzopirano)

2Figura No. 2. Estructura del flavano (2-fenilbenzopirano)

3

Esta alta diversidad estructural está determinada por la presencia de diferentes enzimas

que actúan modificando la estructura de estos compuestos y aumentando la diversidad

en el grupo. Enzimas del tipo sintasas, metiltransferasas, isomerasas, oxidoreductasas e

hidroxilasas, se han encontrado como las enzimas que participan en la biosíntesis de

flavonoides en plantas (Bernd Weisshaar & Jenkins 1998; K. Saito et al. 2013). Tal y

como se presenta en la figura No 1, son muchas las enzimas que participan en la

diversificación de los flavonoides. Diferentes estudios han propuesto que al parecer,

enzimas como fenilalanina amonio liasa (PAL), chalcona sintasa (CHS) y chalcona

isomerasa (CHI), tienen un papel central en la regulación de estas vías biosintéticas. En

este punto se destaca la relación que existe entre los niveles de flavonoides y de

actividad para estas enzimas lo cual ha permitido postular que, al modificar los niveles de

éstas, se afectan los niveles de flavonoides y también por ende, los efectos que estos

últimos presentan en la planta (Winkel-Shirley 2002; Schijlen et al. 2006; Lorenc-Kukuła

52

et al. 2007). Dicho papel regulador al parecer está relacionado con la naturaleza de la

reacción que catalizan y de los factores de transcripción que regulan su expresión génica

(Vom Endt et al. 2002; Dubos et al. 2010; Agati et al. 2012).

Papel de los flavonoides en defensa vegetal

Diferentes estudios han encontrado que los flavonoides hacen parte de la respuesta de

defensa activa que presentan las plantas ante el ataque fitopatógenos (Pedras et al.

2003; McNally et al. 2003; Boddu et al. 2004; Steinkellner et al. 2007; Mikulič Petkovšek

et al. 2011; H. G. Kim et al. 2011; Großkinsky et al. 2012; Kröner et al. 2012). En muchos

de estos casos, estos compuestos se clasifican como fitoalexinas propiamente,

considerando que no se encuentran a nivel constitutivo o no son detectados con las

técnicas usadas. En otros casos, dichos compuestos se pueden encontrar a nivel

constitutivo y presentar un aumento en sus niveles pos infección, siendo considerados

compuestos similares a fitoalexinas. La clasificación formal de un flavonoide como

fitoalexina, requiere que se presente activación de novo de su biosíntesis generalmente

asociada a la expresión de genes durante el proceso infectivo (Treutter 2006; González-

Lamothe et al. 2009). En general, se ha encontrado que la diversidad estructural de los

flavonoides involucrados en este tipo de respuestas activas, es alta e incluye en muchos

de los casos, diferentes tipos de flavonoides glicosilados (tabla No. 3). Considerando su

ubicua distribución en plantas y su versatilidad funcional, se ha propuesto que la

participación de estos compuestos en resistencia puede estar asociada a diferentes

factores entre los que se destacan su actividad antimicrobiana y propiedades

antioxidantes (Treutter 2006; Weston & Mathesius 2013). Con respecto a sus

propiedades antimicrobianas, se ha descrito que está asociada con un efecto al proceso

de germinación de estructuras de latencia y con la inhibición directa del crecimiento por la

acción sobre la síntesis de ácidos nucleicos en el proceso de replicación (Cushnie & A. J.

Lamb 2011).

En otros casos se ha propuesto que la participación de los flavonoides en resistencia

puede tambien estar asociada a su capacidad antioxidante asociada a la regulación de

los niveles de especies altamente oxidantes (Especies Reactivas de Oxígeno “ERO” y

Especies Reactivas de Nitrógeno “ERN”) (Garcia-Limones et al. 2003; Lorenc-Kukuła et

al. 2007; Polkowska-Kowalczyk et al. 2007; Sá et al. 2009; Agati et al. 2012). Estas

especies son generadas como parte del proceso de defensa, cumpliendo diversas

53

funciones relacionadas con señalización. Sin embargo, pueden afectar proteínas vitales

para la célula vegetal si no se hace una regulación estricta de los niveles de los mismos

(Hammerschmidt 2005). De esta manera, la misma planta controla los procesos que

aunque hacen parte de la respuesta de defensa, pueden afectar algunas funciones

necesarias para su funcionamiento una vez se ha superado la infección con el patógeno

(Agati et al. 2012). El modo de acción particular o su papel como fitoanticipinas o

fitoalexinas, dependen de factores como la especie vegetal y el patógeno involucrado

(Treutter 2006)

Tabla No. 3 Ejemplo de algunos flavonoides involucrados en respuestas de defensa activa

Especie

vegetal Tipo de molécula Metabolito específico Referencias

Pinus strobus Flavanona (2S)- Pinocembrina (Hanawa et al.

2001)

Oryza sativa

Flavanona Sakuranetina (Kodama et al.

1992)

Sorghum spp Antocianidinas

Epigenidina y Luteolinidina

(Boddu et al. 2004)

Glycine max

Isoflavonoides

Faseolina

(Dakora & Phillips

1996)

Thlaspi

arvense C- glicósido de flavona

Isovitexin ( apigenina- 6-C--

glucopiranosido )

(Pedras et al. 2003)

Cucumis

sativus L.

C-glicósido de flavonoide

Cucumerina A

(McNally et al.

2003)

Citrus unshiu Flavanonas, flavonas y O-

glicósidos de flavonas

Naringina, hesperidina, poncirina,

Isosinensetina, hexametoxiflavona,

(H. G. Kim et al.

2011)

54

Solanum

tuberosum O- Glicósidos Rutina y nicotiflorina (Kröner et al. 2012)

V.

corymbosum O- Glicósidos Quercetina-3-O-rhamnosido (Miles et al. 2013)

Juglans nigra L O- Glicósidos Quercetina- 3-O- rhamnosido (Mikulič Petkovšek

et al. 2011)

Vitis vinífera O- Glicósido Quercetina- 3-O- glicósido (Ali et al. 2012)

Enzimas involucradas en la biosíntesis de flavonoides

Dentro del variado conjunto de enzimas que participan en la biosíntesis de flavonoides

(figura No. 1), se ha citado que enzimas como la fenilalanina amonio Liasa (PAL), la 4-

cumarato hidroxilasa (4CH), la chalcona sintasa (CHS), y la Chalcona Isomerasa (CHI)

son claves para la acumulación de estos compuestos en plantas (Dixon et al. 2002;

Schijlen et al. 2004; Naoumkina et al. 2010). A continuación se presentan algunos

aspectos claves de las enzimas que son objeto de estudio en esta investigación, las

enzimas PAL, CHS y CHI:

PAL: FENILALANINA AMONIO LIASA (E. C. 4.3.1.5)

La enzima Fenilalanina Amonio Liasa (4.3.1.5) cataliza la primera reacción de la ruta

fenilpropanoide, que consiste en la formación de acido cinámico a partir de fenilalanina

(figura No. 1). Desde hace ya algunas décadas se ha propuesto que esta enzima juega

un papel clave en la regulación de esta ruta del metabolismo secundario (Bate et al.

1994; Hyun et al. 2011). La PAL en plantas vasculares se encuentra codificada en el

núcleo por un conjunto de genes que pueden presentar diferentes patrones de expresión

de acuerdo con la parte de la planta y las condiciones medioambientales en que se

encuentre expuesta (Y. Y. Kao et al. 2002; Cochrane et al. 2004).

Considerando que la PAL cataliza el primer paso de la ruta fenilpropanoide, desde hace

ya algunas décadas se ha propuesto que esta enzima juega un papel clave en su

regulación (Bate et al. 1994). Se ha determinado que en monocotiledóneas también

puede tomar una vía alterna usando L-Tirosina como sustrato para generar ácido p-

cumárico (Rosler et al. 1997). Se encuentra en la fracción citoplasmática de la célula,

generando metabolitos que son translocados vía retículo endoplasmático hacia el

55

apoplasto, en donde participan en lignificación y fortalecimiento de las paredes celulares

(Sato et al. 2004; J. Zhao & Dixon 2010).

Los estudios clásicos realizados con Arabidopsis thaliana y Nicotiana tabacum,

permitieron encontrar algunos de los mecanismos moleculares que estaban involucrados

en la regulación de los genes codificantes para estas enzimas (Kawamata et al. 1997).

En dichas investigaciones con plantas de tabaco transformadas que presentaban

diferente formas de la proteína quimérica de fusión entre el promotor PSPAL1 y el gen de

la Beta- Glucuronidasa (GUS), se encontró que la expresión de estas proteínas está

regulada por el desarrollo de la planta, así como por estímulos externos. Dentro de estos

últimos se destacan principalmente factores medioambientales y la acción de

microorganismos fitopatógenos. Estudios más recientes, han estado enfocados a

determinar cuáles son los factores que están involucrados en la regulación de estos

genes y se ha encontrado que existen factores comunes de transcripción para muchos

de ellos, lo que indica que su transcripción se presenta de manera coordinada luego de

un estímulo externo (Vom Endt et al. 2002; Dubos et al. 2010).

CHS: CHALCONA SINTASA (E.C.2.3.1.74)

La chalcona sintasa (E.C.2.3.1.74), es una enzima homodimérica que cataliza la

formación del anillo aromático A del esqueleto flavonoide por condensaciones

secuenciales de tres moléculas de malonil-CoA, produciendo la 2´,4,4´,6´,

tetrahidroxichalcona. Esta condensación se asemeja a la que se presenta en el

metabolismo primario durante la biosíntesis de ácidos grasos (Michael B. Austin &

Joseph P. Noel 2003). La enzima fue descrita por primera vez en la década de los

setenta, cuando se determinó, gracias al uso de sustratos marcados isotópicamente, que

extractos obtenidos de células en suspensión, eran capaces de realizar la síntesis de

naringerina (Kreuzaler & Hahlbrock 1975). Esta enzima se encuentra ampliamente

distribuida en tejidos vegetales, de plantas gimnospermas y angiospermas, siendo

purificada y caracterizada de muchas fuentes vegetales (Michael B. Austin & Joseph P.

Noel 2003; J-L Ferrer et al. 2008). Su importancia en la biosíntesis de flavonoides le ha

otorgado un papel protagónico en muchos procesos fisiológicos, entre los que se

encuentran la resistencia a patógenos (Dao et al. 2011).

Los genes que codifican para estas proteínas se encuentran distribuidos en familias para

algunas de las plantas estudiadas a la fecha (Koes & Spelt 1989; M. Ito et al. 1997). La

56

regulación de la expresión de estos genes está al parecer controlada de manera

diferencial en los diferentes tejidos de la planta (Claudot et al. 1997), por el control de

algunos factores de transcripción altamente conservados en plantas, de acuerdo con

estudios realizados en maíz y en Arabidopsis thaliana (Vom Endt et al. 2002). En dichos

estudios, se ha encontrado que la expresión de varios de los genes que codifican

enzimas involucradas en el metabolismo fenilpropanoide, incluyendo los de la enzima

CHS, están regulados por el mismo conjunto de factores de transcripción (Vom Endt et

al. 2002). Dichos factores corresponden a proteínas que forman parte de dos distintas

familias de factores de transcripción, que presentan homología a la proteína codificada

por el proto-oncogen c-MYB y la proteína básica-Helix-Loop-Helix (bHLH) codificada por

el proto-onco gen c-MYC. Otros niveles de regulación postranscripcional como la

inhibición por producto, RNA interferente o activación de enzimas inactivas se pueden

presentar en ciertas especies vegetales (Kasai et al. 2004; Dao et al. 2011).

CHI: CHALCONA ISOMERASA (E.C. 5.5.1.6)

La enzima chalcona isomerasa (E.C. 5.5.1.6) cataliza la ciclización intramolecular de la

chalcona sintetizada por la chalcona sintasa (CHS), para formar de manera específica la

(2S)-Naringerina, compuesto central para la generación de otros flavonoides más

complejos. Aunque es bien sabido que dicha reacción se presenta de manera

espontánea, cuando la isomerización se presenta se obtiene una mezcla de isómeros

correspondientes a los compuestos (2S)-Naringenina y (2R)-Naringenina. Además, de

permitir la isomerización enantioespecífica, la acción de la enzima puede aumentar la

velocidad de reacción a casi 100000 veces comparando con la isomerización espontánea

(Jez et al. 2002). Mutantes que presenten compromisos en la actividad catalítica de esta

enzima, presentan disminuciones muy importantes en los niveles de flavonoides (Reuber

et al. 1997; Hong et al. 2012), mientras que la sobreexpresión genera un aumento en los

niveles de estos mismos compuestos (F.-X. Li et al. 2006; N. Il Park et al. 2011). Se ha

establecido el mecanismo químico de la isomerización y se han identificado los

aminoácidos del sitio activo que están comprometidos con la catálisis enzimática, así

como las fuerzas intermoleculares que permiten la estabilización del complejo enzima-

sustrato (Jez & Joseph P Noel 2002).

57

La chalcona isomerasa está constituida por unidades monómericas de aproximadamente

220 residuos y se ha aislado de diversas especies vegetales. Los diversos estudios que

se han llevado a cabo con el fin de evaluar a nivel conformacional la estructura de la

enzima, han permitido establecer que presenta forma de “pinzas” que toman el sustrato

de manera específica y lo acomodan para llevar a cabo la reacción enantioselectiva,

gracias a la presencia de diferentes α-hélices y hojas β-plegadas que favorecen dicha

interacción (Jez et al. 2002). Diferentes investigaciones recientes a nivel bioquímico y

molecular han estado enfocadas a profundizar sobre su papel en plantas y se ha

determinado que pueden presentar mecanismos de regulación semejantes a los que han

sido reportado para otras enzimas de la ruta (Czemmel et al. 2012; W. Wang et al. 2012).

1.6. Actividad antioxidante

Las reacciones de óxido reducción tienen una amplia distribución en la naturaleza y

suceden tanto en el reino animal como en el vegetal, durante el proceso de respiración

celular mientras se consume oxígeno, y se genera ATP, produciendo dióxido de carbono

y agua. Sin embargo, durante esta transformación normal se producen también otras

moléculas residuales, las especies reactivas del oxígeno (EROS) (Céspedes & Sánchez

2000; Hansberg 2002). Dichas especies participan en diversos procesos de señalización

que tienen como objetivo, la modulación de la respuesta al estrés especifico al cual está

sometida la planta (G Paul Bolwell & Daudi 2009; Grant & Loake 2000; Mendoza 2011;

Faulkner & Robatzek 2012; Barna et al. 2012).

Las EROS son átomos o moléculas, dotadas de un electrón desapareado en un nivel

energético superior y por tanto con propiedades paramagnéticas que las hace inestables

y altamente reactivas. Atacan los enlaces de proteínas de los tejidos, los fosfolípidos

poliinsaturados de las membranas celulares, carbohidratos y los ácidos nucleicos de las

células. Al actuar, se activa una reacción en cadena que podría incluso llevar a la muerte

de la célula (Hansberg, 2002). Entre las EROS cabe destacar los radicales: ión

superóxido (O2.-), radical hidroxilo (˙OH), alcoxilo (RO˙), peroxilo (ROO˙) y óxido de

nitrógeno (NO˙) y las no radicales: peróxido de hidrógeno (H2O2) y peroxinitrito (ONOO-)

(Hansberg 2002).

Es importante recordar que la producción de especies altamente oxidadas no es un

fenómeno exclusivo de las condiciones de estrés, de hecho la producción de EROs y

58

nitrógeno (Especies reactivas de nitrógeno ERN) por parte de ciertas reacciones de

oxido-reducción del metabolismo, se presenta de manera normal a nivel celular ante

fenómenos como el transporte de electrones en la cadena respiratoria, la auto-oxidación

de aminoácidos, proteínas, lípidos y ácidos nucleicos. Sin embargo, la célula vegetal, así

como en general las células de los organismos aerobios, cuentan con sistemas de

protección en los que participan enzimas como la superóxido dismutasa, la glutatión

peroxidasa, la catalasa, entre otras (Gara et al. 2003; Mittler et al. 2004; Mandal et al.

2008; Nikraftar et al. 2013). Además de este control enzimático, existen diferentes

compuestos químicos a nivel celular que permiten disminuir los niveles de estos

compuestos altamente reactivos, teniendo en cuenta que tienen la capacidad de

reaccionar con éstos y disminuir sus niveles, como es el caso de los carotenoides (β-

caroteno) y compuestos fenólicos como flavonoides (antocianinas), entre otros.

Reportes recientes en algunas especies vegetales, han propuesto que altos niveles de

actividad antioxidante pueden estar relacionados con defensa ya que el control estricto

de los niveles de EROS, es necesario para evitar daños a nivel de membrana y en

proteínas necesarias para el funcionamiento celular (Hammerschmidt 2005). Es por ello

que al parecer altos niveles de sustancias antioxidantes pueden estar relacionados con

resistencia a diferentes tipos de patógenos incluyendo algunos del género Fusarium

(Garcia-Limones et al. 2003; Lorenc-Kukuła et al. 2007; Polkowska-Kowalczyk et al.

2007; Sá et al. 2009).

POD: PEROXIDASAS (E.C.1.11.1.7)

La peroxidasa (POD) es una enzima implicada en la diferenciación y desarrollo de las

plantas y en respuestas defensivas contra patógenos. Un incremento en la actividad y/o

en la expresión de isoenzimas de peroxidasas es característico de la defensa de las

muchas plantas (Morkunas & Gmerek 2007; A. Dihazi et al. 2011; L. Huang &

Backhouse 2005; P. Prasad et al. 2003; Madadkhah et al. 2012; Mandal et al. 2008). Las

peroxidasas no poseen actividad antifúngica por sí mismas, pero están involucradas en

respuestas a enfermedades porque junto con enzimas como las polifenoloxidasas,

catalizan la oxidación de compuestos fenólicos para la polimerización de la lignina. A

pesar de que las reacciones químicas básicas de las PODs están bien establecidas,

involucrando peróxido de hidrógeno y donores de hidrógeno, también se ha encontrado

que pueden estar asociadas a la generación de peróxido de hidrógeno en la planta

59

(Kawano 2003; Schweizer 2008). Cuando se presentan situaciones de estrés por frío,

estrés mecánico, osmótico o por defensa al ataque de fitopatógenos, es característico

que se produzca como respuesta un incremento súbito en el contenido de sustancias

oxidantes, teniendo lugar una rápida generación de anión superóxido y acumulación de

H2O2 en el apoplasto. Aparentemente, esta acumulación de peróxido tiene diferentes

funciones: induce señales para la transcripción de proteínas de defensa, así como para la

síntesis de fitoalexinas; además, actúa como una forma directa de defensa debido a la

naturaleza antimicrobiana del H2O2 provocando cambios en la estructura de la pared

celular por una rápida insolubilización de las proteínas existentes en la misma, lo que

conduce a su endurecimiento (G Paul Bolwell & Daudi 2009; Mendoza 2011; Heller &

Tudzynski 2011).

A nivel estructural las peroxidasas presentes en los diferentes reinos se pueden clasificar

en 3 súper familias, dentro de las peroxidasas del tipo I encontramos las ascorbato

peroxidasa, enzimas citoplasmáticas, ampliamente conservadas en procariotes y

eucariotes que están involucradas en los sistemas antioxidantes de protección celular

junto con otras enzimas como la catalasa y la glutation reductasa (Gara et al. 2003;

Zámocký et al. 2010; Nikraftar et al. 2013). El grupo II incluye peroxidasas glicosiladas

ampliamente distribuidas en los hongos, las cuales, considerando sus potenciales

aplicaciones en la industria, presentan alto interés biotecnológico (Franken et al. 2011).

Finalmente y no por ello menos importantes, están las peroxidasas de tipo III,

hemoproteínas que se encuentran ubicadas principalmente a nivel del apoplasto, con

puentes disulfuro característicos y dominios de unión a Ca+2 (Mathé et al. 2010).

Considerando que muchas de las enzimas de esta familia presentan ubicación

extracelular, su papel en la inactivación de peróxido de hidrógeno y lignificación, ha sido

ampliamente asociado a la expresión de resistencia vegetal (Almagro et al. 2009; Mathé

et al. 2010; Lüthje et al. 2011). Con respecto al papel que esta enzima cumple en el

metabolismo de las EROs, se ha descrito que hace parte de los sistemas antioxidantes

enzimáticos que protegen a las células de los posibles daños que dichas especies

pueden ocasionar. Dicho papel está relacionado con la capacidad que presentan de

descomponer H2O2, especie altamente oxidante generada por el metabolismo oxidativo

(Polkowska-Kowalczyk et al. 2007; Tománková et al. 2006; Mandal et al. 2008; Almagro

et al. 2009).

60

1.7. Estudios de niveles transcripcionales en modelos planta-patógeno

El estudio de los niveles de transcripción de genes relacionados con defensa constituye

uno de los aspectos de mayor interés en el estudio de las interacciones hospedero-

patógeno (Wise et al. 2007). Actualmente los avances tecnológicos permiten evaluar de

manera simultánea, la expresión de cientos de genes mediante el uso combinado de

técnicas como microarreglos o RNAseq, asociados a diferentes herramientas de análisis

bioinformático (Dhaubhadel et al. 2007; Desmond et al. 2008; Alessandra et al. 2010;

Zhuang et al. 2012). La generación de información a gran escala por parte de estas

aproximaciones holísticas, proporciona un panorama global de la respuesta de defensa

de la planta en términos de los cambios en los transcriptomas y permite la aplicación de

herramientas de la biología de sistemas (Pinzón et al. 2010). Es importante destacar que

para que estos resultados sean validados, se requiere del uso de técnicas como realtime

PCR que permiten confirmar las diferencias en los niveles de transcripción encontradas

para los genes de interés (Desmond et al. 2008; D’Ippólito et al. 2010; Boava et al. 2011;

Bailey et al. 2013).

Para ciertos modelos, si se tienen evidencias histológicas, celulares o bioquímicas que

permitan conocer de antemano cuáles son los fenómenos asociados con la expresión de

resistencia en la planta, el estudio de los niveles de transcripción para genes específicos

asociados, permiten obtener información sobre los mecanismos de regulación que están

involucrados en una respuesta en particular de la planta (Hao et al. 2009; Upchurch &

Ramirez 2010; Gaige et al. 2010; Louime et al. 2011; B. G. Kim et al. 2012). Este es el

caso, por ejemplo, del metabolismo secundario y su papel en resistencia vegetal, en

donde bajo dicha aproximación, se han realizado diversos estudios usando técnicas

como Northern Blot o RT-PCR, en especies vegetales como: uvas (Kostekamp 2006),

pepino cohombro (Cools & H. Ishii 2002), trigo (D. . Bishop 2002), sorgo (Little & C. W.

Magill 2003), yuca (Gómez-Vásquez et al. 2004), arveja (Arfaoui et al. 2007), lino

(Lorenc-Kukuła et al. 2007), arroz (Kuroda et al. 2006), naranja (Ballester et al. 2006),

pera (Mohamed Faize et al. 2004). Sin embargo, el uso de realtime PCR se ha

posicionado en los últimos años como la herramienta más usada en este tipo de

estudios, considerando que permite una cuantificación fiable de los niveles

transcripcionales en muestras biológicas. Esta técnica se ha aplicado, entre otros, para el

caso de almatruz (Morkunas et al. 2011), carretón truncado (Die et al. 2009), arroz (Hao

61

et al. 2009), soya (Upchurch & Ramirez 2010), uva (Louime et al. 2011) y álamo (B. G.

Kim et al. 2012).

1.8. Estudios proteómicos comparativos en modelos de interacción planta-patógeno

Los estudios a nivel proteómico de diferentes modelos planta patógeno han venido en

aumento en los últimos años y se han convertido en una herramienta clave para la

caracterización de las respuestas asociadas a resistencia (Thurston et al. 2005b; Quirino

et al. 2010). Si bien es cierto que muchos de los estudios que actualmente se realizan en

fitopatología molecular están basados en análisis genómicos y transcriptómicos, es

importante no olvidar que son las proteínas las que determinan los distintos fenotipos

vegetales y deben ser por tanto, objeto de particular atención en el momento de estudiar

la resistencia vegetal (Jesús V. Jorrín-Novo et al. 2008). Además, considerando que en

muchas ocasiones los resultados de expresión génica no correlacionan con los datos

proteómicos (Mackay et al. 2004), es ideal validar con experimentos a nivel proteíco o

funcional, los resultados obtenidos mediante técnicas transcriptómicas. El éxito del uso

de una técnica proteómica en plantas está determinado por la selección de las técnicas

adecuadas para extracción, separación y análisis de proteínas, así como en el

planteamiento de un diseño experimental adecuado, sobre todo si se trata de estudios

comparativos (Valledor & Jorrín 2011). Al respecto, las aproximaciones proteómicas

comparativas basadas en electroforesis en 2 dimensiones y posterior análisis de

identificación mediante espectrometría de masas (MALDI-TOF matrix-assisted laser

desorption/ionization – time of flight), se han constituido en herramientas usadas en el

estudio de los mecanismos de defensa en especies como: arroz (Y.-Z. Lin et al. 2008;

Koga et al. 2012), arabidopsis (Mukherjee et al. 2010), trigo (Ding et al. 2011), garbanzo

(Palomares-Rius et al. 2011), menta (Sinha & Chattopadhyay 2011), guisantes (Barilli et

al. 2012), uva (Milli et al. 2011) y fresa (Xianping Fang et al. 2012). Es importante

destacar que aproximaciones metodológicas alternas, que requieran el uso de geles

como el DIGE (2-dimenssional difference gel electrophoresis) (Asano et al. 2012) o que

no lo requieran como las MudPIT (multidimensional protein identification technology), se

usan también para el estudio de las interacciones planta-patógeno (J. F. González et al.

2012; Petriccione et al. 2013). Considerando el alto impacto a nivel económico que tienen

las enfermedades causadas por hongos del género Fusarium, son varios los estudios a

62

nivel proteómico que han buscado dilucidar los mecanismos de defensa vegetal

asociados a su resistencia (Ding et al. 2011; Palomares-Rius et al. 2011; K. Shin et al.

2011; Eggert et al. 2011; Asano et al. 2012).

1.9. Modelo experimental Dianthus caryophyllus L - Fusarium oxysporum f. sp. dianthi raza 2

1.9.1. El hospedero: Clavel Dianthus caryophyllus L.

El clavel es una planta herbácea perteneciente al género Dianthus y a la familia de las

Cariofiláceas. Nativo del Mediterráneo, Dianthus caryophyllus L. es actualmente el origen

de múltiples variedades obtenidas principalmente por cruzamientos.

Dianthus caryophyllus L. es una planta de tendencia rastrera, de tallos articulados y

nudosos; de hojas lineales, opuestas, paralilenervias, de color verde claro, recubiertas

por una capa cerosa. Sus flores son hermafroditas, frondosas, de gran vistosidad y están

ubicadas al final del tallo. Además, poseen características favorables para su

comercialización como son la duración de la flor una vez cortada, la resistencia al

embalaje y la posibilidad de producción durante todo el año (Pizano de M 2000). La

reproducción del clavel se efectúa por semilla o por esquejes, siendo la primera la más

utilizada para la obtención de nuevas variedades. La propagación por esquejes es el

sistema utilizado comercialmente, porque mantiene las características de la variedad y

por el elevado número de esquejes que se obtienen de la planta madre. Las condiciones

climáticas de la sabana de Bogotá; 18 a 20oC de día y 6 a 8oC por la noche, son las

ideales para la producción del clavel, las que sumadas a otros factores, han permitido

que el cultivo de esta flor sea una de las más importantes dentro de las flores de

exportación cultivadas en nuestro país (Pizano de M 2000; Castellanos et al. 2009).

1.9.2. El patógeno: Fusarium oxysporum f. sp. dianthi

Fusarium oxysporum es una especie cosmopolita, habitante natural del suelo, constituido

por líneas patogénicas y no patogénicas, clasificadas en este grupo en función de

criterios morfológicos como la forma de sus macroconidias, la estructura del

microconideoforo y la formación y disposición de clamidosporas (Bosland 1988).

Presenta un micelio aéreo, abundante, algodonoso y con una coloración que puede

variar del blanco al rosado, y en algunos casos de púrpura a violeta intenso dependiendo

63

de la edad (Di pietro et al. 2003). En los últimos años se ha determinado que puede

llegar a ser patogénico para personas inmunosuprimidas y se ha propuesto que es

debido a la variabilidad genética propia de la especie (M. I. Roncero et al. 2003).

Fusarium oxysporum se caracteriza por presentar una reproducción predominantemente

asexual, en donde participan 3 tipos de esporas (Barrera & Gómez 1995): las

microconidias, estructuras unicelulares de pared delgada y generalmente de forma

redonda a elipsoidal, las cuales cumplen una importante función en la diseminación del

patógeno en los haces vasculares de la planta; las macroconidias, estructuras de mayor

tamaño que las anteriores, tienen pared delgada y están compuestas de 3 a 6 células.

Estas son un criterio clave para la clasificación taxonómica, pues su forma fusiforme, (de

ahí el nombre de este organismo) es característica de este género (Pizano de M 2000) y

las clamidosporas, son estructuras bastante resistentes a condiciones ambientales

adversas, lo que les permite cumplir un papel importante en la supervivencia del

patógeno en ausencia del hospedero.

Actualmente se han caracterizado más de 120 formas especiales que se diferencian de

acuerdo con la especie vegetal a la que infectan. Dentro de la forma especial dianthi, se

presentan 8 razas fisiológicas, que difieren ampliamente en su virulencia. Dentro de estas

se ha identificado la raza 2 como la más patogénica, las razas 8, 4 y 1 que le siguen en

virulencia y por último las razas 5, 6 y 7.

Las especies que se encuentran clasificadas dentro del género Fusarium presentan

dentro del arsenal que despliegan en el momento de infectar y colonizar una planta,

mecanismos bastante complejos dentro de los que se destacan un sistema de

percepción bastante sensible que le permite regular sus efectores y factores de

virulencia, proteínas degradadoras de la pared celular vegetal (poligalacturonasas,

pectatoliasas y pectinmetilesterasas) y factores que le permiten realizar una

destoxificación de las fitoalexinas y fitoanticipinas relacionadas con la defensa vegetal (Di

pietro et al. 2003).

1.9.3. El marchitamiento vascular del clavel

Desde finales del siglo XIX, cuando fue reportada por primera vez en Estados Unidos, la

marchitez vascular causada por Fusarium en el clavel, se ha convertido en un factor

limitante de la producción comercial de esta flor. Actualmente esta enfermedad se

64

encuentra ampliamente distribuida a nivel mundial, sin excepción, en todas las regiones

donde se cultiva clavel (Pizano de M 2000).

En nuestro país esta enfermedad se presenta desde 1975, cuando fue introducida por la

importación de esquejes infectados desde Europa, Estados Unidos e Israel. El impacto

de esta enfermedad en la producción del clavel en Colombia ha sido tal, que ha generado

una disminución importante en su producción, ya que a pesar de contar con medidas de

control, estas aumentan significativamente los costos de producción (Castellanos et al.

2009). Dicho aumento a su vez ha generado un ambiente favorable para el cultivo de

otras flores, que se han incorporado exitosamente al comercio internacional y han

desplazado al clavel del primer puesto en las exportaciones. Sin embargo, la producción

de esta flor sigue siendo muy importante para el país, ubicándose como la segunda flor

mas sembrada del país y generando varios miles de millones de dólares en

exportaciones (Arbeláez 2006). La enfermedad se caracteriza por la aparición unilateral

de los síntomas, en donde inicialmente la planta desarrolla amarillamiento seguido por el

marchitamiento de las hojas base y amarillamiento de las venas medias. El ciclo de la

enfermedad se inicia con la germinación de las clamidosporas en dormitancia

estimuladas por los exudados secretados por las raíces de las plantas recién sembradas

(Di pietro et al. 2003). Las hifas del hongo penetran la epidermis, la corteza y

posteriormente la endodermis, hasta llegar a los tejidos vasculares, donde se propagan

en forma ascendente, ya sea por crecimiento miceliar o por difusión pasiva de

microconidias (Baayen & Maat 1987; Baaye et al. 1988; Sarrocco et al. 2007). En las

variedades susceptibles el patógeno coloniza los vasos de todo el tallo y degrada el área

invadida, disolviendo las paredes celulares y formando grandes cavidades llenas de aire

y residuos de los vasos lignificados, los que interrumpen el paso de agua a través del

tallo ocasionando la muerte de la planta (Baayen & D M Elgersma 1985).

Además de secretar un conjunto de fito-toxinas y péptidos que favorecen el proceso de

colonización, este patógeno presenta la secreción de proteínas que le permiten

detoxificar las fitoanticipinas presentes en los tejidos de clavel (Curir et al. 2000; Di pietro

et al. 2003). Los síntomas se mueven lentamente hacia el lado afectado de la planta en

las hojas y los brotes laterales, extendiéndose lentamente hacia arriba a medida que el

patógeno asciende, causando un marchitamiento generalizado y posterior muerte de la

planta (Barrera & Gómez 1995). El patógeno al parecer se restringe a los tejidos

65

vasculares en la planta viva; sin embargo, una vez la planta muere puede llegar a

colonizar los tejidos parenquimáticos de la misma (Di pietro et al. 2003).

La severidad de la enfermedad y las pérdidas económicas que generan están

gobernadas por varios aspectos importantes, entre los que se destacan, por parte de la

planta: la resistencia de la variedad (completa o parcial); por parte del patógeno:, la raza

fisiológica del hongo, su virulencia e infectividad y la cantidad de inóculo, y

adicionalmente los factores ambientales:, como la intensidad solar, el fotoperíodo, la

temperatura y el substrato utilizado para la siembra (Ben-Yephet & Shtienberg 1997). El

desarrollo de las técnicas de cruzamiento ha permitido encontrar algunos genotipos que

presentan resistencia a la enfermedad (Ben-Yephet, Y. et al. 1997.). Sin embargo, dichos

genotipos han sido obtenidos por cruces inespecíficos de variedades, en donde los

mecanismos bioquímicos de dicha resistencia no han sido estudiados y en donde al

parecer las características genotípicas de dicha resistencia no son transmitidas en cruces

posteriores. Teniendo en cuenta esto, el desarrollo de nuevos fungicidas de origen

sintético que presenten una acción importante sobre este patógeno (M. L. Gullino et al.

2002), son una alternativa constante a pesar de los efectos que puedan presentar sobre

el medio ambiente.

1.9.4. Resistencia al marchitamiento vascular

Se han realizado varios estudios encaminados a encontrar los fenómenos más

relevantes de la histopatología y la bioquímica de la respuesta de defensa que presentan

los genotipos resistentes de clavel. En dichos estudios, se ha encontrado que la infección

activa un proceso defensivo multicomponente y compartimentalizado, que tiene como

objetivo localizar el patógeno en los tejidos vasculares xilemáticos infectados (Niemann

1990; Baayen et al. 1996). En este proceso, inicialmente se presenta la formación de

geles, compuestos principalmente de polisacáridos y compuestos fenólicos en los vasos,

ambos exudados de las células parenquimáticas adyacentes al punto de infección. Una

vez los fenólicos se fusionan a la pared y a las gomas, estos pueden estar sujetos a

reacciones de polimerización y oxidación que pueden dar lugar a la formación de una

barrera durable en la interfase de la infección y los tejidos sanos, la cual podría también

ser fortalecida con la deposición de calosa en las células adyacentes (Niemann & Baayen

1988; M. I. Trillas et al. 2000). Por otro lado, se ha encontrado que adicional a la

66

suberización alrededor del punto de infección a nivel del tallo (Niemann et al. 1991;

Niemann et al. 1992) y a nivel de la raíz (Higuera 2001), se producen aumentos en los

compuestos de naturaleza fenólica solubles o parcialmente enlazados a pared. Dentro de

los compuestos encontrados en tallo, se identificaron algunos compuestos nitrogenados

derivados del ácido antranilico, que teniendo en cuenta su carácter inducible y fungitóxico

fueron clasificados como fitoalexinas (Tabla No. 4). De éstos se determinó que su

proporción y velocidad de formación, dependen tanto de la variedad, como de la raza del

patógeno involucrada en la infección (Niemann et al. 1991; Niemann et al. 1992;

Niemann & Baayen 1988). En estudios realizados de manera específica a nivel de la raíz,

se encontraron algunos metabolitos que presentaron patrones de acumulación

relacionados con resistencia o susceptibilidad. Este es el caso del ácido ferúlico, la

escopoletina, una cumarina con importante actividad biológica, y un derivado de la

acridona, estos últimos acumulados en mayor proporción de manera constitutiva en

variedades resistentes al patógeno (Higuera 2001). En este mismo órgano y en tallo,

fueron recientemente identificados, además de un glicósido del kaempferol conocido

como kaempferido 3-O-[2G--D-glucopiranosil] -rutinósido (Tabla No. 4), su respectiva

aglicona del tipo flavonoide (kaempferido), que se encuentran de manera constitutiva y

fueron clasificados como fitoanticipinas (Curir et al. 2001). Estudios recientes sobre estos

últimos compuestos indican que es probable que se acumulen después de la infección y

presenten el comportamiento inducible característico de las fitoalexinas (Curir et al.

2005). A su vez, otros compuestos que presentan actividad antifúngica directa sobre el

patógeno en estudio, son los encontrados en callos de clavel por el grupo de Curir, P et

al. 2003 (Curir et al. 2003) En dicho estudio se reportan los ácidos, protocatecuico,

vanilico y 2,6-dimetoxibenzoico, además de la flavona datistecina y el glicósido de la

quercetina, peltatósido. Es importante citar que los metabolitos reportados en este último

estudio, aunque son encontrados en una variedad resistente, no se comenta si se

presentan de manera diferencial en función de los niveles de resistencia. El resumen de

estos resultados se presenta a continuación en la tabla No. 4.

67

Tabla No. 4. Compuestos caracterizados en clavel (Dianthus caryophyllus L.) con probable

relación en los mecanismos de defensa ante Fusarium oxysporum f. sp. dianthi raza 2.

Órgano de

la planta Compuesto

Características

del compuesto Referencia

Tallo

Diantalexinas

Fitoalexina

(Baayen &

Niemann

1989)

Tallo

Diantramidas

R2= H, OH, OCH3 R1= H,CH3

R1´R2´= H, OH, OCH3

Fitoalexinas

(Baayen &

Niemann

1989)

Tallo

Acetofenona

Fitoanticipina Curir P et al.

1996.

Raiz

Escopoletina

Probable

fitoalexina

(Higuera

2001)

68

Raiz

Acido ferúlico

Disminución de

niveles por

lignificación

(Higuera

2001)

Raiz

Derivado de la acridona

Probable

fitoalexina

(Higuera

2001)

Callos

Ácido 3, 4, dihidroxibenzoico “Ácido

protocatecuico”

Probable

fitoanticipina

(Curir et al.

2003)

Callos

Ácido 4-hidroxi-3-metoxibenzoico “Ácido

vanilico”

Probable

fitoanticipina

(Curir et al.

2003)

69

Callos

Ácido 2, 6-dimetoxibenzoico

Probable

fitoanticipina

(Curir et al.

2003)

Callos

Peltatosido

Probable

fitoanticipina

(Curir et al.

2003)

Callos

Datiscetina

Probable

fitoanticipina

(Curir et al.

2003)

Tallos y raices

kaempferido 3-o-[2G--D-glucopiranosil] -

rutinosido

Fitoanticipina

(Curir et al.

2005; Curir et

al. 2001)

70

Al analizar los compuestos presentes en la tabla No. 4, se evidencia el papel que los

compuestos derivados de la ruta fenilpropanoide cumplen en este modelo, siendo

determinantes de los fenómenos de resistencia y sugiriendo que la vías biosintéticas de

estos compuestos deben ser, a su vez, también determinantes en la expresión de

resistencia en este modelo planta-patógeno. Sin embargo, son pocos los estudios que se

han realizado en las enzimas que participan en dichas rutas biosintéticas. En este

aspecto diversos estudios realizados por el grupo de investigación Estudio de actividades

metabólicas vegetales del departamento de Química de la Universidad Nacional de

Colombia, han sugerido que la participación de algunas enzimas del metabolismo

secundario durante la respuesta de defensa del clavel ante la infección, pueden ser

determinantes en la expresión final de resistencia a este patógeno (Ardila & Higuera,

2005; Ardila, 2006; Ardila 2011). En dichos estudios se encontró que variedades de

clavel resistentes a la enfermedad, presentan tanto a nivel del tallo como de raíz, una

inducción de la enzima polifenol oxidasa, enzima central en el metabolismo de los

fenoles, participando probablemente en biosíntesis de fitoalexinas y lignificación (Ardila &

Higuera 2005; Ardila 2006). Posteriormente, dicha enzima fue purificada y caracterizada

(Mayorga, R. 2006). Estudios recientes han determinado que existe una correlación

positiva entre los niveles constitutivos de expresión de genes codificantes para la enzima

PAL y los niveles de resistencia a la enfermedad, además de su inducción diferencial a

nivel de la raíz en una variedad resistente a la enfermedad. (Ardila et al. 2011). Estos

estudios generaron particular interés considerando que esta enzima presentó una

inducción diferencial en raíces de variedades con diferentes niveles de resistencia,

siendo más temprana para el caso de la variedad resistente e inducida a nivel del tallo,

solamente por la acción de elicitores provenientes del patógeno (Ardila et al. 2007).

Considerando que los factores de transcripción que están involucrados en el proceso de

transcripción de los genes codificantes para la PAL en plantas, son los mismos que

participan en la transcripción de otros genes de la ruta fenilpropanoide (Vom Endt et al.

2002), es probable que el comportamiento que se ha presentado en el clavel pueda ser

extrapolado para otras enzimas de estas rutas biosintéticas. Sin embargo, es necesario

realizar estudios específicos para las diferentes enzimas presentes en el clavel, con el fin

de validar dicha hipótesis.

71

2. Biosíntesis constitutiva de flavonoides en el clavel y su relación con resistencia a Fusarium oxysporum f. sp. dianthi

Resumen

Con el fin de estudiar el papel de los flavonoides en los mecanismos de defensa que

actúan de manera constitutiva en plantas de clavel contra Fusarium oxysporum f. sp

dianthi, se investigó la relación entre algunos componentes bioquímicos preexistentes

asociados con la biosíntesis de estos metabolitos y la resistencia de algunas variedades

al marchitamiento vascular, enfermedad causada por dicho patógeno. Se evaluaron los

niveles constitutivos de fenoles totales, flavonoides y actividad antioxidante, en tallos y

raíces de 9 variedades comerciales de clavel, que se cultivan en Colombia, y que

presentan diferentes niveles de resistencia a la enfermedad. Respecto al tallo, estos

parámetros no mostraron correlación con resistencia, mientras que en raíz las variedades

resistentes mostraron contenidos más altos de flavonoides y de actividad antioxidante,

que los encontrados en variedades susceptibles. Así mismo, se evaluaron las actividades

de algunas enzimas implicadas en la biosíntesis de flavonoides en raíz. Mientras que

para la enzima fenilalanina amonio liasa (PAL) no se vieron diferencias asociadas con

resistencia a la enfermedad, las actividades chalcona sintasa (CHS) y chalcona

isomerasa (CHI) fueron mayores en raíces de las variedades resistentes a la

enfermedad, al comparar con las susceptibles. También se determinaron los niveles de

transcripción, evaluados por PCR en tiempo real para CHS y CHI, los cuales fueron

significativamente mayores en las variedades resistentes, lo que indica que estas

enzimas pueden ser probablemente reguladas a nivel transcripcional. Estos resultados

sugieren que los niveles constitutivos de flavonoides totales a nivel de la raíz, están

probablemente asociados con la resistencia a Fusarium oxysporum f. sp. dianthi, y que

72

dichas diferencias pueden atribuirse a una mayor expresión de genes en la vía

fenilpropanoide, específicamente para CHS y CHI, enzimas que han sido previamente

asociadas a la regulación de la biosíntesis de flavonoides en otras especies.

Abstract

To study the role of flavonoids in the constitutive defense mechanisms against Fusarium

oxysporum f. sp. dianthi in carnations, we investigated the relationship between several

biochemical components associated with the biosynthesis of these metabolites and the

resistance of various carnation plants to vascular wilt caused by this pathogen. We

assessed the constitutive total phenol and flavonoid contents and the antioxidant activity

levels in the stems and roots of nine commercial varieties of carnation grown in Colombia.

Plants with different levels of resistance to the disease were chosen for the study. At the

stem level, these parameters were not correlated with resistance, but at the root level,

resistant varieties exhibited higher levels of flavonoids and antioxidant activity than those

found in susceptible varieties. The activities of some enzymes involved in the biosynthesis

of these compounds were evaluated at the root level. Differences in the phenylalanine

ammonia-lyase enzyme (PAL) activity levels were not associated with disease resistance,

but the activities of chalcone synthase (CHS) and chalcone isomerase (CHI) were higher

in the roots of disease-resistant varieties. Likewise, the transcript levels of CHS and CHI

were significantly higher in resistant varieties, as evaluated by real-time PCR, indicating

that these enzymes are most likely regulated at the transcriptional level. These results

suggest that the constitutive levels of flavonoids at the root level are most likely

associated with resistance to Fusarium oxysporum f. sp. dianthi. Such differences may be

attributed to increased expression of genes in the phenylpropanoid pathway, specifically

CHS and CHI, which are enzymes that have been previously associated with the

regulation of flavonoid biosynthesis in other species.

2.1. Introducción

El marchitamiento vascular causado por Fusarium oxysporum f. sp. dianthi (Fod), es la

enfermedad más importante que afecta la producción del clavel a nivel mundial. Varias

estrategias de control se han utilizado para controlar este patógeno, pero ninguna ha

proporcionado una protección completa. El cultivo de variedades resistentes y el control

biológico se han planteado como opciones de interés (Ben-Yephet et al. 1997; Sant et al.

73

2010; Melero-Vara et al. 2011). De acuerdo con la resistencia multigénica y cuantitativa

del clavel a este patógeno (Baayen et al. 1991), la mayoría de variedades comerciales

presentan una resistencia parcial o susceptibilidad a la enfermedad. En todos los

programas para la obtención de cultivares comercialmente atractivos, la resistencia a

este hongo es uno de los criterios de selección más importantes. Sin embargo, los

estudios para la caracterización de genes de resistencia y el desarrollo de marcadores

para la selección de variedades resistentes no han sido exitosos debido a la falta de

información bioquímica sobre este patosistema. Para dilucidar los fenómenos

bioquímicos asociados a los mecanismos de defensa que actúan en los cultivares

resistentes, se han desarrollado algunos estudios bioquímicos, histológicos y

ultraestructurales (Baayen et al. 1989; Higuera & Ebrahim-Nesbat 1999; Ouellette et al.

2004). Se ha establecido que la capacidad de resistir a la colonización, a la degradación

del tejido y al marchitamiento vascular, depende principalmente de la capacidad del

hospedero para compartimentar la infección en una zona restringida, así como de la

acumulación a nivel del tallo de fitoalexinas derivadas del ácido antranílico (Baayen &

Plas 1992; Baayen et al. 1991). Los compuestos fenólicos juegan un papel central en

este proceso, ya que se liberan de células especializadas del parénquima alrededor de la

infección, se oxidan y se polimerizan para generar una barrera duradera entre la zona de

colonización y de la zona de defensa (Niemann et al. 1991; Higuera & Ebrahim-Nesbat

1999).

Varios estudios han propuesto que algunos compuestos fenólicos del tipo flavonoide

podrían estar asociados con resistencia, actuando a nivel constitutivo como fitoanticipinas

(Curir et al. 2001; Curir et al. 2003; Galeotti, Barile, Lanzotti, et al. 2008), o a nivel

inducible como fitoalexinas (Curir et al. 2005). Los flavonoides son metabolitos

secundarios que se encuentran ubicuamente en las plantas estando asociados a muchos

procesos fisiológicos incluyendo las interacciones simbióticas (Ponce et al. 2009), la

adaptación a la radiación UV (Ryan et al. 2002) y al ataque de herbívoros e insectos

(Simmonds 2003), la regulación del desarrollo (Taylor & Grotewold 2005) y la infección

por microorganismos (Pedras et al. 2003; Lorenc-Kukuła et al. 2007; Loureiro et al. 2012).

El papel de flavonoides en defensa de la planta está relacionado con su actividad

antimicrobiana frente a hongos y bacterias, debido a que presentan capacidad para

inhibir la germinación de las estructuras latentes y a su acción sobre procesos como el

transporte de membrana, la biosíntesis de ácidos nucleicos y el procesamiento

74

energético (Cushnie & A. J. Lamb 2011). Sin embargo, algunos estudios han propuesto

que su papel en la defensa vegetal, podría estar asociada a la actividad antioxidante que

presentan estos compuestos (Kangatharalingam et al. 2002; Lorenc-Kukuła et al. 2007;

Mikulič Petkovšek et al. 2009), la cual puede ser usada por las plantas para regular los

niveles de especies reactivas de oxígeno (EROS) que se generan durante los procesos

infecciosos (Hammerschmidt 2005).

El análisis funcional, utilizando mutantes de genes asociados a la biosíntesis de

flavonoides, han demostrado que los niveles de estos compuestos se regulan por la

acción de un amplio conjunto de enzimas, dentro de las que se destacan la fenilalanina

amonio liasa, la chalcona sintasa y la chalcona isomerasa (Winkel-shirley 2001; Dixon et

al. 2002; Schijlen et al. 2004). La fenilalanina amonio liasa (PAL, EC 4.3.1.5), cataliza la

primera reacción en la vía fenilpropanoide para generar, a partir de fenilalanina, una

amplia variedad de productos incluyendo lignina, flavonoides y compuestos fenólicos.

Considerando el papel de estos compuestos en la planta, esta enzima ha estado

asociada con procesos de adaptación y con la resistencia a enfermedades (Dixon & N. L.

Paiva 1995). Una supresión parcial de la expresión génica PAL puede conducir a una

mayor susceptibilidad a hongos fitopatógenos (Shadle et al. 2003). La enzima chalcona

sintasa (CHS, E.C. 2.3.1.74) cataliza la condensación iterativa de 3 unidades de malonil-

CoA sobre p-coumaroil CoA, producto final de la vía fenilpropanoide, para generar 2',

4,4',6´- tetrahidroxichalcona. A su vez, la chalcona isomerasa (CHI, E.C. 5.5.1.6) cataliza

la ciclación intramolecular enantioselectiva para generar (2S)-naringerina a partir del

producto de CHS. Las mutaciones del sitio activo que afectan la actividad catalítica de

esta enzima están asociadas con una disminución significativa en los niveles de

flavonoides (Reuber, et al. 1997), mientras que la sobreexpresión de esta enzima

produce un aumento significativo en sus niveles (F.-X. Li et al. 2006). Se han estudiado

los niveles transcripcionales para estas enzimas en diferentes especies vegetales

durante la infección con patógenos del género Fusarium oxysporum y se ha propuesto

que un aumento en éstos hace parte de las respuestas de defensa asociadas con

resistencia al marchitamiento vascular (Arfaoui et al. 2007; P. L. A. Chang et al. 2008;

Morkunas et al. 2011).

Considerando que el análisis cualitativo y cuantitativo de los niveles de flavonoides se ha

propuesto como una herramienta para la clasificación de variedades de clavel (Galeotti,

75

Barile, Lanzotti, et al. 2008) y que actualmente no se han reportado marcadores

moleculares para una selección rápida de variedades resistentes en los procesos de

mejoramiento genético, la posible relación entre los niveles de flavonoides y la resistencia

se plantea como una herramienta potencial para la selección de variedades resistentes al

marchitamiento vascular. En esta investigación, se evaluaron algunos parámetros

bioquímicos y moleculares relacionados con la biosíntesis de flavonoides en plantas de

nueve variedades comerciales con diferentes niveles de resistencia al marchitamiento

vascular, para aportar al conocimiento de los mecanismos de defensa que actúan a nivel

constitutivo en esta planta y, de esta manera, proponer marcadores potenciales para la

selección de cultivares resistentes.

2.2. Materiales y métodos

2.2.1. Material vegetal

Esquejes enraizados de nueve variedades comerciales de clavel cultivadas en Colombia

fueron suministrados por dos fincas localizadas en diferentes puntos geográficos de la

Sabana de Bogotá (Colombia): Ubicación 1: Grupo Chía en Tocancipá, latitud norte, 4 °

58' y longitud oeste 73 ° 55 ', T 13o C. Ubicación 2: Sb Talee en Fómeque de latitud norte

4 ° 29' y longitud oeste 73 ° 54 ', T 18 ° C. Las variedades de clavel (S susceptibles y R

resistentes a la raza Fod 2) fueron las siguientes: Star ( S), Tasman (S), Komashi Blanco

(R), LP Candy (R) y Giolee (R), suministrados por el Grupo Chía y Spitfire (S), Bellisima

(S), Esperia (R) y Topacio (R), suministradas por la empresa SB Talee. Para cada

variedad, treinta esquejes de clavel con 3 semanas de enraizamiento fueron separados

en tallos y raíces, lavados exhaustivamente, macerados con nitrógeno líquido y

almacenados a -70 º C para su posterior análisis.

2.2.2. Selección de condiciones de extracción de compuestos polifenólicos a partir de tallos y raíces de clavel

Con el fin de realizar la extracción de metabolitos a partir de tallos y raíces de clavel, bajo

unas condiciones que presentaran los mejores rendimientos en términos de las variables

a analizar, se evaluaron las 4 condiciones de extracción que se describen a continuación

(Biglari et al. 2008; Z. Yi et al. 2008).

76

Tabla No. 5. Condiciones evaluadas para la extracción de metabolitos a partir de tallos y raíces de clavel.

Condición de extracción Solvente usado Uso de ultrasonido

T1 Metanol 80% NO

T2 Metanol 80% SI

T3 Acetona NO

T4 Acetona SI

Estas diferentes condiciones de extracción fueron ensayadas usando 200mg (peso

fresco) de tallos o raíces de la variedad resistente L.P. Candy, usando 1 mL del solvente

descrito en la tabla No. 5 (1:5 p/v). La mezcla se sometió a un tratamiento con ultrasonido

(42Hz y 100w) si era el caso (T2 y T4), durante 15 minutos. Después de la centrifugación

(12000 g, 15 min), el sobrenadante se transfirió a un tubo eppendorf y se almacenó en la

oscuridad a -70oC para su posterior análisis. Todos los análisis se llevaron a cabo por

triplicado para cada órgano de la planta y para cada tratamiento. La selección de las

mejores condiciones de extracción estuvo basada en la comparación estadística

(ANOVA), de los valores obtenidos para las variables fenoles totales, flavonoides totales

y actividad antioxidante (ABTS y DPPH), determinadas usando métodos

espectrofotométricos de acuerdo con las condiciones que son descritas posteriormente.

El análisis comparativo entre variedades se realizó usando el método de extracción

seleccionado, por triplicado para cada variedad, en cada órgano de la planta.

2.2.3. Contenido de fenoles totales

El contenido total de compuestos fenólicos se midió utilizando el método de Folin-

Ciocalteu (Singleton & Rossi Jr JA 1965) con ligeras modificaciones. La mezcla de

reacción contenía 50 µL de los extractos en metanol, 100 µL de reactivo Folin-Ciocalteu y

100 µL de H2O destilada-desionizada. Después de 5 min se adicionaron 200 µL de

Na2CO3 7% y 200 µL de agua destilada-desionizada. Luego de 1 h de incubación a T

amb se midió la absorbancia (764 nm) de la mezcla de reacción (espectrofotómetro

Thermo Genesys 10 UV). Se comparó con una curva de calibración preparada usando 0,

5, 10, 15, 20, 25, 35, 50 ppm de ácido gálico (Sigma ®). Los resultados de fenoles totales

fueron dados como mg de equivalentes de ácido gálico por g de tejido fresco.

77

2.2.4. Determinación de flavonoides totales

El contenido de flavonoides se determinó utilizando el método colorimétrico reportado por

(Z. Jia et al. 1999) y (Barros, Baptista & Ferreira, 2007) con ligeras modificaciones. La

mezcla de reacción contenía 100 µL de extracto de clavel, 30 µL de solución de NaNO2

5% y 100 µL de agua desionizada, a la que se adicionaron después de 5 min, 60 µL de

solución de AlCl3 al 10%. Luego de incubar a T amb por 6 min, se adicionaron 100 µL de

NaOH 2M y se midió la intensidad de color rosa a 510 nm. Se comparó con una curva de

calibración preparada usando 0, 1, 2, 3, 4, 5, 7, 10, 15 ppm de catequina (+) (Sigma®) y

los resultados se expresaron como mg equivalentes de catequina por g de tejido fresco.

2.2.5. Inactivación del radical ABTS

La capacidad para inactivar el radical ABTS (Acido 2,2´-azinobis (3-etilbenzotiazolin)-6-

sulfonico) por parte de extractos de tallos o raíces de clavel, se determinó utilizando el

método descrito por Re et al (1999) con algunas modificaciones. Se preparó una solución

de ABTS disolviendo este compuesto en agua desionizada (concentración final 7 mM) y

generando el catión radical ABTS.+ con la adición de persulfato de amonio (2,5 mM

concentración final). La mezcla se dejó en reposo en la oscuridad a temperatura

ambiente por 18 h antes de su uso. La solución del catión radical ABTS.+ se diluyó con

etanol para obtener una absorbancia entre 0.7-0.9 a 734nm. La mezcla de reacción

contenía 500 µL de solución ABTS diluido y 100 µL de extracto. Después de 20 minutos

de reacción en la oscuridad, se midió la absorbancia a 734 nm y se comparó con una

curva de calibración previamente preparada usando 0,5, 1, 1,5 y 2,0 mM de Trolox (Acido

6-Hydroxi-2,5,7,8-tetrametilcroman-2-carboxilico) (Sigma®). Los resultados finales se

expresaron como mol de equivalentes Trolox (TE) por g de tejido fresco.

2.2.6. Captación del radical DPPH

La capacidad de captación del radical libre DPPH (2,2-difenil-1-picrilhidracilo) se

determinó de acuerdo con (Yoo et al. 2008). Se preparó un control positivo usando 100

µL de solución de ácido ascórbico (0,05 mg/mL) y 500 µL de solución de DPPH (0.4

mg/mL), mientras que el control negativo se obtuvo usando 100 µL de metanol y 500 µL

de la misma solución de DPPH. La determinación en muestras de raíces y tallos de clavel

se llevó a cabo utilizando 100 µL de extracto y 500 µL de solución de DPPH. La mezcla

78

se homogenizó suavemente, se dejó reposar a temperatura ambiente durante 15 minutos

y se realizaron lecturas a 510 nm. La capacidad de captación del radical libre DPPH se

calculó según la siguiente fórmula:

Capacidad de inactivación (%) = (Abs control negativo - Abs muestra) / Abs control

negativo

Se preparó una curva de calibración utilizando 0,02, 0,04, 0,06, 0,08, 0,10 y 0,20 mM de

Trolox (Sigma ®) determinando en cada caso la capacidad de inactivación del radical

DPPH (%). Los resultados finales se expresaron como mol equivalentes de Trolox (TE)

por g de tejido fresco.

2.2.7. Preparación de extractos enzimáticos

Los extractos enzimáticos de las raíces de clavel se obtuvieron de manera independiente

para cada enzima con el fin de obtener ensayos enzimáticos sensibles y reproducibles.

Para el caso de la actividad PAL, se pesaron 0,2 g de material vegetal, se maceraron

usando nitrógeno líquido y se le adicionaron 600 µL de acetona a -20°C. Después de

centrifugar a 4°C (5 min, 12000g), el sobrenadante se eliminó cuidadosamente. Este

procedimiento se repitió tres veces más para eliminar los compuestos fenólicos que

podrían interferir con el ensayo de determinación de la actividad (Ardila 2006). La

extracción a partir del pellet se llevó a cabo utilizando 1 mL de buffer ácido bórico- NaOH

100 mM, pH 8,0, 20 mM EDTA y 20 mM de β-mercaptoetanol. Las muestras se

centrifugaron a 4°C (30 min, 16000g) y el extracto enzimático se recuperó y se almacenó

a -20 ° C para análisis posteriores.

La enzima chalcona isomerasa (CHI) se extrajo de acuerdo con Li et al (2006), con

algunas modificaciones. La eliminación de compuestos interferentes se realizó usando

0,2 g de material vegetal y acetona, tal y como se describió anteriormente. La extracción

posterior se llevó a cabo usando 1mL de buffer Na2HPO4-NaH2PO4 100 mM pH 8,0, 3

mM EDTA, 20 mM β-mercaptoetanol y 2% PVPP. Las muestras se centrifugaron a 4°C

(30 min, 16000g) y el extracto se recuperó y se almacenó a -20 ° C para análisis

posteriores.

79

La enzima chalcona sintasa (CHS) se extrajo de acuerdo con Lozovaya et al (2007) con

algunas modificaciones. Para ello se usó 1,0 g de raíces y 10 mL de buffer de fosfatos

100 mM, pH 7,0 que contenía, 0,5 M de sacarosa, 0,2 mM PMSF, 20 mM de ácido

ascórbico, 1% PVPP, 3 mM EDTA y 0,1% de BSA. Después de centrifugar a 4 ° C (30

min, 16000g), el extracto se recuperó, se concentró y se desalinizó usando

concentradores de tipo ultra-celular cell (Millipore ® 10000 MWCO) hasta un volumen de

1,5 mL. Este extracto se mantuvo a 4 ° C para determinar la actividad en el mismo día.

2.2.8. Determinaciones de actividad enzimática

La actividad PAL se midió utilizando el método espectrofotométrico (Assis et al. 2001)

con algunas modificaciones de acuerdo con (Ardila et al. 2007). La mezcla de reacción

contenía 100 µL de extracto de enzima y 400 µL de L-fenilalanina 20mM en buffer

fosfatos 100 mM, pH 6. Después de 15 min a 37°C, la enzima se inactivó por

calentamiento (15 min a 92oC) y el ácido cinámico generado se evaluó con lecturas a 270

nm (espectrofotómetro Thermo Genesys 10 UV) e interpolación en una curva de

calibración preparada utilizando ácido cinámico (Sigma ®). Una unidad de actividad

enzimática (katal) se definió como la cantidad de enzima que cataliza la formación de 1

mol de ácido cinámico en 1 s. La actividad de la enzima se expresó como nkat de ácido

cinámico / g de tejido fresco.

La actividad chalcona isomerasa (CHI) se determinó utilizando el método

espectrofotométrico reportado por Li et al (2006). La isomerización de 2',4,4',6´-

tetrahidroxichalcona, previamente sintetizada por el método de Moustafa y Wong (1967),

se cuantificó usando 100 µL de extracto enzimático y 400 µL de una solución 100 mM de

este sustrato disuelto en Tris-HCl 100 mM pH 7,6. Los cambios en absorbancia a 390nm

en la mezcla de reacción se evaluaron durante 5 min en un espectrofotómetro (Genesys

® 10UV Thermo) utilizando como control negativo (blanco combinado de enzima y

sustrato) una mezcla que contenía extracto enzimático previamente inactivado por

calentamiento por 5 min a 90oC. Teniendo en cuenta el coeficiente de absorción molar

para el sustrato (E = 29400M-1cm-1), una unidad de actividad enzimática (katal) se definió

como la cantidad de enzima que cataliza la isomerización de 1 mol de chalcona en 1 s.

La actividad enzimática se expresó como microkat chalcona isomerizado / g de tejido

fresco.

80

La actividad chalcona sintasa (CHS) se determinó por el método cromatográfico

reportado por Lozovaya et al. (2007) y (Flores-Sanchez & R. Verpoorte 2008), con

algunas modificaciones. La mezcla de reacción se preparó usando 250 µL de extracto

enzimático concentrado, 150 µL de buffer fosfatos 100 mM pH 8,0, con BSA al 2% (p/v),

β-mercaptoetanol 2,8 mM y 100 µL de sustratos p-cumaroil-CoA (TransMIT

Flavonoidforschung Giessen, Alemania) y malonil-CoA (Sigma ®) a concentraciones

finales de 5 µM y 10 µM, respectivamente. Después de 90 min a 30°C, la reacción se

detuvo mediante la adición de 20 µL de HCl 4M. Se adicionaron 800 µL de acetato de

etilo y después de agitar vigorosamente, se centrifugó durante 2 min. Se recuperó la fase

orgánica y se repitió este procedimiento. Las fases orgánicas se evaporaron en una

centrífuga de vacío y el residuo se mantuvo a 4°C. Las muestras se re disolvieron en 80

µL de metanol HPLC para su análisis posterior. La cuantificación de la naringenina se

realizó por HPLC utilizando un cromatógrafo líquido LC-20AT Shimadzu ®, una columna

RP-18 Phenomenex® (250mmx4.60mm, 5 micras) y un detector UV-VIS Prominence ®

SPD-20AT. Para el análisis por HPLC las condiciones fueron las siguientes: fase móvil A:

agua: H3PO4 (400:2), fase móvil B: metanol 100% y el gradiente como se describe a

continuación: 0 min A 100%, 2 minutos-12 minutos B 45%, 31min - 33min B 78%, 36min-

46min B100%, 48min-54min B0%. El flujo fue 1mL/min y 290 nm para la detección. Los

resultados se obtuvieron por interpolación en una curva de calibración utilizando

naringenina (Sigma ™). La actividad de la enzima se expresó como pkat naringenina/ g

tejido fresco.

2.2.9. Cuantificación por PCR en tiempo real

Para la extracción del RNA total, las raíces de clavel se maceraron usando nitrógeno

líquido en un mortero previamente lavado con una solución de dietil pirocarbonato

(DEPC). Se pesaron 0,4 g del material macerado y se llevó a cabo la extracción

utilizando Trizol (Invitrogen ®) de acuerdo con las instrucciones del proveedor. El RNA se

cuantificó por lecturas de absorbancia a 260 nm (Genesys ® 10UV Thermo). Con el fin

de asegurar la calidad de los ácidos nucleicos usados en las determinaciones, las

muestras que se usaron para estos ensayos presentaron una relación A260/A280 entre

1,9 hasta 2,0. Para evitar la contaminación de ADN, se trataron 2 µg de RNA total con

ADNasa (Epicentre ®) de acuerdo con las condiciones recomendadas por el proveedor.

81

Posteriormente, la síntesis de cDNA a partir de RNA se realizó utilizando oligo dT y la

transcriptasa inversa M-MLV (virus de leucemia murina de Moloney, Invitrogen ®) de

acuerdo con el protocolo del fabricante. Los niveles de transcripción de genes CHS y CHI

en clavel fueron evaluados por PCR en tiempo real mediante cuantificación absoluta

(SYBR ® Green MasterMix IQTM Biorad). Con el fin de usar la misma cantidad de cDNA

en cada reacción (10 ng), se realizó cuantificación por fluorescencia (Qbit ® Invitrogen).

Los cebadores utilizados para la amplificación de los genes de CHS y CHI se citan en la

tabla No. 6. El diseño de éstos se realizó utilizando las secuencias del genebank

identiicadas con GI 1067124 y GI 12239389. Sobre estas secuencias reportadas para el

clavel, mediante alineamientos con secuencias reportadas para otras especies usando el

programa clustalW, se seleccionaron aquellas secuencias conservadas para cada

enzima y sobre éstas se realizó el diseño correspondiente mediante el programa primer3.

La verificación del tamaño de los fragmentos y la especificidad de la amplificación se

realizó mediante electroforesis en geles de agarosa del 1,5%. Las condiciones de

amplificación para ambos casos, consistieron en una desnaturalización inicial a 95◦C

durante 10 min, seguidos de 35 ciclos a 95◦C (15 s), 53,5◦C (20 s), 72oC (20s) y

finalmente 72◦C (1 min). La cuantificación se realizó mediante el método de la curva

estándar. En cada ensayo para cada DNA blanco, se prepararon curvas de calibración

utilizando diluciones seriales de 5 a 6 veces de los amplicones previamente clonados en

un plásmido (sintetizados por la empresa GeneArt ®) desde 100 a 10000000 copias/

reacción. Para cada ensayo se evaluaron por duplicado controles sin plantilla (NTC), las

muestras de cDNA y controles positivos (amplicones previamente clonados). La

especificidad de los productos se validó por el análisis de la curva de fusión y la posible

presencia de contaminantes que pudiesen afectar la eficiencia de la amplificación se

evaluó para cada reacción usando el método de (Ramakers et al. 2003). En este se

evalúa la eficiencia en cada muestra mediante la comparación de las gráficas obtenidas

del Log Fluorescencia vs. tiempo. El análisis se realizó utilizando un C1000Thermalcycle

acoplado a un CFX96 Biorad, sistema en tiempo real. El nivel de expresión de los genes

de interés se reportó como copias/µg de RNA extraído como media de tres repeticiones.

82

Tabla No. 6. Lista de cebadores usados para la cuantificación por PCR en tiempo real de los niveles de mRNA para los genes de biosíntesis de flavonoides.

Nombre de las

proteínas Cebadores Secuencia 5´ 3´

Tamaño del

fragmento

Chalcona sintasa

CHS directo

CHS reverso

GTGGGTCTCACTTTTCACCTG

AATCGAGCCCTTCACCTGCTGT

319pbs

Chalcona isomerasa

CHI directo

CHI reverso

GACAACAATACGCCGACAAA

AGAGTGTCCGGGAGGAAAAT

140pbs

2.2.10. Análisis estadístico

El análisis estadístico se realizó para cada variable en los diferentes tratamientos

evaluados por triplicado. Los datos fueron reportados como medias + / - SD. El análisis

de varianza y las diferencias significativas entre las medias se analizaron mediante

ANOVA de una vía utilizando Statgraphics ® Software versión 5.1. La correlación de

Pearson y el análisis de PCA se realizaron para determinar las correlaciones entre las

medias y la visualización de las diferencias y similitudes entre las variedades, en

términos de los parámetros evaluados, utilizando Microsoft Excel y el software de la línea

de las matrices de Nia. http://lgsun.grc.nia.nih.gov/ANOVA/index.html. Con el fin de

normalizar para el análisis de PCA, todos los datos se transformaron con la función

(Log10 X). La significancia de los coeficientes de correlación de Pearson se realizó con

un α = 0,005 según Azzimonti (2003).

2.3. Resultados y Discusión

2.3.1. Selección de condiciones de extracción de compuestos polifenólicos a partir de tallos y raíces de clavel

Durante la selección de condiciones de extracción se evaluaron diferentes protocolos

frecuentemente usados para la extracción de este tipo de metabolitos en diferentes

especies (Biglari et al. 2008; Z. Yi et al. 2008; Hossain et al. 2011; Kunradi et al. 2011). Si

bien es cierto que existen algunos reportes para la extracción de estos metabolitos en

clavel (Curir et al. 2003; Galeotti, Barile, Curir, et al. 2008), estos incluyen procesos

83

largos de reflujo (1-2 h) que pueden ser poco prácticos cuando se trabaja con un número

importante de muestras. Es por ello que en esta investigación se evalúo el uso de

ultrasonido considerando que puede presentar mejores eficiencias de extracción que el

reflujo, en tiempos más cortos (Paniwnyk et al. 2001). Los resultados correspondientes

para las condiciones de extracción evaluadas, se presentan en las figura 4.

4Figura No. 4. Evaluación de diferentes métodos para la extracción de metabolitos a partir de tallos y raíces de clavel. A) Fenoles totales, B) Flavonoides totales, C) Inactivación de ABTS, D) Inactivación de DPPH. T1: Metanol 80%, T2: Metanol 80% + ultrasonido, T3: Acetona, T4: Acetona + ultrasonido. Las barras verticales presentan la desviación estándar de cada promedio (n = 3). Los análisis estadísticos se realizaron para cada órgano de manera independiente. Los valores marcados con letra diferente, presentan diferencias significativas (P < 0.05).

De acuerdo al análisis estadístico realizado se evidenció el efecto positivo que tiene el

ultrasonido en la extracción de este tipo de metabolitos (T2 y T4), al comparar con los

tratamientos que no lo incluyen (T1 y T3). Esto se debe al conocido efecto cavitacional

que presenta el ultrasonido, favoreciendo la extracción de compuestos polifenolicos

asociados de manera no covalente a componentes insolubles de la planta que se

eliminan durante la extracción (Wrolstad et al. 2005). Así mismo, se determinó que el

metanol al 80% presenta la mayor eficiencia en la extracción de fenoles totales y

0

50

100

150

200

250

T1 T2 T3 T4

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b

b

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A B

C D

84

compuestos con actividad antioxidante al comparar con la acetona (figura No. 4 A-D).

Esto se debe a que la polaridad de este solvente permite una mayor extracción de

compuestos polares, como es el caso de aquellos flavonoides glicosilados reportados

como mayoritarios en clavel (Curir et al. 2003; Galeotti, Barile, Curir, et al. 2008; Galeotti,

Barile, Lanzotti, et al. 2008). En el caso de los flavonoides totales, los extractos obtenidos

con acetona presentaron valores estadísticamente similares a los obtenidos usando

metanol al 80% (figura No. 4 B). Esto se debe a que con acetona se favorece la

extracción de los compuestos de baja polaridad, como es el caso de flavonoides no

glicosilados que pueden detectarse bajo las condiciones del método colorimétrico usado.

Sin embargo, considerando que no se presentaron diferencias significativas con respecto

a la extracción con el metanol al 80%, el tratamiento T2, fue el seleccionado para los

procesos posteriores.

2.3.2. Determinación de niveles constitutivos de fenoles, flavonoides y actividad antioxidante en diferentes variedades de clavel

Para el análisis comparativo entre variedades de clavel con diferentes niveles de

resistencia al marchitamiento vascular, se usaron esquejes de clavel provenientes de dos

fincas ubicadas en diferentes puntos de la sabana de Bogotá. Considerando que la

composición del sustrato de enraizamiento, determinante en el ambiente de la rizosfera y

por ende en los niveles de algunos flavonoides (J.-T. Lin et al. 2010), era diferente en

cada una de las fincas (Grupo Chía mezcla de suelo-cascarilla de arroz, S.B talee:

cascarilla de arroz), se realizaron análisis estadísticos independientes de los resultados

de cada finca, con el fin de evaluar la posible relación entre los parámetros en estudio y

la resistencia al marchitamiento vascular (figura No. 5). Se encontró que la variedad

resistente L.P Candy y la variedad susceptible Bellisima presentaron los mayores

contenidos de fenoles en raíces, para la ubicación 1 y 2 respectivamente (P‹0.05). A nivel

de la raíz, las variedades resistentes presentaron contenidos estadísticamente mayores

(P‹0.05) para flavonoides totales, con excepción de la variedad Komashi Blanco (R), la

cual presentó valores similares a la variedad susceptible Tasman. En general, los niveles

de fenoles y de flavonoides encontrados estuvieron en el rango de 40-120 mg de ácido

gálico y 12-45mg equivalentes de catequina por 100 g material vegetal en base húmeda,

respectivamente.

85

5Figura No. 5. Niveles de fenoles y flavonoides constitutivos en raíces y tallos de clavel de variedades de dos fincas productoras ubicadas en diferentes municipios de la sabana de Bogotá (Tocancipa- Finca Grupo Chia y Cota- Finca S.B. Talee). Contenido de fenoles totales en Tocancipa (A) y Cota (B). Flavonoides totales en Tocancipa (C) y Cota (D). Las barras verticales presentan la desviación estándar de cada promedio (n = 3). Los análisis estadísticos se realizaron para cada órgano de manera independiente. Los valores para cada variedad y cada determinación marcados con diferente letra, presentan diferencias significativas (P < 0.05). S=susceptible y R= Resistente a Fod

Estos valores encontrados para el contenido de fenoles totales (CFT) en tallos y raíces

de clavel (figura No. 5) (40-120 mg equivalentes de ácido gálico/ 100g material húmedo

que corresponden a 4-12 mg equivalentes de ácido gálico GAE/g material en peso seco)

se encuentran en los rangos reportados para diferentes tejidos vegetales (0.2 y 150 mg

GAE / g material en peso seco) (Kahkonen et al. 1999), siendo comparables a los

encontrados en tejidos de diferentes especies como hojas de Cucumber sativum (4 mg

GAE/g material en peso seco), hojas de Daucus carota (7.4 mg GAE/g material en peso

seco) y hojas de Trifolium pratense (7.8 mg GAE/g material en peso seco). Para

flavonoides, los niveles encontrados en este estudio (10-40mg CE/g material fresco que

A B

C D

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bc c c

a ab

86

corresponden a 100-400mg CE/100 g peso seco) se encuentran en el orden de los

reportados para tejidos similares, como es el caso de raíces de Glycin tomentella que

están entre 100 y 200 mg CE/100g material en peso seco (J.-T. Lin et al. 2010), pero son

bajos al comparar con los reportados en tejidos fotosintéticos de diferentes plantas (200-

400 mg CE/ 100g material fresco, Yoo et al 2008). En general, los niveles de estos

metabolitos en tallos y raíces, tienden a ser menores a los encontrados en otros tejidos

más activos a nivel metabólico como hojas o frutos, en donde estos compuestos juegan

un papel importante como pigmentos o como protectores UV (Fico et al. 2000; Ryan et al.

2002). A pesar del potencial que tienen los flavonoides localizados en tallos y raíces para

ser usados como marcadores de selección de variedades en esta especie vegetal (Curir

et al. 2003; Galeotti, Barile, Lanzotti, et al. 2008) y del papel que pueden tener en

resistencia vegetal (Treutter 2006), los niveles de algunos parámetros asociados a la

biosíntesis constitutiva de estos compuestos no habían sido evaluados a nivel de la raíz,

órgano en donde se presenta el primer punto de contacto entre el clavel y el agente

causal del marchitamiento vascular. Algunos estudios referentes a la biosíntesis habían

sido realizados en esta especie, pero enfocados principalmente a la caracterización de

los pigmentos que, a nivel de la flor, generan las diferentes variedades de interés

comercial (Fukui et al. 2003; Yoshida et al. 2004). De acuerdo a los resultados

encontrados, los cuales mostraron que los niveles de fenoles y flavonoides en raíces son

superiores a los de tallo, se pudo observar que en clavel, como en otras especies, la

biosíntesis de estos compuestos está regulada en función del órgano en estudio y de sus

necesidades adaptativas (Fico et al. 2000; Hernández et al. 2009). Mayores niveles de

flavonoides en este órgano pueden estar asociados a procesos propios del ambiente de

la rizosfera como son, captación de nutrientes (Tomasi et al. 2008), crecimiento (Taylor &

Grotewold 2005) e interacción con microrganismos del suelo (L. J. Shaw et al. 2006).

Los resultados de actividad antioxidante en términos de capacidad de inactivación de los

radicales ABTS y DPPH, indicaron que, al igual que lo encontrado para fenoles y

flavonoides, los niveles en raíces fueron superiores a los de tallo (figura No. 6) y fueron

superiores en las variedades resistentes respecto a las susceptibles (P‹0.05). A nivel del

tallo, los niveles de inactivación del radical DPPH fueron estadísticamente iguales para

todas las variedades usadas.

87

6Figura No. 6. Niveles de actividad antioxidante constitutiva en raíces y tallos de clavel de variedades de dos fincas productoras ubicadas en diferentes municipios de la sabana de Bogotá (Tocancipa- Finca Grupo Chia y Cota- Finca S.B. Talee). Inactivación ABTS en variedades de Tocancipa (A) y Cota (B). Inactivación de DPPH en variedades de Tocancipa (C) y Cota (D). Las barras verticales presentan la desviación estándar de cada promedio (n = 3). Los análisis estadísticos se realizaron para cada órgano de manera independiente. Los valores para cada variedad y cada determinación marcados con diferente letra, presentan diferencias significativas (P < 0.05). S=susceptible y R= Resistente a Fod

Los valores de actividad antioxidante ABTS encontrados en raíces (1-12 µmol TE/g peso

seco), son bajos al comparar con otros rangos reportados en plantas (0-2125 µmol TE/g

peso seco), comparables a los encontrados en raíces de Daucus carota (3-28 µmol TE/g

peso seco), raíces de Dioscorea alata (3-8 µmol TE/g peso seco), tallos de Allium

sativum (3-18 µmol TE/g peso seco) y raíces de Ipomoea batata (3-15 µmol TE/g peso

seco) (R. Y. Yang et al. 2006). Los valores de actividad antioxidante por este método

fueron más altos que los encontrados usando DPPH, indicando que existen diferencias

en la capacidad de los compuestos extraídos para inactivar los radicales usados, lo cual

ha sido previamente reportado en otras fuentes vegetales (H. Zhao et al. 2008). El

0

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Spitfire (S) Bellisima (S) Topacio (R) Esperia (R)

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88

análisis estadístico realizado usando los resultados encontrados en cada finca, indicó

que las variedades resistentes presentaron mayores niveles de actividad antioxidante

respecto a las susceptibles a nivel de la raíz (figura No. 6), indicando que la presencia de

metabolitos con capacidad antioxidante, podría estar asociada con la resistencia al

marchitamiento vascular causado por Fod. Otros resultados que están de acuerdo a los

encontrados en esta investigación han sido reportados en otras especies vegetales en

las que metabolitos con actividad antioxidante han presentado actividad antifúngica

contra patógenos del género Fusarium y se ha propuesto una posible relación con

resistencia. Por ejemplo en Linum usitatissimum (Lorenc-Kukuła et al. 2007), Ocimum

basilicum (Hussain et al. 2008) y Myracrodruon urundeuva (Sá et al. 2009). Así como se

ha propuesto, es probable que en el clavel, mayores niveles constitutivos de sustancias

antioxidantes en las variedades resistentes, les puede otorgar ventaja adaptativa durante

la interacción. Esto considerando que el patógeno requiere de un ambiente altamente

oxidante que sea favorable para la muerte de las células vegetales en ciertas fases de la

interacción, la cual se puede ver afectada por la presencia de sustancias antioxidantes en

la planta. Es probable que además, el papel en resistencia de estos metabolitos se

potencialice considerando su ya conocida actividad antifúngíca sobre Fod (Curir et al.

2001; Curir et al. 2003; Galeotti, Barile, Curir, et al. 2008).

2.3.3. Niveles constitutivos en raíces de clavel de enzimas involucradas en biosíntesis de flavonoides

En esta etapa se quiso conocer sobre la biosíntesis constitutiva de los flavonoides en

términos de las enzimas involucradas, con el fin de relacionarlas posiblemente con los

niveles de estos metabolitos y con resistencia a la enfermedad. La enzimas fenilalanina

amonio liasa (PAL), primera enzima de la ruta fenilpropanoide y las enzimas chalcona

sintasa (CHS) y chalcona isomerasa (CHI), participan en las primeras reacciones de la

ruta de biosíntesis de flavonoides. Considerando que en este punto de la investigación, al

menos a nivel constitutivo, los niveles de flavonoides en raíces presentaron relación con

resistencia a la enfermedad, las actividades de las enzimas asociadas con la biosíntesis

de estos metabolitos se evaluaron solamente en este órgano (figura No. 7).

89

7Figura No. 7. Niveles de actividades enzimáticas a nivel de raíz en variedades de clavel de dos fincas productoras ubicadas en diferentes municipios de la sabana de Bogotá. Finca 1, Tocancipa-Grupo Chia: Tasman (S1), Star (S2), Komashi (R1), Gioele (R2) y L.P. Candy (R3). Finca 2, S.B. Talle: Spitfire (S3), Bellisima (S4), Topacio (R4) and Esperia (R5). A) Actividad PAL, B) Actividad CHI, C) Actividad CHS. Las barras verticales presentan la desviación standard de cada promedio (n = 3). Los valores para cada variedad y cada determinación que presentan diferente letra, presentan diferencias significativas (P < 0.05). S=susceptible y R= Resistente a Fod

Para PAL, las variedades Gioele (R) y Esperia (R), presentaron los mayores niveles

(P‹0.05) en cada una de las fincas, respectivamente. Sin embargo, no se presentaron

diferencias significativas entre el resto de variedades. Esta enzima presentó valores de

actividad (300-10000 nkat ácido cinámico/g peso fresco) que se encuentran dentro de los

rangos previamente reportados para esta planta (100-10000 nkat ácido cinámico/g peso

fresco) (Ardila et al. 2011). Con respecto a las actividades enzimáticas CHS y CHI fueron

superiores para las variedades resistentes en ambas fincas, encontrándose valores entre

13 y 300 pkat/g material vegetal para CHS y entre 500 y 4000 µkat/g material vegetal

para CHI. Para las variedades Gioele (R) y Esperia (R) se obtuvieron los mayores valores

de actividad CHS y para las variedades Komashi Blanco (R) y Topacio (R) de CHI. En

0

2000

4000

6000

8000

10000

12000

S1 S2 R1 R2 R3 S4 S5 R4 R5

Acti

vid

ad

PA

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l)

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

4000

4500

S1 S2 R1 R2 R3 S4 S5 R4 R5

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CH

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l)

0

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100

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450

S1 S2 R1 R2 R3 S4 S5 R4 R5

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CH

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l)

FINCA 1 FINCA 2 FINCA 1 FINCA 2

d

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a a

b b

b

a

a

c

b

ab

a

ab

c

a a

a

a

bc

FINCA 1 FINCA 2

C

A B

90

general los niveles de estas dos enzimas, claves para la biosíntesis de flavonoides,

fueron superiores en las raíces de las variedades resistentes de clavel.

Al evidenciar que los niveles de estas enzimas (CHS y CHI) presentaban particular

interés a nivel de raíz, se quiso evaluar si existía relación entre la actividad enzimática y

los niveles transcripcionales para, de esta manera, indagar sobre los puntos de

regulación probables. Los resultados de la evaluación de los niveles transcripcionales

usando qRT-PCR, se presentan en la figura No. 8, expresados como Log (número de

copias/μg de RNA extraído), considerando el orden de las diferencias encontradas entre

las variedades evaluadas (en algunos casos mayor a 3 órdenes). Las tres réplicas para

cada variedad se encontraron dentro del mismo orden de magnitud. Es importante citar

que no se encontraron diferencias en la eficiencia de amplificación entre patrones

(plásmidos recombinantes) y las muestras de cDNA, indicando que la posible presencia

de contaminantes en estas últimas, no afectaba la amplificación y por tanto los resultados

obtenidos. En general, con excepción de la variedad Komashi blanco (R3) que presentó

valores similares a los encontrados para la variedad Star (S2), se pudo determinar que

las raíces de las variedades resistentes presentaron niveles superiores de mRNA para

CHS y CHI, respecto a los encontrados en variedades susceptibles (P‹0,05). El

comportamiento encontrado para la variedad R3, puede estar asociado a sus

características fenotípicas en campo, tal y como se discutirá más adelante.

Es importante citar que, para la enzima PAL, no se determinaron los niveles

transcripcionales considerando que sus niveles de actividad no mostraron relación con la

resistencia a Fod. Algunos reportes han citado que variedades resistentes a patógenos

como los nemátodos Pratylenchus penetrans o Radopholus similis presentan niveles

transcripcionales constitutivos mayores de la PAL, al comparar con variedades

susceptibles, indicando un papel en resistencia (Baldridge et al. 1998; Paparu et al.

2007). Sin embargo, en el caso del clavel es evidente que el papel de la enzima PAL a

nivel constitutivo puede estar asociado entre otros fenómenos, a la generación de los

bloques para la construcción de lignina (Dixon & N. L. Paiva 1995) proceso que a su vez

puede estar relacionado con otras características fenotípicas propias de la planta.

91

8Figura No. 8. Niveles transcripcionales de genes codificantes para CHS y CHI a nivel de raíz en variedades de clavel de dos fincas productoras ubicadas en diferentes municipios de la sabana de Bogotá. Finca 1, Tocancipa-Grupo Chia: Tasman (S1), Star (S2), Komashi (R1), Gioele (R2) y L.P. Candy (R3). Finca 2, S.B. Talee: Spitfire (S3), Bellisima (S4), Topacio (R4) y Esperia (R5). A) CHS, B) CHI. Las barras verticales presentan la desviación estándar de cada promedio (n = 3). Los valores para cada variedad y cada determinación con diferente letra, presentan diferencias significativas (P < 0.05). S=susceptible y R= Resistente a Fod

A través de la evaluación de los niveles de actividad y niveles transcripcionales de las

enzimas CHS y CHI en raíces de clavel, se evidenció que los valores encontrados en las

variedades resistentes son mayores que los de las susceptibles (figuras No. 7B, 7C y 8).

Esto indica que a nivel constitutivo, las variedades resistentes de clavel presentan un

metabolismo favorable para la producción de flavonoides. En general, la mayoría de las

investigaciones sobre estas enzimas en defensa vegetal han estado enfocadas hacia su

inducción durante la infección y pocos hacen referencia al papel pre-infeccional que

pueden tener durante la biosíntesis de fitoanticipinas. Sin embargo, se ha reportado que

altos niveles de transcripción constitutivos, presentes de manera natural (Baldridge et al.

1998) o de manera artificial, ya sea por ingeniería genética (Loren-Kukula et al 2007) o

por el uso de inductores (Fofana et al. 2002), pueden generar un aumento en los niveles

de actividad de las enzimas y de metabolitos con potencial como fitoanticipinas.

Bladridge et al (1998) encontraron que altos constitutivos altos de mRNA para CHS en

raíces de variedades resistentes de alfalfa (Medicago sativa L), podían estar asociados

con la resistencia al nemátodo Pratylenchus penetrans, proponiendo así su papel en

defensa preexistente o constitutiva.

0

1

2

3

4

5

6

7

8

S1 S2 R1 R2 R3 S4 S5 R4 R5

Niv

ele

s d

e m

RN

A

ge

nes

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ican

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CH

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4,6

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5,6

5,8

6

6,2

S1 S2 R1 R2 R3 S4 S5 R4 R5

Niv

ele

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e m

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A

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ara

CH

S (

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o.

Co

pia

s / µ

g R

NA

to

tal

extr

aíd

o)

a

FINCA 1 FINCA 2 FINCA 1 FINCA 2

ab ab

bc

ab

c bc

a

c

a

b

c

b

a

c

d

ab a bc

A B

92

2.3.4. Análisis de correlación de Pearson

En la Tabla No. 7 se presentan los resultados del análisis de correlación entre los

parámetros, evaluados a nivel de raíz, usando la herramienta estadística de Pearson

(Azzimonti 2003). Se determinó que existe correlación positiva entre las variables,

contenido de fenoles totales (CFT), Flavonoides totales (Flav) y actividad antioxidante,

evaluada como inactivación de los radicales DPPH y ABTS (coeficientes entre 0.67 a

0.89 α=0.05), indicando que, dichos metabolitos están asociados a la capacidad

antioxidante que exhiben los extractos obtenidos a partir de esta especie vegetal, así

como ha sido reportado en otras plantas (H. Zhao et al. 2008; C. Xu et al. 2010; Lizcano

et al. 2010; Barros et al. 2012). Así mismo, se determinó que a nivel constitutivo

solamente la actividad enzimática CHI presentó una correlación positiva con los niveles

de flavonoides y con los niveles de actividad antioxidante DPPH (correlación de Pearson

0.82 y 0.85). Estudios funcionales con la enzima CHI han demostrado su papel en la

regulación de los niveles de flavonoides en diferentes plantas (Schijlen et al. 2004). Por

ejemplo, la sobre expresión de una secuencia heteróloga de CHI en Saussurea

involucrata generó un aumento significativo en los niveles de apigenina, un flavonoide

con innumerables propiedades biológicas (F.-X. Li et al. 2006). Así mismo, se ha

encontrado su inducción a nivel transcripcional durante el ataque de microrganismos

patógenos y se ha propuesto un papel en resistencia a enfermedades (Morkunas et al.

2011). Considerando que la enzima PAL participa en la primera reacción de la ruta

fenilpropanoide, que genera una alta cantidad de metabolitos asociados a diferentes

procesos, no solo flavonoides, no es extraño que los niveles de esta enzima y los niveles

de estos metabolitos o de actividad antioxidante, no presenten correlación estadística

(coeficientes de 0.28 y 0.29). Para el caso de la actividad CHS, teniendo en cuenta sus

niveles de actividad en las variedades resistentes de clavel, en la presente investigación

se propone un papel en la regulación de niveles de flavonoides y en resistencia, así como

se ha sugerido en diferentes especies vegetales (Schijlen et al. 2004; Lozovaya et al.

2007; Arfaoui et al. 2007). Es probable que la baja correlación estadística entre los

niveles de estos metabolitos y la actividad de esta enzima se deba a que participa en la

generación no solo de flavonoides, sino también de chalconas, las cuales se pueden

encontrar de manera natural en las plantas (Stevens & Page 2004; Vogel et al. 2008).

Las chalconas en clavel han sido reportadas en flores de algunas variedades de flores

amarillas (Yoshida et al. 2004) y se ha propuesto que se pueden acumular por la

intervención de mecanismos que evitan la acción generalmente inmediata de la enzima

93

CHI (Yoshida et al. 2004; Schlangen et al. 2009). No se puede descartar la presencia de

estos mecanismos en otros órganos de las plantas de clavel, considerando la alta

diversidad de metabolitos secundarios que se pueden encontrar en las raíces de esta

planta (Higuera 2001). Sin embargo, es necesario hacer estudios adicionales que

permitan profundizar el papel de las chalconas en órganos diferentes a los pétalos del

clavel.

Tabla No. 7. Coeficientes de correlación de pearson

CFT Flav ABTS DPPH PAL CHS CHI mRNA

CHS

mRNA

CHI

CFT 1

Flav 0,89 1

ABTS 0,76 0,77 1

DPPH 0,67 0,72 0,77 1

PAL 0,29 0,28 0,34 0,61 1

CHS 0,04 0,39 0,48 0,55 0,40 1

CHI 0,64 0,82 0,65 0,85 0,52 0,59 1

mRNACHS 0,31 0,40 0,73 0,80 0,68 0,75 0,67 1

mRNACHI 0,26 0,14 0,61 0,58 0,62 0,33 0,28 0,81 1

CTF: Contenido de fenoles totales, Flav: Contenido de flavonoides totales, ABTS: Actividad antioxidante sobre

ABTS, DPPH: Actividad antioxidante sobre DPPH, PAL: Actividad enzimática fenilalanina amonio liasa, CHS:

Actividad enzimática chalcona sintasa, CHI: Actividad enzimática chalcona isomerasa, mRNACHS: Niveles

transcripcionales chalcona sintasa, mRNACHI: Niveles transcripcionales chalcona isomerasa

Dentro de los resultados encontrados en esta investigación también se pudo evidenciar

que la regulación de estas enzimas en clavel puede darse a nivel transcripcional,

considerando la correlación encontrada entre los niveles de CHS y mRNA de CHS

(Correlación de Pearson 0.75 α=0.05). La regulación a nivel transcripcional de las

enzimas involucradas en la biosíntesis de flavonoides se ha documentado ampliamente

(Schijlen et al 2004). Sin embargo, es bien conocido que ésta se puede dar en otros

niveles, por ejemplo a nivel pos-transcripcional por acción de mecanismos de RNA

interferente (Depicker & Montagu 1997). De acuerdo al presente estudio, los mecanismos

que actúan para la regulación de estas enzimas en el clavel pueden ser al parecer de tipo

transcripcional, dada la correlación entre los niveles de actividad enzimática y los niveles

94

de mRNA. Sin embargo, considerando lo reportado en otras especies como en soya

(Glicine Max), en la que se han encontrado otros puntos de regulación

postranscipcionales para CHS, no se puede descartar la acción de mecanismos alternos

en otros órganos y procesos en el clavel (Senda et al. 2004; Kasai et al. 2004). Así como

(Claudot A. C. et al. 1999) encontraron correlación entre los niveles transcripcionales, la

actividad enzimática y metabolitos de tipo flavonoide presentes en un hibrido de nogal

(Juglans nigra x Juglans regia), en raíces de clavel también se evidenció dicha relación a

nivel constitutivo, indicando que estas enzimas son responsables de generar metabolitos

activos que pueden jugar un papel como fitoanticipinas ante el patógeno causal del

marchitamiento vascular. Es importante citar que se deben realizar estudios adicionales

que pretendan profundizar en si las diferencias encontradas a nivel transcripcional se

deben a diferencias genéticas entre variedades o a diferencias en la activación

constitutiva de factores de transcripción entre las mismas.

Al respecto, es importante anotar que si se tiene en cuenta la correlación positiva entre

los niveles de mRNA de CHS y CHI (Correlación de Pearson 0.81), es probable que la

acumulación de mRNA para estas enzimas se presente en clavel de manera simultánea

y coordinada por la acción de los mismos factores de transcripción (Vom Endt et al. 2002;

Broun 2005), así como se ha reportado en especies como Arabidopsis thaliana (Mehrtens

et al. 2005). Sin embargo, es necesario realizar estudios adicionales que permitan

confirmar la presencia de este proceso de regulación en el clavel.

2.3.5. Análisis de componentes principales PCA

Los análisis estadísticos multivariados se constituyen en una herramienta de interés para

la clasificación y agrupamiento de genotipos vegetales, teniendo en cuenta parámetros

de su metabolismo secundario (Hossain et al. 2011). De acuerdo con el análisis de

componentes principales para los parámetros asociados a la biosíntesis de flavonoides

en el clavel (figura No. 9A), con excepción de la variedad Komashi Blanco (R), la cual se

encuentra en el lado derecho de la gráfica, el PC1 (62.6%) permite agrupar las

variedades en función de su nivel de resistencia al marchitamiento vascular. De esta

manera las variedades resistentes se encuentran agrupadas hacia el lado izquierdo de la

gráfica, mientras que las variedades susceptibles lo hacen al derecho. Por otro lado, el

PC2 (19.8%), permite explicar la variación propia determinada por la localización de la

finca y el suelo usado en el enraizamiento. Esto considerando que las variedades

95

provenientes de la finca 1 (Grupo Chia-Tocancipa) se encuentran en la parte superior de

la gráfica, mientras que las de la segunda finca (Cota-SB Talee) lo hacen en la parte

inferior. A pesar de que (L. S. Wu et al. 2009) no encontraron diferencias importantes en

los niveles de flavonoides en Houttuynia cordata en función de la región geográfica, se ha

reportado que las condiciones ambientales, el suelo de la siembra, la humedad y otros

factores externos pueden determinar los niveles de los metabolitos secundarios, entre

ellos los flavonoides (Winkel-Shirley 2002; J.-T. Lin et al. 2010; Agati et al. 2012;

Ballizany et al. 2012). Este es el caso de Glycin tomentella, en donde se determinó que el

suelo usado en la siembra afecta los niveles de algunos flavonoides en raíces (J.-T. Lin

et al. 2010).

9Figura No. 9. Análisis de componentes principales para metabolitos, actividades enzimáticas y niveles

transcripcionales para el metabolismo de flavonoides en raíces de clavel. A) Distribución de variedades de clavel en los componentes de variación. B) Distribución de las variables evaluadas en los componentes de variación (Gráfica de cargas o loadings)S=susceptible y R= Resistente a Fod

Considerando que el componente PC1 permitió explicar la mayor parte de la variación de

los resultados obtenidos, con un 62.6%, se propone que existe una relación entre los

niveles de resistencia a la enfermedad y la biosíntesis de flavonoides a nivel de la raíz.

Este resultado tiene potenciales aplicaciones considerando que una agrupación de

variedades resistentes y susceptibles con base en los parámetros asociados al

metabolismo secundario, puede ser una herramienta candidata para la discriminación de

variedades en función de la resistencia a la enfermedad (figura No. 9 A). La aplicación

PC1

PC2

Act CHS

mRNA CHS

mRNA CHI

Act PAL

Act CHI Gioele (R)

Komashi (R)

Topacio (R)

Esperia (R)

Tasman (S)

Star (S)

Spitfire (S)

Bellisima (S)

L.P Candy (R)

PC1

PC2

Resistencia Susceptibilidad

Finca 1

Finca 2

A B

96

del PCA para la clasificación de variedades de cebada (Hordeum vulgare L) usando

como variables los contenidos de fenólicos, flavonoides y actividad antioxidante, se ha

planteado como una alternativa para la selección de variedades con características

organolépticas de interés (H. Zhao et al. 2008). En general, el PCA basado en diferencias

en el contenido de fenoles, flavonoides y actividad antioxidante está siendo usado para la

clasificación de variedades de diferentes especies vegetales (C. Xu et al. 2010; Hossain

et al. 2011; Bernaert et al. 2012). Reportes recientes han incluido también para este tipo

de clasificaciones, datos tanto a nivel de actividades enzimáticas y niveles de

transcripción (Thill et al. 2012). Esto se debe a que la evaluación conjunta de las rutas

biosintéticas a nivel de la presencia de proteínas activas (actividad enzimática) y niveles

de mRNA, permite evaluar de manera simultánea cuáles son aquellos posibles puntos de

regulación de la ruta. Es importante citar que a dicho patrón de clasificación usando PCA,

reportado por esta investigación, solo se escapa la variedad resistente Komashi blanco,

la cual presentó niveles intermedios de flavonoides, actividad antioxidante, actividad de la

enzima CHS y niveles transcripcionales de CHI. Se sabe, por información de los

cultivadores, que dicha variedad presenta también niveles menores de resistencia a la

enfermedad en campo.

La gráfica de distribución de variables (figura No. 9B), muestra cuales son las principales

variables que influyen sobre la generación de los componentes generados (PC1, PC2,

PC3, etc). En este caso se evidencia que las variables mRNACHS y Act CHS, son las

que tienen un mayor efecto sobre los componentes PC1 Y PC2. Esto nos indica que la

distribución de variedades susceptibles y resistentes en la figura 9A, está influenciada en

gran medida, por los niveles de actividad y transcripcionales de la enzima chalcona

sintasa. Bajo estos resultados se puede concluir que los niveles de esta enzima, son

importantes en el agrupamiento estadístico realizado y generan particular interés cuando

se requiera seleccionar un parámetro con el fin de profundizar en el papel del

metabolismo de flavonoides en la resistencia del clavel.

De acuerdo con esta fase de la investigación, se propone que uno de los componentes

de la resistencia del clavel al marchitamiento vascular, es una mayor biosíntesis

constitutiva de flavonoides a nivel de la raíz, proceso que al parecer está regulado a nivel

enzimático por las enzimas CHI y CHS. Esta propuesta se realiza teniendo en cuenta la

naturaleza poligénica de la resistencia del clavel al marchitamiento vascular reportada

(Baayen et al. 1991), en donde se ha determinado que son varios los componentes

97

génicos que determinan el fenotipo resistente en el clavel. Así mismo, se propone que la

biosíntesis de estos metabolitos puede llegar a ser un potencial marcador de resistencia

que deberá ser evaluado en un mayor número de variedades con el fin de avanzar en la

generación de marcadores para la selección de variedades de clavel resistentes al


2.4. Conclusiones

Las condiciones seleccionadas para la extracción de flavonoides totales y actividad

antioxidante a partir de tallos y raíces de clavel, incluyen un tratamiento con metanol al

80% y ultrasonido por 15min.

Los niveles constitutivos de flavonoides y actividad antioxidante en clavel fueron mayores

en raíces que en tallos para todas las variedades evaluadas, indicando que existe una

regulación órgano dependiente de la biosíntesis de este tipo de metabolitos, determinada

por las necesidades adaptativas de la planta.

La actividad antioxidante obtenida a partir de raíces de clavel y evaluada mediante los

métodos espectrofotométricos, está asociada a la presencia de metabolitos de tipo

fenólico y/o flavonoide, tal y como ha sido reportado para otras especies vegetales.

Los niveles constitutivos de flavonoides y actividad antioxidante en raíz, son superiores

en las variedades resistentes al comparar con las susceptibles, indicando un posible

papel de dichos metabolitos en los mecanismos de defensa pasiva asociada con la

resistencia al patógeno.

Los niveles de actividad CHS y CHI están asociadas con resistencia al marchitamiento

vascular en las variedades evaluadas, indicando que a nivel constitutivo, estas enzimas

regulan la generación de los metabolitos de tipo flavonoide y capacidad antioxidante en

las raíces del clavel. Dicho comportamiento se sustenta a nivel estadístico en especial

para la enzima CHI de acuerdo a la correlación entre los niveles de actividad enzimática

y metabolitos.

Los niveles transcripcionales de los genes codificantes para CHS y CHI están asociados

con resistencia a la enfermedad en las variedades estudiadas y con la actividad para las

98

enzimas que dichos genes codifican, en especial para la CHS, para la que se encontró

una correlación estadística entre actividad enzimática y niveles de mRNA.

De acuerdo con los análisis estadísticos multivariados se puede concluir que el PCA

permitió agrupar las variedades de clavel objeto de estudio en esta investigación, en

función de la resistencia a la enfermedad, posicionándose éste como un posible

marcador para la selección de variedades resistentes al marchitamiento vascular.

La biosíntesis de flavonoides a nivel de las raíces del clavel está asociada con la

resistencia al marchitamiento vascular y está mayormente determinada por la

transcripción de los genes codificantes para las enzimas chalcona sintasa y chalcona

isomerasa, en este organo, primer punto natural de contacto entre la planta y el

patógeno.

99

3. Biosíntesis de metabolitos fenólicos en clavel durante su interacción con Fusarium oxysporum f. sp. dianthi

Resumen

Se evaluó el efecto que tiene la inoculación con Fusarium oxysporum f. sp. dianthi raza 2

sobre algunos parámetros bioquímicos y moleculares asociados a la biosíntesis de

fenólicos en tallos y raíces de las variedades de clavel L.P Candy (Resistente) y Tasman

(Susceptible). Esta evaluación comparativa buscó determinar si la biosíntesis de dichos

compuestos, se activa como respuesta asociada a la resistencia al patógeno causal del


Se determinó que en la variedad resistente, tanto a nivel de la raíz como a nivel del tallo,

se presenta un aumento en los niveles de fenoles y flavonoides totales, asi como de

actividad antioxidante, durante las primeras horas de la interacción con el patógeno.

Considerando que en la variedad susceptible dicho aumento se presentó solo a nivel de

la raíz, a tiempos mas tardíos y con niveles menores a los encontrados en la variedad

resistente, se concluyó que la regulación espacio temporal de las cantidades de estos

metabolitos es importante en la resistencia de la planta. Se encontró usando la técnica de

HPLC, que al menos 4 compuestos con características químicas similares a las de los

flavonoides, están asociados a estos procesos en la raíz (Grupo I) y 2 compuestos a nivel

del tallo (Grupo II). Se propone al Kaemferido 3-O-β-D–glucopiranosil-(1→2)-O--L-

ramnopiranosil-(1→6)- β-D –glucopiranosido como perteneciente a dichos grupos de

compuestos en raíz, y al Kaemferol 3-O-β-D–glucopiranosil-(1→2)-O--L-

100

ramnopiranosil-(1→6)-β-D–glucopiranosido en el tallo. Los aumentos en los niveles de

flavonoides en las raíces de la variedad resistente, se asociaron con la modulación de la

actividad de las enzimas chalcona sintasa (6 y 48hpi), chalcona isomerasa (48hpi) y

fenilalanina amonio liasa (96 hpi). Para el caso del tallo, solo los niveles de la enzima

chalcona sintasa, presentaron un cambio significativo en esta variedad (96hpi). El

aumento en actividad CHS y CHI en raíz a las 48 hpi parece estar asociado al cambio en

los niveles de mRNA para estas enzimas a las 12 y 24 hpi. En el tallo, los niveles de

mRNA para la enzima CHS aumentaron en la variedad resistente inoculada con respecto

al control a las 48hpi. En general, se evidenció un aumento de la biosíntesis de

flavonoides en tallos y raíces de la variedad resistente inoculada, indicando que estos

metabolitos están asociados a los mecanismos de defensa activa del clavel, durante su

interacción con Fod.

Abstract

We evaluated the effect of Fusarium oxysporum f. sp. dianthi race 2 inoculation, on some

biochemical and molecular parameters associated to flavonoid biosynthesis in stems and

roots of two carnation cultivars (LP Candy resistant and Tasman susceptible). This

comparative evaluation aimed to determinate the role of biosynthesis of flavonoids in

active defense mechanisms associated to resistance to vascular wilt in carnation

The resistant cultivar showed increased levels of total phenols and flavonoids, as well as

antioxidant activity, at both root (6.12 and 96 pih) and stem level (12 and 96 hpi). In the

susceptible cultivar, this increase was found at root level, at later times (96 hpi) and lower

levels, than those found in the resistant cultivar. Acording to these results, it was found

that spatio-temporal regulation of flavonoid and phenol levels is important in resistance to

vascular wilt. It was determined by HPLC that at least 4 compounds in roots (Group I)

and 2 in stems (Group II) with similar characteristics to those expected for flavonoids,

were associated to disease resistance. We are proposing as belonging to these groups,

the compounds Kaempheride 3-O-β-D-glucopyranosyl (1 → 2)-O- -L-rhamnopyranosyl-

(1 → 6) - β-D-glucopyranoside at root level and kaempherol 3-O-β-D-glucopyranosyl (1

→ 2)-O- -L-rhamnopyranosyl-(1 → 6) - β-D-glucopyranoside in stems. The increased

levels of flavonoids in the resistant roots were associated to activity of enzymes, chalcone

synthase (6 y48hpi), chalcone isomerase (48hpi) and phenylalanine ammonia lyase (96

101

hpi). At stem, the levels of the enzyme chalcone synthase, showed a significant change at

96hpi. It was determined that the enzymatic response at 48hpi for CHS and CHI in roots,

was associated with increased transcriptional levels at 12 and 24 hpi. In stems, levels of

mRNA for CHS increased in the resistant cultivar inoculated when were compared to the

non-inoculated control at 48hpi. In conclussion, an increased flavonoid biosynthesis in the

inoculated roots and stems of resistant cultivar (L.P Candy) showed that these

metabolites are associated with active defense mechanisms in carnation, during its

interaction with Fod.

3.1. Introducción

El cultivo de variedades resistentes de clavel (Dianthus caryophyllus L) se ha posicionado

como una de las herramientas más eficientes para el manejo del marchitamiento vascular

causado por Fusarium oxysporum f. sp. dianthi. Es por ello que dentro de las

características de mayor interés en los programas de cruzamiento se encuentra la

resistencia en campo a esta enfermedad. En estudios realizados en estas variedades se

ha determinado que la resistencia al patógeno es multigénica (Baayen et al. 1991) y que

la capacidad para detener la colonización y degradación de los tejidos vasculares está

determinada por diversos factores que se deben activar de manera coordinada durante la

infección. La acumulación de diversos metabolitos secundarios es uno de estos procesos

y se ha identificado que puede estar asociado a la resistencia, tanto por su papel en el

fortalecimiento de paredes celulares (Niemann et al. 1991; Higuera & Ebrahim-Nesbat

1999; Ouellette et al. 2004), como por su acción antifúngica directa sobre el patógeno

(Baayen & Niemann 1989; Curir et al. 2001; Curir et al. 2003; Galeotti, Barile, Curir, et al.

2008). Se ha reportado que en el clavel, esta respuesta depende del órgano de la planta

involucrado, ya que a nivel del tallo algunos de estos compuestos son nitrogenados

derivados del ácido antranilico (Baayen & Niemann 1989), mientras que a nivel de la raíz,

primer punto de contacto con el patógeno, dichos metabolitos nitrogenados no se

detectan, pero si otros metabolitos de tipo fenólico (Higuera & Montes de Gómez 1996).

Particular interés en este modelo ha generado la presencia de flavonoides con actividad

antifúngica contra Fod a nivel constitutivo e inducible (Curir et al. 2001; Curir et al. 2003;

Curir et al. 2005; Galeotti, Barile, Curir, et al. 2008). Se ha propuesto al respecto, que

estos compuestos pueden cumplir un papel central dentro de la respuesta de defensa

102

activa o inducible de la planta, como es el caso del compuesto kaempferido 3-O-[2G--D-

glucopiranosil]--rutinosido (tabla No. 4). Este presentó aumento en sus niveles en tallos

y raíces de la planta, durante la inoculación con el patógeno y se clasificó como un

compuesto similar a fitoalexina (Curir et al. 2005). Esta clasificación se debe a que,

aunque cumple con la premisa de presentar un aumento durante la inoculación con el

patógeno, al encontrarse de manera constitutiva, no puede ser clasificado como una

fitoalexina real. Sin importar su clasificación en este modelo particular, la naturaleza

inducible de estos compuestos genera particular interés en los mecanismos de defensa

del clavel, considerando el papel protagónico que pueden tener en la resistencia a

patógenos como Fusarium, en donde la maquinaria antioxidante de la planta puede jugar

un papel central (Farnochi et al. 2005; Lorenc-Kukuła et al. 2007; Sá et al. 2009; Kamil

Kostyn et al. 2012; Barna et al. 2012).

Diversos estudios realizados con mutantes han permitido determinar que los niveles de

estos metabolitos pueden estar regulados por algunas de las enzimas que participan en

su biosíntesis, como son fenilalanina amonio liasa (PAL), chalcona sintasa (CHS) y

chalcona isomerasa (CHI) (Schijlen et al. 2004; Winkel-Shirley 2002; Vogt 2010). Se ha

determinado que la modulación de los niveles de actividad y transcripcionales de estas

enzimas durante la infección, puede estar asociada a la resistencia vegetal a patógenos

del género Fusarium (P. L. A. Chang et al. 2008; Arfaoui et al. 2007; Lorenc-Kukuła et al.

2007; Kamil Kostyn et al. 2012; Morkunas et al. 2010). En el clavel, se han realizado

diversos estudios sobre la biosíntesis de estos metabolitos en procesos como floración y

senescencia (Fukui et al. 2003; Mato et al. 2000; Yoshida et al. 2004). Si bien es cierto

que, de acuerdo a la primera etapa de este estudio, se determinó que los niveles

constitutivos de actividad y mRNA para las enzimas CHS y CHI en raíces del clavel,

están asociados a los niveles de flavonoides totales (Ardila, S. T. Martinez, et al. 2013),

no se conoce como se regula la biosíntesis de estos metabolitos en la planta durante la

infección con el patógeno. Esto es central, considerando que solo mediante evidencias

bioquímicas o moleculares que indiquen que las rutas involucradas en la biosíntesis de

estos metabolitos se activan por efecto de la inoculación, se puede postular su papel en

los mecanismos de defensa del clavel. En la discusión acerca del papel de un metabolito

en defensa para un modelo planta-patógeno determinado, debe contrastarse los niveles

de dichos metabolitos con determinaciones asociadas a las actividad y expresión de

genes para enzimas involucradas en su biosíntesis (Hammerschmidt 1999; Treutter

103

2006). En esta etapa de la investigación, se evalúo el efecto que tiene la inoculación con

Fod sobre los niveles de compuestos fenólicos, flavonoides totales y actividad

antioxidante, en 2 variedades de clavel que presentan diferentes niveles de resistencia a

la enfermedad. Así mismo, se compararon los perfiles por HPLC de los metabolitos tipo

flavonoide y se verificó su inducción en la planta durante la infección. Los niveles de

estos metabolitos se contrastaron con los niveles de actividad y transcripcionales de

algunas de las enzimas involucradas en su biosíntesis, (PAL, CHS y CHI). El análisis

conjunto de estos resultados permitió obtener información de los fenómenos que pueden

ser probables puntos de regulación durante la interacción con el patógeno y se postulan

aquellos mecanismos que pueden estar asociados con la resistencia a la enfermedad.

3.2. Materiales y Métodos

3.2.1 Material biológico

Para el presente estudio se usaron esquejes indexados libres de patógenos, con 3

semanas de enraizamiento, de dos variedades comerciales de clavel (Dianthus

caryophyllus L) cultivadas en Colombia (L.P Candy, Resistente y Tasman, Susceptible)

suministradas por la empresa Grupo Chia ubicada en Gachancipá (Sabana de Bogotá,

Colombia). Se usó un aislamiento de Fusarium oxysporum f. sp. dianthi raza 2 obtenido

por la empresa floricultora Grupo Chia a partir de plantas susceptibles con sintomatología

típica de marchitamiento vascular. Se evidenció a través de microscopia (50X) la

presencia de macroconideas típicas de la especie y se verificó con herramientas

moleculares la especie (Abd-elsalam et al. 2003) y la raza (Chiocchetti et al. 2009). Este

patógeno se mantuvo en medio sólido PDA hasta el momento de la inoculación.

3.2.2. Evaluación de parámetros asociados con la biosíntesis de flavonoides durante la infección con el patógeno

Para llevar a cabo este análisis comparativo de los parámetros de interés entre las

variedades seleccionadas, se realizó un ensayo in vivo de inoculación, usando cuatro

tratamientos (T1 resistente control; T2, resistente inoculado; T3, susceptible control; T4,

susceptible inoculada) y diferentes tiempos de muestreo posinoculación. Para ello se

104

siguió el diagrama de flujo descrito a continuación. Los detalles de las diferentes etapas,

se describen en los numerales siguientes.

10Figura No. 10. Diagrama de flujo general para el estudio de parámetros asociados a la biosíntesis de flavonoides en clavel durante la infección con el patógeno Fod

3.2.3 Proceso de Inoculación

La mitad de los esquejes (150) de las dos variedades de clavel fueron inoculados con el

patógeno por inmersión de las raíces en una suspensión de conidias durante 20

segundos tal y como se describió previamente (Higuera & Montes de Gómez 1996). El

inóculo fue preparado en medio Czapek Dox Broth previamente esterilizado, mediante

AISLAMIENTO DE Fusarium oxysporum f.

sp, dianthi raza 2

DETERMINACIÓN DE FENOLES TOTALES,

FLAVONOIDES TOTALES Y ACTIVIDAD

ANTIOXIDANTE (ABTS Y DPPH)

Métodos

espectrofotométricos

ENSAYO in vivo PROCESO DE INOCULACIÓN

T1, Resistente Control, T2 Resistente inoculado, T3 Susceptible control, T4 Susceptible inoculado

MUESTREO POSTINOCULACIÓN

0, 6, 12, 24, 48 y 96 HORAS

COMPARACIÓN DE

PERFILES Y ANÁLISIS

CUANTITATIVO

HPLC-UV

VARIEDADES DE CLAVEL CON DIFERENCIAS

EN LOS NIVELES DE RESISTENCIA AL

MARCHITAMIENTO VASCULAR

VARIEDAD RESISTENTE L.P. Candy

VARIEDAD SUSCEPTIBLE Tasman

NIVELES DE ACTIVIDAD ENZIMÁTICA (chalcona

sintasa, chalcona Isomerasa, fenilalanina

amonio liasa)

Métodos espectrofotométricos y

HPLC

NIVELES

TRANSCRIPCIONALES PARA LOS GENES DE LAS

ENZIMAS (chalcona sintasa, chalcona isomerasa,

fenilalanina amonio liasa)

RT- PCR en tiempo real

APROXIMACIÓN A LA

ESTRUCTURA QUÍMICA DE

COMPUESTOS DE INTERÉS

HPLC-DAD HPLC-MS

105

agitación por 7 dias a 25oC, en erlenmeyers de 200 mL. El contenido del medio fue

diluido con agua estéril para obtener una concentración final de 1,0 x 106 conidias/mL. De

manera simultánea, 150 esquejes control de estas mismas variedades, fueron sometidos

al mismo proceso pero usando agua estéril en cambio de inóculo. Se contó asi con 4

tratamientos: T1 resistente control, T2, resistente inoculado, T3, susceptible control, T4,

susceptible inoculado. Una vez inoculados, los esquejes fueron sembrados en recipientes

plásticos sobre una mezcla de suelo y cascarilla de arroz 50/50 previamente esterilizada

(30 plántulas/recipiente). Estos fueron dispuestos al azar, de acuerdo al diseño

experimental completamente aleatorizado propuesto (figura No. 11). Los muestreos se

realizaron a las 0, 6, 12, 24, 48 y 96 horas posinoculación, tanto de los esquejes control

como de los inoculados, para las dos variedades, tomando 25 individuos de cada uno de

los 4 tratamientos. Los esquejes fueron lavados con abundante agua para eliminar el

exceso de suelo y separados los tallos de las raíces, para ser mantenidos a -80oC hasta

la realización de los análisis posteriores.

11Figura No. 11. Distribución de esquejes en el arreglo experimental completamente aleatorizado planteado en el estudio de parámetros asociados a la biosíntesis de fenólicos en clavel durante la infección con Fod

3.2.4. Evaluación de compuestos fenólicos, flavonoides y

actividad antioxidante

Esta evaluación se realizó en tallos y raíces de clavel para los diferentes tratamientos

bajo las mismas condiciones de extracción y cuantificación de metabolitos, descritas en

la primera etapa de esta investigación (numerales 2.2.3-2.2.6). Cada determinación se

realizó usando triplicado biológico y duplicado analítico. La comparación estadística

(ANOVA de una sola vía) se realizó en cada tiempo, para cada órgano de la planta,

usando el programa Statgraphics 5.1.

Resistente control

Resistente inoculado Susceptible inoculado

Susceptible control

106

3.2.5. Comparación de perfiles cromatográficos por HPLC

Considerando los resultados obtenidos en el contenido de fenoles totales, flavonoides

totales, y de actividad antioxidante, se seleccionaron aquellos tiempos en los que se

presentaron cambios estadísticamente significativos, asociados a la inoculación con el

patógeno (raíz 6 y 96 horas, tallo, 96 horas). La evaluación de perfiles cromatográficos

por HPLC se realizó de acuerdo con las condiciones de separación y análisis que fueron

puestas a punto, según los ensayos preliminares en los que se seleccionaron gradientes,

solventes y volúmenes de inyección. Se usó un cromatógrafo líquido LC-20AT Shimadzu

®, una columna RP-18 Phenomenex® (250mmx4.60mm, 5 micras) y un detector UV-VIS

Prominencia ® SPD-20AT. Para la separación las condiciones fueron las siguientes: fase

móvil A: agua: H3PO4 400:2 pH 2,5, fase móvil B: acetonitrilo 100% y el gradiente como

se describe a continuación: 0 min A 100%, 0 minutos-10 minutos B 15%, 10 min-45 min

B 30%, 45min- 70min B 50%, 70min- 75min B100%, 75min- 80min B100%, 80min- 82min

B 0%, 82min-90min B 0%. El Flujo usado fue de 1mL/min y las inyecciones se realizaron

usando un loop de 100µL. Para la detección se usaron las absorbancias a 280 y 350nm,

esta última longitud de onda fue la seleccionada para el análisis de flavonoides, de

acuerdo con reportes previos en esta especie vegetal (Galeotti, Barile, Lanzotti, et al.

2008). Se hicieron ensayos con diferentes patrones de manera independiente y con

mezclas de los mismos para asegurar la separación con el gradiente seleccionado. Las

sustancias usadas como patrones fueron ácido cafeico SIGMA®, ácido ferúlico SIGMA®,

quercetina TRANSMIT® y kaempferol TRANSMIT®. La comparación de los perfiles se

realizó a 350nm, usando los valores de áreas para cada pico, correspondiente a un

compuesto o grupo de compuestos que fueron separados de acuerdo a las condiciones

seleccionadas. Los resultados fueron analizados mediante ANOVA de una vía utilizando

Statgraphics ® Software versión 5.1. Así mismo, mediante análisis de PCA se evaluaron

similitudes entre los tratamientos en términos de los compuestos o grupos de

compuestos cuantificados, usando el software de la línea de las matrices de Nia.

http://lgsun.grc.nia.nih.gov/ANOVA/index.html. Con el fin de normalizar para el análisis de

PCA, todos los datos se transformaron con la función (Log10 X). Bajo estas condiciones,

se seleccionaron algunos compuestos o grupos de compuestos que al estar

probablemente asociados con la resistencia a la enfermedad, fueron sujetos a análisis

posteriores con el fin de obtener información estructural de los mismos.

107

3.2.6. Aproximación a la estructura química de algunos

compuestos de interés.

Con el fin de obtener información acerca de la estructura química de los compuestos (o

grupo de compuestos) que al presentar aumento de sus niveles en la variedad resistente

durante la infección, presentaban interés particular en este estudio, se usaron técnicas

como HPLC-DAD y HPLC-MS. La obtención de los espectros UV se realizó en el

cromatógrafo líquido HPLC – DAD Merck-Hitachi D-7000, equipado con un detector de

arreglo de diodos L-4500, bomba inteligente L-6200A e interfase L-6000A. Las

condiciones de separación y análisis fueron las descritas previamente en el numeral

anterior 3.2.5. en la que se realizó la comparación cuantitativa de los perfiles

cromatográficos para los diferentes tratamientos. Para el análisis por HPLC-MS de baja

resolución se usó el equipo Shimadzu® LCMS- 2010 con bomba LC-10ADvp, detector

UV SPD-10Avp y detector de masas LCMS 2010EV. Las condiciones de separación en

este equipo fueron las mismas usadas anteriormente pero cambiando la fase móvil A por

una solución acuosa de acido acético pH 3,0. En el espectrómetro de masas se usó

electrospray (ESI) como fuente de ionización, con un voltaje de 1,5 kV y un flujo de gas

nebulizador (N2) de 1,5 mL/min.

3.2.7. Evaluación de actividades enzimáticas

La evaluación de las actividades enzimáticas fenilalanina amonio liasa (PAL), chalcona

sintasa (CHS) y chalcona isomerasa (CHI) durante la interacción con el patógeno, se

realizó de acuerdo a las condiciones de extracción y de cuantificación previamente

descritas, tanto en tallos como en raíces de clavel (2.2.7 y 2.2.8). Cada determinación se

realizó usando triplicado biológico y duplicado analítico. La comparación estadística se

realizó usando ANOVA de una sola vía para los datos de cada tiempo y para cada

órgano de la planta, se usó el programa Statgraphics 5.1.

108

3.2.8. Evaluación de niveles transcripcionales

La evaluación de los niveles de transcripción para los genes codificantes de fenilalanina

amonio liasa (PAL), chalcona sintasa (CHS) y chalcona isomerasa (CHI) durante la

interacción con el patógeno, se realizó de acuerdo a las condiciones previamente

descritas (2.2.9). Este análisis se llevó a cabo solo para aquellas enzimas que

presentaron cambios significativos en términos de su actividad enzimática. Los

cebadores usados para esta etapa de la investigación, son los que se describen en las

tablas No. 7 y 8. Cada determinación se realizó usando triplicado biológico y duplicado

analítico. Los resultados obtenidos después de la cuantificación absoluta se reportaron

como número de copias / pg cDNA (Y. Lu et al. 2012). Se verificó que no se presentaran

variaciones en la eficiencia de amplificación de muestras y patrones usando el algoritmo

reportado por (Ramakers et al. 2003). Los resultados también se presentan como la

relación de la expresión del inoculado con respecto al control (Desmond et al. 2008;

Godard et al. 2009), para evaluar diferencias propias del proceso de inoculación con el

patógeno. La comparación estadística de los resultados obtenidos de la cuantificación

absoluta, se realizó en cada tiempo, para cada órgano de la planta, usando ANOVA de

una sola via con el programa Statgraphics 5.1.

Tabla No. 8. Lista de cebadores usados para la cuantificación por PCR en tiempo real de los niveles de mRNA para los genes codificantes para fenilalanina amonio liasa

Nombre de la

proteína Cebadores Secuencia 5´ 3´

Tamaño del

fragmento

Fenilalanina amonio

liasa

PAL directo

PAL reverso

ACTTGGTCCCGCTTTCCTAC

GTGAGGATCTCACCGTTGG 85 pbs


La presente etapa de esta investigación buscó profundizar sobre los componentes

bioquímicos y moleculares que se activan durante la infección por Fod y que están

asociados con la resistencia al marchitamiento vascular del clavel. Particularmente se

evaluó si dentro de dichos mecanismos de defensa activa, se encuentra la biosíntesis de

109

flavonoides, metabolitos dinámicos que pueden cumplir diversos papeles en la defensa

vegetal. La información adquirida en esta fase de la investigación, complementaba el

panorama que se había generado en la etapa anterior en la que se había determinado

que a nivel constitutivo, las variedades resistentes de clavel presentan una biosíntesis de

flavonoides más activa que las variedades susceptibles (Ardila, S. T. Martinez, et al.

2013). Con este fin, se planteó el diagrama de flujo que se describió anteriormente (figura

No. 10). Este se encuentra dividido en tres grandes etapas, la primera correspondiente al

análisis de metabolitos, la segunda a las determinaciones de actividades enzimáticas y la

tercera a la evaluación de los niveles transcripcionales. Es importante comentar que, con

el fin de asegurar que las respuestas bioquímicas y moleculares estudiadas estuvieran

relacionadas con diferencias en los niveles de resistencia de las variedades objeto de

estudio, se hizo seguimiento del avance de la enfermedad durante cuatro semanas pos

inoculación y se determinó al final de este periodo, los niveles de incidencia al

marchitamiento de la enfermedad en cada uno de los tratamientos propuestos. Cada una

de las etapas de esta fase de la investigación se presenta a continuación de manera

independiente y finalmente se comparan en conjunto, con el fin de conocer el panorama

general de la modulación espacio-temporal de las respuestas evaluadas, para cada una

de las variedades en estudio.

Es importante resaltar que las condiciones de inoculación usadas en la investigación

presente, han permitido evaluar respuestas asociadas a la resistencia del clavel en

estudios previos (Higuera 2001; Ardila & Higuera 2005; Cuervo et al. 2009; Ardila et al.

2011). Se ha determinado que la inmersión de las raíces en una suspensión de conidias

del hongo, además de semejar las condiciones que el patógeno usa para infectar las

plantas en el campo, es la que presenta mayor efectividad en la infección, al comparar

con otras técnicas de inoculación de raíces como el “drench“ o la inoculación directa del

suelo (Higuera 2001). Considerando que se querían evaluar respuestas asociadas a

defensa en tallos y raíces, otras técnicas de inoculación como las que son usadas

directamente en el tallo, fueron descartadas. Dichas técnicas requieren además, del uso

de cortes o punciones en este órgano (Niemann & Baayen 1988; Baayen & Niemann

1989), condiciones que generan respuestas al estrés no deseadas que pueden interferir

con las respuestas a evaluar. La generación de heridas en papa (Solanum tuberosum)

por ejemplo, puede desencadenar aumentos en enzimas involucradas en metabolismo

de fenoles como las polifenoloxidasas (Thipyapong et al. 1995).

110

Durante este ensayo in vivo, los diferentes tratamientos propuestos se mantuvieron bajo

las mismas condiciones ambientales de iluminación, temperatura y humedad (figura No.

12). Esto permitió, en el momento de realizar el análisis de resultados, tener en cuenta

con base en los controles, el posible efecto que las condiciones ambientales pueden

presentar en los parámetros de interés, pues es sabido que por ejemplo altos niveles de

radiacion o altas fuerzas iónicas en la rizosfera, pueden afectar la biosíntesis de

flavonoides (Ryan et al. 2002; Agati et al. 2011).

12Figura No. 12. Fotografías del ensayo in vivo a las 2 horas poinoculación. A) vista general del ensayo con las 600 plantas usadas para los 4 tratamientos. B) Vista superior de un recipiente con plantas de la variedad susceptible. C). Vista superior de un recipiente con plantas de la variedad resistente

3.3.1 Evaluación de incidencia del marchitamiento vascular causado por Fusarium oxysporum f. sp. dianthi raza 2 en las dos variedades de clavel

La selección del material vegetal es un punto central en el éxito de cualquier estudio

comparativo sobre mecanismos de defensa vegetales y debe considerar la inclusión de al

menos 2 genotipos con diferencias marcadas en términos de la resistencia a la

enfermedad en estudio (Wise et al. 2007). La selección de las variedades que fueron

usadas en el presente estudio se realizó teniendo en cuenta la opinión de expertos de la

empresa de floricultura Grupo Chia (comunicación oral con el Ingeniero agrónomo

Alejandro Saavedra), quienes teniendo en cuenta su comportamiento en campo, han

clasificado a la variedad Tasman como susceptible y a la variedad L.P Candy como

A B C

111

resistente al marchitamiento vascular. Considerando su resistencia a la enfermedad, esta

última variedad ha sido usada como referente en otras investigaciones en las que se han

estudiado algunos cambios químicos que se presentan en la planta durante la

inoculación con el patógeno (Higuera 2001).

Adicional a los estudios previos y los reportes de la empresa floricultora proveedora del

material vegetal sobre el comportamiento de las variedades Tasman y LP Candy en

campo, se confirmó bajo las condiciones particulares de inoculación de este ensayo, que

efectivamente estas variedades se comportan diferencialmente en términos de la

resistencia a la enfermedad. Esto era importante considerando que la presión de inóculo

que se usó en el presente estudio, es superior a la comúnmente encontrada en el suelo

usado para los cultivos. Es por ello que se realizó una evaluación visual de la incidencia

de síntomas en las plantas controles e inoculadas de las variedades estudiadas, a

tiempos posteriores a los seleccionados para realizar los muestreos, cuando se espera,

se inicie la expresión de la sintomatología típica de la enfermedad.

Se determinó que a las 4 semanas posinoculación, la variedad susceptible inoculada,

presentó un proceso de marchitamiento evidente, con inclinación del tallo y

amarillamiento de las hojas del tercio inferior con visibles síntomas de deshidratación, en

un 87 % de los esquejes. Para las plantas control de esta misma variedad, un 14% de los

esquejes presentaban algún tipo de amarillamiento leve en sus hojas, el cual no fue

asociado con los síntomas típicos de marchitamiento. (figura No. 13. T3 y T4). En el caso

de la variedad resistente, solamente se presentó este mismo amarillamiento leve en

algunas de las plantas control e inoculadas, que correspondieron al 14 y 20% del total,

respectivamente (figura No. 13. T1 y T2). Este leve amarillamiento, que solo se presentó

en algunas de las hojas, no fue generalizado ni considerado grave, ya que aquellas

plantas que lo presentaban, se recuperaron posteriormente del mismo y fue asociado a la

adaptación a alguna condición ambiental del ensayo en el momento de la evaluación (4

semanas posinoculación). Es importante resaltar que la evaluación de las respuestas

bioquímicas se realizó a tiempos tempranos (máximo a 4 dias posinoculación), periodo

en el cual, tallos, raíces y hojas, presentaron una apariencia sana y vigorosa para ambos

genotipos estudiados. En dichos tiempos se espera se presenten los evetnos tempranos

asociados con la resistencia a la enfermedad (Beckman 2000; Zhou & F. Wu 2009;

Mandal et al. 2008; Van Pelt-Heerschap & Smit-Bakker 1999; Morkunas et al. 2011).

112

13Figura No. 13. Incidencia del marchitamiento vascular causado por Fod durante el ensayo in vivo con las variedades T1) variedad resistente control, T2) variedad resistente inoculada, T3) susceptible control, T4) Susceptible inoculada.

Finalmente, a las 8 semanas posinoculación, la presencia de los síntomas se evidenció

solamente en la variedad susceptible inoculada en la que el 100% de los individuos

evaluados (15 en total) presentaron un amarillamiento completo hasta el tercio superior,

con evidente pardeamiento del haz vascular del tallo y aspecto leñoso y hueco del

mismo, que les ocasionó la muerte. Esto se pudo observar mediante cortes transversales

realizados en algunas plantas seleccionadas comparadas con los respectivos controles

(tabla No. 9). Vale la pena anotar, que en este tiempo posinoculación, las plantas

controles de las dos variedades y las de la variedad resistente inoculada, no presentaron

la sintomatología típica del marchitamiento vascular. El corte transversal de la variedad

resistente inoculada, permitió evidenciar a su vez, la presencia de un anillo café en los

tejidos vasculares, típico de la activación de los mecanismos asociados con lignificación y

oxidación de compuestos fenólicos (tabla No. 9).

Bajo esta evidencia experimental, se confirmaron a nivel fisiológico, las diferencias en los

niveles de resistencia para las variedades objeto de estudio y se generó la confianza

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

T1 T2 T3 T4

INC

IDEN

CIA

DE

AM

AR

ILLA

MIE

NTO

()%

p

lan

tas

con

re

spe

cto

al t

ota

l)

TRATAMIENTO

113

necesaria para asociarlas con los resultados de los parámetros bioquímicos y

moleculares que se evaluaron.

Tabla No. 9. Cortes transversales de tallos para las variedades de clavel estudiadas, controles e inoculados a las 8 semanas posinoculación con Fod

Control Inoculado

Variedad

Susceptible

Tasman

Variedad

Resistente

L.P Candy

3.3.2. Evaluación de niveles de fenoles, flavonoides y actividad antioxidante durante la interacción con el patógeno

a. Evaluación de fenoles y flavonoides totales en raíces de clavel

En primer lugar se evaluó la acumulación de fenoles totales, variable que permite un

acercamiento preliminar al comportamiento general de este tipo de metabolitos y que

puede estar asociada a los niveles de flavonoides, considerando la naturaleza

polifenólica de estos últimos. Al respecto, se encontró que en raíces de la variedad

resistente, se generó un aumento temprano de los niveles de fenoles totales a las 6 y 12

hpi (Fig. 14 A). Este aumento, que resultó ser significativo de acuerdo al análisis

estadístico realizado (α=0,05), no se presentó ni en el control correspondiente, ni en la

variedad susceptible inoculada a estos tiempos. Además de esta acumulación temprana

de compuestos fenólicos, también se presentó un aumento significativo a las 96 hpi en

este mismo tratamiento (figura No. 14 A), indicando que la respuesta de defensa de la

planta a nivel de este órgano se presenta en dos fases, una temprana (6-12 hpi) y otra

tardia (96 hpi) así como ha sido reportado anteriormente en otros modelos (Matern &

Kneusel 1988; Panka et al. 2013).

114

14Figura No. 14. Efecto de la inoculación del patógeno Fod en los niveles de compuestos fénolicos totales (A) y flavonoides totales (B) presentes en raíces de clavel. Las barras verticales presentan la desviación estándar de cada promedio (n = 3). Los valores con diferente letra, presentan diferencias significativas (P < 0.05).

Considerando que este comportamiento particular ha sido también reportado para otras

respuestas asociadas a defensa en plantas, como es el caso de la acumulación de

peróxido de hidrógeno (Mittler et al. 2004; Tománková et al. 2006), es probable que este

tipo de respuestas estén relacionadas entre ellas, de acuerdo a la naturaleza

multicomponente y coordinada de la defensa vegetal (Nikraftar et al. 2013). Para el caso

particular del clavel, la relación de la acumulación de estos compuestos y la inducción de

peróxido de hidrógeno, se discutirá en el siguiente capitulo.

0

10

20

30

40

50

60

70

0 h 6 h 12 h 24 h 48 h 96 h

Fla

vo

no

ide

s t

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l)

0

20

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60

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140

0 h 6 h 12 h 24 h 48 h 96 h

Fen

ole

s t

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mg

eq

uiv

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/100g

mate

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a a

a a

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ab b

c

a a

ab

a

b b

b b ab

b

a ab

a a

B

A

Variedad resistente control Variedad resistente inoculada Variedad susceptible control Variedad susceptible inoculada

Tiempo posinoculación

115

Este comportamiento en dos fases, se presentó tambien para el caso de los niveles de

flavonoides en este órgano de la planta durante la infección con el patógeno (figura No.

14 B). En este caso, los niveles de estos metabolitos aumentaron de manera significativa

a los mismos tiempos posinoculación en la variedad resistente inoculada (6,12 y 96 hpi),

indicando que hacen parte de la respuesta activa de la planta a nivel de la raíz y que

están relacionadas con los valores encontrados para fenoles totales.

Estos resultados concuerdan con el ya reportado aumento que se presenta en los niveles

de ciertos compuestos fenólicos evaluados por HPLC en este órgano de la planta por

efecto de la inoculación con el patógeno (Higuera 2001). Sin embargo, se presentan

algunas diferencias considerando que en dicho estudio, el aumento de los mismos se

presenta a partir de las 96 hpi y no se registró el mismo aumento temprano a las 6-12 hpi

encontrado en la presente investigación. Esta discrepancia se puede deber a las

diferencias propias en las técnicas usadas; es probable que en el proceso de extracción

puesto a punto en el estudio actual (Numeral 2.2.1), el metanol al 80% (v/v), permita la

extracción de componentes fenólicos más polares, que no son extraídos con acetona,

solvente de extracción usado por Higuera 2001. De esta manera, es probable que los

compuestos que se inducen en estas primeras etapas (6-12h), sean aquellos fenólicos de

mayor polaridad, entre los que se pueden incluir algunos glicosilados, o ácidos

hidroxicinámicos como el ácido férulico, el ácido caféico o el ácido p-coumárico. Sobre

estos últimos compuestos existen diferentes reportes que los vinculan a la primera línea

de defensa química en las plantas, ya que se acumulan a tiempos tempranos de la

interacción y pueden participar como precursores de diferentes fenómenos asociados al

fortalecimiento de paredes celulares durante el evento de la interacción con el patógeno

(Matern & Kneusel 1988; Mandal & Mitra 2007; Bellés et al. 2008; Santiago & Armas

2009; Vogt 2010). Esto tiene un evidente papel en defensa considerando que la

esterificación de estos compuestos sobre componentes de la pared celular, disminuye la

degradación de ésta (Jones, Chattopadhyay, Shukla, Zón, & Saxena, 2012) y evitan la

efectividad en la acción de enzimas del patógeno.

Así mismo, el aumento en los niveles de compuestos fenólicos a las 96 hpi puede estar

asociado a diferentes procesos que han sido ampliamente discutidos en estudios previos

(Higuera 2001). La infusión de dichos compuestos a polisacáridos para la generación de

gomas que tienen como objetivo localizar al patógeno en los tejidos vasculares a nivel de

raíz. Es probable que estos se liberen de los compartimentos especializados y por acción

116

de diferentes enzimas, se oxiden y polimericen a los diferentes elementos de la pared

celular o de las gomas, que en este órgano del clavel, se ha demostrado juegan un papel

en los mecanismos de defensa de la planta (Higuera & Ebrahim-Nesbat 1999).

Otro de los procesos que involucra estos compuestos ens las raíces de la planta, es la

acumulación de metabolitos con actividad antifúngica (Higuera 2001). Si bien es cierto

que, de acuerdo al estudio comparativo usando HPLC, no existe evidencia de la

acumulación de nuevos metabolitos por efecto de la inoculación en la variedad resistente

(Higuera & Montes de Gómez 1996), algunos compuestos que se encontraban a nivel

constitutivo, presentaron un comportamiento inducible asociado probablemente a su

capacidad antifúngica hacia este patógeno; este es el caso particular de una cumarina

con propiedades biológicas y un derivado de la acridina (Higuera 2001). El aumento en

los niveles del compuesto fenólico de naturaleza flavonoide Kaemferido 3-O-[2G--D-

glucopiranosil]--rutinosido, el cual presentó además actividad antifúngica sobre este

patógeno, tambien ha sido reportado en este órgano de la planta (Curir et al. 2001; Curir

et al. 2005).

En el caso particular de modelos planta-patógeno que involucran patógenos del género

Fusarium, se ha encontrado que dentro de la activación de la respuesta de defensa de

las plantas, se presenta un aumento en los niveles de compuestos de tipo flavonoide

(Lorenc-Kukuła et al. 2007; Morkunas et al. 2011; R. S. Sekhon et al. 2006; Arfaoui et al.

2007; A. Dihazi et al. 2011). A pesar de dichas evidencias, considerando la muy conocida

especificidad de la activación de las respuestas defensivas vegetales, la cual a su vez es

dependiente del patógeno y de la planta involucrada en cada interacción (Berrocal-Lobo

& Molina 2008), no se pueden generalizar este tipo de respuestas para todas las

especies vegetales que son hospederos de estos patógenos y hace necesario que cada

modelo sea estudiado de manera independiente si se quiere profundizar en la

comprensión de enfermedades específicas. Este es el caso del clavel, ya que si bien es

cierto que se había caracterizado la acumulación de compuestos fenólicos en raíces

(Higuera, 2001) y se había encontrado una relación con los mecanismos de defensa

pasiva de la planta (Ardila, Martínez, et al. 2013), era necesario realizar estudios que

permitieran confirmar que la inducción de dichos metabolitos estaba asociada con los

mecanismos de defensa activa de la planta. Ese fue el objetivo de esta parte de la

investigación y permitió determinar que efectivamente en raíces, órgano de la planta en

donde se establece el primer punto de contacto con el patógeno, los niveles de

117

flavonoides totales tienen un comportamiento inducible asociado a resistencia similar al

encontrado para fenoles totales (figura No. 14 B).

Es interesante analizar que dicha acumulación coincide con estudios previos en los que

se ha encontrado aumento en los niveles del flavonoide kaemferido 3-O-[2G--D-

glucopiranosil] -rutinosido en raíces de clavel inoculadas con el patógeno (Curir et al.

2005). Sin embargo, en dicho reporte la acumulación de este metabolito es lineal con el

tiempo y no se presenta el comportamiento bifásico descrito en la presente investigación

(6-12 y 96 hpi) (figura No. 14 B). Esto se puede deber a que en la investigación presente,

se evaluaron los niveles totales de compuestos flavonoide presentes en cada órgano de

la planta (tallos y raíces) y no de compuestos particulares como en el estudio de Curir et

al. 2005. Es probable que los resultados reportados de flavonoides totales, no se afecten

de manera significativa por los cambios en un solo metabolito.

Es bien sabido que los compuestos flavonoides a nivel de la raíz, están asociados a

diferentes procesos desarrollado en la rizosfera como captación de nutrientes (Tomasi et

al. 2008), crecimiento (Taylor & Grotewold 2005) e interacción con microrganismos del

suelo (L. J. Shaw et al. 2006; Weston & Mathesius 2013) De acuerdo a la evidencia

encontrada en el presente estudio, en el clavel dichos metabolitos están asociados a los

mecanismos de defensa pasiva de la planta (Capítulo No. 2) y a mecanismos de defensa

activa que se inducen en este primer punto de contacto con el patógeno Fod.

El papel de estos metabolitos en raíces de clavel debe estar asociado a los fenómenos

previamente descritos en este órgano, como son la generación de estructuras para

confinar el patógeno (Higuera & Ebrahim-Nesbat 1999). Se ha encontrado que en

algodón (Gossypium hirsutum L.) algunos flavonoides se fusionan a la pared celular

durante su interacción con la bacteria Xanthomonas campestris p.v. malvacearum (G. H.

Dai et al. 1996). Asi mismo, pueden estar asociados a actividad antifúngica, tal y como

se ha sugerido por autores como (Curir et al. 2001) y (Curir et al. 2005). Sin embargo,

considerando reportes en otras especies, en los cuales se ha propuesto que el papel de

estos metabolitos en defensa puede estar tambien asociada a su actividad antioxidante,

es probable que este comportamiento pueda presentarse tambien en el clavel. Con el fin

de estudiar esta posibilidad, se determinaron los niveles de actividad antioxidante en

raíces de la planta durante la infección con el patógeno.

118

b. Evaluación de los niveles de actividad antioxidante en raíces de clavel

De acuerdo a los resultados del presente estudio (figura No. 15), se determinó que la

inoculación con Fod genera un aumento significativo en los niveles de actividad

antioxidante evaluada hacia los radicales ABTS+. y DPPH., en raíces de la variedad L.P.

Candy (Resistente) a las 6,12 y 96 hpi.

Estos resultados muestran que un aumento en los niveles de especies antioxidantes en

raíces de la planta hace parte de los mecanismos asociados con resistencia al

marchitamiento vascular causado por Fod. Este comportamiento está de acuerdo con lo

encontrado previamente en otros modelos que involucran a patógenos del género

Fusarium (Lorenc-Kukuła et al. 2007; Hussain et al. 2008; Sá et al. 2009).

Es evidente, de acuerdo a estos resultados, la relación de los niveles de flavonoides y

actividad antioxidante, considerando que estas variables presentan sus máximos valores

a los mismos tiempos posinoculación (figuras No. 14 y 15). Es importante no olvidar, que

dichas variables mostraron correlación positiva a nivel estadístico en el estudio a nivel

constitutivo (capítulo 2) y es probable que a estos tiempos tempranos dicha relación se

mantenga. Bajo esta consideración, es muy factible que la actividad antioxidante

inducible que se presentó por la infección por el patógeno, esté asociada a los cambios

que se presentan en los niveles de estos compuestos, asi como se ha propuesto para

otros modelos (Morkunas & Bednarski 2008; Lorenc-Kukuła et al. 2007; Boba et al.

2011).

Estos resultados indican que no se puede descartar que la planta use los compuestos de

tipo flavonoide para regular la respuesta de defensa vegetal, en términos de la

inactivación de especies altamente reactivas que pueden favorecer la colonización por

parte del patógeno y regular finalmente la respuesta de defensa vegetal. Se ha

reportado, que a tiempos posteriores al reconocimiento inicial (por ejemplo 96 hpi), estas

especies altamente oxidantes no se requieren en la misma proporción y deben ser

eliminadas para evitar la muerte celular que puede favorecer la propagación de

patógenos que presentan fases necrotróficas de crecimiento como ciertos patógenos del

género Fusarium (Lorenc-Kukuła et al. 2007; Hussain et al. 2008; Sá et al. 2009). Así

mismo, considerando el papel que tienen en la defensa a patógenos vasculares las

células parenquimáticas ubicadas en el tejido vascular de la planta, la muerte celular de

119

las mismas se constituiría además, en un punto a favor para el patógeno dentro del

complejo intercambio de señales que determina la expresión de resistencia o

susceptiblidad de la planta.

15Figura No. 15. Efecto de la inoculación del patógeno Fod en los niveles de actividad antioxidante presente en raíces de clavel. A: capacidad inactivación ABTS y B: capacidad inactivación DPPH. Las barras verticales presentan la desviación estándar de cada promedio (n = 3). Los valores con diferente letra, presentan diferencias significativas (P < 0.05).

Si se detallan los resultados encontrados a nivel de raíz para el caso de la variedad

susceptible, se puede evidenciar que a 96 hpi se alcanza a presentar un aumento

significativo en los niveles de actividad antioxidante con respecto al control no inoculado

(figura No. 15 A y B). Este resultado indica que es probable que la acumulación de estos

metabolitos se presente a tiempos más tardíos en esta variedad y que por tanto, la

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120

correcta activación y regulación espacio temporal de su biosíntesis sean necesarias para

que finalmente se presente la expresión de resistencia. La activación de estos

mecanismos de manera más tardia en la variedad susceptible, no le permitiría afrontar la

infección desde las primeras etapas de la interacción y seria una evidente ventaja para el

patógeno en su objetivo de colonizar la planta. Sin embargo, es necesario realizar

estudios adicionales que permitan evaluar a tiempos más tardíos la acumulación de estos

compuestos en la variedad susceptible.

Considerando que la acumulación de compuestos fenólicos es una respuesta común en

tejidos vegetales durante diferentes tipos de estrés biótico como la interacción con virus

(Rasoul et al. 2012), bacterias (Hassan & Abo-elyousr 2013) y hongos (Tománková et al.

2006; Mikulič Petkovšek et al. 2009; Jabeen et al. 2009; Dinis et al. 2011; Panka et al.

2013; Nikraftar et al. 2013), se ha propuesto que este aumento puede hacer parte de la

respuesta basal de las plantas y estar determinado por el reconocimiento de diferentes

tipos de motivos asociados a microorganismos (MAMPs Microbial Associated Molecular

Patterns). En algunos modelos planta patógeno, en los que la resistencia es poligénica y

puede estar basada en estos mecanismos, se ha determinado que diferencias propias en

la regulación espacio temporal de esta respuesta en la planta, pueden hacer la diferencia

entre la expresión de resistencia o susceptibilidad (Dinis et al. 2011; Nikraftar et al. 2013).

Bajo dichas consideraciones, los resultados del presente estudio estarían de acuerdo con

la resistencia multigénica que se ha establecido para la raza 2 de Fod (Baayen et al.

1991).

c. Evaluación de fenoles y flavonoides totales en tallos de clavel

La evaluación de los niveles de fenoles y flavonoides en el tallo permitió determinar que

estos aumentan en la variedad resistente inoculada con respecto al control, a las 6 y 96

hpi para fenoles y a las 6, 12 y 96 hpi para flavonoides, mientras que para la variedad

suceptible no se presentan cambios (figura No. 16). Esto comprobó que la respuesta de

defensa vegetal asociada a la biosíntesis de metabolitos secundarios está

compartimentalizada en el clavel, siendo dependiente del órgano evaluado, tal y como

había sido previamente descrito (Higuera 2001). Este comportamiento se pudo evidenciar

teniendo en cuenta que la acumulación temprana de compuestos fenólicos en tallos de la

121

variedad resistente, no estuvo acompañada con un aumento en los niveles de

flavonoides, tal y como se presentó en la raíz.

16Figura No. 16. Efecto de la inoculación del patógeno Fod en los niveles de compuestos fénolicos totales (A), flavonoides totales (B), presentes en tallos de clavel. Las barras verticales presentan la desviación estándard de cada promedio (n = 3). Los valores con diferente letra, presentan diferencias significativas (P < 0.05).

Es probable que el aumento en compuestos fenólicos en este tiempo, esté asociado a un

proceso de fortalecimiento de las paredes de la planta durante la infección en estas

primeras etapas (Matern & Kneusel 1988; Bellés et al. 2008; Mandal & Mitra 2007;

Santiago & Armas 2009). Se ha reportado, por ejemplo, que la infusión de metabolitos

derivados de los ácidos cinámico y benzoico a la pared celular se presenta como

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122

respuesta a la presencia del patógeno en tallos de clavel infectados por Fod (Niemann et

al. 1991), lo cual está asociado con la generación de barreras físicas y gomas que se

inducen para localizar el patógeno y evitar su propagación en los tejidos de la planta

(Baaye et al. 1988; Niemann & Baayen 1988).

Por otra parte, se ha propuesto que la biosíntesis de fitoalexinas en este órgano, debe

contar con niveles suficientes de compuestos fenólicos derivados del ácido cinámico o

del ácido benzoico. Es por ello que a 12 y 96 hpi, (Fig 16A) el aumento de fenólicos

totales tambien puede estar asociado al suministro de dichos precursores, los cuales se

requieren para la biosíntesis de diantalexinas y diantramidas, compuestos nitrogenados

que han sido encontrados a nivel del tallo y han sido clasificado como fitoalexinas

(Niemann 1992; Baayen et al. 1991; Niemann et al. 1992). De esta manera, un suministro

de estos últimos compuestos a partir de fenoles provenientes de la rutas fenilpropanoide

o del ácido shikimico (Wildermuth 2006), es necesario para la respuesta de defensa

exitosa de la planta a este nivel.

Es probable que asi como se encontró en raíz, la respuesta en términos de compuestos

de tipo flavonoide, esté asociada a un aumento en los niveles de actividad antioxidante.

Con el fin de corroborar esta posibilidad, se evaluaron los niveles de actividad

antioxidante en este órgano de la planta en los diferentes tratamientos propuestos.

d Evaluación de actividad antioxidante a nivel de tallos de clavel

La evaluación de los niveles de actividad antioxidante durante la infección con el

patógeno a nivel del tallo, permitió encontrar un aumento en los niveles de especies

antioxidantes a las 6, 12 y 96 hpi en la variedad resistente inoculada (figura No. 17).

Estos resultados indican que tal y como había sido encontrado en raíz, un aumento en

dichas especies hace parte de los mecanismos de defensa asociados con resistencia a la

enfermedad.

123

17Figura No. 17. Efecto de la inoculación del patógeno Fod en los niveles de capacidad inactivación ABTS (A) y capacidad inactivación DPPH (B), presentes en tallos de clavel. Las barras verticales presentan la desviación estándard de cada promedio (n = 3). Los valores con diferente letra, presentan diferencias significativas (P < 0.05).

Es interesante observar que a las 96 hpi, la acumulación de compuestos fenólicos está

asociada a un aumento en compuestos de tipo flavonoide y de la actividad antioxidante.

Este resultado corrobora las características inducibles que tienen los flavonoides en este

órgano de la planta y que están asociados muy probablemente a la capacidad antifúngica

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A

B

124

que presentan estos metabolitos (Curir et al. 2005) Asi mismo, ésta puede estar

complementada con la capacidad antioxidante, la cual aumenta de manera conjunta, con

los niveles de flavonoides en la planta de acuerdo a este estudio (figuras No. 16 y 17).

En general, en esta fase de la investigación se determinó que en la variedad resistente,

se presentan cambios significativos en los niveles de flavonoides durante la interacción

con el patógeno. Considerando que esta respuesta se presentó tanto en tallos como en

raíces del clavel, es probable que dentro de los componentes que determinan la

resistencia poligénica a la raza 2 de Fod, se encuentre una biosíntesis de flavonoides

más activa. Esta puede a su vez hacer parte de los mecanismos de defensa basal de la

planta, considerando que en este hospedero, fenómenos que involucran el metabolismo

de los fenoles, se pueden presentar de manera no especifica para otros patógenos

vasculares (Niemann 1992) y que la correcta regulación espacio temporal de los niveles

de estos versátiles metabolitos, es la que finalmente determina la expresión de

resistencia (figuras No. 14 y 16).

No hay que olvidar que otros fenómenos como la correcta localización de los flavonoides

en la planta durante la infección, pueden ser otros factores que pueden afectar en alguna

medida la acción de estos metabolitos y por tanto la resistencia a la enfermedad

(Hammerschmidt 2011; Agati et al. 2012). La exudación de estos metabolitos desde la

planta hacia la rizosfera es un punto que puede ser determinante para que dichos

metabolitos puedan ser efectivos contra patógenos (Weston & Mathesius 2013). Este es

el caso por ejemplo, de Medicago truncatula en donde el silenciamiento de un

transportador ABC asociado al transporte de flavonoides en tejidos vasculares, aumenta

la incidencia por parte del patógeno Fusarium oxysporum (Banasiak et al. 2013).

Estudios futuros que permitan evaluar la ubicación de estos metabolitos en la planta a

nivel histológico y celular, son de interés dentro de la elucidación de su papel en el

modelo objeto de estudio.

Es probable que los componentes genéticos asociados a la biosíntesis de estos

metabolitos sean de interés en la identificación de QTLs (Quantitative trait loci) para ser

usados como marcadores moleculares de selección para resistencia en este modelo, asi

como ha sido reportado en el modelo trigo-Fusarium graminareum (Gunnaiah et al.

2012). Sin embargo, si bien es cierto que esta aproximación genómica puede ser una

alternativa para el desarrollo de marcadores de selección, otra aproximación puede ser la

125

aplicación de técnicas de separación e identificación de metabolitos, para el desarrollo de

marcadores metabolómicos. Es por ello que el primer acercamiento que se debe hacer al

respecto es identificar de manera preliminar, cuales son aquellos compuestos que

pueden participar en la resistencia de la planta y ser potencialmente usados para iniciar

estudios para el desarrollo de dichos marcadores. Para ello, mediante el uso de técnicas

cromatográficas se abordó el estudio de los metabolitos particulares que al aumentar en

las variedades resistentes, pueden ser de interés en la interacción.

3.3.3. Comparación de perfiles obtenidos por HPLC y análisis cuantitativo de compuestos tipo flavonoide en raíces de clavel, durante la infección con Fod

En la siguiente etapa se analizaron los perfiles cromatográficos de metabolitos de tipo

flavonoide acumulados durante la infección con el patógeno, esto sin olvidar que de

acuerdo a la compartimentalización de las respuestas de defensa en este modelo

(Higuera 2001), era muy probable que se presentaran diferencias cualitativas y

cuantitativas importantes para dichos metabolitos en función del órgano de la planta

estudiado. Para ello, se compararon los perfiles de separación por HPLC de extractos

obtenidos en aquellos tiempos en los que, de acuerdo con los resultados descritos en el

númeral anterior 3.3.2., se presentaron los mayores cambios en el contenido de

flavonoides y actividad antioxidante por efecto de la inoculación con el patógeno (raices 6

y 96 hpi y tallos 96 hpi).

Estos análisis se realizaron usando detección a 350 nm, en donde se presenta la banda I

característica del espectro de absorción UV de estos compuestos, ocasionada por la

presencia del anillo B de su estructura (figura No. 2). Si bien es cierto que esta longitud

de onda es ampliamente usada para el análisis de flavonoides en diferentes fuentes

vegetales (Galeotti, Barile, Lanzotti, et al. 2008; Tattini et al. 2010; Mikulič Petkovšek et

al. 2009; Azevedo et al. 2010), no se debe olvidar que bajo estas mismas condiciones

otros metabolitos de diferentes naturaleza química con diferentes grupos cromóforos,

pueden absorber y actuar como interferentes. Sin embargo, a esta longitud de onda se

pueden obtener espectros más limpios que los obtenidos a 280 nm, tal y como se

presenta en la figura No. 18 para extractos obtenidos a partir de raíces de las dos

variedades objeto de estudio.

126

18Figura No. 18. Perfiles cromatográficos para extractos obtenidos a partir de raíces de clavel de las variedades LPcandy (Resistente) y Tasman (Susceptible). Comparativo a 280 nm y 350 nm variedad LP Candy (A) y Tasman (B). Perfiles con detección a 350 nm ampliados para las variedades LP Candy (C) y Tasman (D). Se muestran los compuestos o grupo de compuestos separados que son considerados en el análisis.

Estas consideraciones son tenidas en cuenta por (Galeotti, Barile, Lanzotti, et al. 2008),

quienes realizan un análisis comparativo con diferentes variedades de clavel, en términos

10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 45.0 50.0 55.0 60.0 65.0 min

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Detector A Ch2:350nm

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Detector A Ch2:350nm Detector A Ch1:280nm

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C

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127

de la composición de flavonoides en diferentes órganos de la planta y determinan que

diferencias cuantitativas en los niveles de dichos metabolitos, pueden ser usadas para la

clasificación de variedades. Teniendo en cuenta estos antecedentes, en el presente

trabajo, y con el fin de mantener un lenguaje homogéneo a lo largo del escrito, los

diferentes compuestos que sean detectados bajo estas condiciones, serán denominados

“compuestos de probable naturaleza flavonoide”.

De acuerdo a la comparación realizada a nivel constitutivo entre raíces de las dos

variedades, se encontraron diferencias principalmente cuantitativas en los compuestos

detectados. Es importante destacar que la complejidad en términos de la composición del

extracto, sumada con los bajos niveles en que se encontraban los compuestos de interés

con respecto a otros componentes, hizo necesario considerar volúmenes de inyección de

100 µL y tener en cuenta sólo aquellos compuestos que se encontraban sobre el limite

de cuantificación previamente evaluado (9800 unidades arbitrarias de área que

corresponden a 10 veces el ruido del equipo).

Bajo estas consideraciones se encontraron 10 compuestos o grupos de “compuestos de

probable naturaleza flavonoide”, comunes en ambas variedades (figura No. 18) y se

determinó que a nivel constitutivo, estos compuestos se encuentran en mayor cantidad

en la variedad resistente con respecto a la susceptible, de acuerdo a la comparación

estadística realizada de la suma del área, para todos los 10 compuestos separados (tabla

No. 10)

Tabla No. 10. Comparación del contenido total (1) inicial de compuestos con absorción a 350 nm, presentes en extractos obtenidos a partir de raíces de clavel de variedades resistente y susceptible

Variedad L.P Candy (Resistente) Tasman (Susceptible)

Area (unidades

arbitrarias)(1)

1512577 b

1170138 a

(1) Expresado como la sumatoria de área de todos los picos del cromatrograma obtenido por HPLC según

condiciones establecidas en númeral 3.2.5

(2) Los valores seguidos con letras diferentes presentan diferencias significativas (α=0,05)

128

Estos resultados están de acuerdo con lo encontrado previamente (Capitulo 2) y con lo

ya reportado para compuestos fenólicos totales por Higuera 2001, en cuanto a que las

variedades resistentes tienen constitutivamente, mayores niveles de compuestos

fenólicos a nivel de la raíz. Estas diferencias entre variedades también están de acuerdo

con los resultados obtenidos previamente con el método espectrofotométrico (Figura No.

15) y constituyen una evidencia experimental más sobre el probable papel de los

flavonoides en la defensa pasiva de las raíces del clavel. Considerando su naturaleza

constitutiva, es importante no olvidar que además de su acción como fitoanticipinas y/o

como bloques para el fortalecimiento de barreras físicas, estos metabolitos pueden

cumplir diversos papeles a nivel fisiológico en la planta, generando muy probablemente,

ventajas adaptativas para la planta resistente en otros procesos importantes como la

captación de nutrientes o la interacción con microorganismos benéficos para la rizosfera

(Weston & Mathesius 2013).

La comparación entre los niveles de estos compuestos acumulados por efecto de la

inoculación con Fusarium oxysporum f. sp. dianthi raza 2 (figura No. 19) permitió

determinar que en este órgano de la planta, en los tiempos evaluados, solamente se

presentaron cambios a nivel cuantitativo en los niveles de los “compuestos

probablemente flavonoides” separados y que no se encontraron, al nivel de detección

trabajado, cambios cualitativos asociados a la aparición o desaparición de señales.

(Figura No. 19)

129

19Figura No. 19. Perfiles cromatográficos por HPLC para extractos obtenidos a partir de raíces de clavel de la variedad LPcandy a diferentes tiempos posinoculación con Fod. A) Control a 6h, B) Inoculado a 6h, C) Control a 96h D) Inoculado a 96h.

Con el fin de tener una aproximación inicial del efecto de la inoculación con el patógeno

sobre los niveles de estos compuestos, se comparó la suma de las áreas totales de los

10 compuestos (o grupos) para cada tratamiento en los diferentes tiempos

posinoculación. Se determinó que existen diferencias significativas entre los valores

promedio encontrados para los diferentes tratamientos en el ensayo in vivo (tabla No. 11)

10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 45.0 50.0 55.0 60.0 65.0 min

0

10

20

30

40

50mAU


15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 45.0 50.0 55.0 60.0 65.0 min

0

10

20

30

40

50mAU


15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 45.0 50.0 55.0 60.0 65.0 min

0

10

20

30

40

50

mAUDetector A Ch2:350nm

10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 45.0 50.0 55.0 60.0 65.0 min

10

20

30

40

50


A

B

C

D

130

Tabla No. 11. Variación del contenido total de “compuestos probablemente flavonoides” (HPLC con detección a 350nm), en raíces de clavel a diferentes tiempos posinoculación con el patógeno Fod raza 2.

Resistente

control

Resistente

inoculada

Susceptible

control

Susceptible

inoculada

0 horas 1512577 b 1512577 b 1170138 a 1170138 a

6 horas 1682700 a 1975762 b 2095652 b 2349296 b

96 horas 2817350 a 4065055 b 3074887 ab 2882967 ab

(1) Expresado como la sumatoria de área de todos los picos del cromatrograma

(2) Los tratamientos seguidos con letras diferentes presentan diferencias significativas (α=0,05)

Al comparar los resultados obtenidos entre tratamientos, en cada uno de los tiempos

posinoculación, se encuentra que la inoculación con el patógeno tuvo efecto en los

niveles de estos compuestos únicamente en la variedad resistente al nivel de

significancia trabajado (α=0,05). Si bien es cierto que para la variedad susceptible se

presentó un aumento en los valores promedio para los dos tiempos evaluados (0 y 96

hpi), dichos valores no son diferentes estadísticamente al comparar con el respectivo

control no inoculado. Estos resultados, están de acuerdo con los obtenidos previamente

usando la técnica espectrofotométrica de formación de complejos con el AlCl3 (aq), la cual

se basa en la conocida reacción entre los flavonoides y el Al+3 (Harborne et al. 1975) y

que ha sido usada de manera frecuente en reportes recientes con el fin de determinar los

contenidos de flavonoides totales en diferentes muestras vegetales (J.-T. Lin et al. 2010).

Esto demuestra que mediante las dos técnicas usadas, los niveles constitutivos de

compuestos flavonoides en raíces, son mayores en las variedades resistentes que las

susceptibles. Así mismo, se evidencia el efecto que tiene la inoculación con el patógeno

sobre los niveles de flavonoides en raíces de la variedad resistente.

Estos resultados evidencian el efecto que tienen las condiciones externas y/o los

cambios propios basales en el metabolismo de la planta, sobre los niveles de estos

metabolitos, ya que a los diferentes tiempos, tanto para controles como para inoculados,

se presenta un aumento en los contenidos totales de los mismos. Es probable que las

condiciones ambientales afecten los niveles de estos metabolitos a nivel de raíz, tal y

como se ha sido recientemente revisado (Weston & Mathesius 2013). En Ligustrum

vulgare por ejemplo, se ha encontrado que diferencias en radiación y salinidad del suelo,

131

pueden afectar los niveles de flavonoides a nivel de la raíz (Tattini et al. 2010). Los

resultados encontrados en la presente investigación, confirman la necesidad de tener un

control no inoculado en cada tiempo posinoculación, con el fin de descontar el efecto que

pueden tener factores externos asociados al ambiente o factores propios de la planta,

asociados a cambios fisiológicos que se pueden presentar durante los tiempos en los que

se realizan los muestreos.

Con el fin de conocer cuál era el comportamiento durante la infección con el patógeno de

los compuestos o grupo de compuestos de manera independiente, se compararon las

áreas promedio de tres réplicas biológicas en cada uno de los casos. Los resultados

correspondientes se presentan en la tabla No. 12.

Tabla No. 12. Variación del contenido de “compuestos probablemente flavonoides” especificos (HPLC con detección a 350nm) de acuerdo a las Figuras No. 18 y 19, en raíces de clavel a diferentes tiempos posinoculación con el patógeno Fod raza 2.

0 HORAS 6 HORAS 96 HORAS

T1 T3 T1 T2 T3 T4 T1 T2 T3 T4

F1 197232 b 84958 a 141030 a 237712b 87134ª 117636a 191383a 188721ª 205425ª 197411 a

F2 297145 b 185286 a 339713 b 491773 c 110144 a 173030 a 393991 b 583361 c 212496 a 198270 a

F3 189136 b 85854 a 178592 b 262637 c 97601 a 115323 a 221659 b 240410 b 87285 a 85796 a

F4 146107 b 221887 a 222737 b 211173 c 696638b 713087 ab 147272a 158934ª 811378ª 753760a

F5 83905ª 142935b 51939a 81557ª 344404b 354208b 79802 a 64327 a 556724 b 473538 b

F6 48637 a 81991a 91262a 136351ª 102253ª 95012a 136414a 126239ª 80896ª 57626a

F7 61513ª 67604a 65358ab 61963ab 92561b 49816a 61070a 147719ª 99390ª 80276a

F8 31539ª 78609b 22120a 50203b 64769b 89723c 52647a 69450ª 67989ª 59150a

F9 211048b 95017a 267533a 225240ª 309973ª 276602a 646509a 991021b 532961ª 518279a

F10 246316b 125996a 259951a 326521ab 243434ª 364860b 886602b 1561540c 420342ª 458861a


(2) Los tratamientos se definen en el númeral 3.2.3. (T1 resistente control, T2 resistente inoculado, T3

susceptible control y T4 susceptible inoculado)

Grupo I

Grupo I

132

Se presenta un grupo de compuestos (Grupo I) que presentan niveles estadísticamente

mayores en raíces de la variedad resistente inoculada, cuando se comparan con

respecto al control no inoculado en el mismo tiempo (α=0,05). Estos resultados coinciden

con lo encontrado previamente en raíces de esta misma planta, donde la inoculación con

el patógeno generó un aumento significativo para los niveles en un grupo de compuestos

constitutivos de tipo fenólico en la variedad resistente LP Candy (Higuera, 2001) y

permite proponer, considerando que el aumento no se presentó en la variedad

susceptible, que los compuestos pertenecientes a dicho grupo (Grupo I) deben estar

asociados a los mecanismos de defensa que se activan ante la presencia del patógeno a

nivel de la raíz.

Con el fin de evaluar en conjunto los resultados obtenidos para los diferentes

compuestos, se usaron herramientas de análisis multivariado (PCA). Estas herramientas

se han venido usando frecuentemente en metabolómica, permitiendo estudiar el efecto

que tienen tratamientos específicos en los niveles de varios compuestos de manera

simultánea (Steffensen et al. 2011; Ballizany et al. 2012; Bernaert et al. 2012; H. Zhao et

al. 2008). Para este caso se pudo determinar que la variación completa de los datos está

asociada tanto a la variedad involucrada como al tiempo posinoculación (figura No. 20).

Se evidenció que el componente principal 1 (PC1), explica el 68 % de la variación en los

resultados y permite hacer agrupaciones en función del genotipo vegetal; los tratamientos

que incluyen a la variedad resistente, se encuentran hacia la derecha, mientras que los

de la susceptible, se agrupan hacia la izquierda. Este comportamiento indica que

diferencias cuantitativas propias en los perfiles de estos metabolitos entre variedades,

determinan la separación encontrada en dicho componente. Así mismo, se evidencia

que las condiciones externas determinan el 14 % de la variación y permite separar los

tratamientos correspondientes a las 96 hpi, de los demás tiempos. A este tiempo (4 dias

posinoculación) se deben presentar los mayores efectos posibles evaluados

considerando que fue el último tiempo de muestreo en este ensayo in vivo.

133

20Figura No. 20. Análisis de componentes principales para los resultados obtenidos durante la separación de compuestos de tipo flavonoide en raíces de clavel inoculados con el patógeno causal del marchitamiento vascular. A) Distribución de los diferentes tratamientos en los componentes de variación. B) Distribución de los compuestos “tipo flavonoide” en los componentes de variación (Loading graph) S=susceptible, R= Resistente a Fod, C= Control, I= Inoculado

Asi mismo, la gráfica de distribución de compuestos de “tipo flavonoide” (Figura No. 20B)

permite definir aquellos metabolitos que están determinando la separación encontrada.

Se puede ver que los compuestos F2, F3, F9 y F10, los cuales se encuentran en el grupo

I previamente definido, determinan de manera importante el agrupamiento realizado por

el análisis multivariado para los tratamientos de la variedad resistente. Estos compuestos

son además de particular interés, considerando que presentan una variación significativa

por efecto de la inoculación con el patógeno en la variedad resistente (figura No. 21 y

tabla No. 12).

Es de interés para este modelo planta-patógeno, la identidad de estos metabolitos

considerando que los mismos deben cumplir algún papel en la resistencia de la planta,

algunos de ellos pueden presentar propiedades como actividad antifúngica o actividad

antioxidante. Es por ello que en la siguiente etapa, se abordó una aproximación a la

identificación de al menos uno de estos metabolitos, para de esta manera conocer su

naturaleza química y finalmente aumentar la evidencia sobre la participación de estos

metabolitos en los mecanismos de defensa del clavel.

F9

Susceptible A B

F10

F5

F4

F3

F2

Grupo I

Resistente

SC96h RC96h

RI96h

RC6h

RC0h

RI96h

SI96h

SC6h

SC0h

SI6h

134

21Figura No. 21. Variación en el contenido de los componentes F2 (A), F3 (B), F9 (C) y F10 (D) durente la infección con el patógeno en las variedades resistente y susceptible. El análisis estadístico correspondiente se encuentra en la tabla No. 12. Los tratamientos seguidos con letras diferentes presentan diferencias significativas (α=0,05).

Con respecto al análisis de compuestos de tipo flavonoide en tallo, se realizó el mismo

proceso pero evaluando los perfiles solamente a 96 hpi, tiempo en el que se presentaron,

de acuerdo a la fase anterior del estudio (figura No.16), las diferencias más importantes

en los niveles de flavonoides por efecto de la inoculación con el patógeno. De manera

inicial, se compararon los perfiles de metabolitos probablemente flavonoides a nivel

constitutivo y se encontraron diferencias tanto a nivel cualitativo como a nivel cuantitativo

entre las variedades LP Candy y Tasman (figura No. 22). Se determinó que de acuerdo a

este análisis existen al menos 8 compuestos de tipo flavonoide en este órgano de la

planta, los cuales presentaron una distribución diferente en función de la variedad. Al

comparar estos perfiles con los obtenidos en extractos de raíces de la planta (figura No.

18), se evidencia que, al menos al nivel de detección trabajado, no existen compuestos

comunes entre ambos órganos de la planta y que, considerando los tiempos de

retención, en el caso del tallo, se encuentran compuestos tipo flavonoide más polares.

Estos resultados son consistentes con los reportados por (Galeotti, Barile, Lanzotti, et al.

2008), quien encontró diferencias principalmente a nivel cualitativo entre los perfiles de


0

100000

200000

300000

400000

500000

600000

700000


AR

EA (

UN

IDA

DES

AR

BIT

RA

RIA

S)

TIEMPO POSINOCULACIÓN

F2

0

200000

400000

600000

800000

1000000

1200000


AR

EA (

UN

IDA

DES

AR

BIT

RA

RIA

S)


F9

0

500000

1000000

1500000

2000000

0 HORAS 6 HORAS 96 HORASAR

EA (

UN

IDA

DES

AR

BIT

RA

RIA

S)


F10

0

50000

100000

150000

200000

250000

300000

350000

400000


AR

EA (

UN

IDA

DES

A

RB

ITR

AR

IAS)


F3

A

C D

B

a

b

c

b b

a a

a

c

b

a

b

c

a

b

a

b

a a

b

a a

b

a

c

135

flavonoides para diferentes variedades de clavel y que los compuestos encontrados en

tallo son eluidos a tiempos de retención más tempranos en fase reversa. Es importante

no olvidar que para ambos órganos de la planta se usaron las mismas condiciones de

separación y que los análisis se realizaron por triplicado en cada uno de los tratamientos.

22Figura No. 22. Perfiles cromatográficos por HPLC con detección a 350 nm para extractos obtenidos a partir de tallos de clavel de las variedades A) LP Candy (Resistente) y B) Tasman (Susceptible). Se muestran los compuestos o grupo de compuestos separados que son considerados en el análisis.

Al comparar en función de la variedad, las sumatorias totales de áreas obtenidas para los

diferentes compuestos o grupo de compuestos “probablemente flavonoides” en este

órgano de la planta, se determinó que la variedad resistente presenta mayores niveles de

metabolitos de tipo flavonoide que los encontrados en la variedad susceptible. (tabla No.

13). Estos resultados están de acuerdo a lo encontrado en el numeral anterior 3.3.2, en

donde para estas mismas variedades, los niveles de flavonoides totales presentes en

tallo, son estadísticamente superiores en la variedad resistente (figura No. 16). Esto

indica que efectivamente existe una relación entre los resultados obtenidos por las dos

técnicas usadas en este estudio.

5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 45.0 50.0 55.0 60.0 min

0

50

100

150


5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 45.0 50.0 55.0 60.0 65.0 min

0

25

50

75

100

125

150

175mAU


F1 F2

F3

F4

F7 F8

F1 F2

F3 F4 F5

F6

F7 F8

B

A

136

Tabla No. 13. Comparación del contenido total inicial de compuestos con absorción a 350 nm, presentes en extractos obtenidos a partir de tallos de clavel de variedades resistente y susceptible

Variedad L.P Candy (Resistente) Tasman (Susceptible)

Area (unidades arbitrarias) 6366257 b

4737583 a



Sin embargo, si los resultados obtenidos mediante el método cromatográfico en tallos y

raíces para una misma variedad, se comparan con los obtenidos mediante la técnica

espectrofotométrica, dicha relación no se mantiene (tabla No. 14). Se esperaría, de

acuerdo a los resultados obtenidos en la primera fase de esta investigación (Capitulo 2),

que la sumatoria de las áreas para la raíz fuesen superiores a las encontradads para

tallo. Sin embargo, se presenta lo contrario y los valores encontrados en tallo son

superiores a los encontrados en raíz para las dos variedades analizadas. Al parecer, las

condiciones analíticas que se usan para la cuantificación por HPLC de los metabolitos

“probablemente flavonoides” en tallo, presenta interferentes como son la la presencia de

otro tipo de metabolitos que pueden absorber a la longitud de onda de análisis. Este

resultado puede explicarse dado que estos extractos no fueron sujetos a ningún proceso

de purificación previo al analisis como el uso de precolumnas para extracción en fase

sólida (Wrolstad et al. 2005).

Otra posibilidad es que, considerando las diferencias entre tallos y raíces en términos de

la composición de compuestos tipo flavonoide, las cuales se evidencian al comparar los

perfiles a 350nm, es probable que los metabolitos que se encuentran en tallos además

de ser más polares, pueden presentar mayores coeficientes de absortividad a este λ, que

aquellos que se encuentran en la raíz de la planta. Esto podría pasar teniendo en cuenta

que los diferentes tipos de flavonoides presentan diferencias entre sus espectros UV y

por tanto diferencias en la absorción a una longitud de onda determinada (Harborne et al.

1975; Wrolstad et al. 2005).

137

Tabla No. 14. Comparación del contenido total inicial de compuestos de tipo flavonoide en extractos obtenidos a partir de tallos de clavel de variedades resistente y susceptible mediante método espectrofotométrico y HPLC

Variedad Variedad resistente Variedad susceptible

Órgano Tallo Raíz Tallo Raíz

Método espectrofotométrico

(mg equivalentes catequina/ 100g) 19,1 28,8 14,1 22,0

Metodo cromatográfico (Unidades

arbitrarias de area)

6982838

1512577

5833177

1170138

Se determinó el efecto que tenia la inoculación con el patógeno, sobre el total de la

sumatoria de las áreas para los compuestos o grupo de compuestos detectados en cada

tratamiento a nivel del tallo (tabla No. 15). Mediante dicha comparación, se evidenció que

las condiciones ambientales y los cambios en el metabolismo basal de la planta durante

los tiempos de muestreo tienen un efecto sobre los niveles totales de estos metabolitos

considerando que para todos los tratamientos, a 96 hpi, se presenta un aumento general

en los niveles de los mismos.

De acuerdo al análisis estadístico realizado con estos resultados (α=0,05), no se

encontraron diferencias significativas entre controles e inoculados para ninguna variedad,

indicando que esta comparación en términos de áreas totales no era la más conveniente;

era probable en ese punto que algunos de los flavonoides mayoritarios a nivel del tallo

aumenten solamente por efecto de la inmersión y pudiesen estar enmascarando cambios

en los niveles de aquellos flavonoides que realmente pudiesen aumentar por efecto de la

inoculación con el patógeno.

138

Tabla No. 15. Variación del del contenido total de compuestos tipo flavonoide (HPLC A 350nm), en tallos de clavel a diferentes tiempos posinoculación con el patógeno Fod raza 2.

T1 T2 T3 T4

0 horas 6366257 b 6366257 b 4737583 a 4737583 a

96 horas 8262905 a 8293885 a 6931289 a 6592795 a



(3) Los tratamientos corresponden a los definidos en el númeral 3.2.3. (T1 resistente control, T2 resistente

inoculado, T3 susceptible control y T4 suseptible inoculado)

Bajo estas condiciones, se optó por recurrir directamente a un análisis independiente

para cada compuesto o grupo de compuestos separados (tabla No. 16). Este análisis

permitió realizar una evaluación independiente de los compuestos que absorben a esta

longitud de onda y facilitó por tanto, la asociación de los cambios en los niveles de los

mismos durante la inoculación con el patógeno. Se pudo determinar que al igual que en

el caso de la raíz, dentro de los compuestos que presentaban algún tipo de variación

estadística, se incluían algunos que aumentaban por efecto de la inoculación en la

variedad resistente y fueron clasificados en el Grupo II.

Estos corresponden a los compuestos FT2 y FT6, los cuales presentaron un aumento

significativo en sus niveles en la variedad resistente inoculada, con respecto al control a

tiempo 0 y a 96h. Esto indicaba que estos compuestos podrian estar asociados al

aumento encontrado previamente (figura No. 16) y en donde se había encontrado que la

inducción diferencial de flavonoides, está asociada a la resistencia a la enfermedad en

este órgano también.

139

Tabla No. 16 Variación del contenido de compuestos tipo flavonoide especificos (HPLC a 350nm), en tallos de clavel a diferentes tiempos posinoculación con el patógeno Fod raza 2.

0 HORAS 96 HORAS

T1 T3 T1 T2 T3 T4

FT1 1045973 a 1071234 a 3421600 a 2887411 a 2867765 a 2350172 a

FT2 794037 a 755052 a 717422 a 1096101 b 675770 a 693246 a

FT3 959453 a 1212690 b 880410 a 896910 a 1576783 b 1449509 ab

FT4 808525 b 658021 a 440338 a 501719 a 914832 b 1035668 b

FT5 1547595 b 66646 a 1442619 b 1526336 b 58175 a 62160 a

FT6 510994 b 43750 a 503610 b 628327 c 47776 a 45467 a

FT7 305718 a 523141 b 439679 a 342968 a 420599 a 538060 a

FT8 393963 a 407049 a 417228 a 414113 a 369590 a 419252 a


(2) Los tratamientos corresponden a los definidos en el númeral 3.2.3. (T1 resistente control, T2 resistente

inoculado, T3 susceptible control y T4 susceptible inoculado)

Con el fin de evaluar todos los resultados, se usaron herramientas de análisis

multivariado (PCA) y se deteminó que en conjunto, la variación de los resultados está

determinada principalmente por la variedad involucrada. Es evidente que de acuerdo al

PC1, el cual permite explicar el 95 % de la variación en los resultados, se pueden

diferenciar los extractos obtenidos de las dos variedades estudiadas (figura No. 23). De

la misma manera, se determinó que apenas un 4 % de la variación está definida en el

componente 2, el cual permite separar a los tratamientos de la variedad resistente en

función del tiempo posinoculación, esto se puede deber a que esta variedad

probablemente reacciona de manera más eficiente a los cambios ambientales debido a

características fisiológicas propias y que evidentemente la diferencian de la variedad

susceptible. Esta propuesta está basada en los resultados encontrados hasta ese

momento de la investigación, en donde se evidenciaba un metabolismo de biosíntesis de

flavonoides más dinámico para esta variedad resistente. Para la variedad susceptible, el

segundo componente, no generó separación indicando que no hay diferencias entre los

mismos.

Grupo II

Grupo II

140

De acuerdo a la gráfica de distribución de compuestos (figura No. 23 B) que permite

explicar como éstos afectan la distribución previamente realizada, es evidente que los

compuestos o grupo de compuestos FT5 y FT6 tienen un importante efecto en el

agrupamiento de los tratamientos de la variedad resistente hacia la derecha de la gráfica.

Esto es de esperarse considerando que los mismos se encuentran en altos niveles en la

variedad resistente, mientras que en la variedad susceptible, los niveles de los mismos

son mucho más bajos. Este comportamiento indica que el cambio evaluado a este tiempo

posinoculación está determinado por un aumento de los niveles de compuestos

preexistentes de la planta, fenómeno que ha sido ampliamente discutido en este modelo

planta-patógeno (Higuera, 2001)

23Figura No. 23. Análisis de componentes principales para los resultados obtenidos durante la separación de compuestos de tipo flavonoide en tallos de clavel inoculados con el patógeno causal del marchitamiento vascular. A) Distribución de los diferentes tratamientos en los componentes de variación. B) Distribución de los compuestos de tipo flavonoide en los componentes de variación (Loading graph) S=susceptible and R= Resistente a Fod. I: Inoculado; C. Control.

En conclusión, el grupo de compuestos FT2 y FT6 son de particular interés, en el estudio

de los mecanismos que se activan en la variedad resistente, considerando que presentan

una variación significativa por efecto de la inoculación con el patógeno en la variedad

resistente (figura No. 24).

FT4

FT5

FT6

Resistente

SC96h

RC96h

RI96h

RC0h

SI96h

SC0h

Susceptible

FT1

A B

141

24Figura No. 24. Variación en el contenido de los componentes FT2 (A) y FT6 (B) durante la infección con el patógeno en las variedades resistente y susceptible. El análisis estadístico correspondiente se encuentra en la tabla No. 16. Los tratamientos seguidos con letras diferentes presentan diferencias significativas (α=0,05).

De acuerdo a los resultados encontrados hasta este punto, fue evidente un aumento en

los niveles de metabolitos que presentaban absorción a 350nm, por efecto de la

inoculación con el patógeno en raíces (Grupo I) y tallos (Grupo II). Estos presentan

particular interés para el estudio de este modelo teniendo en cuenta su comportamiento

inducible asociado con resistencia. Sin embargo, como se discutió previamente, es de

interés para este estudio determinar si algunos de los componentes de dichos grupos son

efectivamente flavonoides.

Es por ello, que sin pretender elucidar completamente la estructura de los mismos, se

usaron diferentes herramientas analíticas para tener una aproximación de las

características estructurales de dichos metabolitos de interés.

3.3.4. Aproximación a la estructura química para compuestos probablemente asociados a la resistencia del clavel

Para conocer algunas caracteristicas estructurales de los compuestos de los grupos I y II,

y sin pretender realizar una elucidación estructural completa, se analizaron los extractos


0

200000

400000

600000

800000

1000000

1200000

1400000

0 HORAS 96 HORAS

AR

EA (

UN

IDA

DES

AR

BIT

RA

RIA

S)


FT2

0

200000

400000

600000

800000

1000000

1200000

0 HORAS 96 HORAS

AR

EA (

UN

IDA

DES

AR

BIT

RA

RIA

S)


FT6

A B

a a a

b

a

c

b b

a

142

crudos obtenidos a partir de raíces y tallos de clavel infectados con el patógeno,

mediante técnicas como HPLC-DAD y HPLC-MS. Los resultados correspondientes se

presentan por órgano de la planta resaltando los aspectos más relevantes de estos

análisis y realizando propuestas estructurales para cada caso.

a. Análisis de metabolitos de interés en raíz (Grupo I)

Dentro de este grupo de metabolitos se encuentran aquellos que a nivel de la raíz

presentaron un aumento significativo en sus niveles en la variedad resistente por efecto

de la inoculación con el patógeno (F2, F3, F9 y F10). A pesar de que la separación

mediante las tres técnicas disponibles se realizó en cromatógrafos diferentes, el perfil

resultó ser exactamente igual para cada uno de los casos considerando que se usó la

misma columna y el mismo gradiente de elución (figura No. 25)

25Figura No. 25. Comparación de la separación cromatografica obtenida mediante los diversos tipos de análisis realizados (A) HPLC-MS, (B) HPLC-DAD Y (C) HPLC-UV

A continuación se presentan en la tabla No. 17, los resultados correspondientes para el

análisis de los metabolitos del grupo I, obtenidos por HPLC-DAD

F9

F10

F2

F3

HPLC-UV

HPLC-DAD

HPLC-MS

A

B

C

30 35 40 45 50 55 60 65 min

143

Tabla No. 17 Resumen de los espectros UV (250-500nm) para los compuestos del grupo I presentes en raíces de clavel, obtenidos mediante HPLC-DAD

Compuesto o

grupo de

compuestos

Tiempo de

Retención (min) Espectro UV

Maximos de absorción

(nm)

F2 35,34

<250, 285 h, 320

F3 35,84

<250, 295h , 335

F9 54,72

260,290, 320h

F10 60,05

290 h, 330

Se puede evidenciar que todos los compuestos presentan un máximo de absorción entre

320 y 350nm, típica de estructuras con grupo cinamoil como es el caso de los flavonoides

Dicho comportamiento no fue tan evidente para el compuesto F9, que presenta apenas

un hombro de baja intesidad a 320nm. En general los diferentes analitos presentan al

menos dos bandas de absorción en el rango de 260 a 400nm, lo cual es propio, pero no

necesariamente exclusivo, de los compuestos de tipo flavonoide. Es importante recordar

que los espectros de absorción UV de este tipo de compuestos, presentan diferentes

144

cambios en sus máximos de absorción en función de sus patrones de sustitución y del

solvente en el cual se encuentra disuelto (Harborne et al. 1975) y que su calidad depende

tambien, de la concentración del metabolito. Bajo estas consideraciones, teniendo en

cuenta que los máximos valores de absorbancia para estos compuestos se encuentran

en rangos bajos (0,020 UA a 350nm), es probable que estos espectros no presenten la

mejor calidad para obtener información estructural concluyente sobre los compuestos de

interés. Además, la posible coelución de otros compuestos que presenten absorción a

longitudes de onda cercanas, pueden interferir con la calidad de los resultados, tal y

como parece suceder para el caso de los compuestos F2 y F3, en donde la absorción a

longitudes de onda menores a 250 nm, puede afectar la calidad del espectro.

Los resultados encontrados para los compuestos del grupo I se compararon con los

valores de los máximos de absorción reportados para los diferentes compuestos de tipo

flavonoide que a la fecha han sido aislados y caracterizados del clavel (tabla No. 18). Tal

y como se observa en esta tabla, muchos de los flavonoides aislados a la fecha son

derivados glicosilados del kaemferol, flavonol con conocida actividad biológica

ampliamente distribuido en plantas (Hernández et al. 2009; Ballizany et al. 2012)

(Hernandez I 2009, Ballizany 2012). Estos compuestos presentan bandas de absorción

en la zona de 260 a 330nm, comportamiento típico de los flavonoles 3-O sustituidos

(Harborne et al. 1975; T. J. Mabry et al. 1980). Esto se debe a que la sustitutición en

dicha posición genera un corrimiento hipsocromico en la banda I del espectro, con

respecto a las del compuesto kaemferol puro ( λmax banda I en metanol 367nm ).

Al comparar estos resultados con los encontrados en la presente investigación (tabla No.

17) es probable que este tipo de compuestos (flavonoles 3-O-sustituidos) aislados de

variedades cultivadas en Europa tambien se encuentren en las variedades cultivadas

comercialmente en nuestro pais, considerando que los espectros obtenidos para los

compuestos encontrados en la presente investigación, tambien presentan valores de

absorción entre 250 y 320 nm (tabla No. 18). Esto es muy probable ya que de acuerdo a

(Galeotti, Barile, Lanzotti, et al. 2008), dichos compuestos se presentan en muchas

variedades de clavel en diferentes órganos de la planta y es probable que sean propios

de la especie vegetal de interés, Dianthus caryophyllus L. Sin embargo, esto es apenas

una aproximación sustentada en la comparación de máximos de absorción, criterio

preliminar para realizar una afirmación de este tipo, considerando que otros flavonoides

glicosilados pueden tambien presentar comportamiento similares (Harborne et al. 1975).

145

Tabla No. 18. Resumen de fórmula molecular, estructura y absorción UV, para flavonoides aislados de clavel

Fórmula

molecular y

masa molar

calculada

Estructura y nombre

Absorción

en el UV

(nm)

Referencia

C39H50O25

918,7973

CH3OH

O

OH

OH

O

O

OH

OH

O

O

O

OH

O

OHOH

OH

O

OHOH

OH

OH

OH

O

O

OH

Kaemferol 3-O-β-D –glucopiranosil (1→2)-O- β-

D –glucopiranosil (1→2)-O--L-ramnopiranosil-

(1→6)- β-D –glucopiranosido

324, 302,

266 en

metanol

(Galeotti,

Barile, Curir, et

al. 2008)

C33H40O20

756,6587

CH3OH

O

OH

OH

O

O

OH

OH

O

O

OH

O

OHOH

OH

OH

OH

O

O

OH

Kaemferol 3-O-β-D –glucopiranosil (1→2)-O--

L-ramnopiranosil-(1→6)- β-D –glucopiranosido

322 302

267

(Galeotti,

Barile,

Lanzotti, et al.

2008)

146

C27H30O15

594,5181

CH3OH

O

OH

OH

O

O

OH

OH

OH

O

OH

OH

O

O

OH

Kaemferol 3-O- -L-ramnopiranosil-(1→6)- β-D

–glucopiranosido

322, 302,

267

(Galeotti,

Barile,

Lanzotti, et al.

2008)

C27H30O15

594,5181

OH

O

OH

OH

OH

OH

O

OHOH

OH

OH

OH

O

O

OH

Apigenin 6,8-di-C- β- D –glucopiranosido

329, 298 y

273

(Galeotti,

Barile,

Lanzotti, et al.

2008)

C34H42O20

770,6850

CH3

CH3OH

O

OH

OH

O

O

OH

OH

O

O

OH

O

OHOH

OH

O

OH

O

O

OH

Kaemferido 3-O-β-D –glucopiranosil (1→2)-O-

-L-ramnopiranosil-(1→6)- β-D –

glucopiranosido

350 216

264

(Curir et al.

2001)

C26H28O16

596,49092

OH

OH

OH

OH

O

O

OH

O OH

O OH

OH

O

OH

O

OH

3-6-O-(-L-arabinopiranosil)-β-D-

glucopiranosil-quercetina (peltatosido)

359, 297,

270, 257

(Curir et al.

2003)

147

C15H10O6

286,2363

OH

OH

O

O

OH

OH

3,5,7,2´tetrahidoxiflavona (Datiscetina)

264, 398 (Curir et al.

2003)

Con los resultados obtenidos hasta este punto, se tenía alguna información acerca de la

probable naturaleza flavonoide de los compuestos del grupo I. Es por ello que se

prosiguió con los análisis por HPLC-MS buscando que estos análisis permitirian obtener

mas información para proponer algunas características estructurales de los mismos. Los

análisis se realizaron con un detector de masas de baja resolución, que presentaba una

interfase de ionización con electrospray (ESI) (Metodologia 3.2.6). Este método de

ionización débil, permite obtener información principalmente acerca del ión

pseudomolecular y permite deducir por tanto, la masa de los compuestos de interés

(Prasain et al. 2004). Esta aproximación experimental fue considerada válida para

efectos del presente estudio, teniendo en cuenta que no se buscaba elucidar

completamente la estructura de los compuestos de interés y que además, con la

información de la masa de los compuestos flavonoides mayoritarios del clavel (tabla No.

18), se podría comparar y proponer la posible correspondencia de estos compuestos con

los pertenecientes al grupo I.

Bajo estas consideraciones se realizaron los análisis para los extractos obtenidos de

raíces resistentes inoculadas a 6 hpi, inicialmente mediante modo SCAN en el rango de 0

a 2000 m/z (figura No. 26). Considerando la baja concentración de los metabolitos en la

muestra y que solamente se hicieron inyecciones con volúmenes de 5 µL, los TIC (Total

ion chromatogram) de los diferentes análisis mostraban que la detección de los iones

provenientes de los compuestos que eluian en los tiempos de interés era baja.

148

26Figura No. 26. Comparación del perfil de elución y el TIC para el análisis por HPLC-MS de los extractos obtenidos de raíces de clavel. Condiciones de elución y análisis por MS de acuerdo al numeral 3.2.6.

Los espectros obtenidos mediante este modo de análisis, permitieron la detección de un

número importante de iones en cada tiempo de elución, lo que indicaba que

efectivamente se trataba de mezclas de compuestos, además de ruido correspondiente

al equipo (tabla No. 19), considerando que con las condiciones suaves propias del

método de ionización usado, era poco probable que los iones que se detectaban fuesen

producto de un proceso de fragmentación típico, obtenido de un proceso de ionización

más fuerte como el que se puede obtener mediante impacto electrónico (IE).

El análisis de los posibles abductos que se podrían formar para los diferentes

compuestos flavonoides que a la fecha han sido reportados en clavel (tabla No. 18), se

realizó teniendo en cuenta los diferentes componentes de la fase móvil (ácido acético y

acetonitrilo) y el modo de detección usado (modo negativo). Para ello se usó la hoja de

cálculo suministrada desde http://www.alchemistmatt.com/mwtwin.html, en donde se

determinó que, de los diferentes iones encontrados en estos tiempos de elución en modo

SCAN (tabla No. 19), en raíces de clavel, ninguno correspondia a los metabolitos

esperados (tabla No. 18). Esto indicaba que esta aproximación experimental no era la

adecuada y que probablemente los iones detectados se generaban por la elución de

otros compuestos o a ruido propio del equipo.

10 20 30 40 50 60 70 80 min

0.00

0.25

0.50

0.75

1.00

1.25

mAU(x10)Detector A Ch2:350nm

TIC

Perfil de elución

a 350nm

http://www.alchemistmatt.com/mwtwin.html

149

Tabla No. 19. Información obtenida de los análisis por HPLC-MS modo SCAN, de extractos obtenidos a partir de raíces de clavel

Compuesto o

mezcla de

compuestos

Tiempo retención en

HPLC-MS (min) Señales encontradas (m/z)

F2 34,1 600.15, 659.05, 713.45 *, 791.25, 1017.05

F3 35,0 600,15, 713.45, 826.50* 904.55, 1017.05

F9 59,1 329.25, 657.25*, 713.35, 826.90, 911.40

F10 64,3 281.95, 713.15, 826.45, 930.70*, 980.05

Bajo estas consideraciones, se optó por realizar un seguimiento de la elución de iones

específicos, como la que se puede realizar mediante el modo SIM (Selected Ion

Monitoring); este permite aumentar la sensibilidad de la detección de ciertos iones de

interés que se presentan en muy bajos niveles en matrices complejas. Específicamente

se evaluó si el compuesto Kaemferido 3-O-β-D–glucopiranosil-(1→2)-O--L-

ramnopiranosil-(1→6)- β-D–glucopiranosido (peso molecular: 770,6 uma), el cual ha sido

encontrado en tallos y raíces de clavel infectadas por el patógeno (Curir et al. 2005), se

encontraba en las raíces de la planta. Así mismo, este análisis permitiría determinar, por

comparación con los tiempos de retención de los compuestos del grupo I, si dicho

compuesto era alguno de estos metabolitos, que de acuerdo con el presente estudio,

están asociados a los mecanismos de defensa activa y a la resistencia al marchitamieto

vascular.

El análisis en modo SIM, para el ión pseudomolecular correspondiente a este compuesto

(M-1) con un m/z=769 se presenta a continuación en la figura No. 27. Se pudo

determinar que el ión de interés eluye en un tiempo de 35,4 min, tiempo en el que se

espera eluyan los iones correspondientes al compuesto F2. Considerando la naturaleza

polar de este compuesto, era de esperarse que eluyera en los tiempos de retención

cercanos a los del compuesto F2; la elución de los flavonoides glicosilados se debe

presentar en tiempos de retención menores que los encontrados para las agliconas

teniendo en cuenta la mayor polaridad de los primeros y que se estaba usando una

columna en fase reversa (Wrostland 2005).

150

27Figura No. 27. Comparación del perfil de elución del ión m/z= 769 y el perfil de elución a 350nm para extractos obtenidos de raíces de clavel. Condiciones de elución en HPLC y análisis de MS de acuerdo al númeral 3.2.6.

En general, la coincidencia encontrada en los tiempos de elución se constituyó en

evidencia para proponer que el compuesto Kaemferido 3-O-β-D –glucopiranosil (1→2)-O-

-L-ramnopiranosil-(1→6)- β-D –glucopiranosido, era probablemente el compuesto F2,

el cual de acuerdo al análisis previamente realizado, participaba en los mecanismos de

defensa activa en raíces de clavel, tal y como había sido propuesto por Curir et al (2005).

En este punto de la investigación, considerando los resultados obtenidos en HPLC-DAD

y HPLC-MS, se tenía evidencia para proponer que al menos uno de los compuestos del

grupo I, era un flavonoide y que este era probablemente el mismo compuesto que había

sido aislado en estudios previos por Curir 2005. El análisis en modo SIM de los otros

iones pseudomoleculares esperados para los demás compuestos de la tabla No. 18, no

presentaron resultados concluyentes considerando que el tiempo de elución encontrado

para cada uno de ellos, no coincidían con los tiempos de elución que habían sido

definidos para los compuestos del grupo I. Considerando que se había cumplido con el

objetivo de encontrar evidencia sobre la presencia de flavonoides inducibles en este

órgano de la planta, determinando la presencia de al menos uno de ellos, el análisis de

los demás compuestos F3, F9 y F10, queda como tema de investigación para próximos

estudios en donde se usen herramientas como sistemas de detección de alta resolución

y sistemas de ionización secuenciales, como HPLC-MS-MS, técnica ampliamente usada

10 20 30 40 50 60 70 80 min

-2.0

-1.0

0.0

1.0

2.0

3.0

4.0


Perfil cromatográfico elución A

350nm

151

en el análisis de este tipo de compuestos en matrices vegetales (Prasain et al. 2004;

Truchado et al. 2009; Aguirre-Hernández et al. 2010; Gunnaiah et al. 2012).

b. Análisis de metabolitos de interés en tallo (Grupo II)

Con el fin de determinar la naturaleza de los compuestos del grupo II, los cuales

presentaron una inducción diferencial en tallos de clavel por la infección con el patógeno,

se evaluaron de manera inicial los espectros UV mediante la técnica HPLC-DAD (tabla

No. 20) En este caso particular, se encontraron espectros con bandas bien definidas,

típicas de compuestos de tipo flavonoide, indicando que los compuestos FT2 y FT6,

probablemente correspondían a esta familia de compuestos.

Tabla No. 20. Resumen de los espectros UV (250-500nm) para los compuestos del grupo II presentes en tallos de clavel, obtenidos mediante HPLC-DAD

Compuesto o

grupo de

compuestos

Tiempo de

Retención (min) Espectro UV

Maximos de absorción

(nm)

FT2 21,01

270, 330

FT6 30,21

265, 340

Al comparar los valores de los máximos de absorbancia para estos metabolitos, con

respecto a los ya reportados en otros compuestos aislados del clavel (tabla No. 18), se

pudo determinar que era muy probable que existieran coincidencias. Sin embargo, tal y

como se citó para los compuestos de la raíz, el criterio de los máximos de absorción, es

apenas un acercamiento a la estructura de dichos metabolitos.

152

Bajo esta consideración, se realizaron los análisis correspondientes de HPLC-MS en

modo SCAN inicialmente, considerando que la buena calidad de los espectros UV para

estos compuestos, indicaba que era probable que los resultados en este modo de

análisis generaran mejores resultados que en raíz. Sin embargo, este no fue el caso para

aquellos tiempos de retención en donde se esperaba la elución del compuesto FT2,

teniendo en cuenta que se presentó un importante número de iones, de manera similar a

lo encontrado en el caso de los componentes del grupo I de raíz. Para el caso del

compuesto FT6, se encontró un espectro de masas relativamente limpio, con un ión de

m/z= 755,10 +/- 0,5 (figura No. 28). Considerando que en esta relación carga/masa se

esperaba el ión pseudomolecular (M-1) para el compuesto Kaemferol-3-O-β-D–

glucopiranosil-(1→2)-O--L-ramnopiranosil-(1→6)-β-D–glucopiranósido (masa

molecular = 756,6 uma), se propuso que este compuesto era el FT6, metabolito que se

induce por infección por el patógeno en tallos de la variedad resistente L.P Candy. En

este espectro se evidencia tambien la coelución de un ión pseudomolecular con una

relación m/z de 600,4, lo que indica que tampoco para el compuesto FT6, se presentó

una elución totalmente independiente.

28Figura No. 28. Especto de masas en modo SCAN para el compuesto FT6 presente en tallos de clavel. Las condiciones correspondientes de separación y análisis por HPLC-MS se describen en el númeral 3.2.6.

Con este resultado se pudo proponer la naturaleza flavonoide para el compuesto FT6 y

permitió por tanto confirmar que en tallos del clavel, se presenta la participación de

flavonoides en los mecanismos de defensa activa de la planta. Bajo estas

consideraciones, no se realizaron análisis posteriores para el compuesto FT2, y el

análisis estructural completo para este compuesto, queda como objetivo de próximas

investigaciones.

En conjunto, los resultados obtenidos en tallos y raíces de clavel en esta parte de la

investigación, se constituyeron en más evidencia acerca del papel que estos compuestos

153

pueden jugar en la interacción con el patógeno y permitieron seguir proponiendo a los

flavonoides, como parte de los mecanismos que se activan en la planta resistente en su

interacción con el patógeno, tal y como había sido ampliamente discutido en apartes

anteriores de la investigación. Considerando las características antifúngicas de los

metabolitos Kaemferol 3-O-β-D –glucopiranosil (1→2)-O--L-ramnopiranosil-(1→6)- β-D

–glucopiranosido y Kaemferido 3-O-β-D –glucopiranosil (1→2)-O--L-ramnopiranosil-

(1→6)- β-D –glucopiranosido, reportadas en estudios previos (Curir et al. 2005; Curir et

al. 2001), se puede pensar que el papel de estos metabolitos puede estar referido a estas

propiedades antifúngicas. Un aumento en los niveles de estos metabolitos en las

primeras etapas de la infección, puede ser una caracteristica determinante para evitar el

éxito de la colonización del patógeno en los tejidos de la planta.

La distribución de los derivados glicosilados del kaemferol en los tejidos vegetales, ha

sido ampliamente documentada y se han asociado con procesos de adaptación a

diferentes estados de estrés (Sánchez-Rodríguez et al. 2011). A pesar de que la

actividad antioxidante reportada para estos metabolitos, es menor que la reportada para

otros flavonoles glicosilados con patrón de hidroxilación 3´,4´en el anillo B, la presencia

del patrón de sustitución 5,7 del anillo A, ha sido asociada a la capacidad de inactivar

radicales y por tanto presentar actividad antioxidante (Catherine Rice-Evans et al. 1996).

Es por ello que no se puede descartar una posible acción de los mismos, en la

inactivación de especies altamente oxidantes, sobre todo en aquellas etapas de la

interacción en donde la presencia de dichas moléculas oxidantes, no es benéfica para la

planta. Sin embargo, considerando que la localización de estos metabolitos finalmente es

la que permitirá su interacción con dichas especies oxidantes, ésta debe ser un punto

determinante para su acción (Agati et al. 2012).

Se ha propuesto que estos compuestos glicosilados se acumulan en las vacuolas de las

células parenquimaticas adyacentes a los vasos del xilema, en donde se constituyen

como reservorios para ser usados en el momento en que se necesiten durante la

interacción con potenciales patógenos (Beckman 2000). Se ha reportado que algunas

enzimas del tipo UDP-glicosil transferasas, involucradas en la biosíntesis de estos

compuestos glicosilados, se inducen por el efecto de la inoculación con patógenos

(Miranda et al. 2007; Veljanovski & Constabel 2013). Asi mismo una vez sintetizados,

éstos pueden ser transportados a través de procesos como el tráfico vesicular, por acción

154

de transportadores MATE (Multidrug and toxic compound extrusion transporters) o por la

acción de transportadores ABC, para su almacenamiento en las vacuolas o su

localización en el punto de acción a nivel del apoplasto (J. Zhao & Dixon 2010; Agati et

al. 2012).

A pesar de que se ha propuesto que las correspondientes agliconas son las que

presentan la mayor actividad antimicrobiana, diferentes glicosidos del kaempferol han

sido asociados con resistencia vegetal (Abdel-farid et al. 2009; Kröner et al. 2012;

Troncoso-Rojas et al. 2012). En clavel, tanto el flavonoide kaemferido (3´-metil

kaemferol), como su derivado triglicosilado kaemferido 3-O-β-D –glucopiranosil-(1→2)-O-

-L-ramnopiranosil-(1→6)- β-D –glucopiranosido, presentan actividad antifungica sobre

Fod. Sin embargo, se ha encontrado que la especie glicosilada puede presentar una

actividad más alta que la correpondiente aglicona (Curir et al. 2005). Teniendo en cuenta

que en esta especie vegetal no se han realizado estudios a nivel histológico que permitan

conocer como se ubican a nivel subcelular dichos compuestos y se desconoce por tanto

su modo de acción en la planta, deberán realizarse próximas investigaciones para

determinar finalmente cual es papel que cumplen los mismos en esta interacción.

En conjunto, los resultados obtenidos hasta este punto de la investigación permiten

proponer un papel para los compuestos de tipo flavonoide en los mecanismos de defensa

que se activan en las plantas de clavel. Sin embargo, era claro que con el fin de tener

aún más evidencia sobre el papel de estos metabolitos en la planta, era de interés

conocer si se presentaba estimulación de las rutas biosintéticas asociadas, durante la

interacción con el patógeno. La acumulación de metabolitos y enzimas asociadas a su

biosíntesis, es un fenómeno que debe ser estudiado en cada interacción planta-

patógeno, con el fin de determinar si realmente existe una generación de dicho

metabolito por parte de la planta durante la interacción (Hammerschmidt 1999; Treutter

2006).

155

3.3.5. Evaluación de los niveles de actividad y transcripcionales para las enzimas PAL, CHS y CHI, en raíces y tallos de clavel durante la interacción con Fod

Teniendo como antecendente lo estudiado en la primera fase de esta investigación

(Capítulo 2) en donde se encontró la relación que a nivel constitutivo existía entre los

niveles de flavonoides y de las enzimas asociadas con su biosíntesis, era de interés para

este modelo, conocer como se presentaba la regulación espacio temporal de dichas

enzimas, en la interacción particular de la planta con este patógeno. De esta manera, en

la presente etapa, se evaluaron los niveles de actividad y transcripciónales para las

enzimas fenilalanina amonio liasa (PAL), chalcona sintasa (CHS) y chalcona isomerasa

(CHI) tanto en raíces como en tallos de clavel, y se relacionaron con la acumulación de

flavonoides previamente descrita y con la resistencia a la enfermedad marchitamiento

vascular.

Los análisis de actividades enzimáticas se llevaron a cabo para ambos órganos de la

planta en todos los tiempos posinoculación planteados (0, 6, 12, 24, 48 y 96 hpi) y de

acuerdo con los resultados obtenidos, se seleccionaron aquellas enzimas para las cuales

se realizó la evaluación de niveles transcripcionales; si la infección con el patógeno no

generaba un aumento en los niveles de actividad enzimática, no era de interés, al menos

para esta investigación, conocer como se modulaban los niveles de mRNA

correspondientes.

Las determinaciones de actividades enzimáticas y niveles transcripcionales se realizaron

de acuerdo a las condiciones descritas en los numerales 3.2.7 y 3.2.8. Al respecto de la

evaluación de los niveles de mRNA, teniendo en cuenta los resultados obtenidos en

ensayos preliminares, en donde no se encontró un gen casero que presentara niveles

relativamente constantes durante el periodo posinoculación evaluado (los genes

codificantes para la β-actina variaban en mas de 4 órdenes de magnitud y otros como los

de las histonas y del factor de elongación no amplificaron o presentaron

inespecificidades), se optó por realizar una evaluación por cuantificación absoluta de los

niveles transcripcionales para las diferentes enzimas objeto de estudio. De esta manera

los resultados correspondientes se presentan como número de copias/pg de cDNA de

acuerdo a las recomendaciones citadas por (Y. Lu et al. 2012), para tejidos que se

encuentran en el mismo estado de desarrollo y no presentan cambios importantes en la

156

expresión genómica global. Se asume que durante el tiempo del estudio (0 a 96 hpi), no

se presentan cambios importantes al respecto, en raíces y tallos de clavel.

Con el fin de tener en cuenta los cambios en las condiciones ambientales o en el

metabolismo basal de la planta durante los tiempos de muestreo, los resultados se

expresan también como la relación entre los niveles de mRNA entre inoculados y

controles para cada tiempo posinoculación y cada tratamiento, de esta manera se evalua

solamente el efecto que presenta la inoculación con el patógeno (Desmond et al. 2008;

Godard et al. 2009). Se usaron condiciones semejantes en los procesos de extracción de

RNA y retrotranscripción para todas las muestras y se cuantificó el cDNA por

fluorescencia en cada una de las reacciones (metodología 3.2.8). De esta manera se

aseguró que la eficiencia en los procesos previos al análisis por PCR en tiempo real

fuese la misma (Cikos & Koppel 2009; Y. Lu et al. 2012). Finalmente la eficiencia de

amplificación se evaluó usando los datos de fluorescencia vs No. de ciclos (Ramakers et

al. 2003), y se determinó que bajo las condiciones de trabajo no se presentaba

contaminantes que afectaran finalmente los resultados obtenidos.

Se presentan para cada órgano de la planta y para cada enzima, los resultados de

manera independiente, mostrando primero los resultados de actividad y si es el caso,

inmediatamente después, sus niveles transcripcionales correspondientes. Posteriormente

se discuten los resultados obtenidos en cada órgano objeto de estudio y finalmente se

comparan todos los resultados obtenidos para tener un panorama general de la

respuesta en toda la planta.

a. Fenilalanina Amonio Liasa (PAL) en raíces de clavel

En esta fase del estudio se respondió la pregunta si había relación entre el aumento en

los niveles de flavonoides encontrados en este órgano durante la infección con el

patógeno y los niveles de actividad de las enzimas asociadas con su biosíntesis. Se pudo

determinar que para el caso de la enzima PAL (figura No. 29), los niveles de actividad

presentaron un aumento significativo en la variedad resistente inoculada a las 96 hpi,

mientras que en la variedad susceptible no se presentó cambio alguno. El aumento en la

actividad de esta enzima, que fue de casi 3 veces con respecto al control no inoculado,

constituyó evidencia de su participación en el aumento de compuestos fenólicos que se

presentan en este órgano de la planta a este mismo tiempo posinoculación (figura No.

157

15). Este resultado está de acuerdo con un estudio previo realizado en el grupo con la

variedad resistente Kiss, en el que bajo las mismas condiciones de inoculación, se

presento un aumento en los niveles de esta enzima, a las 48 hpi con el patógeno (Ardila

et al. 2011).

Estos resultados coinciden con estudios realizados en otras plantas en donde el aumento

de la actividad de esta enzima, es un fenómeno asociado a resistencia a diferentes

patógenos o al reconocimiento de elicitores provenientes de los mismos (Giberti et al.

2012; Rahman & Punja 2005; Forlani 2010; Y. Ge et al. 2013). Se ha encontrado por

ejemplo, un aumento en los niveles de esta enzima asociados con resistencia a Fusarium

oxysporum f. sp. albedinis en palma (Modafar et al. 2001) y Fusarium oxysporum f.sp.

cubense en banana (Subramaniam et al. 2006).

El hecho de que los niveles de esta enzima no cambien en tiempos más tempranos

cuando se presenta un aumento en los niveles de fenoles y flavonoides (6 hpi), indica

que, sí en este tiempo posinoculación se presenta la acumulación de compuestos

derivados del ácido hidroxicinámico propuesta previamente, es probable que sea debido

a procesos independientes a la estimulación de la ruta fenilpropanoide. Tal y como ha

sido sugerido, la acumulación de estos metabolitos a tiempos tempranos no

necesariamente requiere la activación de la transcripción y traducción de genes

codificantes para enzimas asociadas a su biosíntesis (Matern & Kneusel 1988;

Naoumkina et al. 2007). De esta manera, es probable que la posible acumulación de

ácidos hidroxicinámicos, se deba a su liberación a partir de formas glicosiladas

disponibles, como las que se pueden encontrar en vacuolas de células especializadas

ubicadas estratégicamente en los tejidos parenquimáticos que se encuentran junto a los

vasos xilemáticos (Beckman 2000). Los procesos de descompartimentalización

intracelular y posterior localización de estos metabolitos en la planta, en donde

participarían β-glucosidasas y transportadores ABC serían, a este tiempo posinoculación,

los que finalmente podrían estar asociados con la expresión de resistencia, tal y como ha

sido propuesto para células de Medicago truncatula tratadas con ácido jasmonico

(Naoumkina et al. 2007).

158

29Figura No. 29. Niveles de actividad fenilalanina amonio liasa en raíces de clavel durante el ensayo in vivo de inoculación con el patógeno Fod raza 2. Se presentan los resultados promedio de tres extracciones independientes para cada tratamiento. Las letras diferentes muestran tratamientos diferentes significativamente (α= 0,05)

El aumento en la actividad de enzima a las 96 hpi, indica que es probable que la

inducción de ésta en clavel, sea un fenómeno asociado con el reconocimiento de

elicitores generales provenientes de patógenos de este género y a la activación de

mecanismos asociados a la resistencia basal de la planta, lo cual concuerda con estudios

previos en este modelo en donde se presentó un aumento en la actividad de esta

enzima, por el tratamiento con elicitores crudos provenientes de este patógeno (Ardila et

al. 2007). Sin embargo, solo con estudios adicionales que permitan obtener una mayor

evidencia al respecto, se puede corroborar dicha hipótesis en el clavel. Por ejemplo,

estudios que permitan evaluar los niveles de esta enzima en otros genotipos del clavel, o

que permitan determinar cuales son los receptores de la planta y los elicitores

provenientes del patógeno asociados con dicho reconocimiento, permitirían obtener

mayor evidencia al respecto para apoyar o refutar dicha hipótesis.

Con el fin de indagar si uno de los puntos de regulación de la enzima está a nivel de la

transcripción, se evaluaron en estos tiempos posinoculación, los niveles de mRNA

mediante la técnica de realtime PCR con cuantificación absoluta, siguiendo las

recomendaciones que se citaron previamente en los ensayos preliminares (figura No. 30.

A y C). Con estos mismos datos se determinó tambien, la relación entre los niveles de

mRNA entre inoculados y controles para cada tiempo posinoculación (figura No. 30. B y

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C), para tener en cuenta el efecto de las condiciones ambientales (Desmond et al. 2008;

Godard et al. 2009).

30Figura No. 30. Niveles transcripcionales para genes codificantes para la enzima PAL en raíces de clavel durante el ensayo in vivo de inoculación con el patógeno Fod raza 2. Variedad resistente L.P. Candy cuantificación absoluta (A) y relación inoculado/ control (B). Variedad susceptible Tasman cuantificación absoluta (C) y relación inoculado/ control (D). Se presentan los resultados promedio de tres extracciones independientes para cada tratamiento. Las letras diferentes muestran tratamientos diferentes significativamente (α= 0,05). El análisis estadístico para la relación inoculado/control se realizo entre los diferentes valores encontrados para los diferentes tiempos

Los resultados que se encontraron, indicaron que en general los niveles transcripcionales

a las 6hpi, tanto para controles e inoculados para las dos variedades estudiadas, son

superiores a los encontrados para las cero horas, hecho que se puede explicar teniendo

en cuenta los diferentes reportes en donde se ha encontrado en otras especies

vegetales, un aumento en los niveles de mRNA para esta enzima y/o de promotores

asociados con su transcripción, en diferentes condiciones ambientales (Seelakshmri &

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160

R. Sharma 2008; Lea et al. 2007; Winkel-Shirley 2002; Agati et al. 2011). El proceso de

inmersión de las raíces de la planta en una solución de conidías o en agua, supone un

cambio en las condiciones de temperatura y de humedad, para el cual la planta debe

activar un conjunto de mecanismos que le permiten su adaptación. De acuerdo a los

resultados de este estudio, estos fenómenos, estan sujetos a un aumento en los niveles

de transcripción para dichos genes, lo cual a su vez, debe estar asociado a los aumentos

que se presentaron para todos los tratamientos, a este mismo tiempo posinoculación en

los niveles de actividad enzimática y en los niveles de “compuestos probablemente

flavonoides” determinados por HPLC (figura No. 29 y tabla No. 11).

Un aumento en los niveles de mRNA tambien se presentó a 48 hpi, en el control y el

correspondiente inoculado para la variedad resistente L.P Candy (figura No. 30). Es

evidente que este aumento se presenta por efecto de las condiciones ambientales

propias del ensayo y que la variedad susceptible no responde de la misma manera a

dichas condiciones ambientales. Es probable que diferencias propias a nivel del genotipo,

le den a las plantas resistentes la capacidad de responder a diferentes condiciones de

estrés vegetal, incluyendo la interacción con microorganismos o condiciones ambientales

particulares. Se ha propuesto que las respuestas que se activan en plantas resistentes

ante patógenos y la adaptación a condiciones de estrés abiótico, deben tener algunos

mecanismos comunes; se ha determinado que diferentes condiciones de estrés, pueden

estar asociados a cambios en los niveles de enzimas del metabolismo secundario de

manera similar a lo encontrado durante la interaccion con otros patógenos (J. J. Choi et

al. 2001; YunSheng Wang et al. 2012; Boava et al. 2011; Seelakshmri & R. Sharma

2008).

Con respecto a la inoculación con el patógeno (figura No. 30 B yD), se evidencia que

tanto en la variedad resistente como en la susceptible, se presentan niveles superiores

de mRNA para los tratamientos inoculados con el patógeno, siendo de hecho, más

temprano el aumento en el caso de la variedad susceptible (6 hpi). Estos resultados

indican que la presencia del patógeno genera tanto en plantas resistentes como

susceptibles, aumentos en los niveles de mRNA para esta enzima, siendo por tanto una

respuesta inespecífica, la cual debe estar asociada con la respuesta basal de la planta en

ambas variedades de clavel. Es probable que el número de conidias del patógeno que

entran en contacto entre los tejidos vasculares de la planta, aumente más rapidamente

en el caso de la variedad susceptible y generen una inducción más temprana en la

161

transcripción de estos genes (6hpi), que el presentado para la variedad resistente (12

hpi). Diferentes fenómenos asociados a la defensa extravascular, pueden actuar a nivel

de este órgano (Baayen & Plas 1992) y es probable que generen diferencias en la

velocidad con la que el patógeno entra en contacto con los tejidos vasculares entre la

variedad resistente y la susceptible. Estos resultados tambien concuerdan con estudios

previos realizados en el grupo, en el que se encontró que los niveles transcripcionales

para la enzima PAL a nivel de la raíz en este modelo, aumentan primero en la variedad

susceptible usando la técnica RT-PCR semicuantitativa (Ardila et al. 2011).

De acuerdo con los resultados encontrados en la presente investigación, se encontró que

el aumento encontrado en los niveles de mRNA para la enzima PAL en la variedad

resistente (12 y 24 hpi) (figura No. 30), no se presenta de manera simultánea con el

aumento en la actividad de la enzima (96 hpi) (figura No. 29). Es probable que el

aumento en los niveles de mRNA encontrados puedan conducir a la síntesis de la PAL, la

cual se puede producir de forma inactiva y a las 96 hpi activarse con otra señal en la

proteína activa. Esto estaría de acuerdo con lo sugerido previamente, sobre la acción

mecanismos de regulación postranscripcional para esta enzima en raíces de clavel

durante la infección con este patógeno (Ardila et al. 2007). Algunos reportes han citado

que pueden existir diversos mecanismos de regulación postranscripcional que pueden

determinar los niveles de actividad de la PAL en plantas como la inhibición por producto

(Blount et al. 2000), glicosilación (N. M. Shaw et al. 1990), defosorilación (S. Cheng et al.

2001; Seelakshmri & R. Sharma 2008). Es probable que algunos de estos mecanismos

de regulación, estén asociados a diferentes fenómenos de reconocimiento del patógeno y

final activación de los mecanismos de defensa en este órgano de la planta a las 96 hpi,

con el fin de aumentar los niveles de esta enzima y generar un aumento final de

metabolitos en este tiempo posinoculación. Esta propuesta estaría de acuerdo con lo

reportado por (S. Cheng et al. 2001) en Arabidopsis thaliana, en donde la activación de la

PAL por fosforilación se debe a la acción de una kinasa con dominios similares a

calmodulina (CDPK por sus siglas en ingles para calmodulin-like domain protein kinase),

la cual es sensible a los cambios en los niveles de Ca+2 a nivel citoplasmático, fenómeno

que a su vez, ha sido asociado al reconocimiento de elicitores (S. Cheng et al. 2001). Es

importante recordar que un aumento en los niveles de Ca+2 citoplasmático ha sido

asociado a la activación de este tipo de kinasas, debido a un reconocimiento de MAMPs

162

en la expresión de la resistencia basal o inmunidad activada por MAMPs (MTI, de sus

siglas en ingles MAMP trigered inmunity) (Muthamilarasan & M. Prasad 2013).

En general, el aumento en los niveles de esta enzima en la variedad resistente a este

tiempo posinoculación, genera inquietudes con respecto al comportamiento de la

actividad en tiempos posteriores; no se sabe si los niveles de esta enzima siguen

aumentando o disminuyen luego de un tiempo para establecer un comportameinto

modular. Así mismo, no se sabe si a tiempos posteriores pos inoculación, se presenta un

aumento en los niveles de actividad en la variedad susceptible, asociado a la posible

activación de aquellos mecanismos de regulación postranscripcional previamente

mencionados para la variedad resistente. Estos deben ser objeto de estudio a futuro en

próximas investigación que permitan profundizar sobre dichas inquietudes y en general,

sobre el papel de esta enzima en los mecanismos de defensa del clavel.

b. Chalcona Sintasa CHS en raíces de clavel

Con respecto a los niveles de actividad chalcona sintasa (CHS), enzima asociada con la

biosíntesis de chalconas y flavonoides en tejidos vegetales (figura No. 31), se evidenció

un aumento estadísticamente significativo en raíces de la variedad resistente inoculada a

las 6 y 48 hpi, mientras que para la variedad susceptible, en ningún tiempo evaluado se

presentaron cambios significativos entre controles e inoculados. Estos resultados

evidencian que el aumento en los niveles de esta enzima están asociados con los

mecanismos de defensa que se activan en el clavel durante la infección con el patógeno,

tal y como ha sido encontrado para otras especies vegetales (Â. D. Campos et al. 2003).

163

31Figura No. 31. Niveles de actividad Chalcona sintasa en raíces de clavel durante el ensayo in vivo de inoculación con el patógeno Fod raza 2. Se presentan los resultados promedio de tres extracciones independientes para cada tratamiento. Las letras diferentes muestran tratamientos diferentes significativamente (α= 0,05)

Hasta este punto es importante anotar con respecto a este aumento en la actividad CHS

presente en raíces de clavel, que si bien es un fenómeno que habia sido asociado a

resistencia en diferentes modelos planta-patógeno (Dao et al. 2011), no había sido

estudiado en esta especie particular durante la interacción con patógenos. De acuerdo a

los resultados de la presente investigación, este aumento en la actividad enzimática debe

estar asociado con el aumento en metabolitos de tipo flavonoide descrito en apartes

previos de esta investigación; el aumento de esta enzima que se presentó a las 48 hpi,

probablemente generó la inducción de este tipo de metabolitos a las 96 hpi en esta

variedad (figura No. 15). Asi mismo, el aumento que se presentó a las 6hpi en el

contenido de flavonoides totales, debe tambien estar asociado con los niveles de

actividad para esta enzima.

Estos resultados evidencian el papel que tiene la chalcona sintasa en los mecanismos de

defensa activa de la planta y generan inquietudes respecto a como se regulan sus formas

activas a nivel de las raíces de clavel. Con el fin de indagar sobre estos procesos, en los

mismos tiempos posinoculación se determinaron los niveles de mRNA para los genes

codificantes de esta enzima, tal y como se describió en la metodología 3.2.8. (figura No.

32)

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164

32Figura No. 32. Niveles transcripcionales para genes codificantes para la enzima CHS en raíces de clavel durante el ensayo in vivo de inoculación con el patógeno Fod raza 2. Variedad resistente L.P. Candy cuantificación absoluta (A) y relación inoculado/ control (B). Variedad susceptible Tasman cuantificación absoluta (C) y relación inoculado/ control (D). Se presentan los resultados promedio de tres extracciones independientes para cada tratamiento. Las letras diferentes muestran tratamientos diferentes significativamente (α= 0,05). El análisis estadístico para la relación inoculado/control se realizó entre los diferentes valores encontrados para los diferentes tiempos

Como parte de estos resultados (Fig 32 B y D), se pudo determinar que la inoculación

con el patógeno genera un aumento significativo para las dos variedades, siendo mas

temprano y superior para el caso de la variedad resistente (12 y 24hpi) al comparar con

la variedad susceptible (24hpi). Este aumento en los niveles de mRNA para esta enzima

muestra que la expresión diferencial de estos genes está asociada con la resistencia.

Resultado similar se reportó para otras especies vegetales como palma (Arfaoui et al.

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165

2007), soya (Upchurch & Ramirez 2010), Uva (Louime et al. 2011), almatruz amarillo

(Morkunas et al. 2011), arroz (Hao et al. 2009), lino (Kamil Kostyn et al. 2012), algodón

(Y. Cui et al. 2000). Asi mismo, dentro de estos reportes se encuentra que la expresión

de los genes que codifican para esta enzima, está asociada a resistencia a patógenos del

género fusarium como Fusarium oxysporum f. sp. ciceris (Arfaoui et al. 2007), Fusarium

oxysporum f. sp. lupini (Morkunas et al. 2011) y Fusarium oxsyporum sp. lini (Kamil

Kostyn et al. 2012).

Para el caso de la variedad susceptible, se presentó un aumento en los niveles de mRNA

para esta enzima con respecto al control no inoculado de 3 veces a las 24 hpi (figura No.

32 D). Este aumento evidencia que la correcta regulación temporal de la transcripción de

estos genes está asociada con resistencia; un aumento a dicho tiempo de 3 veces con

respecto al control, se constituiría como una respuesta tardía que puede no ser eficiente

en el momento de responder a la infección del patógeno. Considerando estos resultados

y la evidencia encontrada en otros modelos (Arfaoui et al. 2007; Morkunas et al. 2011;

Kamil Kostyn et al. 2012), es probable que la activación transcripcional de estos genes

haga parte de la defensa basal de la planta de clavel, activada por moléculas señal que

se encuentran en este patógeno y que haria parte de los mecanismos de defensa

determinantes en este modelo. Esta propuesta estaria de acuerdo con la conocida

naturaleza poligenica para la resistencia a la raza 2 de este patógeno en el clavel

(Baayen et al. 1991).

Al comparar los niveles de actividad y transcripcionales de la variedad resistente, se

evidencia que el aumento presentado en los niveles transcripcionales a las 12 y 24 hpi

(figura No. 32), debe estar asociado al aumento en los niveles de actividad enzimática

observados a las 48 hpi (figura No. 31). Estos resultados indican que tal y como ha sido

reportado para otras plantas (Lozovaya 2007, Naoumkina 2010, Wang et al 2010), en el

clavel una parte de la regulación de esta enzima se lleva a cabo a nivel transcripcional.

Sin embargo, considerando el importante aumento en los niveles de actividad de esta

enzima a las 6 hpi en las raíces de las plantas resistentes, que no está correlacionado

con un aumento en los niveles de mRNA a este mismo tiempo, es evidente que a este

tiempo posinoculación deben existir otros mecanismos de regulación que determinen

finalmente el aumento en la actividad de esta enzima en las raíces de la planta.

166

Al respecto, se ha citado que los mecanismos de regulación de esta enzima tambien se

pueden presentar a nivel postranscripcional (Dao et al. 2011). Por ejemplo, se ha

encontrado que altos niveles de flavonoides pueden inhibir la actividad chalcona sintasa

en centeno (A. Peters et al. 1988) y zanahoria (Hinderer & H. U. Seitz 1985) y no se

puede descartar por tanto una regulación por retroinhibición por producto (feedback) a

nivel citoplasmático, compartimento celular donde se encuentra esta enzima (Saslowsky

& Winkel-shirley 2001). Con esta evidencia se propuso que cambios en los niveles

citoplasmáticos de estos metabolitos pueden afectar la actividad de esta enzima y que

por tanto una disminución en los niveles de los mismos, podría estar activando esta

enzima. Esto podría ser extrapolado a las 6 hpi para el clavel, cuando es probable que,

se presenten fenómenos que generen una disminución de estos compuestos a nivel del

citoplasma, como pueden ser la rápida exportación de este tipo de compuestos hacia el

apoplasto para actuar en los procesos de defensa contra el patógeno o hacia las

vacuolas donde estos metabolitos se acumulan generalmente en sus formas glicosiladas

(Miranda et al. 2007). El transporte de metabolitos mediante mecanismos de exportación

activa, ha generado particular interés en modelos que involucran patógenos del género

Fusarium y se ha encontrado que son determinantes en resistencia a este tipo de

patógenos en plantas como almatruz amarillo (Banasiak et al. 2013), maíz (Lanubile,

Bernardi, Battilani, et al. 2012) y banana (Paparu et al. 2013).

Es probable que estos fenómenos sean importantes también a nivel de la raíz en este

modelo, en donde se ha encontrado que una buena parte de la respuesta de defensa al

patógeno se presenta en los vasos del xilema y en el apoplasto de las células

parenquimáticas adyacentes (Higuera & Ebrahim-Nesbat 1999) y en donde a este tiempo

posinoculación, hay un aumento en los niveles del compuestos glicosilado F2, el cual

teniendo en cuenta estas consideraciones puede ser acumulado en las vacuolas de la

planta o ser exportado fuera de la célula para su acción contra el patógeno.

Se puede deducir por tanto, que es probable que el aumento en los niveles de

flavonoides totales presentes en este órgano durante la infección con el patógeno a las 6

hpi (figura No. 15 B), esté asociado a metabolitos que se encuentran en el apoplasto y en

las vacuolas que han sido transportados por los mecanismos previamente mencionados.

Sin embargo, es importante realizar nuevos estudios encaminados a evaluar la

localización de estos metabolitos en las primeras horas de la interacción y confirmar

167

evidencia experimental que permita conocer mas sobre estos procesos se llevan a cabo

en el clavel.

c. Chalcona Isomerasa en raíces de clavel

Diferentes estudios han sugerido que las enzimas de la biosíntesis de flavonoides se

encuentran asociadas entre ellas como complejos multienzimáticos (Winkel-shirley 2001;

Saslowsky & Winkel-shirley 2001) y que su regulación a nivel transcripcional se lleva a

cabo de manera conjunta en la célula vegetal. Es por ello que en el presente estudio se

quiso evaluar si el comportamiento encontrado para la enzima CHS en raíces del clavel

de la variedad resistente, se podía extrapolar para el caso de la CHI. Se determinó que

esta última enzima presenta un aumento significativo (α = 0,05) en sus niveles de

actividad a las 48 hpi para la variedad resistente inoculada con respecto a su control no

inoculado, mientras que en la variedad susceptible controles e inoculados no varían a

ningún tiempo (figura No. 33). Esto evidencia el papel de esta enzima en los mecanismos

de defensa que se activan en las raíces de la variedad resistente. De acuerdo a los

resultados es probable que este papel en defensa esté asociado al que se encontró para

la enzima CHS y se constituye como la primera evidencia sobre la pobable regulación

conjunta que tienen estas enzimas en el clavel durante la interacción con patógenos.

33Figura No. 33. Niveles de actividad chalcona isomerasa en raíces de clavel durante el ensayo in vivo de inoculación con el patógeno Fod raza 2. Se presentan los resultados promedio de tres extracciones independientes para cada tratamiento. Las letras diferentes muestran tratamientos diferentes significativamente (α= 0,05)

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168

La participación de la enzima CHI en los mecanismos de defensa del clavel a nivel de la

raíz, coincide con lo encontrado en otros reportes para otras especies vegetales (Fofana

et al. 2002; Morkunas et al. 2011). En el clavel, considerando los tiempos de inducción

encontrados para las actividades enzimáticas CHS y CHI (48 hpi), es probable que estas

participen en conjunto para generar el aumento en los niveles de compuestos flavonoides

a tiempos más tardíos (96 hpi). Teniendo en cuenta la diferencia en los tiempos de

inducción (48 hpi para las enzimas y 96 hpi para los metabolitos) y la naturaleza

glicosilada de los metabolitos de tipo flavonoide que se inducen en este órgano de la

planta (Por ejemplo, compuesto F2: Kaemferido 3-O-β-D–glucopiranosil (1→2)-O--L-

ramnopiranosil-(1→6)- β-D –glucopiranosido), es probable que estas enzimas participen

en la síntesis de la estructura básica de los flavonoides y que posteriormente, a tiempos

entre 48 y 96hpi, se presente la acción de enzimas como la flavonol sintasa o la glicosil

transferasa, que permitan la biosíntesis final de los metabolitos que tienen un papel en la

defensa de la planta. Acumulación de estas enzimas son parte importante de la

respuesta ante diferentes condiciones de estrés en otras especies vegetales (Miranda et

al. 2007; Päsold et al. 2010).

Este efecto se evidencia también cuando se analizan los resultados obtenidos a nivel

transcripcional para esta enzima (figura No. 34), en donde al igual que en el caso de las

enzimas PAL y CHS, el proceso inoculación, tanto en controles como inoculados, genera

un aumento significativo en los niveles de mRNA. De manera similar se presentó un

aumento a las 48 hpi, en los niveles de mRNA (No. de copias/ pg cDNA) para estas

mismas enzimas por efecto de las condiciones ambientales (Gráficas A y C de las figuras

No. 30, 32 y 34), indicando que posiblemente en clavel, para los tres casos se comparten

los mecanismos que regulan el proceso de transcripción, tal y como ha sido ampliamente

reportado en otras especies vegetales (Vom Endt et al. 2002; Dubos et al. 2010;

Czemmel et al. 2012).

Al respecto se conoce que la expresión de estos genes está regulada de manera directa

por una combinación de dos distintas familias de factores de transcripción, que presentan

homología a la proteína codificada por el proto-oncogen c-MYB y la proteína básica-

Hélice-Bucle-Hélice (bHLH por sus siglas en inglés basic-Helix-Loop-Helix) codificada por

el proto-onco gen c-MYC (Vom Endt et al. 2002), los cuales se unen a secuencias

promotoras comunes en los genes que codifican para esas proteínas. Se ha reportado

169

que los niveles de estos factores de transcripción pueden estar estimulados por

diferentes condiciones como respuesta a la luz, radiación UV, tratamiento con elicitores y

heridas (J. Zhao et al. 2005; C.-Q. Yang et al. 2012). Considerando que el papel de

dichos factores de transcripción ha sido reportado en diferentes especies como tabaco

(Gális et al. 2006), Arabidopsis thaliana (Dubos et al. 2010), uva (Czemmel et al. 2012),

té Camellia sinensis (Dongqing Yang et al. 2012), Medicago truncatula (Verdier et al.

2011), su acción puede tratarse de un mecanismo altamente conservado en plantas

vasculares, y puede ser probablemente extrapolado al clavel.

34Figura No. 34. Niveles transcripcionales para genes codificantes para la enzima CHI en raíces de clavel durante el ensayo in vivo de inoculación con el patógeno Fod raza 2. Variedad resistente L.P. Candy cuantificación absoluta (A) y relación inoculado/ control (B). Variedad susceptible Tasman cuantificación absoluta (C) y relación inoculado/ control (D). Se presentan los resultados promedio de tres extracciones independientes para cada tratamiento. Las letras diferentes muestran tratamientos diferentes significativamente (α= 0,05). El análisis estadístico para la relación inoculado/control se realizo entre los diferentes valores encontrados para los diferentes tiempos

0

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a

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a


A

D C

B

170

De esta manera, es probable que durante el ensayo in vivo, cambios en las condiciones

ambientales pueden afectar los niveles de dichos factores de transcripción y generar un

cambio en los niveles de transcripción de manera simultánea, para estos tres grupos de

genes codificantes para PAL, CHS y CHI. Por otro lado, cuando se evalua el efecto que

tiene la inoculación con el patógeno en la variedad resistente sobre los niveles

transcripcionales para esta enzima, permite evidenciar que tal y como se presentó para la

enzima CHS, el aumento en los niveles de actividad a las 48 hpi, están probablemente

asociados a una regulación transcripcional a las 12 y 24 hpi (figura No. 34). Este

aumento por efecto de la inoculación por patógenos del género Fusarium en los niveles

de mRNA para estas enzimas, ha sido descrito para plantas como almatruz amarillo

(Morkunas et al. 2011) y Lino (Lorenc-Kukuła et al. 2007), indicando que la regulación

transcripcional para las mismas es un proceso asociado con resistencia a este tipo de

patógenos y corrobora, que dentro de los mecanismos asociados a la resistencia

poligenica descrita en el clavel, se encuentra un aumento en la biosíntesis para estos

metabolitos en los tiempos evaluados.

Estos resultados evidencian que asi como ha sido discutido para el estrés ambiental, la

inoculación con patógenos en esta planta, afecta la transcripción de los genes en estudio

(C.-Q. Yang et al. 2012; Ambawat et al. 2013), muy probablemente involucrando a los

factores de transcripción previamente citados. Por ejemplo, se ha encontrado que en

Sorgo (Sorghum spp.), mutaciones en el alelo que codifica para el factor de transcripción

de la familia cMYB, yellow seed 1, presenta una disminución importante en la

acumulación de cierta familia de flavonoides (3-deoxiantocianidinas) que actúan como

fitoalexinas durante la infección con Colletotrichum sublineolum (Boddu et al. 2005). Se

podría pensar por tanto que a las 12 y 24 hpi, en raíces de la variedad resistente

inoculada, un aumento en los niveles de estos factores de transcripción estimularía la

síntesis de mRNA y generaría acumulación de las enzimas CHS y CHI (48hpi) y

finalmente aumento en los niveles de flavonoides (96 hpi).

Es importante no olvidar que es probable que se presenten en este órgano de la planta,

otros mecanismos de regulación, como parece suceder a las 6 y 96 hpi para el caso de

las enzimas CHS y PAL respectivamente. Este panorama muestra la complejidad que

tienen los mecanismos moleculares asociados con la regulación de los niveles de los

171

metabolitos secundarios en plantas, ya que dependiendo del tipo de estrés al cual se

encuentre expuesta, ésta puede activar unos u otros mecanismos dependiendo de sus

necesidades. Es por ello que otras aproximaciones experimentales que permitan el

estudio conjunto de las respuestas ya sea a nivel transcriptómico o proteómico, se

constituyen en alternativas para encontrar esas otras proteínas que eventualmente

pueden estar involucradas en el fenómeno estudiado.

No se puede olvidar además, que una de las limitaciones que tiene este tipo de estudios,

es que al tratar de analizar un proceso dinámico con solo algunos tiempos del proceso,

se pierde información que puede ser de importancia cuando se presenta la activación de

la respuestas, en tiempos que no fueron evaluados. Es por ello que los resultados

encontrados a las 6 horas en términos de la acumulación de metabolitos, deben estar

asociados a cambios a tiempos más tempranos; la acumulación del compuesto F2 que

presentó un aumento significativo en la variedad resistente a este tiempo, debe estar

asociado a un aumento de su biosíntesis a tiempos más tempranos (menores a 6hpi), tal

y como se presentó en la acumulación de este metabolito a las 96hpi.

Con esta información se propone que el aumento en la actividad CHS a las 6 hpi y la

actividad CHI constitutiva, pueda explicar el aumento significativo que se presenta en los

niveles del compuesto F2 (Kaemferido 3-O-β-D–glucopiranosil (1→2)-O--L-

ramnopiranosil-(1→6)- β-D –glucopiranosido) en las raíces de la variedad resistente

inoculada. Además es probable que a este tiempo y posteriores (entre 6 y 12hpi) se

presente también la acumulación de compuestos de tipo chalcona, los cuales requieren

la acción de la enzima CHS, pero no de la CHI (figura No. 8). Se ha reportado que

dihidrochalconas aisladas de Piper septuplinervium presentan actividad antifúngica sobre

Fusarium oxsyporum f. sp. dianthi (Avila et al. 2011). La presencia de estos metabolitos

no puede ser descartada en raíces del clavel y eventualmente podría ser el “metabolito

probable flavonoide” F3, que presentó un aumento significativo a ese mismo tiempo

posinoculación.

En general, de acuerdo a los resultados encontrados hasta ese punto de la investigación

en raíces de clavel, se evidencia que un aumento en la biosíntesis de compuestos de tipo

flavonoide está asociada con la resistencia a la enfermedad y corrobora la hipótesis incial

planteada, sobre su participación en los mecanismos de defensa activa de la planta. Con

el fin de determinar si este mismo comportamiento se presenta en tallo, se evaluaron los

172

niveles de estas mismas enzimas, en los tiempos posinoculación planteados, tal y como

se describió en la sección de materiales y métodos (3.2.7)

En esta parte de la investigación se quería complementar el panorama con respecto al

comportamiento de las enzimas asociadas a la biosíntesis de flavonoides en clavel y su

relación con resistencia al marchitamiento vascular en tallo. De esta forma, tal y como se

describió en raíces, se evaluaron los niveles de actividad en los tratamientos propuestos

en tallo y si era el caso, se determinaron los niveles transcripcionales correspondientes.

d. Actividad fenilalanina amonio liasa en tallos de clavel

Para el caso de la enzima PAL, en los tiempos 6 y 12 hpi, si bien se presentó un aumento

significativo en la variedad resistente inoculada (T2) cuando se compara con respecto al

tratamiento control (T1) en un análisis pareado (solamente estos dos tratamientos)

(α=0,05), al realizar el análisis estadístico con los tratamientos de la variedad susceptible

(T3 y T4), los 4 tratamientos resultaron ser estadísticamente similares. De esta manera,

no se evidencia una relación entre los niveles de esta enzima y la resistencia a la

enfermedad marchitamiento vascular (figura No. 35).

Estos resultados están de acuerdo con estudios previos en los que se demostró que en

este órgano de la planta no se encuentra una relación entre los niveles de esta enzima y

resistencia (Ardila et al. 2007; Ardila et al. 2011). Con estos resultados no se puede

descartar que a tiempos mas tardíos, se pueda presentar un aumento en la actividad de

esta enzima con el fin de suministrar los compuestos fenólicos que se requieren para la

biosíntesis de metabolitos de tipo fitoalexina, que a tiempos mas tardíos (2 semanas), se

acumulan en este órgano de la planta (Van Peer et al. 1990; Niemann et al. 1992). Al

respecto, no se debe olvidar que el objetivo de este estudio, era determinar los cambios

que se presentan a tiempos tempranos solamente, donde se activan los procesos más

determinantes en la expresión de resistencia para este tipo de patógenos (Beckman

2000; Mandal et al. 2008; Morkunas et al. 2011; Van Pelt-Heerschap & Smit-Bakker

1999).

Asi mismo, es importante recordar que el patógeno se encuentra en los tejidos

vasculares de la planta y que la evaluación se realizó en todo el tallo, es probable que si

el aumento que se presenta por efecto de la inoculación no es muy alto, como parece

suceder a las 6 y 12 hpi, se puede presentar una “dilución” de la respuesta considerando

173

que la extracción se realiza usando tallos completos que incluyen corteza, epidermis y

endodermis. Sin embargo, bajo las condiciones del presente estudio, las cuales tambien

han sido frecuentemente usadas para el análisis de esta enzima en otras especies

vegetales (Mandal & Mitra 2007; Seelakshmri & R. Sharma 2008; Forlani 2010), no se

encontró un aumento en la actividad PAL que permitiera asociarla con resistencia, al

menos en los tiempos tempranos evaluados. Considerando este resultado, no fue de

interés para este estudio, realizar una evaluación de los niveles transcripcionales para

esta enzima en los tiempos evaluados. Al respecto es importante comentar, que estudios

previos al respecto realizados usando la técnica de RT-PCR semicuantitativo, no

generaron resultados que asociaran los niveles de mRNA para esta enzima con

resistencia (Ardila et al. 2011).

35Figura No. 35. Niveles de actividad fenilalanina amonio liasa en tallos de clavel durante el ensayo in vivo de inoculación con el patógeno Fod raza 2. Se presentan los resultados promedio de tres extracciones independientes para cada tratamiento. Las letras diferentes muestran tratamientos diferentes significativamente (α= 0,05)

e. Niveles de chalcona sintasa en tallos de clavel

Con respecto a los niveles de la enzima chalcona sintasa, se determinó que al contrario

de lo encontrado en raíz, la infección con el patógeno no generó cambios

estadísticamente significativos en la variedad resistente inoculada a tiempos de

0

50000

100000

150000

200000

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a

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a


174

inoculación tempranos (Fig 36). A pesar de esto, es interesante resaltar que a las 96 hpi,

se encontró que esta enzima aumenta en la variedad resistente inoculada con respecto al

control correspondiente, pero los niveles asociados a dicho aumento, no varian

estadísticamente con respecto a la variedad susceptible control. Considerando que era

de interés para el presente estudio, solo aquellas respuestas asociadas con resistencia,

dicho aumento indicaba que no había relación en los niveles de actividad en este órgano

y la resistencia a la enfermedad. No hay que olvidar que la comparación con los niveles

de la variedad susceptible, son el punto de referencia con el fin de determinar si una

respuesta en la variedad L.P candy está asociada o no con la resistencia a la

enfermedad.

36Figura No. 36. Niveles de actividad chalcona sintasa en tallos de clavel durante el ensayo in vivo de inoculación con el patógeno Fod raza 2. Se presentan los resultados promedio de tres extracciones independientes para cada tratamiento. Las letras diferentes muestran tratamientos diferentes significativamente (α= 0,05)

Sin embargo, el significativo aumento con respecto al control en esta variedad resistente,

indicaba que era probable que la actividad de esta enzima aumentara sus niveles por

efecto de la inoculación con el patógeno y que los niveles estadísticamente iguales en la

variedad susceptible control, podrian estar asociados a alguna condición ambiental

externa que de manera particular estaria afectando los niveles de esta enzima en dicha

variedad.

0

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A

RESISTENTECONTROL

RESISTENTEINOCULADO

Es por ello que, con el fin de determinar si existía un aumento en los niveles de

transcripción que estuviesen asociados a los cambios en la actividad enzimática

encontrados, se deteminaron los niveles de mRNA tal y como había sido realizado a nivel

de la raíz previamente; diferencias en los niveles de mRNA para esta enzima en la

variedad resistente inoculada, ratifican que el aumento que se encontró estaba asociado

con la resistencia a la enfermedad (figura No. 37).

37Figura No. 37. Niveles transcripcionales para genes codificantes para la enzima CHS en tallos de clavel durante el ensayo in vivo de inoculación con el patógeno Fod raza 2. Variedad resistente L.P. Candy cuantificación absoluta (A) y relación inoculado/ control (B). Variedad susceptible Tasman cuantificación absoluta (C) y relación inoculado/ control (D). Se presentan los resultados promedio de tres extracciones independientes para cada tratamiento. Las letras diferentes muestran tratamientos diferentes significativamente (α= 0,05). El análisis estadístico para la relación inoculado/control se realizo entre los diferentes valores encontrados para los diferentes tiempos

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A

B A

D C

B

176

Al respecto se determinó que la inoculación con el patógeno, efectivamente generó un

aumento en los niveles de mRNA para la enzima chalcona sintasa en la variedad

resistente inoculada a las 24 y 96 hpi, y que el aumento en los niveles de actividad a este

último tiempo efectivamente estaban asociados con resistencia al patógeno. Resultados

similares han sido reportados por otros autores en otros modelos vasculares como

Fusarium oxysporum f. sp. ciceris (Arfaoui et al. 2007), Fusarium oxysporum f. sp. lupini

(Morkunas et al. 2011) y Fusarium oxsyporum sp. lini (Kamil Kostyn et al. 2012).

f. Niveles de chalcona isomerasa en tallos

Por otro lado durante la evaluación de los niveles de actividad CHI en tallos de la planta

(figura No. 38), se determinó que en ningun tiempo posinoculación, se presentó un

aumento para los tratamientos sometidos a inoculación. De esta manera, se encontró

que en este órgano, al menos en los tiempos evaluados, no se presenta un aumento en

los niveles de ésta enzima asociado a la resistencia de la planta. Bajo esta

consideración, tambien se descartó evaluar los niveles transcripcionales para esta

enzima, en los tiempos posinoculación propuestos en este estudio.

De acuerdo a estos resultados, se evidencia que en este órgano de la planta, el aumento

en los niveles de flavonoides a 96 hpi, está asociado a un aumento en los niveles de la

enzima CHS, pero no de la CHI. Sin embargo, la acción de esta última enzima no se

puede descartar siendo probable que la reacción de isomerización del compuesto tipo

chalcona que se genera por acción de la CHS en este órgano de la planta, se presente

enzimáticamente por acción de la actividad CHI que se encuentra de manera constitutiva.

Otra posibilidad es que en los tiempos en donde no se realizaron muestreos, es decir

entre 24 y 48 hpi o entre 48 y 96 hpi, se presente un aumento en la actividad de esta

enzima que no pudo ser evaluada y que está asociada con el aumento de los niveles de

estos metabolitos a las 96 hpi.

Otra posibilidad para justificar este aumento en los niveles de la enzima CHS, puede ser

que tal y como se propuso en raíces a las 6 hpi, la inoculación con el patógeno en la

variedad resistente estimule la biosíntesis de metabolitos de tipo chalcona, los cuales tal

y como se discutió previamente, pueden ser potenciales actores de la respuesta de la

planta (Avila et al. 2011). Estudios que permitan obtener mayor información estructural de

aquellos metabolitos que presentaron inducción diferencial en este órgano, como es el

177

caso del compuesto FT6, permitirán conocer más sobre los mecanismos de defensa que

se activan en tallos de clavel.

38Figura No. 38. Niveles de actividad chalcona isomerasa en tallos de clavel durante el ensayo in vivo de inoculación con el patógeno Fod raza 2. Se presentan los resultados promedio de tres extracciones independientes para cada tratamiento. Las letras diferentes muestran tratamientos diferentes significativamente (α= 0,05)

Considerando que el aumento en los niveles de compuestos fenólicos totales

encontrados a las 12 hpi en este órgano de la planta (figura No. 16) no se correlaciona

con un aumento en los niveles para ninguna de las enzimas evaluadas, es probable que

otros procesos que no involucran la síntesis de fenilpropanoides determinen este

aumento en este tiempo posinoculación. Se ha reportado que la liberación de metabolitos

a partir de compuestos glicosilados por acción de la acción de diferentes enzimas de tipo

glicosidasas pueden presentarse durante la interacción con patógenos a tiempos

tempranos (Naoumkina et al. 2007).

En general, el presente estudio permitió demostrar que en tallos de clavel, la biosíntesis

de los flavonoides se presenta tambien, como parte de la respuesta de defensa vegetal al

patógeno causal del marchitamiento vascular. Sin embargo, es necesario realizar nuevas

investigaciones que permitan determinar como se comportan especificamente estas

enzimas en los tejidos vasculares de la planta, tal y como ha sido propuesto para otras

enzimas por (Van Pelt-Heerschap & Smit-Bakker 1999). Esta aproximación permitiría

determinar cómo se lleva a cabo la respuesta de la planta de manera amplificada, ya que

es probable que la presencia de la epidermis, corteza y endondermis de los tallos, tejidos

0

200

400

600

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178

que no coloniza el patógeno y se constituyen como la mayor parte de la masa de los

tallos de la planta, diluyan la respuesta evitando que se evidencien cambios

estadísticamente significativos entre tratamientos de interés. A pesar de esto, es

evidente que el aumento de los niveles de flavonoides a nivel del tallo a las 96hpi, está

asociado, tal y como fue encontrado en raíz, a un aumento en su biosíntesis

acompañado con cambios a nivel enzimático y transcripcional para la enzima CHS.

En general, la evidencia que se encontró con respecto a la regulación transcripcional y

postranscripcional para estas enzimas en el clavel, muestra la complejidad de los

procesos que están implicados en la activación de las respuestas de defensa a Fod.

Estas a su vez, deben estar determinadas por fenómenos como el reconocimiento y

posterior señalización, específicos para este patógeno, asi como ha sido sugerido para

las diferentes formas especiales de Fusarium oxysporum (Berrocal-Lobo & Molina 2008).

Con el fin de aportar al estudio particular de estos procesos de reconocimiento y

señalización que están asociados a la activación de la biosíntesis de flavonoides, en la

próxima etapa de esta investigación, se estudiaron los niveles de una especie altamente

reactiva de oxigeno como es el peróxido de hidrógeno. Esta especie altamente oxidante,

involucrada en muchos procesos a nivel celular, ha sido asociada a la activación de

factores de transcripción MYB. Estos a su vez, tal y como se citó previamente, estimulan

la transcripción de genes de las enzimas PAL, CHS y CHI, siendo por tanto reguladores

positivos de la biosíntesis de flavonoides en estados de estrés en otras especies

vegetales (Agati et al. 2012). A su vez, teniendo en cuenta la conocida capacidad

antioxidante de estos metabolitos, cambios en sus niveles pueden tambien afectar las

especies reactivas de oxígeno (EROs) y finalmente determinar un ambiente redox

adecuado para el funcionamiento celular.

Con el fin de conocer más sobre el papel de estos metabolitos en la interacción clavel-

Fusarium oxysporum f. sp dianthi, en la siguiente fase de la investigación se presenta

una comparación de los niveles de peróxido de hidrógeno, con los niveles de estos

metabolitos y su posible relación con otros mecanismos de regulación antioxidante como

el que involucra enzimas del tipo peroxidasas como lo son la guayacol peroxidasa GPX y

la ascorbato peroxidasa APX.

179

3.4. Conclusiones

Los resultados que se presentan en esta investigación constituyen el primer reporte

conocido acerca de la relación entre la biosíntesis de compuestos flavonoides a nivel

enzimático y transcripcional con los mecanismos de defensa activa del clavel a Fusarium

oxysporum f. sp. dianthi, encontrándose que la regulación espacio-temporal de esta ruta

biosintética está asociada con resistencia al marchitamiento vascular

El presente estudio permitió deteminar que las variedades de clavel resistente (L.P.

Candy) y susceptible (Tasman), presentan diferencias en términos de la activación de la

biosíntesis de flavonoides durante la infección con el agente causal del marchitamiento

vascular tanto a nivel del tallo, como de la raíz

La inoculación con el patógeno generó un cambio en los niveles de compuestos fenólicos

y flavonoides totales a las 6,12 y 96 hpi en raíces y 12 y 96 hpi en tallos de la variedad

resistente, indicando que la activación de la respuesta de defensa activa incluye una

regulación espacio-temporalmente coordinada de la acumulación de estos metabolitos en

el clavel.

El aumento en los niveles de actividad antioxidante en raíces de la variedad resistente a

las 6,12, y 96 hpi y en tallos a las 96 hpi, está al parecer asociado a la acumulación

observada de flavonoides durante los tiempos posinoculación evaluados.

El análisis estadístico multivariado de los datos obtenidos por HPLC evidenció diferencias

cuantitativas y cualitativas en los perfiles obtenidos para extractos de raíces de las dos

variedades de clavel en los diferentes tiempos posinoculación evaluados, indicando que

las condiciones ambientales y el genotipo involucrado, afectan en mayor proporción los

niveles de los metabolitos separados. Con respecto a la inoculación con el patógeno se

encontraron al menos 4 compuestos a nivel de la raíz (Grupo I) y 2 compuestos en el

tallo (Grupo II), que aumentan sus niveles significativamente en la variedad altamente

resistente L.P. Candy.

180

La aproximación a la estructura química de al menos un compuesto de los grupos I y II,

permitió determinar que éstos poseen estructura de tipo flavonoide. Dentro del grupo I, el

compuesto F2 es probablemente el kaemferido 3-O-β-D –glucopiranosil (1→2)-O--L-

ramnopiranosil-(1→6)- β-D–glucopiranosido y el compuesto FT6 del grupo II,

corresponde probablemente al kaemferol 3-O-β-D –glucopiranosil (1→2)-O--L-

ramnopiranosil-(1→6)- β-D–glucopiranosido.

Un aumento en los niveles de actividad enzimática fenilalanina amonio liasa (96hpi),

chalcona sintasa (6 y 48 hpi) y chalcona isomerasa (48 hpi), en raíces de la variedad

resistente L.P. Candy, evidencian la participación de estas enzimas del metabolismo

fenilpropaonoide en los mecanismos de defensa que se activan en este órgano de las

plantas de clavel durante la inoculación con Fod.

Un aumento en los niveles del mRNA para las enzimas CHS y CHI, por efecto de la

inoculación con el patógeno a las 12 y 24 hpi, a nivel de la raíz en la variedad resistente,

indica una relación entre la resistencia a la enfermedad y la estimulación de la

transcripción de los genes que codifican dichas enzimas.

Existe relación entre los niveles de metabolitos (fenoles totales, flavonoides totales y

actividad antioxidante) a las 96hpi y los niveles de enzimas CHS y CHI (actividad y

niveles de mRNA) a las 48 hpi en raíces, indicando que el aumento en los metabolitos

por efecto de la inoculación con el patógeno, puede estar ocasionado por el aumento en

los niveles de las enzimas, mientras que a nivel del tallo la inoculación con el patógeno

no generó aumentos significativos en los niveles de actividad de las enzimas PAL y CHI

en tallos, indicando que estas no están asociadas con el aumento de metabolitos descrito

para este órgano a las 12 y 96 hpi.

En la variedad resistente L.P. Candy se presentó a nivel del tallo un aumento en los

niveles de actividad enzimática CHS y de mRNA por efecto de la inoculación del

patógeno, indicando que una estimulación de esta enzima, está asociada con el aumento

de metabolitos (96hpi) y con la resistencia al marchitamiento vascular.

181

4. Evidencias bioquímicas y moleculares de la participación de peroxidasas en la resistencia del clavel (Dianthus caryophyllus L) a Fusarium oxysporum f. sp. dianthi

Resumen

Esquejes de dos variedades de clavel (Dianthus caryophyllus L) con respuesta diferencial

al marchitamiento vascular causado por Fusarium oxysporum f. sp. dianthi (Fod), fueron

inoculados con este patógeno y comparados los niveles de peróxido de hidrógeno,

actividad guayacol peroxidasa (GPX) y ascorbato peroxidasa (APX). A nivel de la raíz, se

presentó un aumento significativo a las 6, 24, 48 y 96 hpi en los niveles de peróxido de

hidrógeno en la variedad resistente (L.P Candy), mientras que los niveles de las enzimas

APX y GPX, permanecieron constantes durante los tiempos evaluados. A nivel del tallo,

se presentó un aumento significativo en la actividad GPX a las 12, 24 y 48 horas

posinoculación (hpi), mientras que en la variedad susceptible (Tasman), se evidenció

solo un ligero aumento a un tiempo mayor (96 hpi). Los niveles de peróxido de hidrógeno

en la variedad resistente aumentaron a las 12 y 24 hpi en este órgano, mostrando

correlación (α=0.05) con los aumentos en los niveles de actividad GPX. Los niveles de la

enzima APX permanecieron constantes durante estos tiempos posinoculación. Para la

variedad susceptible se observó en tallo, un aumento en contenido de peróxido de

hidrógeno a las 12 hpi que no mostró correlación con los niveles de actividad enzimática

GPX. Los contenidos de lignina no cambiaron durante los tiempos evaluados y por tanto

no se pudieron asociar a la actividad GPX en etapas tempranas de la interacción a nivel

del tallo. Mediante zimogramas se determinó que el aumento en la actividad GPX en

182

tallos de la variedad resistente se debe al aumento en los niveles de isoformas

constitutivas, como es el caso de una peroxidasa con un pI de 6.9, y no a la generación

de nuevas isoformas. La cuantificación absoluta de los niveles transcripcionales de la

peroxidasa de clase III, Dcprx02, indicó que en la variedad resistente, los niveles de

mRNA aumentaron casi 8 veces con respecto al control a las 6 hpi, comparado con la

variedad susceptible en la que solo hubo un aumento cercano a dos veces, a 12 hpi. Se

pudo determinar que el aumento en los niveles de peróxido de hidrógeno, está

correlacionado con el aumento en los niveles transcripcionales de Dcprx02. Diferencias

en la regulación temporal de las variables evaluadas durante la infección, permiten

postular que la producción de especies reactivas de oxígeno (EROs) y su posterior

regulación mediada por la acción de enzimas antioxidantes como GPX, son relevantes en

la resistencia al agente causal del marchitamiento vascular.

Abstract

Roted cuttings of two carnation (Dianthus caryophyllus L) cultivars with differential

response to vascular wilt caused by Fusarium oxysporum f. sp. dianthi (Fod), were

inoculated and the levels of hydrogen peroxide, guaiacol peroxidase (GPX) and ascorbate

peroxidase (APX) activities evaluated. At root level, it showed a significant increase in the

levels of hydrogen peroxide in the resistant variety (LP Candy) inoculated at 6, 24, 48 and

96 hpi, whereas the levels of enzymes GPX and APX were constant over the times

studied. At stem level instead, it showed a significant increase in GPX activity at 12, 24

and 48 hours post-inoculation (hpi), whereas the susceptible variety (Tasman), showed

only a slight increase to a longer time (96 hpi). The levels of hydrogen peroxide in the

resistant variety increased to 12 and 24 hpi, showing correlation (α = 0.05) with GPX

activity levels. The APX enzyme levels remained constant during these times after

inoculation. Stems of the susceptible cultivar showed an increase in hydrogen peroxide

content at 12 hpi which showed no correlation with the GPX enzymatic activity levels.

Lignin content did not change during the days tested, and are therefore not able to

associate the GPX activity in early stages of interaction in this organ. By zymograms was

determined that the increased GPX activity in the resistant variety, is due to increased

levels of constitutive isoforms, as is the case of a peroxidase with a pI of 6.9, rather than

the generation of new isoforms. The absolute quantification of transcriptional levels of

183

class III peroxidase, Dcprx02, indicated that in the resistant variety, their mRNA levels

increased almost 8-fold over control at 6 hpi compared with the susceptible variety in

which there was only one increased nearly twice, and 12 hpi. It was determined that the

increased levels of hydrogen peroxide are correlated with increased transcriptional levels

Dcprx02. Differences in the temporal regulation during infection assessed variables allow

production postulate that reactive oxygen species (ROS) and subsequent regulation

mediated by the action of antioxidant enzymes such as GPX are relevant in resistance to

the causal agent of wilt vascular.

4.1. Introducción

Se ha generado en los últimos años un particular interés en el desarrollo de nuevas

alternativas de control para el marchitamiento vascular causado por Fusarium oxyporum

f. sp. dianthi en el clavel (Dianthus caryophyllus L) (Borrero et al. 2008; Gryczka et al.

2010; Sant et al. 2010). Sin embargo, la poca información que se tiene sobre las bases

bioquímicas y moleculares de la resistencia a la enfermedad, ha generado un aparente

retraso al respecto. Algunos estudios en este sentido, han mostrado que las variedades

resistentes activan la biosíntesis de compuestos con actividad antifúngica directa sobre el

patógeno para afrontar la infección (Curir et al. 2003; Galeotti, Barile, Curir, et al. 2008;

Clematis et al. 2011), además de procesos de lignificación, suberización y localización de

material electrodenso (Higuera & Ebrahim-Nesbat, 1999; Niemann et al., 1991; Ouellette

et al., 2004; Trillas et al., 2000). En este proceso, inicialmente se presenta en los vasos

xilemáticos la formación de geles, compuestos principalmente de polisacáridos y de

compuestos fenólicos, exudados de las células parenquimáticas adyacentes al punto de

infección. Una vez estos compuestos se fusionan a la pared pueden presentar

reacciones de polimerización y oxidación, con el fin de formar una barrera durable en la

interfase de la infección y los tejidos sanos. En este tipo de respuestas, se ha propuesto

que la oxidación de compuestos fenólicos, catalizada por enzimas del tipo guayacol-

peroxidasas (GPX) y polifenoloxidasas (PFO), es fundamental en la expresión de

resistencia en plantas vasculares (Beckman 2000). Particularmente en el modelo clavel-

Fusarium, estas enzimas han generado interés en estudios previos, considerando que se

inducen de manera diferencial en variedades resistentes a la enfermedad durante la

infección por el patógeno (Ardila & Higuera 2005; Cuervo et al. 2009). En conjunto con

184

las ascorbato peroxidasas (APX), las GPX se han asociado a la regulación de especies

reactivas de oxígeno (EROs) en diferentes interacciones hospedero-patógeno (Sarowar

et al. 2005; Simonetti et al. 2010; Asano et al. 2012), incluyendo las que involucran

patógenos del género Fusarium (Morkunas & Gmerek 2007; Goswami & Punja 2008).

Las EROs están relacionadas con los procesos de reconocimiento, siendo fundamentales

en la activación transcripcional asociada a varias respuestas de defensa vegetal (Agati et

al. 2012; Barna et al. 2012). A pesar de la importancia de estas especies en señalización,

para modelos que involucran patógenos necrotróficos, los niveles de dichas especies

deben ser regulados por la misma planta considerando que si se mantienen altos en

etapas posteriores al reconocimiento, pueden causar muerte celular vegetal y ser una

ventaja para el patógeno (Hammerschmidt 2005; Barna et al. 2012; Mendoza 2011). Al

respecto, considerando que muchas de las GPX han sido localizadas en el apoplasto, su

papel ha estado asociado con la regulación de los niveles de peróxido de hidrógeno a

nivel extracelular, mientras que para el caso de las APX, es probable que su papel

regulatorio se presente principalmente a nivel intracelular considerando su ubicación

citoplasmática o en organelos como cloroplastos, mitocondrias y peroxisomas (Almagro

et al. 2009). En diferentes estudios se ha determinado que las peroxidasas de clase III,

en donde se clasifican las GPX, tienen relación con resistencia vegetal, considerando su

participación en lignificación (Marjamaa et al. 2009), en la generación de H2O2 durante su

interacción con patógenos (Bindschedler et al., 2006; Kawano, 2003), o por la capacidad

antioxidante asociada a la detoxificación del mismo durante el evento de interacción

(Tománková et al. 2006). Es probable que el aumento ya reportado en la actividad

peroxidasa durante la infección con Fod en el clavel (Cuervo et al. 2009), esté asociado

también a la regulación de alguno de estos fenómenos. Sin embargo, a la fecha no

existen estudios en clavel que permitan relacionar la actividad de la enzima GPX con

estos otros procesos asociados con resistencia, como puede ser la regulación de EROs.

Tampoco se ha profundizado sobre los puntos de regulación de las GPX en esta especie

vegetal, conocimiento necesario para la generación de alternativas que permitan

aumentar la actividad de esta enzima en plantas susceptibles, así como se ha realizado

en otras especies vegetales para aumentar la resistencia a patógenos (Schweizer 2008).

Actualmente en la base de datos Peroxibase (Bakalovic et al. 2006), se encuentran 6

secuencias de aminoácidos para peroxidasas de clase III para esta especie, deducidas

por traducción teórica de una base de datos de ESTs obtenida a partir de pétalos de

clavel (http://peroxibase.toulouse.inra.fr/). En general, un aumento en los niveles de

http://peroxibase.toulouse.inra.fr/

185

transcriptos de genes asociados a la defensa vegetal durante la interacción con

organismos patógenos del género Fusarium es un fenómeno documentado (Arfaoui et al.

2007; Desmond et al. 2008; Zhou & F. Wu 2009; Alessandra et al. 2010). Sin embargo,

considerando la acción de diferentes puntos de regulación de la expresión de genes en

plantas (Mackay et al. 2004), los estudios a nivel de las proteínas son necesarios para

validar estos resultados obtenidos a nivel transcriptomico. En el presente estudio se

evaluó la relación que existe entre la resistencia a la enfermedad marchitamiento

vascular y los niveles que se presentan por inoculación con Fod, de la actividad

enzimática GPX y APX. Así mismo, los niveles de estas se relacionaron con otros

parámetros como el contenido de peróxido de hidrógeno y de lignina, número de

isoformas y niveles transcripcionales de genes codificantes para peroxidasas de clase III

en el clavel. Un mayor conocimiento sobre los fenómenos que se activan de manera

coordinada durante la infección con el patógeno en este modelo, permitirá establecer

aquellos factores determinantes para la generación de nuevas alternativas de control

para el marchitamiento vascular.

4.2. Materiales y Métodos

4.2.1. Material biológico y ensayo in vivo

En esta parte de la investigación se determinaron los niveles constitutivos de actividad

APX y GPX, en tallos y raíces de las 9 variedades de clavel que fueron descritas en la

primera fase de esta investigación (Capitulo 2) y que presentaban diferentes niveles de

resistencia a Fod (Metodología 2.2.1). La evaluación de los niveles inducibles para estas

mismas enzimas se realizó en las variedades L.P Candy (Resistente) y Tasman

(Susceptible), en muestras provenientes del ensayo in vivo que se describe

detalladamente en el Capitulo 3 (3.2). El análisis de las diferentes enzimas, se realizó por

triplicado en los mismos tiempos posinoculación propuestos (0, 6, 12, 24, 48 y 96 hpi).

186

4.2.2. Extracción y determinación de las actividades Guayacol-peroxidasa (GPX) y Ascorbato-peroxidasa (APX)

La extracción y cuantificación de la actividad GPX se realizó de acuerdo con Mandal et.

al. (2008). Para ello se tomaron 0.2 g de tallos o raíces, los cuales fueron macerados

usando nitrógeno liquido y transferidos a un tubo Eppendorf. Sobre este macerado se

adicionó 1mL de buffer fosfatos 100 mM pH 7.0, 10 mM ácido ascórbico y se agitó

vigorosamente. Las muestras se centrifugaron a 4° C (30 min, 16000 g) y el extracto

enzimático se recuperó y se almacenó a -20°C para posteriores análisis. La

determinación de actividad peroxidasa (EC1.11.1.7) se realizó usando el seguimiento

espectrofotométrico a temperatura ambiente de la oxidación de guayacol a tetraguayacol.

La mezcla de reacción consistió en 100 µL de guayacol (Sigma ®) 20mM, 300 µL de

buffer ácido cítrico-citrato de sodio (Sigma ®) 100 mM pH 5.5, 100 µL de peróxido de

hidrógeno (Sigma ®) 40mM y 5 µL del extracto enzimático. Una vez realizada esta

mezcla, se siguió la oxidación del sustrato a 470 nm durante 2 min usando un

espectrofotómetro Thermo Genesys 10 UV. Los resultados se expresaron como micromol

guayacol consumidos/min* g material vegetal, tomando el promedio de tres repeticiones.

La extracción y determinación de la actividad APX (E.C. 1.11.1.11) se realizó de acuerdo

a Mandal (2008), con algunas modificaciones. En ensayos previos, se determinó que las

mejores condiciones de extracción de esta enzima en tallos y raíces de clavel, incluían el

tratamiento de 0.2 g de material vegetal previamente macerado con nitrógeno liquido, con

400 μL de acetona fría para eliminar compuestos interferentes (Ardila & Higuera 2005;

Ardila, S. T. Martinez, et al. 2013). Luego de someter el material a este tratamiento con

acetona por dos veces, se adicionó 1mL de buffer fosfatos 100 mM pH 7.0, 1 mM ácido

ascórbico y 1% (p/v) de PVPP (polivinil polipirrolidona). Luego de agitar vigorosamente,

las muestras se centrifugaron a 4° C (30 min, 16000 g) y el extracto enzimático se

recuperó y se almacenó a -20°C para posteriores análisis. La mezcla de reacción para la

determinación de la actividad, consistió en 100 µL de una solución de ácido ascórbico

(Sigma ®) 2,5 mM, 300 µL de buffer fosfatos 100 mM pH 7.0, 100 µL de peróxido de

hidrógeno (Sigma ®) 1,0 mM y 20 µL del extracto enzimático. Una vez realizada esta

mezcla, se siguió la oxidación del sustrato a 290 nm durante 2 min usando un

espectrofotómetro Thermo Genesys 10 UV. Los resultados se expresaron como

micromoles de ácido ascórbico consumidos/min* g material vegetal, tomando el

promedio de tres repeticiones.

187

4.2.3 Determinación de peróxido de hidrógeno

Se realizó de acuerdo al método reportado por Mandal S, et al. (2008). Tallos o raíces de

clavel fueron macerados con nitrógeno liquido y homogenizados con ácido tricloroacético

al 0.1% en una relación 1:10 (w/v). Se centrifugaron por 15 min a 12000 g a 40C. La

cuantificación se realizó mezclando 100 µL del sobrenadante con 200 µL de una solución

de yoduro de potasio (KI) 1M, dejando incubar por 5 min a temperatura ambiente, con el

fin de determinar la absorbancia del producto de oxidación a 390nm. La cantidad de

peróxido fue calculada por interpolación en una curva de calibración obtenida en las

mismas condiciones usando soluciones de concentraciones conocidas de H2O2: 1, 5, 10,

25, 50, 75, 100 micromolar. Los resultados se expresaron como pmol peróxido de

hidrógeno/ g material vegetal en base húmeda.

4.2.4. Determinación de lignina

La determinación de los niveles de lignina en tallos de clavel se realizó de acuerdo con el

procedimiento reportado por (Bruce & West 1989). Se usaron de 0.2 a 0.4 g de tallos de

clavel previamente macerados, a los que se adicionó 500 µL de etanol absoluto y se

centrifugó por 10 min a 5000 g. El precipitado se secó a 60 ºC durante 24 h, se pesaron

aproximadamente 5 mg de material vegetal seco y se re-suspendieron en 500 µL de HCl

2N y 50 µL de ácido tioglicólico. La mezcla se calentó durante 4 h a 92ºC. Una vez

enfriada a 4ºC durante 10 min, se centrifugó a 16000 g por 15 min. Los precipitados se

lavaron con 500 µL de agua desionizada, se les adicionó 500 µL de NaOH 0.5N y se

dejaron en agitación durante toda la noche a temperatura ambiente. El residuo insoluble

fue removido por centrifugación y el tioglicolato de lignina se precipitó por la adición de

500 µL de HCl concentrado y enfriamiento a 4ºC durante 3 h. Después de centrifugar a

16000g por 10 min, el residuo fue re-suspendido en 750 µL de NaOH 0.5N y finalmente

se hizo la lectura a 280 nm. El contenido de lignina se expresó en unidades de

absorbancia por mg de material vegetal seco.

4.2.5 Zimogramas de peroxidasas

La separación electroforética de las isoenzimas GPX se realizó por SDS-PAGE usando el

sistema vertical mini-gel (Thermo EC 120). El gel de resolución fue del 12% y el de

188

concentración del 5% (p/v). El buffer de corrido fue Tris-HCl 0.05M- Glicina 0.2M-SDS

0.1%, pH 8.3. En cada pozo se colocaron 20 µg de proteína (Bradford 1976) linealizado

por (Zor & Sellinger 1996), provenientes de los extractos previamente desalinizados y

concentrados usando el sistema Amicon ® Ultra-0.5mL 10KDa. La separación se realizó

a voltaje constante de 100V. La asignación de pesos moleculares se efectuó usando

patrones de peso molecular en el rango 6500-66000 Da (Marker Low range Sigma ®),

que fueron separados en el mismo gel pero teñidos usando Coomassie coloidal. La

tinción para evidenciar la presencia de las bandas con actividad peroxidasa se describe

posteriormente y se aplicó tanto para esta separación, como para la realizada por punto

isoeléctrico.

El isoelectroenfoque se realizó de acuerdo con las condiciones reportadas por Olmos, E.

et al. 1997, con algunas modificaciones, en geles de poliacrilamida al 5% preparados

usando 1.6 mL de una mezcla de acrilamida (30% (w/v) y 1% (w/v) bisacrilamida), 0.2 mL

de anfolitos Biorad ® de un rango 3-10 unidades de pH, 5.75 mL de agua dd, 50 µL de

persulfato de sodio al 10% (p/v) y 5 µL de TEMED. La mezcla se polimerizó en el

montaje de los vidrios del sistema electroforético Thermo EC Vertical mini-system. La

separación por isoelectroenfoque se realizó con un protocolo previo de

acondicionamiento a 100V por 1h. Luego de aplicar la muestra, la separación se realizó

por 1 h a 100V, 30 min a 200V, 1.5 h a 400 V y 30 min a 600V. Se usaron como

soluciones de corrido en el cátodo NaOH 20mM y en el ánodo CH3COOH 20mM. Para

cada pozo se colocaron 20 µg de proteína, provenientes de los extractos previamente

desalinizados y concentrados usando el sistema Amicon ® Ultra-0.5mL 10KDa. Con el fin

de realizar la asignación de pI, se usaron en cada uno de los geles los patrones IEF en el

rango de 3.6 a 9.3. La asignación de pI de las peroxidasas se realizó comparando con

una curva construida con la movilidad electroforética y el punto isoeléctrico de los

patrones.

La tinción específica de peroxidasas se llevó a cabo por inmersión del gel en una

solución de guayacol 20mM y peróxido de hidrógeno 40mM, preparada en el buffer ácido

cítrico-citrato de sodio 100mM pH 5.5. Se agitó suavemente hasta la aparición de bandas

y se tomó la imagen del gel usando la cámara Coolpix 8700 Nikon del Digimage System

de Major Science.

189

4.2.6. Niveles transcripcionales de peroxidasas de clase III

La evaluación de los niveles transcripcionales para los genes que codifican las

peroxidasas de clase III en tallos de clavel durante el ensayo in vivo, se llevó a cabo

usando el mismo procedimiento y condiciones de extracción de RNA y retrotranscripción

que se describen para el capítulo 3. Los niveles de transcripción de los genes

codificantes para las proteínas en clavel DcPrx01, DcPrx02, DcPrx03, DcPrx04 y

DcPrx05 (codificación de acuerdo a la base de datos http://peroxibase.toulouse.inra.fr/.)

fueron evaluados a las 12 hpi, por PCR en tiempo real mediante cuantificación relativa

con el método de 2-Ct (Wong & Medrano 2005), usando β-Actina como gen control

(Goswami & Punja 2008; Simonetti et al. 2010; Alessandra et al. 2010). Se confirmaron

los niveles de mRNA de la proteína DcPrx02 mediante cuantificación absoluta usando

SYBR ® Green MasterMix IQTM Biorad y usando como patrón, un plásmido con la

secuencia correspondiente del gen dcprx02. Con el fin de usar la misma cantidad de

cDNA en cada reacción (10 ng), se realizó cuantificación por fluorescencia (Qbit ®

Invitrogen). Los cebadores utilizados para la amplificación de los genes codificantes para

peroxidasas en clavel se citan en la tabla No. 21. El diseño de estos cebadores se realizó

usando el programa primer3 sobre aquellas secuencias de nucleótidos consignadas en el

ncbi (http://www.ncbi.nlm.nih.gov), que codifican para las peroxidasas de clase III

reportadas en la peroxibase (http://peroxibase.toulouse.inra.fr). La verificación del tamaño

de los fragmentos y la especificidad de la amplificación se realizó mediante electroforesis

en geles de agarosa al 1,5%. Las condiciones de amplificación para ambos casos

consistieron en una desnaturalización inicial a 95◦C durante 10 min, seguida de 35 ciclos

a 95◦C (15 s), 60◦C (20 s), 72oC (20s) y finalmente 72◦C (1 min). La cuantificación de los

niveles de mRNA de la proteína DcPrx02 se realizó mediante el método de la curva

estándar. En cada ensayo se prepararon curvas de calibración utilizando diluciones

seriadas de 5 a 6 veces del fragmento de dcprx02 previamente clonado en un plásmido

(sintetizados por la empresa GeneArt ®) desde 100 a 10000000 copias/ reacción. Para

cada ensayo se evaluaron por duplicado controles sin plantilla (NTC), las muestras de

cDNA y controles positivos (amplicones previamente clonados). La especificidad de los

productos se validó por el análisis de la curva de fusión. El análisis se realizó utilizando

un C1000Thermalcycle acoplado a un CFX96 Biorad sistema en tiempo real.

Considerando que se usaron tallos en un mismo estado de desarrollo, los niveles de

transcripción de la secuencia codificante para la proteína DcPrx02 se reportaron como

190

copias/ ng de cDNA como media de tres repeticiones (Y. Lu et al. 2012). Se verificó que

no se presentaran variaciones en la eficiencia de amplificación de muestras y patrones

usando el algoritmo reportado por (Ramakers et al. 2003). Los resultados también se

presentan como la relación de la expresión del inoculado con respecto al control

(Desmond et al. 2008; Godard et al. 2009), para evaluar diferencias propias del proceso

de inoculación con el patógeno.

4.2.7. Análisis estadístico

El análisis estadístico se realizó para cada variable en los diferentes tratamientos

evaluados por triplicado. Los datos fueron reportados como medias + / - SD. El análisis

de varianza y las diferencias significativas entre las medias se analizaron mediante

ANOVA de una vía utilizando Statgraphics ® Software versión 5.1. La correlación de

Pearson se realizó para determinar las correlaciones entre las medias de las actividades

enzimáticas, niveles de lignina, de peróxido de hidrógeno y de mRNA para la proteína

DcPrx02, utilizando Microsoft Excel. La significancia de los coeficientes de correlación de

Pearson se realizó con un α = 0.005 según Azzimonti (2003).

Tabla No. 21. Cebadores usados para la cuantificación por PCR en tiempo real de los niveles de mRNA para los genes de peroxidasas en clavel

Nombre de

la proteína

GI de la

Secuencia

Nombre de

los

cebadores

Secuencia 5´ 3´ Tamaño

del

fragmento

DcPrx01 76445534 POD1dir

POD1rev

TTTCACGATTGTTTCGTCCA

TTAATTTGAGGTCGGCTTCG

316pbs


POD2rev

TATTCGCAAAATCGACCACA

AATCTCACCCAAACCGACAT

328pbs


POD3rev

TCATGAGCAGTTTGCTAGGG

TGAACTTTAATAATTTCGAGGAACC

153pbs


POD4rev

CCCACCCTAAACACGGACTA

ATTTGTGCGGATTTCTCCAG

312pbs

DcPr05 76445526 POD5dir

POD5rev

CCTTGATGACCCGTGAGAAC

GCATTCCTCGATCAAACTCC

227pbs

ACT 11761145

ACT1dir

ACT1rev

GGCCGTTCTCTCTCTGTACG

AGGTGGTCGGTAAGATCACG

156pbs

191

4.3. Resultados y discusión

4.3.1. Evaluación de niveles constitutivos de las enzimas GPX y APX, en variedades de clavel con diferentes niveles de resistencia al marchitamiento vascular

En la determinación de los niveles constituvos de las enzimas objeto de estudio en esta

fase de la investigación, se determinó que no hay correlación entre los niveles de

actividad y la resistencia a la enfermedad marchitamiento vascular; algunas variedades

susceptibles presentan valores constitutivos mayores que los que presentan variedades

resistentes (figura No. 39). Los niveles de las actividades enzimáticas presentes en tallos

y raíces, se encuentran en el mismo rango de valores, siendo este para la APX, entre

0,08 y 0,31 micromol ácido ascórbico/ min* g material vegetal y para la GPX entre 0,7 y 7

micromol de guayacol/min* g material vegetal. Esto indica que estas enzimas hacen parte

de procesos fisiológicos constitutivos que son comunes en los órganos evaluados;

mecanismos como la regulación de EROs producto de procesos como la respiración son

comunes en todas las células vegetales (Breusegem et al. 2001; Agati et al. 2012).

Las raíces de la variedad Bellisima (S) y los tallos de las variedades Tasman (S) y

Topacio (R), presentaron los niveles más altos para la actividad APX, indicando que es

muy probable que asi como ha sido encontrado para diversas especies vegetales, estas

presenten características fenotípicas asociadas con una mejor adaptación a condiciones

de estrés abiótico (M Faize et al. 2011; Maruta et al. 2010).

Para el caso de la actividad GPX, se encontró que para 6 de las 9 variedades evaluadas,

los niveles de actividad enzimática constitutiva son mayores en raíces que en tallos. Esto

muestra que es muy probable que en este órgano de la planta, se presente, al menos a

nivel constitutivo, biosíntesis de ligninas o regulación de especies reactivas de oxigeno,

mayor que la encontrada en el tallo.

192

39Figura No. 39. Niveles de actividad enzimática constitutiva (A) Ascorbato peroxidasa y (B) Guayacol peroxidasa en tallos y raíces de clavel con diferentes niveles de resistencia al marchitamiento vascular.Se presentan los resultados promedio de tres extracciones independientes para cada tratamiento. Las letras diferentes muestran tratamientos diferentes significativamente (α= 0,05)

De acuerdo con estos resultados se determinó que no hay relación entre los niveles

constitutivos de las enzimas estudiadas y los mecanismos de defensa pasiva de la

planta. Esto indicó que estas enzimas en el clavel están asociadas a otras características

fenotípicas diferentes a la resistencia, al menos a nivel constitutivo, y difieren a lo

encontrado para algunas de las involucradas en la biosíntesis de flavonoides en raíces

(Ardila, S. T. Martinez, et al. 2013). Es probable por tanto, que la acción de la enzima

GPX en clavel, al menos a nivel constitutivo, no esté asociada con altos niveles de

flavonoides. Esta relación se consideró teniendo en cuenta algunos reportes en los que

se ha encontrado que GPXs ubicadas a nivel de las vacuolas, pueden actuar sobre

flavonoides glicosilados ubicados en este organelo con el fin de regular los niveles de

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,35

0,4

TASMAN (S) STAR(S)

KOMASHI(R)

GIOELE (R) LP CANDY(R)

SPITFIRE (S) BELLISIMA(S)

TOPACIO(R)

ESPERIA (R)

Acti

vid

ad

asco

rba

to p

ero

xid

a

(mic

rom

ol ácid

o a

sco

rbic

o/m

in*g

m

ate

rial veg

eta

l)

RAIZ

TALLO

0

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TASMAN (S) STAR(S)

KOMASHI(R)

GIOELE (R) LP CANDY(R)

SPITFIRE (S) BELLISIMA(S)

TOPACIO(R)

ESPERIA (R)

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abc

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A

B

193

peróxido de hidrógeno a nivel subcelular (Ferreres et al. 2011; Agati et al. 2012). Al

parecer, considerando los resultados de la presente investigación, este proceso no se

lleva a cabo a nivel constitutivo en tallos o raíces de clavel.

Con el fin de determinar el papel de estas enzimas en los mecanismos de defensa activa

de la planta, se determinaron los niveles de actividad APX y GPX en raíces y tallos

inoculadas con el patógeno y se compararon con los niveles de peróxido de hidrógeno.

De esta manera, se determinó si la activación de los mecanismos de defensa activa de la

planta, incluían un aumento en los niveles de EROS y/o cambios en la activación de

mecanismos antioxidantes enzimáticos que involucran estas enzimas.

4.3.2. Evaluación de los niveles de peróxido de hidrógeno, APX y GPX, durante la inoculación con el patógeno en tallos y raíces de clavel

a. Determinación de peróxido de hidrógeno en raíces

De acuerdo con los resultados de la presente investigación, se evidenció que un aumento

en los niveles de peróxido de hidrógeno en raíces, hace parte de la respuesta de defensa

activa en plantas resistentes a la enfermedad marchitamiento vascular (figura No. 40).

Este aumento que fue significativo a las 6, 24, 48 y 96 hpi, con respecto al

correspondiente control, se presentó con menor intensidad en la variedad susceptible, en

la que a las 6 y 96 hpi con el patógeno, se presentó un leve aumento con respecto a su

control no inoculado.

Este incremeto en los niveles de peróxido de hidrógeno observado por efecto de la

inoculación con el patógeno, ha sido ampliamente descrito en otras interacciones planta-

patógeno (Mellersh et al. 2002). Este fenómeno cumple un destacado papel en

señalización en los mecanismos de defensa vegetal, en las etapas más tempranas de la

interacción. Esta respuesta se puede activar por el reconocimiento de un amplio rango de

elicitores del tipo MAMPS (Microbial Associated Molecular Patterns) que se presentan de

manera común en microrganismos (Faulkner & Robatzek 2012; Gururani et al. 2012) y

que pueden ser reconocidos tanto por plantas resistentes como susceptibles (Michèle C

Heath 2000). Es por ello que la acumulación de H2O2 se puede dar tanto en interacciones

compatibles como incompatibles tal y como se presentó en este estudio.

194

Sin embargo, es importante destacar que la acumulación en la variedad susceptible, se

observó con menor intensidad que la presentada para la variedad resistente indicando

que, tal y como ha sido descrito en otras especies vegetales, la regulación temporal de la

acumulación de especies reactivas de oxígeno (EROs) como el peróxido de hidrógeno,

es determinante para el proceso de señalización en resistencia (C. Lamb & Dixon 1997;

Tománková et al. 2006; Heller & Tudzynski 2011). Se ha aceptado que dicho proceso

está relacionado principalmente a la activación de los Homólogos de Oxidasas de

Explosión Respiratoria Oxidativa (RBOH), las principales generadoras de EROs en

plantas (Sagi & R Fluhr 2001; Hancock et al. 2002; Sagi & Robert Fluhr 2006).

Fig 40.

40Figura No. 40. Niveles de peróxido de hidrógeno en raíces de clavel durante el ensayo in vivo de inoculación con el patógeno Fod raza 2. Se presentan los resultados promedio de tres extracciones independientes para cada tratamiento. Las letras diferentes muestran tratamientos diferentes significativamente (α= 0,05)

Al comparar los tiempos en los que se presentó este aumento en los niveles de peróxido

de hidrógeno, con respecto a los resultados obtenidos para fenoles y flavonoides totales

en la fase anterior de la investigación (Capitulo 3), se puede observar que en raíces de la

variedad resistente, el aumento de peróxido de hidrógeno tambien presenta el

comportamiento inducible en dos fases descrito para metabolitos (figura No. 15). Es

probable, por tanto, que estas variables se encuentren relacionadas y que altos niveles

de peróxido de hidrógeno encontrados de manera temprana a las 6 hpi estén asociados

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SUSCEPTIBLE CONTROL SUSCEPTIBLE INOCULADO


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b

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b

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c

b b

a

c

195

a un aumento en los niveles de metabolitos a este mismo tiempo y que a su vez, el

aumento a las 24-96 hpi en el H2O2, esté asociado al aumento encontrado a las 48-96 hpi

para fenoles totales, flavonoides totales y actividad antioxidante.

De esta manera, es probable que en el clavel exista una relación entre los niveles de

peróxido de hidrógeno y la activación transcripcional de genes que están involucrados en

la biosíntesis de metabolitos de tipo flavonoide, tal y como ha sido propuesto para otras

especies vegetales (Agati et al. 2012). Dicho aumento se puede presentar por el efecto

que tienen los cambios en los niveles de EROs en la activación de factores de

transcripción MYB, los cuales, tal y como se mencionó anteriormente, están asociados a

la activación transcripcional de enzimas de la biosíntesis de flavonoides (Falcone

Ferreyra et al. 2010; Dubos et al. 2010; Heine et al. 2004). Así, altos niveles de peróxido

de hidrógeno encontrados en la variedad resistente inoculada (figura No. 40), pueden

estar asociados a la activación de este tipo de factores de transcripción y generar un

aumento en los niveles de mRNA para los genes que codifican las enzimas CHS y CHI a

las 12 y 24 hpi (figura No. 32 y 34).

Se ha encontado que altos niveles de peróxido están asociados tambien a la activación

de mecanismos de regulación postranscripcional durante la interacción con patógenos

(Mendoza 2011) y es probable por tanto, que la activación de la fosforilación y

desfosforilación de enzimas del metabolismo secundario mediado por cambios en los

niveles de Ca+2 citoplasmático (S. Cheng et al. 2001; Seelakshmri & R. Sharma 2008), se

pueda ver afectado tambien por cambios en los niveles de EROs. Así el aumento en los

niveles de H2O2, puede tambien estar asociado con la activación de la enzima PAL en

raíces resistentes de clavel durante su interacción con el patógeno causal de


A pesar de que se requieren estudios funcionales con mutantes de clavel comprometidos

en la producción de peróxido para confirmar esta hipótesis, la presente investigación

permitió determinar que la reacción de defensa que se activa en raíces de esta especie

vegetal, involucra un aumento en los niveles de metabolitos de tipo flavonoide (figura No.

15), el cual muy probablemente, está asociado a la activación de los niveles de actividad

y mRNA para las enzimas involucradas en su biosíntesis (figuras No. 31-34). Este

aumento a su vez, probablemente se genera por el aumento en los niveles de peróxido

196

de hidrógeno que se presenta debido al reconocimiento del patógeno por parte de la

planta.

Es interesante comentar que en los tiempos en que la variedad susceptible presentó

aumento en los niveles de peróxido de hidrógeno (6,12, y 24 hpi), se observó aumento en

los niveles transcripcionales que fueron previamente descritos para la enzima PAL en

raíces para esta misma variedad (figura No. 32). Esto muestra que es probable que el

aumento registrado en los niveles de peróxido de hidrógeno, esté asociado con el

aumento en la transcripción de estos genes. Sin embargo, considerando que no existe

correlación con los niveles de actividad enzimática PAL (figura No. 31), es probable que

existan mecanismos de regulación postranscripcionales que no se activen en esta

interacción compatible o que se afecten por la acción de efectores que son secretados

por el patógeno durante la infección en la planta. Se han descrito a la fecha, efectores en

algunos patógenos del género Fusarium que pueden afectar la respuesta de defensa

vegetal (Houterman et al. 2008) y es posible que este mismo comportamiento se

presente en el caso de Fusarium oxysporum f. sp. dianthi.

El efecto que estos efectores puedan tener sobre la variedad resistente L.P Candy,

estaría asociado al correspondiente reconocimiento de los mismos por parte de proteínas

R. La presencia de este tipo de proteínas asociadas a resistencia a patógenos del género

Fusarium, ha sido previamente documentada en otras especies vegetales (Palomares-

Rius et al. 2011; Berrocal-Lobo & Molina 2008) y su acción depende claramente de la

especie vegetal involucrada. La presencia de estas proteínas en el clavel, se discute en

siguientes etapas de esta investigación, considerando las evidencias experimentales que

fueron encontradas en el estudio proteómico de esta interacción.

b. Determinación de actividad APX y GPX en raíces

Con respecto a los niveles de las actividades enzimáticas antioxidantes objeto de

estudio, se encontró que los niveles de actividad APX y GPX, no presentaron cambios

significativos entre controles e inoculados para ninguna de las variedades estudiadas a

nivel de la raíz (figura No. 41). Esto indica que en este órgano de la planta, en los

tiempos evaluados, no se han activado los mecanismos de regulación enzimática de

EROs que habían sido descritos en otras interacciones que involucran patógenos del

género Fusarium (Palomares-Rius et al. 2011; Mandal et al. 2008).

197

41Figura No. 41. Niveles de actividad (A) guayacol peroxidasa y (B) ascorbato peroxidasa en raíces de clavel durante el ensayo in vivo de inoculación con el patógeno Fod raza 2. Se presentan los resultados promedio de tres extracciones independientes para cada tratamiento. Las letras diferentes muestran tratamientos diferentes significativamente (α= 0,05)

Estos resultados difieren con lo encontrado en tomate (Solanum lycopersicum) por

Mandal et al (2008), quienes encontraron que la infección con el patógeno Fusarium

oxysporum f. sp lycopersici, generó un aumento en enzimas antioxidantes desde las 24

hpi a nivel de la raíz. Sin embargo, es probable que en la interacción clavel-Fod, la

respuesta de defensa en estos tiempos esté focalizada en mantener altos niveles de

EROs con el fin de activar las respuestas de defensa que han sido encontradas en este

modelo, como la activación transcripcional para genes codificantes para CHS y CHI que

se presenta a las 12 y 24 hpi o la activación de la posible fosforilación de la PAL para su

activación a las 96 hpi.

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a

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b

a

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a

a

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A

B

198

En general, con los resultados que se encontraron en la presente investigación se puede

concluir que, al menos en los tiempos posinoculación evaluados, no existe una activación

de la maquinaria antioxidante enzimática en raíces de clavel, muy probablemente debido

a los requerimientos particulares de este órgano, en estos tiempos posinoculación. Sin

embargo, no se puede descartar la acción de otros métodos de regulación de especies

antioxidantes, como es el caso de la acción de compuestos flavonoides, que en raíz se

activan a las 6 y 96 hpi (figura No. 15).

c. Determinación de peróxido de hidrógeno en tallos

Con respecto al estudio de estos mismos mecanismos a nivel del tallo, se encontró que

la respuesta en este órgano en términos de la acumulación de peróxido de hidrógeno, es

semejante a la encontrada previamente en raíz. Se determinó que los niveles

aumentaron por efecto de la inoculación con el patógeno en la variedad resistente,

siendo superiores a las 12 y 24 hpi, al comparar con sus respectivos controles (figura No.

42).

42Figura No. 42. Niveles de peróxido de hidrógeno en tallos de clavel durante el ensayo in vivo de inoculación con el patógeno Fod raza 2. Se presentan los resultados promedio de tres extracciones independientes para cada tratamiento. Las letras diferentes muestran tratamientos diferentes significativamente (α= 0,05)

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b

199

Por otro lado, en la variedad susceptible, se presentó un aumento a un solo tiempo (12

hpi). Estos resultados indican que, tal y como ha sido descrito en raíces, la regulación

temporal de la acumulación de peróxido de hidrógeno, es determinante para el proceso

de señalización en resistencia y es probable que un aumento mantenido de esta especie

química, sea requerido para una correcta activación de las respuestas de defensa (C.

Lamb & Dixon 1997; Tománková et al. 2006; Heller & Tudzynski 2011).

En este órgano de la planta es tambien probable que el aumento en peróxido de

hidrógeno esté asociado a la activación de la respuesta basal de la planta por el

reconocmiento de MAMPs presentes en el patógeno, en ambas variedades estudiadas, y

por la activación de Homólogos de Oxidasas de Explosión Respiratoria Oxidativa

(RBOH), las principales generadoras de EROs en plantas (Sagi & R Fluhr 2001; Hancock

et al. 2002; Sagi & Robert Fluhr 2006), tal y como fue propuesto en raíz.

Es interesante recordar que el aumento previamente descrito para los niveles de mRNA

para la enzima CHS en este órgano de la planta, se presentó también a las 12 y 24 hpi

(Fig 37). Esto indicaría que así como se propuso en raíz, es muy probable que el

aumento de esta especie altamente oxidante, active el proceso de transcripción de los

genes asociados con la biosíntesis de flavonoides en este órgano (Agati et al. 2012;

Falcone Ferreyra et al. 2010; Dubos et al. 2010; Heine et al. 2004).

d. Determinación de actividad APX y GPX en tallos

Con respecto a las enzimas objeto de estudio a nivel del tallo, se encontró que no existen

diferencias significativas (α=0,05) en los niveles de actividad APX durante la interacción

con el patógeno (figura No. 43). Esto indica que no existen evidencias estadísticas que

permitan proponer la participación de esta enzima en los mecanismos de defensa que se

activan en los tallos resistentes.

b

c

200

43Figura No. 43. Niveles de actividad ascorbato peroxidasa en tallos de clavel durante el ensayo in vivo de inoculación con el patógeno Fod raza 2. Se presentan los resultados promedio de tres extracciones independientes para cada tratamiento. Las letras diferentes muestran tratamientos diferentes significativamente (α= 0,05)

Por otro lado, los niveles de actividad guayacol peroxidasa obtenidos al analizar los

extractos de tallos de clavel inoculados con Fusarium oxysporum f. sp. dianthi raza 2,

presentaron un comportamiento diferencial entre las dos variedades usadas en el

presente estudio, tal como se muestra en la Fig 44.

44Figura No. 44. Niveles de actividad guayacol peroxidasa en tallos de clavel durante el ensayo in vivo de inoculación con el patógeno Fod raza 2. Se presentan los resultados promedio de tres extracciones independientes para cada tratamiento. Las letras diferentes muestran tratamientos diferentes significativamente (α= 0,05)

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a a

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c

201

La variedad resistente presentó niveles estadísticamente superiores (α=0.05) de

actividad enzimática, al comparar con los respectivos controles sin inocular y con la

variedad susceptible, a las 12, 24 y 48 hpi. Los niveles de la enzima en las muestras

controles de las dos variedades estudiadas, permanecieron aproximadamente constantes

hasta las 96 horas, tiempo en el que se presentó un aumento en la actividad. En este

mismo tiempo se presentó aumento en la actividad para la variedad susceptible

inoculada al comparar con el respectivo control no inoculado (α=0.05).

Es evidente, de acuerdo a los presentes resultados, que el proceso de inoculación con

Fusarium oxysporum f. sp dianthi raza 2, generó un aumento temprano de la actividad

GPX a nivel del tallo en el genotipo de clavel resistente al marchitamiento vascular (figura

No. 44). Resultado similar se había obtenido en el grupo de investigación con otra

variedad de clavel (Cuervo et al, 2009). Dicho aumento de actividad se presentó a 12, 24

y 48 hpi, tiempos tempranos en los se han evidenciado las primeras etapas de la

infección con este patógeno y en los que se presentan las primeras respuestas de

defensa en los genotipos resistentes de clavel (Van Pelt-Heerschap & Smit-Bakker 1999;

Ardila & Higuera 2005; Ardila et al. 2011). Para el caso de la variedad susceptible se

presentó aumento en la actividad enzimática sólo a las 96 hpi, el que, además de ser

tardío, es mucho menor que el presentado por la variedad resistente. Estos resultados

están de acuerdo con otros en los que se ha reportado un aumento temprano en la

actividad de esta enzima durante la interacción con patógenos del género Fusarium en

genotipos resistentes de otras especies (P. Prasad et al. 2003; L. Huang & Backhouse

2005; Mandal et al. 2008; Madadkhah et al. 2012). Se ha propuesto que estas enzimas

(GPX), las cuales hacen parte de la familia de peroxidasas de clase III, participan en

diversos fenómenos que han sido descritos como claves dentro del modelo de resistencia

de plantas a patógenos vasculares como Fusarium (Beckman, 2000), como son

lignificación (Jaiti et al. 2009), regulación de los niveles de peróxido de hidrógeno

(Mandal, 2008), generación de peróxido (Bindschedler et al. 2006) o generación de

especies químicas con actividad antifúngica (Morkunas & Gmerek 2007; A. Dihazi et al.

2011).

202

e. Determinación de niveles de lignina en tallos

Con el fin de determinar si el aumento que se había presentado en términos de esta

actividad enzimática estaba correlacionado con el aumento en los niveles de lignina se

determinó su contenido en tallos de clavel a los diferentes tiempos posinoculación

propuestos (figura No. 45). Se evidenció que la inoculación no afectó los niveles de

lignina en tallos de las dos variedades en estudio, para ninguno de los tiempos evaluados

(α=0.05). La variedad resistente presentó niveles constitutivos superiores de este

polímero al comparar con la variedad susceptible Tasman (α=0.05).

45Figura No. 45. Niveles de lignina en tallos de clavel durante el ensayo in vivo de inoculación con el patógeno Fod raza 2. Se presentan los resultados promedio de tres extracciones independientes para cada tratamiento. Las letras diferentes muestran tratamientos diferentes significativamente (α= 0,05)

Al comparar el contenido de este polímero con los de actividad enzimática GPX (figura

No. 44) se evidenció que no hay relación entre estos dos. Este resultado no coincide con

reportes previos realizados en este modelo en donde si se presentó una acumulación de

lignina a las 96 hpi en tallos de la variedad resistente Bárbara, inoculada con este

patógeno (Cuervo, et al. 2009). Es probable que la acumulación de este polímero se

inicie a tiempos posteriores para el caso de la variedad resistente usada en la presente

investigación (L.P Candy), considerando que diferencias propias de los genotipos, de la

virulencia del aislamiento del patógeno o de las condiciones ambientales propias del

ensayo, afectan la colonización y por tanto el tiempo al que se observan las respuestas

de defensa (Ben-Yephet & Shtienberg 1997). Otros procesos que tienen que ver con el

0

0,002

0,004

0,006

0,008

0,01

0,012

0 6 12 24 48 96

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a

b

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a


203

fortalecimiento de paredes celulares y que han sido asociados con resistencia en este

modelo, que no fueron evaluados en el presente estudio como son la suberización y la

acumulación de material electrodenso (Higuera & Ebrahim-Nesbat 1999; Ouellette et al.

2004), pueden implicar también la participación de peroxidasas (Almagro et al. 2009; A.

Dihazi et al. 2011).

4.3.3. Zimogramas de peroxidasas usando SDS-PAGE e IEF

Teniendo en cuenta los mayores niveles de GPX obtenidos en el tallo, la comparación de

los perfiles electroforéticos se realizó usando los extractos obtenidos de tallos a 12, 24 y

48 hpi para la variedad resistente inoculada y sus respectivos controles. Se determinó

por SDS-PAGE en condiciones no reductoras y posterior tinción específica, que los

extractos presentan principalmente dos bandas con pesos moleculares aparentes de 101

y 62 kDa aproximadamente. La banda de 62 kDa presentó un evidente aumento en su

intensidad en la muestra correspondiente a 24 hpi, indicando que el aumento de los

niveles de actividad enzimática, observados a este mismo tiempo, puede asociarse con

un mayor contenido de peroxidasas que presentan este peso molecular aparente. Así

mismo, es probable que a las 48 hpi el aumento en la intensidad en la banda a 101 kDa

pueda estar asociado al aumento en la actividad enzimática que se presentó en este

tiempo posinoculación.

46Figura No. 46. Comparación de perfiles electroforéticos por SDS-PAGE de extractos de peroxidasas obtenidos a partir de tallos de la variedad resistente L.P. Candy. 1) Patrones de PM, 2) Control 12 hpi, 3) inoculado 12 hpi, 4) control 24 hpi, 5) inoculado 24 hpi, 6) Control 48 hpi, 7) Inoculado 48 hpi

66 kDa

45 kDa

29 kDa

24

36 kDa

24 kDa

24

62 kDa

101 kDa

1 2 3 4 5 6 7

204

La comparación de los perfiles de isoenzimas usando IEF se realizó para los extractos de

la variedad resistente a 12 y 24 hpi. Se pudo evidenciar que no existe la generación de

nuevas isoformas con actividad POD, sino el aumento en los contenidos de isoformas

pre-existentes que se observaron también en el control no inoculado (figura No. 47).

47Figura No 47. Comparación de perfiles electroforéticos por isoelectroenfoque de extractos de peroxidasas obtenidos a partir de tallos de clavel de la variedad resistente L.P. Candy. 1) Patrones de PM, 2) Control 12 hpi, 3) inoculado 12 hpi, 4) control 24 hpi, 5) inoculado 24 hpi. La tinción de los patrones (1) se realizó usando Comassie Coloidal y de los extractos enzimáticos (2-5) con tinción específica.

Este es el caso de una isoforma con un pI de 6.9, que a las 24 hpi presenta un

importante aumento en su intensidad. Así mismo, a las 12 hpi se observó un aumento en

la intensidad de bandas con pI de 5.2, 5.8 y 7.2, que puede asociarse con el aumento en

la actividad enzimática obtenido a dicho tiempo.

Las peroxidasas de clase III se encuentran codificadas por un amplio conjunto de genes

y existe alta diversidad de estas enzimas que difieren en pesos moleculares y puntos

isoeléctricos (Almagro et al. 2009; Mathé et al. 2010). Sin embargo, considerando que la

mayoría de los reportes han citado un peso molecular en el rango entre 25 y 40 kDa para

peroxidasas de plantas (Mathé et al. 2010), es probable que estos pesos moleculares

mas altos para el caso del clavel (62 y 101kDa) se deban a la presencia de

9,3

8,6

8,4

7,3

6,8

5,8

3,6

4,5

5,2

1 2 3 4 5

6,9

205

conglomerados constituidos principalmente por dímeros o tetrámeros. Dichas estructuras

multiméricas se pueden presentar, ya sea por la presencia de asociaciones funcionales

desde la planta (Lüthje et al. 2011) o por su generación durante la extracción mediante la

formación de puentes disulfuro intercatenarios entre las unidades monoméricas. La

presencia de varios puentes disulfuro ha sido reportada para esta enzima (Reading &

Aust 2001; Mathé et al. 2010) y podrían ser los responsables de la generación de dichas

estructuras. Considerando que el método de detección usado fue la tinción específica, no

se usaron agentes reductores con el fin de evitar pérdidas de actividad enzimática. Bajo

estas consideraciones, los resultados del presente estudio se pueden comparar con los

encontrados en Capsicum annuum L. chungok, en donde bajo las mismas condiciones de

electroforesis no reductoras, se presentan también dos bandas de actividad con pesos

moleculares aparentes de 114 y 53KDa solamente (H. Zheng et al. 2005).

De acuerdo a estos resultados, el aumento en la actividad enzimática GPX a las 24 hpi

en la variedad resistente a nivel del tallo, se debe, al parecer, principalmente al aumento

en los niveles de la peroxidasas pre-existentes. Esta observación se confirmó con

isoelectroenfoque en donde se encontró que el número de isoformas entre inoculados y

controles permanece constante y solo se presentó aumento en los niveles de

peroxidasas pre-existentes (figura No. 47). Lo obtenido está de acuerdo con lo reportado

previamente en clavel por Van Pelt-Heerschap, H and Smit-Bakker, O. (1999), en donde

se encontró que la inoculación con aislamientos de Fusarium oxysporum f. sp. dianthi, de

las razas 1 y 8 presentes en suelos europeos, no genera inducción de nuevas isoformas

de peroxidasas en líquido de lavado intercelular a nivel del tallo. Así mismo, coincide con

lo encontrado en otros modelos planta-patógeno (Sujeeth et al. 2010) como Girasol

(Helianthus annus L)-Plasmopara halstedii (Saftić-panković et al. 2006) o palma (Phoenix

dactylifera L) - Fusarium oxysporum f. sp. albendinis (Jaiti et al. 2009), en donde se

encontró que el aumento de la actividad GPX está asociada al aumento de isoformas

preexistentes de esta enzima.

206

4.3.4. Niveles transcripcionales de peroxidasas de clase III

Con el fin de conocer si la regulación de los niveles de estas enzimas se presentaba a

nivel transcripcional, se determinaron los niveles de mRNA para las diferentes isoformas

reportadas a la fecha de peroxidasas en clavel de acuerdo a las condiciones citadas en la

metodología (4.2.6). Se determinó que a las 12 hpi, la variedad resistente presentó un

aumento en la transcripción de los genes que codifican las proteínas DcPrx01, DcPrx02 y

DcPrx04 (figura No. 48), siendo casi 8 veces superiores en el caso de DcPrx02.

Gráfica No. 6. Comparación de niveles transcripcionales por cuantificación relativa de

peroxidasas a nivel del tallo a las 12 hpi con Fusarium oxysporum f. sp. dianthi raza 2.

Se usó como gen housekeeping actina. El valor reportado corresponde al promedio de

dos determinaciones.

48Figura No. 48. Comparación de niveles transcripcionales por cuantificación relativa de peroxidasas a nivel del tallo a las 12 hpi con Fusarium oxysporum f. sp. dianthi raza 2. Se usó como gen control actina. El valor reportado corresponde al promedio de dos determinaciones

De acuerdo a estos resultados, la presencia del patógeno generó cambios en los niveles

de mRNA para la proteína DcPrx02 a las 12 hpi, superiores a los presentados en las

otras proteínas evaluadas, usando como gen control β-actina. Esto está de acuerdo con

reportes en otras especies vegetales en donde se ha determinado que las peroxidasas

se encuentran codificadas por un conjunto de genes que presentan patrones de

expresión dependientes, entre otros factores, del tejido involucrado y del gen especifico

en estudio (Hiraga et al. 2000; Bakalovic et al. 2006; Baluška & Mancuso 2006; Mathé et

al. 2010). Estas diferencias han sido asociadas a la presencia de diferentes secuencias

promotoras en los genes codificantes para estas enzimas. Por ejemplo en Arabidopsis

thaliana, diferencias en elementos reguladores cis para los genes codificantes de las

enzimas Atprx33 y Atprx34, están asociados, al parecer, con las diferencias en

transcripción que se presentan en estos genes para tallos y hojas (Passardi et al. 2006).

Los resultados del presente estudio indican que en tallos de clavel se presenta, una

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

4,5

DcPrx01 DcPrx02 DcPrx03 DcPrx04 DcPrx05

Niv

ele

s tr

ansc

rip

cio

nal

es

rela

tivo

a β

-act

ina

CONTROL INOCULADO

207

estimulación diferencial de aquellos promotores asociados a la regulación de él o los

genes codificantes para la proteína Dcprx02, por efecto de la inoculación con el

patógeno, cuando se compara con las demás proteínas evaluadas. De acuerdo a análisis

realizados con los programas MEME (Multiple Em for Motif Elicitacion versión 3.5.3) y

MAST (Motif Aligment & Search Tool), la proteína Dcprx02 presenta motivos típicos de

peroxidasas de clase III, como son los asociados a los sitios de unión a grupo hemo y a

los sitios de unión a calcio (figura No. 49).

Motivo 1. Aminoácidos de unión a grupo hemo y catalíticos de peroxidasas de clase III presentes en proteínas como (gi|11514092| Chain A, Arabidopsis Thaliana Peroxidase A2).

Motivo 2. Aminoácidos de unión a calcio presentes en proteínas como (gi|7245406|pdb|1QGJ|A Chain A, Arabidopsis Thaliana Peroxidase N)

Motivo 3. Este motivo no tiene secuencias asociadas con un e-value adecuado.

49Figura No. 49. Motivos presentes en la proteína Dcprx 02 en Dianthus cayophyllus L encontrados con el programa MEME (Multiple Em for Motif Elicitacion versión 3.5.3). Se describe en la parte inferior la descripción correspondiente de los diferentes motivos de acuerdo al programa MAST (Motif Aligment & Search Tool)

Estos motivos al estar altamente conservados en peroxidasas extracelulares (Mathé et al.

2010), confirman su ubicación a nivel del apoplasto en donde se presentan los eventos

tempranos mas importantes durante la interacción con patógenos (Almagro et al. 2009;

Hammerschmidt 2011).

Con el fin de realizar una evaluación aun más exacta de los niveles de mRNA para esta

proteína, y considerando la necesidad de usar varios genes control de manera

simultánea cuando se trabaja con cuantificación relativa (Aoun, M. et. al. 2010), se optó

por realizar cuantificación absoluta en muestras de todos los tiempos posinoculación,

para los niveles de transcripción de la proteína DcPrx02, siendo expresados como No de

copias por pg de cDNA, tal y como ha sido recientemente propuesto en plantas, de

acuerdo a las consideraciones previamente discutidas en el capitulo 3 (Y. Lu et al. 2012).

En el ensayo no se presentaron diferencias en los valores de la eficiencia para patrones y

muestras de acuerdo al procedimiento sugerido por Ramakers C. et. al. 2003, indicando

que los resultados encontrados no están afectados por la presencia de contaminantes.

208

50Figura No. 50. Niveles de mRNA para la proteína DcPrx02 a nivel del tallo durante la inoculación con Fusarium oxysporum f. sp. dianthi raza 2. Variedad Resistente L.P Candy: A) Niveles transcripcionales por cuantificación absoluta, B) Niveles relativos del inoculado con respecto al control no inoculado. Variedad Susceptible Tasman: C) Niveles transcripcionales por cuantificación absoluta, D) Niveles relativos del inoculado con respecto al control no inoculado. Los resultados son el promedio de tres réplicas. Los tratamientos que presentan diferencias están asignados con letras diferentes (α=0,05)

Esta cuantificación confirmó que los niveles de transcriptos para la proteína Dcprx02

aumentan casi 8 veces con respecto al control para la variedad resistente a las 6 hpi

(figura No. 50 B). Dicho aumento se mantiene a las 12 horas y debe estar asociado a la

inducción de actividad enzimática que se presenta principalmente a las 12 y 24 hpi (figura

No. 43).

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

4000

4500

0 6 12 24 48 96

No

de

co

pia

s/p

g cD

NA

Resistente Control

Resistente Inoculado

0

2

4

6

8

10

12

0 6 12 24 48

Rela

ció

n n

ivele

s t

ran

scri

pc

ion

ale

s

ino

cu

lad

o/c

on

tro

l

0

2

4

6

8

10

12

0 6 12 24 48 96

Rela

ció

n n

ivele

s t

ran

scri

pc

ion

ale

s

ino

cu

lad

o/c

on

tro

l

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

4000

4500

0 6 12 24 48 96

No

de

co

pia

s/p

g c

DN

A

Susceptible Control

Susceptible Inoculado

Resistente

c

b

a

a

b

a

a

a

a a

a

Susceptible

b

a

a

a

a

a a

a

a


A

D C

B

209

Considerando que para la variedad susceptible se presentó un aumento en los niveles de

transcripción para esta proteína de apenas 2 veces con respecto al control a las 12 hpi

(figura No. 50 D), sin aumento en la actividad enzimática, se postula que existe una

respuesta diferencial entre variedades R y S y que la activación transcripcional temprana

de este gen está posiblemente asociada con resistencia al patógeno. Resultados

similares se han encontrado en otros modelos, en los que se ha observado una inducción

a nivel transcripcional para esta enzima asociada con resistencia (Desmond et al. 2008;

Goswami & Punja 2008; F. C. L. Medeiros et al. 2009; Lanubile, Bernardi, Marocco, et al.

2012).

Con el fin de determinar si los niveles de mRNA de este gen estaban correlacionados con

los parámetros previamente evaluados en este mismo órgano, se compararon las

diferentes variables y se determinaron los coeficientes de correlación de Pearson (α=

0,05) (tabla No. 22). Se encontró que los niveles de actividad y transcripcionales no se

encontraban estadísticamente correlacionados (r=0.67), indicando que deben existir

mecanismos de regulación postranscripcionales para finalmente generar la enzima activa

en los tallos de la planta. De acuerdo a esta evidencia, primero se activa la transcripción

de este gen (6 y 12 hpi) para luego de unas horas, iniciar la síntesis de las enzimas que

participarán en los procesos de defensa mencionados (12 y 24 hpi).

Tabla No. 22. Análisis estadísticos de correlación de Pearson entre las variables evaluadas

mRNA DcPrx02 Peróxido de Hidrógeno

Actividad GPX Lignina

mRNA DcPrx02 1

Peroxido de Hidrógeno 0,82246682 1

Actividad GPX 0,676588427 0,89738239 1

Lignina 0,541985451 0,418178846 -0,014514981 1

De acuerdo a estos resultados era evidente que el aumento en los niveles de mRNA para

el gen que codifica para la peroxidasa de clase III Dcprx02 en la variedad resistente

(figura No. 49 A) debe estar asociado al aumento de actividad enzimática peroxidasa que

se presenta en esta variedad (figura No. 44). Esta regulación a nivel transcripcional de

las peroxidasas de plantas durante la interacción con patógenos, ha sido documentada

en otros modelos (Hao et al. 2009), y permite proponer que la activación de la

210

transcripción del gen codificante para la peroxidasa Dcprx02, es importante dentro de los

eventos tempranos de defensa en este modelo.

Por otro lado, de acuerdo a los análisis estadísticos realizados se presentó correlación

entre los niveles de peróxido de hidrógeno y los niveles de mRNA para esta proteína

(0.82). Esto coincide con el conocido papel del peróxido de hidrógeno para inducir la

expresión de genes de defensa (Kúzniak & Urbanek 2000; Almagro et al. 2009). De esta

manera, el aumento en los niveles de peróxido de hidrogeno en la variedad resistente,

desencadenaría una respuesta a nivel transcripcional del gen codificante para la

peroxidasa Dcprx02, la cual genera a su vez, un aumento en los niveles de esta enzima a

nivel del apoplasto, punto de localización de esta proteína y en donde se presentan

algunos de los eventos de defensa mas relevantes en esta interacción (Almagro et al.

2009; Hammerschmidt 2010).

Considerando que la inducción de peróxido de hidrógeno también se presentó en la

variedad susceptible de clavel (figura No. 42) y que no se presentó aumento en la

transcripción para el gen codificante de la proteína Dxprx02, en esta variedad, se hace

evidente que existen diferencias entre ambos genotipos, en términos de la acción de

mecanismos que actúan posteriores a la generación del peróxido de hidrógeno, en la

cascada de señalización. Estos pueden ser por ejemplo la acción de fosfatasas o MAP

kinasas y la activación de factores de transcripción que estimulan la expresión de genes

asociados con la defensa vegetal (Hancock et al. 2002). Es probable que tal y como se

propuso a nivel de la raíz, en el genotipo susceptible esta activación se vea afectada por

la acción de efectores del patógeno, los cuales actuarían sobre estas vías de

señalización afectando algún punto sensible en la transducción de la señal (Kamoun

2007; Pritchard & Birch 2011).

Se determinó que existe correlación significativa entre los niveles de H2O2 y los niveles de

actividad GPX para la variedad resistente (α= 0,05) Es bien sabido que las peroxidasas

de clase III participan en la regulación de los niveles de peróxido de hidrógeno en plantas

(Hancock et al. 2002; Almagro et al. 2009; Mathé et al. 2010). Dentro de estos estudios

se ha determinado que estas enzimas participan en su eliminación, asociada a la

oxidación de fenoles para la generación de quinonas que pueden ser usadas en el

proceso de defensa contra patógenos (Tománková et al. 2006; Mandal et al. 2008) y

211

también en su generación a nivel del apoplasto (Kawano 2003; Jacyn Baker et al. 2005;

Bindschedler et al. 2006). Muchas peroxidasas de clase III presentan dominios de unión

a membrana plasmática y se ha propuesto que varios de estos procesos regulatorios se

pueden llevar a cabo hacia el lado apoplástico de la membrana celular (Lüthje et al.

2011).

De acuerdo a los resultados del presente estudio, se propone que también en tallos de

clavel, la enzima peroxidasa estaría asociada a estos procesos de regulación, teniendo

en cuenta la correlación estadística que se presentó entre los niveles de peróxido y los

niveles de actividad enzimática para la variedad resistente inoculada (tabla No. 22).

Considerando que no existe correlación entre los niveles de peróxido de hidrógeno y la

actividad peroxidasa en la variedad susceptible, en donde la actividad permaneció sin

variaciones estadísticas a pesar de la acumulación de peróxido a las 12 hpi (Gráfica No.

42), es probable que durante la interacción con el patógeno participen principalmente

RBOHs para la generación de estas especies altamente oxidantes que se requieren para

los procesos iniciales de señalización en ambas variedades como un proceso de la

defensa basal, tal y como se propuso anteriormente en la raíz de la planta(Sagi & Robert

Fluhr 2006; Hancock et al. 2002).

En general, los resultados de este estudio muestran la complejidad de los procesos que

están involucrados en esta interacción planta-patógeno y evidencian la necesidad de

profundizar sobre los que eventualmente pueden estar asociados a mecanismos de

defensa que determinan la resistencia a la enfermedad. Es por ello que en la siguiente

etapa de la investigación, se abordó el estudio de la resistencia del clavel usando

herramientas proteómicas, con el fin de complementar la información sobre los

fenómenos hasta este punto estudiados y brindar un panorama aun más completo de los

mecanismos bioquímicos y moleculares asociados a la resistencia del clavel.

212

4.4. Conclusiones

Los niveles de peróxido de hidrógeno a nivel del tallo, aumentaron en la variedad

resistente por efecto de la inoculación con Fod a las 12 y 24 hpi, mientras que para la

variedad susceptible dicho aumento se presentó solamente a las 12 hpi, indicando que

diferencias en la regulación de los niveles de esta especie oxidante pueden estar

asociados con la resistencia a la enfermedad en este órgano.

Los niveles de GPX aumentaron de manera diferencial en tallos de la variedad resistente

al patógeno Fod, a las 12, 24 y 48 hpi y presentaron correlación estadística con los

niveles de H2O2 en este mismo órgano, indicando que en esta variedad, los niveles de

esta enzima pueden estar asociados con la regulación de los niveles de esta especie

reactiva de oxìgeno (ERO), de manera simultánea con la activación de los mecanismos

de defensa en que esta enzima participa.

La inoculación con el patógeno Fod, generó a nivel de la raíz un aumento significativo en

los niveles de H2O2 en la variedad resistente (L.P. Candy) a las 6, 24, 48 y 96 hpi,

mientras que en la variedad susceptible (Tasman), dicho aumento se presentó en una

proporción menor a las 6 y 96 hpi, indicando que diferencias en la intensidad de la

respuesta, está asociada con la correcta activación de los mecanismos de defensa que

se presentan en la planta a este nivel.

Como resultado de la inoculación con el patógeno, los niveles de las enzimas APX y GPX

se mantienen constantes en raíces de las dos variedades estudiadas, indicando que en

este órgano de la planta no se activan mecanismos enzimáticos de regulación de EROs

asociados a estas enzimas, durante tiempos tempranos de la interacción. Los niveles

constitutivos de estas enzimas en este órgano y en tallos, tampoco mostraron correlación

con los niveles de resistencia al marchitamiento vascular causado por Fod

El aumento en los niveles de actividad GPX que se presenta en tallos de la variedad L.P.

Candy (R) por efecto de la inoculación, está asociado con el aumento en los niveles de

isoformas preexistentes, las cuales presentan pesos moleculares aparentes de 62 y 101

kDa y puntos isoeléctricos de 5.2, 5.8, 6.9 y 7.2.

213

La inoculación con el patógeno Fod, genera a nivel del tallo un aumento diferencial en los

niveles de mRNA para peroxidasas de clase III, que depende del gen evaluado,

indicando que la regulación de la actividad está determinada por la activación

transcripcional diferencial de los genes codificantes para este tipo de enzimas.

Un aumento en los niveles transcripcionales del gen codificante para la enzima Dcprx02,

la cual presenta dominios asociados a localización extracelular, está asociada con los

mecanismos de defensa que a nivel del tallo, se activan para dar lugar a la resistencia del

clavel al patógeno causal del marchitamiento vascular.

La correlación observada entre los niveles de mRNA del gen Dcprx02 y los niveles de

peróxido de hidrógeno en tallos de la variedad L.P. Candy (Resistente), muestran que la

activación transcripcional de este gen puede estar mediado por los cambios en los

niveles de esta especie química, durante la activación de los mecanismos de defensa de

la planta

La correcta regulación espacio temporal de los niveles de peróxido de hidrógeno puede

ser un factor importante durante la activación de los mecanismos de defensa que se

activan en tallos y raíces de la variedad resistente L.P. Candy, probablemente asociado a

la activación de la defensa activa basal de las plantas de clavel. Sin embargo, otras

respuestas asociadas a esta respuesta como la activación de peroxidasas, depende

grandemente del órgano de la planta involucrado, indicando que existen diferencias entre

órganos, en términos de los fenómenos de reconocimiento, transducción de señal y

activación de los mecanismos de defensa vegetales contra el patógeno causal del


215

5. Aproximación proteómica al estudio de los mecanismos de defensa del modelo clavel-Fusarium oxysporum f. sp dianthi

Resumen

Se investigaron los cambios en los proteomas de tallos y raíces de clavel infectados por

Fusarium oxysporum f. sp dianthi de dos variedades Tasman (Susceptible) y L.P Candy

(Resistente), mediante electroforesis monodimensional (1DE) y bidimensional (2DE) y

posterior identificación por espectrometría de masas (MALDI-TOF-TOF). Se seleccionó el

método (ATA/Acetona/fenol) para la extracción de proteínas totales y unas condiciones

de separación en 2DE que incluyen un gradiente de pH no lineal (NL) de 3 a 10 para la

separación en la primera dimensión. La visualización de proteínas se realizó mediante el

método de tinción combinado Sypro Rubi-Coomassie coloidal. Se encontró que a nivel de

la raíz, la variedad resistente presenta niveles constitutivos superiores de la enzima

málica, asociada con el metabolismo de carbohidratos y de una proteína que posee

dominio NB-ARC, altamente conservado en proteínas de resistencia. En este mismo

órgano, se encontró que la inoculación con el patógeno a las 6 hpi, generó un aumento

en proteínas asociadas a la biosíntesis de componentes de pared celular (α-1,4-glucan-

protein sintasa), de los aminoácidos serina y metionina (fosfoglicerato deshidrogenasa y

metionina sintasa) y de proteínas (factores de elongación EF1 Y EF2). Una disminución

en los niveles de enzimas asociadas con el ciclo de las pentosas fosfato (Glucosa-6-

fosfato deshidrogenasa y transaldolasa) y de rutas de actividad antioxidante

(monodehidroascorbato reductasa) muestran que como parte de la respuesta asociada a

resistencia, se encuentran respectivamente, una redirección del metabolismo del carbono

216

para la generación de energía y mantener altos niveles de peróxido de hidrógeno. A nivel

del tallo a las 24 hpi, se presenta por efecto de la inoculación con el patógeno, un

aumento en la ruta biosintética para la generación de etileno (metionina sintasa y

adenosilmetionin sintasa) y en los niveles de una proteína de choque térmico (HSP70),

chaperona asociada con el correcto plegamiento de las proteínas. Estos resultados

muestran la importancia que tienen procesos como la biosíntesis de proteínas y

componentes de la pared celular, así como la procesos de señalización en la resistencia

a Fusarium oxysporum f. sp. dianthi.

Abstract

The changes in proteomes of carnation stems and roots infected by Fusarium oxysporum

f. sp dianthi of Tasman (susceptible) and LP Candy (resistant), were evaluated by 1D

electrophoresis (SDS-PAGE) and 2D (IEF-SDS PAGE) and subsequent identification by

mass spectrometry (MALDI-TOF). The method ATA / acetone / phenol was selected for

total protein extraction, and a 3 to 10 NL gradient for IEF separation with a subsequent

detection method Sypro-colloidal Coomassie for 2D-electrophoresis. It was found that in

the roots, the resistant cultivar has higher constitutive levels malic enzyme involved with

the metabolism of carbohydrates and a protein with NB-ARC domain, which is highly

conserved in resistance proteins. At the same level, the pathogen inoculation at 6 hpi

caused an increase in proteins involved in biosynthetic process of cell wall components

(α-1,4-glucan-protein-synthase), of serine and methionine (Phosphoglycerate

dehydrogenase and methionine synthase ) and proteins (elongation factors EF1 and

EF2). A decrease in the levels of enzymes associated with the pentose phosphate cycle

(Glucose-6-phosphate dehydrogenase and transaldolase) and antioxidant activity

pathways, showed that metabolism carbon for energy generation and high levels of

hydrogen peroxide are part of the response associated with resistance. In the stems at

24 hpi, the patogen inoculation caused an increase in the biosynthetic pathway for

ethylene generation (methionine synthase and adenosilmetionin synthase) and levels of

heat shock protein (HSP70), chaperone associated with the correct folding of proteins.

These results show the importance of process and protein biosynthesis and cell wall

components, as well as the signaling processes in the resistance to Fusarium oxysporum

f. sp. dianthi.

217

5.1. Introducción

Los mecanismos de defensa que activan las plantas resistentes de clavel (Dianthus

caryophyllus L ) a la enfermedad marchitamiento vascular son de particular interés para

la comunidad científica interesada en el desarrollo de nuevas alternativas de control. Sin

embargo, el conocimiento sobre las proteínas y genes que están asociados a dichos

fenómenos, está limitado a algunas respuestas específicas (Van Pelt-Heerschap & Smit-

Bakker 1999; Ardila & Higuera 2005; Cuervo et al. 2009; Ardila et al. 2011), ya que los

estudios proteómicos y transcriptómicos que permiten realizar una evaluación global de

la respuesta son, a la fecha, inexistentes en este modelo planta-patógeno. A nivel

proteómico, la electroforesis bidimensional (2-DE) es una de las herramientas más

usadas para el análisis de proteomas en plantas permitiendo el estudio de un gran

número de procesos biológicos como, por ejemplo, las interacciones con microrganismos

patógenos (Thurston et al. 2005a; Quirino et al. 2010; Abdelbasset El Hadrami et al.

2012). De hecho, en los últimos años el análisis descriptivo de proteínas involucradas en

la interacción con patógenos, usando 2-DE y posterior identificación usando

espectrometría de masas, se ha convertido en una importante herramienta en

fitopatología para diferentes especies vegetales como arroz (Y.-Z. Lin et al. 2008; Koga et

al. 2012), Arabidopsis thaliana (Mukherjee et al. 2010), trigo (Ding et al. 2011), garbanzo

(Palomares-Rius et al. 2011), menta (Sinha & Chattopadhyay 2011), guisantes (Barilli et

al. 2012), uva (Milli et al. 2011) y fresa (Xianping Fang et al. 2012). Al respecto, muchos

de estos estudios se han abordado mediante aproximaciones de proteómica comparativa

en donde las respuestas bioquímicas de interés, se deducen al comparar el

comportamiento de variedades que presentan diferencias de resistencia ante la

enfermedad en estudio. Son varios los reportes que han permitido encontrar proteínas

asociadas a defensa en modelos que involucran patógenos del género Fusarium,

comparando la respuesta que presentan las variedades susceptibles y resistentes

durante su inoculación con el patógeno (Ding et al. 2011; Palomares-Rius et al. 2011; K.

Shin et al. 2011; Eggert et al. 2011; Asano et al. 2012).

218

Sin embargo, la aplicación de estas herramientas está limitada a la obtención de un

extracto de proteínas de calidad libre de contaminantes como polisacáridos y/o

polifenoles, que pueden reaccionar de manera inespecífica con las proteínas, afectando

su migración y por tanto la resolución en el sistema de separación. Teniendo en cuenta

que la presencia de dichos contaminantes está determinada en parte por la correcta

combinación tejido vegetal y método de extracción (A.M Maldonado et al. 2008; M. A. da

Silva et al. 2010; De La Fuente et al. 2011), es necesario realizar la evaluación de

distintos métodos que permitan encontrar las mejores condiciones de extracción de

proteínas, cuando se trabaja por primera vez con una especie vegetal. Así mismo, es

importante contar con unas metodologías que permitan obtener altos rendimientos

durante la extracción y alta sensibilidad durante la tinción. Esto considerando que

generalmente las proteínas asociadas a los mecanismos de defensa de las plantas se

encuentran en niveles bajos y requieren para su detección los más altos niveles de

sensibilidad posibles, conseguidos con tinciones alternativas a las comúnmente usadas

(López et al. 2000). En general, las condiciones de extracción, separación y detección,

son determinantes para el estudio de la respuesta de interés y deben ser puestas a punto

en función del órgano y de la especie vegetal objeto de estudio.

Bajo estas consideraciones, con el fin de profundizar sobre los mecanismos que se

activan en tallos y raíces de clavel durante la interacción con Fod, se seleccionaron en

primer lugar las condiciones para la extracción y separación de proteínas a partir de

dichos órganos, con el fin de llevar a cabo el análisis de proteomas usando las técnicas

de separación basadas en gel (1-DE y 2-DE). Posteriormente, bajo las condiciones

seleccionadas, se realizó un análisis comparativo tanto a nivel constitutivo como por

efecto de inoculación con el patógeno, de los proteomas presentes en las variedades L.P

Candy (R) y Tasman (S). La posterior identificación de aquellas proteínas que

presentaron un comportamiento de interés mediante el análisis MALDI-TOF/TOF,

evidenció posibles mecanismos que son de interés en esta interacción y permiten

complementar, en parte, el panorama que hasta este punto se había generado sobre la

bioquímica de la interacción clavel-Fod.

219

5.2. Materiales y métodos

5.2.1. Material Vegetal

Se usaron tallos y raíces de las variedades L.P Candy (Resistente) y Tasman

(Susceptible), provenientes del ensayo in vivo que se describe detalladamente en el

Capitulo 3 (3.2). Las extracciones y posteriores análisis, se realizaron por triplicado en

aquellos tiempos posinoculación en los que se habían presentado los mayores cambios

en el contenido de proteína total entre controles e inoculados (0, 6, 24, y 96 hpi).

5.2.2. Selección de condiciones de extracción

Con el fin de seleccionar las condiciones más favorables para la extracción de proteínas

a partir de tallos y raíces de clavel, se evaluaron tres procedimientos de extracción

previamente publicados para el análisis de proteomas en plantas y en estudios de

interacción planta patógeno (M. A. da Silva et al. 2010; De La Fuente et al. 2011;

Palomares-Rius et al. 2011). La selección de las mejores condiciones se realizó

comparando los rendimientos obtenidos expresados como mg proteína / g material

vegetal en base seca y la calidad de la separación en 1DE y 2DE usando geles

pequeños. Las metodologías aplicadas sobre tallos y raíces de clavel se presentan a

continuación y se encuentran de manera aún más detallada en (Ardila, González-

Fernández, et al. 2013).

Procedimiento A, basado en extracción, posterior precipitación y redisolución

Para este primer método se pesaron 20 mg de liofilizado de tallos o raíces de clavel de la

variedad Tasman en un tubo eppendorf nuevo de 2 mL y se adicionó 1 mL de buffer de

extracción de proteínas totales (Tris-HCl 0,5 M pH 8,0, SDS 5%, Glicerol 15%, DTT 100

mM, 1 mM PMSF). Esta mezcla se agitó por 30 min a 4oC. Luego de centrifugar a 16000

g por 10 min a 4oC y transferir el sobrenadante a un tubo nuevo de 2mL, se adicionó 1mL

de TCA al 100% (p/v). Después de homogenizar y mantener la muestra por 2 horas a

4oC, se centrifugó a 16000 g y se lavó el pellet (3 veces) con acetona con una

centrifugación final a 16000 g por 5 min. El pellet resultante se dejó secar al aire en una

cabina de extracción para eliminar la acetona remanente, se disolvió en 200µL del buffer

de solubilización (urea 9 M, tiourea 2 M, CHAPS 4% (p/v), Tritón X-100 0,5% (p/v) y DTT

20 mM) y se agitó por 4 horas a 4oC. La proteína total presente en este extracto se

220

determinó por el método de Bradford (Ramagli & Rodriguez 1985) usando BSA como

patrón y se guardó a -20ºC para posteriores análisis.

Procedimiento B, basado en extracción mediante precipitación con TCA-Acetona

Al igual que en el procedimiento anterior se pesaron 20 mg de tallos o raíces de la

variedad Tasman (S) previamente liofilizados, en un tubo eppendorf nuevo de 2 mL y se

adicionaron 500 μL de TCA al 10% (p/v) y DTT (0,07% w/v) en acetona. Esta mezcla se

sometió a ultrasonido (3 veces x 10 segundos a 50W, amplitud 60) a 4oC y se puso en

hielo por 1 min. Luego de mezclar vigorosamente usando vortex, se adicionó TCA al 10%

y DTT (0,07% w/v) en acetona hasta llenar el tubo y nuevamente se mezcló

vigorosamente. Después de precipitar toda la noche a -20oC, se centrifugó a 16000 g por

10 min y 4oC. El sobrenandante correspondiente se descartó y el pellet se lavó (3 veces)

con acetona mezclando con vortex en cada paso. Luego de centrifugar a 16000 g por 5

min a 4oC se eliminó la acetona por decantación y se dejó en la cabina de extracción

para eliminar el solvente remanente. El pellet en este punto se disolvió en el buffer de

solubilización previamente descrito y se agitó por 4h a 4ºC. Luego de cuantificar las

proteínas usando el método de Bradford, el extracto se guardó a -20ºC para posteriores

análisis.

Extracción C, basada en precipitación con TCA/acetona y posterior extracción con fenol

Se pesaron 20mg del mismo material vegetal liofilizado en un tubo eppendorf nuevo de

2mL y se adicionó TCA al 10% (p/v) en acetona hasta llenar el tubo. Esta mezcla se

sometió a ultrasonido (3 veces x10 segundos a 50W, amplitud 60) y se dejó en hielo por

1 min. Luego de mezclar vigorosamente, se centrifugó a 16000 g por 5 min y se descartó

el sobrenadante por decantación. Sobre el pellet se realizaron lavados con acetato de

amonio 0,1M en metanol al 80% y posteriormente con acetona al 80%, realizando

centrifugaciones en cada caso a 16000 g por 5 min a 4oC. En este punto al pellet se le

adicionó una mezcla (1:1) de fenol saturado y buffer de lisis (sacarosa 30 % p/v, SDS 2%

p/v y β-mercaptoetanol 5%) hasta llenar el tubo. Después de homogenizar vigorosamente

usando un pistilo e incubar por 5 min en hielo, se centrifugó a 16000 g por 5 min a 4oC.

La fase fenólica (superior) se transfirió a un tubo nuevo de 2mL y se le adicionó acetato

de amonio 0,1M en metanol. Luego de dejar precipitar toda la noche a -20oC, se

centrifugó a 16000 g por 5 min a 4oC para eliminar finalmente el sobrenadante por

221

decantación. El pellet resultante se lavó con metanol al 100% y posteriormente con

acetona al 80%, realizando centrifugaciones en cada caso a 16000 g por 5 min a 4oC. El

pellet se secó a temperatura ambiente para eliminar los residuos de acetona. Finalmente

el pellet libre de acetona se disolvó en 200µL del buffer de solubilización antés descrito y

se agitó por 4h a 4oC. Al igual que en los tratamientos anteriores, luego de cuantificar las

proteínas usando el método de Bradford, el extracto se guardó a -20oC para posteriores

análisis.

Criterio para la selección de condiciones de extracción para proteínas totales a partir de tallos y raíces de clavel

Con el fin de comparar los métodos de extracción propuestos, además del rendimiento

expresado como mg proteína/g material vegetal, se evaluó la calidad de la separación

por 1DE y posterior detección usando Stain-Free Criterion de Biorad ®, con geles

preteñidos y prefabricados con un gradiente continuo del 4 al 20%. El buffer de

electroforesis fue Tris-HCl 0.05M pH 8,3, Glicina 0.2M y SDS 0.1%. En cada pozo se

colocaron 15 µg de proteína (Ramagli & Rodriguez 1985), provenientes de extractos

obtenidos por los métodos previamente descritos. La separación se realizó a voltaje

constante de 150V. La asignación de pesos moleculares se efectuó usando los

marcadores Precision Plus Protein Standards Biorad®. La visualización se realizó usando

el equipo Criterion Stain Free de Biorad ®, capturando la imagen correspondiente. La

calidad de la separación se evaluó mediante el número de bandas obtenido para cada

uno de los tratamiento ensayados en cada órgano de la planta usando el programa

Quantity One de Biorad ®

Posteriormente, con el fin de constatar la calidad de los extractos obtenidos mediante el

método de extracción seleccionado, se realizaron electroforesis en 2D de diferentes

cantidades de proteína total, usando tiras de IPG (Inmovilized pH Gradient) de 11 cm en

el rango de pH entre 3 y 10, en el equipo PROTEAN IEF cell Biorad ®. Para la segunda

dimensión, se usaron al igual que en 1D, geles prefabricados del sistema Criterion de

Biorad ®. En la primera dimensión se usaron volúmenes de extracto equivalentes a 100 y

200 µg de proteína y se llevaron a 185 μL, usando para ello el buffer de hidratación de

tira que presentaba la composición: urea 7M, tiourea 2M, CHAPS 4%, azul de bromofenol

0,1%, 100 mM DTT y 0,2 % de anfolitos rango 3-10 Biorad®. Luego de realizar el

proceso correspondiente de hidratación activa a 50 V por 16 horas, se usó un programa

222

para la separación a 20oC y un voltaje final de 8000 V (30 000 V-h). La corriente máxima

por tira fue de 50 µA. Al finalizar esta separación, las tiras se dispusieron para el proceso

de equilibrio correspondiente mediante agitación por 15 min., en una solución de Tris-HCl

375 mM pH 8,8, urea 6 M, glicerol 20%, SDS 2% y 2% DTT por 15 min y posteriormente

por otros 15 min, con la misma solución sin DTT, pero complementada con

iodoacetamida al 2%.

Se realizó luego la separación en la segunda dimensión en geles prefabricados de

poliacrilamida con un gradiente de 8 al 20 % y usando el patrón de peso molecular antes

mencionado. Luego de posicionar las tiras previamente equilibradas sobre el gel evitando

la entrada de burbujas, se realizó el correspondiente sellado usando la solución

compuesta por agarosa 0,5% y 0,01% de azul de bromofenol. La separación

electroforética se realizó a un voltaje constante de 150V a T ambiente. La detección y

posterior obtención de imágenes de los geles se realizó en el equipo Stain-Free Criterion

de Biorad ®. Finalmente, se evaluó de manera visual la presencia de “striking” en los

diferentes geles obtenidos para extractos de tallos y raíces de clavel; la presencia de éste

es uno de los criterios que se usan para determinar la existencia de contaminantes no

proteicos.

5.2.3. Selección de condiciones de separación en geles grandes

Selección de condiciones para la tinción en geles de 1D

Durante la selección de condiciones para la separación en geles grandes de 20X20 cm,

se evaluó el método de tinción que presentaba una mayor sensibilidad en la detección de

proteínas. Para ello se usaron extractos obtenidos mediante el método de extracción

seleccionado (TCA/Acetona/Fenol), a partir de raíces de las variedades L.P. Candy y

Tasman a las 0 y 6 hpi con el patógeno y sus respectivos controles sin inocular. Con

estos se llevaron a cabo electroforesis en geles de poliacrilamida con SDS (SDS-PAGE),

usando el sistema PROTEAN II XL Cell de Biorad ®. El sistema de separación consistió

en un gel de poliacrilamida al 12% (p/v) para la separación de las proteínas y uno de

concentración al 5% (p/v). El buffer de corrido fue Tris-HCl 0,05M pH 8,3, SDS 1%(p/v).

En cada pozo se colocaron 100 µg de proteína previamente cuantificados y la separación

se desarrolló a un voltaje constante de 100V a 4oC. La asignación de pesos moleculares

se realizó mediante comparación con el marcador SDS-PAGE Standards 6,5-200 KDa

223

Biorad®. Una vez realizada la separación, se evaluaron los procedimientos de tinción

que se describen a continuación:

Tinción con Sypro Rubi

Los geles se dispusieron en recipientes plásticos independientes y se lavaron por 30 min

con la solución fijadora que contiene metanol 10% y ácido acético 7%. Esta solución se

retiró y se adicionó Sypro Ruby Biorad ® hasta cubrir todo el gel. Después de agitar en la

oscuridad por 18 horas, se retiró la solución de tinción y se adicionó nuevamente la

solución fijadora metanol 10% y ácido acético al 7%. Luego de agitar durante 30 a 60

min, se lavó con abundante agua destilada y se capturó la imagen en el equipo escáner

de fluorescencia (FX Pro Plus Multiimager, Bio-Rad).

Tinción con Sypro-Comassie

Cada gel luego de ser digitalizado, se lavó por 3 a 4 horas con la solución bicarbonato de

amonio 20mM y acetonitrilo al 50%, con el fin de eliminar el Sypro. Luego de lavar con

agua destilada-desionizada por 30 min, se adicionó suficiente Comassie coloidal (0.06M

(NH4)2SO4, 20% (v/v) metanol, 1.9 % (w/w) H3PO4, 0,1 % (w/v) Coomassie G-250) para

cubrir cada gel y se agitó durante 60 h. Cuando terminó el proceso de tinción, cada gel se

lavó por 3 min, en la solución para desteñir A (0.1 M Tris-H3PO4, pH 6.5) y luego por 1

min, en la solución para desteñir B (25% (v/v) metanol). Finalmente, los geles se

mantuvieron en solución de desteñir C (sulfato de amonio 20% p/v) por mínimo 24 horas

y se digitalizó la imagen usando el densitómetro calibrado GS-800 de Biorad ®.

La selección del método de tinción se realizó comparando la sensibilidad obtenida en

cada caso, evaluando el número de bandas para un mismo extracto con el programa

Quantity one de Biorad ®

Selección de condiciones de separación en geles de 2D

Selección de cantidad de proteína en electroforesis 2D y de gradiente de pH

En la selección de la cantidad de proteína para realizar la separación en la primera

dimensión en geles grandes, se adicionó en tubos independientes 200µg y 400µg de

proteína de los extractos obtenidos a partir de tallos y raíces liofilizados de clavel. Se

224

completó a 400 µL usando el buffer de rehidratación descrito anteriormente y se agitó

vigorosamente. En el porta tiras, se adicionó esta solución y una tira de IPG de 17 cm

con un rango lineal de pH de 3 a 10, por cada una de las muestras. Se realizó el proceso

de rehidratación activa colocando el electrodo porta tiras en el equipo de enfoque

(PROTEAN IEF Biorad ®) por 16 horas a 50V. La separación se realizó a 20oC y un

voltaje final de 10000 V (60000 V-h). La corriente máxima de 50µA/tira. Luego de realizar

la separación en la primera dimensión, se equilibraron las tiras con 5 mL de buffer de

equilibrio de tira que contiene DTT al 2% durante 15 minutos en agitador reciprocante.

Luego se retiró esta solución y se realizó el mismo procedimiento usando la misma

solución pero con iodoacetamida al 2%. Después de realizar un lavado final con buffer de

corrido para eliminar la solución de equilibrio remanente, se realizó la separación en la

segunda dimensión colocando la tira en la parte superior de un gel grande previamente

preparado de 20 x 20 cm y 12% de acrilamida para el sistema PROTEAN II XL Cell. Se

usó el marcador (SDS-PAGE Standards 6,5-200KDa Biorad®) al lado izquierdo de la tira.

Luego de sellar cuidadosamente con la solución de sellado previamente descrita, se

realizó la separación electroforética a 100V. La tinción se realizó de acuerdo a las

condiciones previamente seleccionadas (Sypro-Comassie) y la imagen se tomó usando

el densitómetro calibrado. La selección de la cantidad de proteína se realizó mediante la

comparación visual de la resolución de la separación y el número de manchas proteicas

presentes para las dos cantidades de proteínas evaluadas, en cada órgano de la planta.

Bajo las condiciones seleccionadas de cantidad de proteína, se evaluó el gradiente de pH

en las tiras de IPG para la primera dimensión. Para ello se usaron tiras de IPG de 17 cm,

con un rango lineal y otra con un rango no lineal para las muestras de tallo y raíz. Se

siguieron las condiciones de separación en la primera y segunda dimensión descritas

anteriormente. Finalmente, se compararon los diferentes geles obtenidos en términos de

la resolución obtenida en la primera dimensión. Considerando que los resultados

indicaban que las mejores condiciones se obtenían con el gradiente de 3 a 10 NL para

ambos órganos del clavel, se hicieron ensayos adicionales para la asignación de puntos

isoeléctricos. Se realizó la separación del patrón comercial (Specialty Standard IEF de

Biorad ®), usando tiras de estas mismas características, tomando 5 µL de estos patrones

y completando a un volumen final de 400 µL usando buffer de rehidratación, tal y como

se describe anteriormente. Luego se realizó la separación en la primera dimensión bajo

las condiciones previamente descritas: rehidratación activa por 16 horas a 50V y

225

separación a 20oC y un voltaje final de 10000 V (60000 V-h). Las tiras de IPG se tiñeron

directamente con una solución de Comassie-coloidal y se evaluó la posición de los

patrones sobre la tira. La asignación de los puntos isoeléctricos se realizó mediante la

evaluación del desplazamiento desde el punto de pH 3 para los patrones sobre la tira y el

valor de desplazamiento de algunas manchas proteicas características en el gel desde

este mismo punto. Mediante comparación con éstos, se asignaron los pI de otras

proteínas en el programa PDQuest Biorad ®.

5.2.4. Análisis comparativo entre tratamientos usando electroforesis en 1D

Con el fin de comparar los perfiles de proteínas en 1D para las diferentes tratamientos se

realizaron las extracciones de acuerdo al método seleccionado anteriormente

(ATA/Acetona/fenol) a partir de tallos y raíces a las 0, 6, 24 y 96 hpi. Con el fin de obtener

información consistente del fenómeno biológico en estudio, se usaron 3 réplicas

biológicas para cada tratamiento en cada tiempo posinoculación (Valledor & Jorrín 2011).

La separación mediante SDS-PAGE se realizó usando 100 µg de cada extracto, bajo las

condiciones de separación previamente descritas y usando la tinción previamente

seleccionada (Sypro-Comassie). La digitalización de los geles se realizó usando el

densitómetro calibrado) y la comparación correspondiente se realizó mediante el

programa Quantity One Bio-Rad ®. El análisis densitométrico correspondiente se realizó

para cada una de las bandas, con previa normalización con respecto a la banda de PM

84 kDa que presentaba una intensidad constante en la mayoría de los carriles. La

correspondiente comparación para cada banda se realizó usando los valores

previamente normalizados teniendo en cuenta las tres réplicas biológicas realizadas,

usando análisis ANOVA y posterior asignación de diferencias usando el programa

STATGRAFICS 5.1. El análisis de identificación para las bandas de interés se realizó tal

y como se describe en el ítem 5.2.7.

226

5.2.5. Análisis comparativo entre tratamientos usando electroforesis 2D

Teniendo en cuenta los análisis realizados en 1D, se pudo determinar que a las 6 hpi en

raíces y 96 hpi en tallo, se presentaban los cambios más importantes en los perfiles de

proteínas por efecto de la inoculación con el patógeno y en consecuencia, fueron los

tiempos seleccionados para realizar el análisis comparativo en 2D. Para ello, se hicieron

extracciones por triplicado a partir de tallos y raíces de la planta, en los 4 tratamientos

propuestos, de acuerdo a las condiciones antes descritas. Los análisis por electroforesis

en 2D, se llevaron a cabo bajo las condiciones previamente puestas a punto, en términos

de la cantidad de proteína (400µg) y el gradiente de pH para la primera dimensión (3-10

NL). Con el fin de generar la mayor homogeneidad posible en las condiciones

experimentales, se realizaron las electroforesis de manera simultánea para los diferentes

tratamientos, usando el sistema electroforético para doce geles de 20x20 cm Protean

Dodeca Cell Bio-Rad ®. La tinción se realizó mediante el método combinado Sypro-

Coomassie y las imágenes fueron adquiridas con el densitómetro calibrado. El análisis

comparativo en cada órgano se realizó usando el programa PD-Quest de Biorad ® y se

consideraron solamente aquellos manchas proteicas consistentes, presentes en las tres

réplicas evaluadas. Con el fin de normalizar para el análisis de componentes principales

(PCA), todos los datos se transformaron con la función (Log10 X). El análisis estadístico

correspondiente se realizó usando las herramientas estadísticas disponibles en la página

web NIA (http://lgsun.grc.nia.nih.gov/ANOVA/index.html).

5.2.6. Digestión de proteínas en gel e identificación de proteínas por MALDI-TOF/TOF

Los análisis correspondientes de identificación fueron realizados en el laboratorio del

Servicio Central de Apoyo a la Investigación (SCAI) de la Universidad de Córdoba

(España). Para ello, las proteínas de interés se picaron del gel automáticamente en una

estación Investigator ProPic (Genomic Solutions). Los fragmentos del gel resultantes se

digirieron con tripsina y se depositaron sobre la placa MALDI también de manera

automática en una estación ProPrep II (Diglab genomic Solutions Inc. U.K.) con las

siguientes condiciones: dos pasos de destinción de 30 min con una solución del 40%

(v/v) de acetonitrilo y 200mM de bicarbonato de amonio; dos lavados con bicarbonato de

amonio 25mM durante 5 min y nuevamente con una solución del 40% (v/v) acetonitrilo y

227

200mM de bicarbonato de amonio por 15 min. La muestra se deshidrató con acetonitrilo

al 100% durante 5 minutos y se secó, para posteriormente hidratar con 10 µL de tripsina

a 12,5 ng/ µL en bicarbonato de amonio 25 mM durante 10 min a T ambiente. La

digestión se realizó durante 12 h a 37oC y se detuvo adicionando a cada muestra 10 µL

de una solución de ácido trifluoroacetico al 0,5% en agua. Los péptidos resultantes de la

digestión con tripsina, se purificaron mediante una micro-columna de resina C-18 (ZipTip,

Milipore) con elución por adición de una solución de matriz (3 mg/mL de ácido α-ciano-4

hidroxicinamico en 70% de acetonitrilo y 0,1 % de ácido trifluoroacetico) sobre la placa de

MALDI en un volumen de 1 µL. Tras la co-cristalización sobre la placa, las muestras se

analizaron mediante espectrometría de masas MALDI-TOF/TOF para obtener la huella

peptídica (MS) en un espectrómetro 4800 Proteomics Analyzer (Applied Biosystems)

equipado con extracción retardada y reflector en modo positivo. Se realizó calibración

interna de los espectros utilizando las relaciones masa/carga (m/z) de los péptidos

resultantes de la autolisis de la tripsina porcina (M+H+ = 842.509, M+H+ = 2211.104),

obteniendo de esta manera precisión en la medida de +/- 20ppm. De cada muestra se

obtuvieron los espectros de fragmentación (MS/MS) para las m/z más intensas.

La identificación de proteínas se realizó combinando los espectros MS y sus respectivos

MS/MS, sobre la base de datos NCBInr, utilizando MASCOT (MatrixScience) como motor

de búsqueda y limitando la categoría taxonómica a plantas (Viridiplantae), con

carbamidometilación completa de los residuos de cisteína y oxidación parcial de los

residuos de metionina. El error máximo permitido en la búsqueda fue de 100 ppm y el

número máximo de errores en el corte de la proteasa fue de uno.


5.3.1. Selección de condiciones para la extracción y separación por electroforesis en 1D y 2D de proteínas presentes en tallos y raíces de clavel

De acuerdo a los resultados encontrados, se determinó que los tres métodos de

extracción evaluados, no presentaron diferencias en términos del rendimiento de la

extracción de proteínas en raíces, mientras que en tallo los métodos B y C presentaron

rendimientos superiores de extracción (tabla No. 23).

228

Tabla No. 23. Rendimiento para los diferentes métodos de extracción de proteínas totales en tallos y raíces de clavel

Rendimiento

(µg proteína/mg

material vegetal)

Procedimiento A

Extracción y posterior

precipitación

Prodecimiento B

TCA/Acetona

Procedimiento C

TCA/Acetona/Fenol

Raíz 15,3 +/- 2,6 14,5 +/- 2,2 14,0 +/- 1,8

Tallo 18,7 +/- 2,5 27,3 +/- 2,7 24,1 +/- 1,2

Los resultados se presentan como el promedio de tres determinaciones +/- la desviación estándar.

Estos resultados indican que bajo las condiciones evaluadas para el caso de las raíces,

cualquiera de estos puede ser usado con la misma eficiencia para la extracción de

proteínas totales. En el caso del tallo, los procedimientos B y C, eran los más indicados

para obtener la mayor cantidad de proteína por mg de material liofilizado. Estas

diferencias son probablemente debidas a características propias del tejido usado, a nivel

del tallo los métodos que incluyen el tratamiento previo con acetona y ATA (B y C), deben

eliminar en buena proporción las clorofilas presentes que pueden afectar la

determinación posterior de proteínas por métodos colorimétricos (Berges et al. 1993).

Además de esto, no hay que olvidar que el punto más importante que se debe evaluar

durante estos ensayos de selección, es la presencia de contaminantes no proteícos que

afectan la movilidad electroforética de las proteínas. Por esta razón, se evaluó la

separación de las proteínas presentes en los diferentes extractos obtenidos, mediante

electroforesis en 1D. De acuerdo a estos ensayos (figura No. 51), se determinó que los

extractos obtenidos a partir de tallo usando el procedimiento B, presentaban una

extracción de contaminantes que afectaban la calidad de la separación y la resolución de

las bandas de bajo peso molecular con pesos menores de 25 kDa. Este efecto no se

presentó para extractos obtenidos a partir de este mismo órgano mediante los

procedimientos A y C. Considerando que este último (C: ATA/acetona/fenol) también

presentaba un valor alto en la eficiencia de extracción (tabla No. 23), este se posicionaba

como el más conveniente para llevar a cabo la extracción de proteína en este órgano de

la planta.

229

51Figura No. 51. Electroforesis en 1D para los extractos obtenidos mediante los diferentes procedimientos de extracción de proteína evaluados a partir de tallos y raíces de clavel. A) Extracción y posterior precipitación, B) TCA/Acetona, C) TCA/Acetona/Fenol. En la parte inferior se encuentra el número de bandas por carril. Cantidad de

proteína en cada pozo 15 µg.

Para el caso de la raíz, los extractos obtenidos, presentaban algún tipo de

contaminantes, siendo mayores para el caso del procedimiento B, seguidos por el A y el

C. Esto indicaba que así como se había seleccionado en tallos, el procedimiento C

presentaba los mejores resultados en términos de la eliminación de contaminantes que

interfieren con la separación de las proteínas extraídas. Este procedimiento que incluye

la precipitación con TCA/Acetona y posterior tratamiento con fenol, se ha constituido en

el procedimiento usado con más frecuencia en la extracción de proteínas de tejidos

vegetales para estudios proteómicos permitiendo la obtención de una fracción

relativamente libre contaminantes no proteicos que afectan la separación electroforética

(Carpentier et al. 2005).

Estos resultados fueron corroborados usando electroforesis 1D con mayores cantidades

de proteína total (figura No. 52), en donde se encontró que los extractos obtenidos

usando TCA/Acetona/Fenol, presentan una muy buena resolución de separación para el

caso del tallo en todas las concentraciones de proteína evaluadas. Para el caso de la

raíz, el efecto de los contaminantes solo se evidenció en las concentraciones de

proteínas más altas (30-40µg). Los tejidos recalcitrantes que se caracterizan por ser

matrices complejas con presencia de altos niveles de compuestos fenólicos y

polisacáridos (Carpentier et al. 2005; A.M Maldonado et al. 2008), como es el caso de las

raíces del clavel, presentan inconvenientes para su estudio a nivel proteómico. Sin

Marcadores de PM

(KDa)

Tallo Raíz

200 150

100

75

50

37

25 20

15

10

Número de Bandas 42 32 41 41 31 40

A B C A B C

230

embargo, de acuerdo a las condiciones evaluadas, el procedimiento C, presentó buenos

resultados en términos de la separación electroforética a niveles de cantidad de proteína

adecuados.

52Figura No. 52. Electroforesis en 1D para los extractos obtenidos mediante el procedimiento TCA/Acetona/Fenol a partir de tallos y raíces de clavel, con diferentes cantidades de proteína total en cada pozo.

Con el fin de determinar si el procedimiento seleccionado (TCA/Acetona/fenol) permitía

obtener extractos proteicos que durante la separación en 2D tuviesen una buena

separación y por tanto una resolución adecuada, se hicieron ensayos en geles pequeños

usando diferentes cantidades de proteína. Los resultados que se encontraron (figura No.

53), permiten evidenciar que los extractos obtenidos usando tallos, presentan una

separación adecuada en 2D; se observa la presencia de manchas proteicas bien

definidas en los dos niveles de proteína evaluadas (100 y 200 µg). A su vez en raíces, si

bien a altas concentraciones de proteína (200 µg) se observa un efecto “striking” para

algunas de las señales, es evidente la presencia de manchas proteicas bien definidas

sobre todo a pHs ácidos para ambas concentraciones de proteína.

La presencia de contaminantes no proteicos a 200 µg de proteína total permite evidenciar

la importancia que tiene realizar la puesta a punto de condiciones con diferentes

cantidades de proteína. No siempre, la mayor cantidad de proteína permite la obtención

de los mejores resultados; aumentar la cantidad de proteína implica también un aumento

en los contaminantes no proteicos que puede afectar la separación en las dos

dimensiones y generar por tanto la presencia de “striking”.

5 10 20 30 40 μg 5 10 20 30 40 μg

Marcadores de PM

(KDa)

Tallo Raíz

200 150

100

75

50

37

25 20

15

10

231

53Figura No. 53. Electroforesis en 2D para los extractos obtenidos mediante el procedimiento TCA/Acetona/Fenol a partir de tallos y raíces de clavel, con diferentes cantidades de proteína total en cada pozo. A: raíz 100 µg, B: raíz 200 µg, C: tallo 100 µg y D: tallo 200 µg.

Estos experimentos permitieron también realizar una evaluación del rango en el cual se

encuentran los puntos isoeléctricos (pIs) de las proteínas de esta especie vegetal. Se

encontró que éstas se distribuyen principalmente en el rango de pH de 4 a 9. Esto

indicaba que el rango seleccionado para trabajar considerando los IPGs comercialmente

disponibles a la fecha, era de 3 a 10; el uso de un rango diferente como el de 5-8 no

permitiría la separación de proteínas con pIs en los rangos 4-5 y 8-9, en donde se

pueden encontrar, en plantas, proteínas que pueden participar en la interacción con

patógenos. Muchas proteínas PRs presentan pIs que se encuentran en estos rangos de

pH (Van Loon et al. 2006).

Con extractos obtenidos bajo las condiciones seleccionadas, se realizaron ensayos

usando geles grandes en el formato de 20x20 cm, esto con el fin de usar cantidades de

proteína superiores a las que se venían trabajando y detectar proteínas que se

encuentran en bajos niveles. Tal y como se citó previamente, muchas de las proteínas

pH3 pH10 pH3 pH10

100µg 200 µg

200 150

100 75

50

37

25 20 15 10

Marcadores de

PM (KDa)

Raíz

Tallo

pH3 pH10 pH3 pH10

200 150

100 75

50

37

25 20 15

10

232

que son de interés en los estudios proteómicos, se encuentran en bajas proporciones y

se deben realizar ensayos adicionales que permitan realizar su detección. Por ejemplo,

es necesario realizar la selección de condiciones de tinción que permitan obtener el

mayor número de bandas o manchas proteicas, en electroforesis 1D o 2D

respectivamente, de acuerdo a las condiciones particulares de trabajo (B. Chakravarti et

al. 2010; Chiangjong & Thongboonkerd 2009).

En ensayos preliminares se había encontrado que la tinción directa con Coomassie

coloidal presentaba baja sensibilidad y solo se detectaba en promedio de 15 a 20 bandas

en electroforesis en 1D para geles en este formato (Resultados no mostrados). Es bien

conocido que el uso de reactivos como el Sypro Ruby para la detección de proteínas en

gel mediante fluorescencia, tiene una mayor sensibilidad que la encontrada con otros

reactivos como el Coomassie Azul Brillante R250 (CBB-R250) o el CBB-G250; mientras

que la sensibilidad de este último se encuentra en el rango de ng, la del Sypro Ruby

puede llegar a los órdenes de los pg (Chiangjong & Thongboonkerd 2009). Sin embargo,

el uso de este reactivo se encuentra limitado grandemente por el acceso al sistema de

captura de imagen que requiere un sistema especializado y de la pérdida de la

fluorescencia con el tiempo, lo cual genera problemas en el almacenamiento de los

geles.

Bajo dichas limitaciones, en el presente estudio se quiso evaluar un método alternativo

que consiste en la tinción combinada Sypro-Coomassie, este procedimiento tiene una

tinción inicial de alta sensibilidad con Sypro Ruby y una posterior tinción con Coomassie

G-250. Para ello, se usaron geles de separación en 1D (SDS-PAGE) de extractos

obtenidos a partir de raíces de las variedades L.P Candy (R) y Tasman (S), a 0 y a 6 hpi,

y se comparó la sensibilidad en la detección de bandas de la tinción directa con Sypro-

Ruby Biorad ®, con respecto a la combinada con Coomassie Coloidal (figura No. 54).

233

54Figura No. 54. SDS-PAGE para la comparación de los métodos de tinción en extractos obtenidos a partir de raíces de clavel. A: Sypro-Ruby Biorad ® y B: Sypro-Ruby Biorad ®- Coomassie coloidal. Las muestras corresponden a 1: L.P. Candy (R) control 0 horas; 2: Tasman (S) control 0 horas; 3: R control 6 horas; 4: R inoculado 6 horas; 5: S control 6 horas; 6: S inoculado 6 horas. Cantidad de proteína en cada pozo 100 µg.

Se encontró que la sensibilidad que presentaban ambas técnicas era similar y que por

tanto, esta última podría ser usada para la tinción de geles en formato grande (20 x 20

cm), con las ventajas previamente mencionadas de sensibilidad y tiempo de

almacenamiento. De hecho, esta última tinción permite la obtención de geles más limpios

sin los interferentes que se presentan de manera frecuente debido a los sedimentos del

reactivo detectados mediante fluorescencia cuando solo se usa el reactivo Sypro Ruby

Biorad ®. Es importante comentar en este punto, que esta técnica combinada era

compatible con los análisis posteriores de identificación usando MALDI-TOF-TOF y fue

por tanto la tinción usada en experimentos posteriores en donde se compararon los

proteomas de las variedades en estudio durante la inoculación con el patógeno.

Con el fin de obtener la mayor información posible en los estudios comparativos que se

planeaban hacer usando geles en 2D, se evaluaron algunos parámetros que deben ser

tenidos en cuenta para su puesta a punto, tal y como se comentó en la parte

Marcadores de peso (KDa)

Marcadores de peso (KDa) 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6 200 116 97

66

45

31

22

14

6.5

200

11697

66

45

31

22

14

6.5

Número de

bandas 54 56 58 56 56 56

234

experimental. Los resultados correspondientes a la evaluación de cantidad de proteína y

el gradiente separación en la primera dimensión se resumen en la tabla No. 24.

Tabla No. 24. Resumen de los resultados de la puesta a punto de condiciones de análisis para la separación en 2D de proteínas obtenidas de tallos y raíces de clavel

Cantidad de proteína Gradiente primera dimensión

200 µg 400 µg 3-10 lineal 3-10 No lineal

Número

de

manchas

Resolución

Número

de

manchas

Resolución

Número

de

manchas

Resolución

Nùmero

de

manchas

Resolución

Raíz 231 Buena 450 Buena 469 Buena 566 Muy

buena

Tallo 270 Buena 502 Buena 509 Buena 541 Muy

buena

(1) Los valores encontrados de número de manchas son obtenidos mediante el programa PD-

Quest.

(2) La resolución se determinó mediante inspección visual y evaluando el enfoque de una misma

mancha proteica en los diferentes tratamientos evaluados

De acuerdo con estos resultados, se pudo determinar que al usar 400 µg de proteína en

geles grandes, usando para la primera dimensión IPGs con un gradiente lineal de 3 a 10,

se obtenía un número de manchas de proteínas que se encontraba entre 450 y 500 para

raíces y tallos respectivamente. Considerando que con esta cantidad de proteína, no se

presentaba striking en los geles y se obtenía una buena resolución durante la separación

en la primera y segunda dimensión, ésta fue la cantidad de proteína seleccionada para

los ensayos posteriores. Al usar cantidades de proteína superiores era probable que se

presentará stricking, tal y como se presentó en los geles pequeños con cantidades de

proteína de 200 µg (figura No. 53). Además de ello, el uso de una cantidad de proteína

superior requería de una mayor cantidad de material vegetal, lo cual podía afectar la

extracción donde el material liofilizado era limitado.

Con la cantidad de proteína seleccionada (400μg) se realizaron algunos ensayos con el

fin de comparar el tipo de gradiente que se usaría en la primera dimensión de la

separación. Se encontró que el uso de tiras con un gradiente no lineal de 3 a 10,

presentaba una mayor resolución que la encontrada para el gradiente lineal y un

aumento en el número de manchas proteicas resuelto para extractos obtenidos a partir

de ambos órganos de la planta. Esto fue una ventaja ya que permitió obtener mayor

235

información de los geles obtenidos en el momento del análisis de las muestras

provenientes del ensayo in vivo. Una muestra de la mejor separación encontrada para el

análisis de extractos obtenidos a partir de tallos y raíces del clavel, de las dos variedades

objeto de estudio, se presenta en la figura No. 55. De manera preliminar, es importante

anotar que algunas de las manchas proteicas se comparten en geles obtenidos de raíces

y tallos de la planta, sin importar la variedad, indicando que muchos de ellos deben

contener proteínas que participan en procesos conservados en las células vegetales. A

pesar de esto se evidencian también manchas proteicas que son particulares de cada

órgano, las cuales probablemente deben estar asociadas a otros procesos que se llevan

a cabo de manera tejido-dependiente.

L.P Candy (Resistente) Tasman (Susceptible)

Tallo

Raíz

55Figura No. 55. Geles 2D de extractos obtenidos a partir de tallos y raíces de clavel bajo las condiciones de separación seleccionadas (Gradiente 3-10 NL y 400 µg de proteína) con tinción sypro-Coomassie.

pH 3 10 pH 3 10 Marcador

(KDa) Marcador

(KDa) 200

116 97

66

45

31

22

14

6.5

200

116 97

66

45

31

22

14

6.5

Marcador

(KDa) Marcador

(KDa) pH 3 10 pH 3 10

200

116 97

66

45

31

22

14

6.5

200

116 97

66

45

31

22

14

6.5

236

En conclusión, las condiciones de separación (400 µg de proteína y gradiente 3-10 NL)

fueron las que finalmente se usaron para el análisis comparativo de proteínas de los

diferentes tratamientos del ensayo in vivo de inoculación con el patógeno. Dicho estudio

se inició con una comparación mediante 1DE en donde se evaluaron algunas diferencias

preliminares y se seleccionaron los tiempos correspondientes al ensayo in vivo que

fueron posteriormente analizados en geles 2D con el fin de encontrar proteínas

asociadas a los mecanismos bioquímicos de la interacción clavel-Fod.

5.3.2. Análisis comparativo entre tratamientos usando 1-DE

Durante el análisis comparativo entre los diferentes tratamientos del ensayo in vivo, se

determinó que usando las condiciones de separación que fueron previamente descritas

(numeral 5.2.4) y la tinción Sypro-Coomassie seleccionada, el número de bandas que se

obtienen para los diferentes extractos de tallos y raíces de clavel, variaba entre 57 y 60.

En la figura No. 56, se presenta una imagen de los geles obtenidos; para cada órgano de

la planta se tenían tres geles similares, obtenidos en cada caso con una réplica biológica

diferente para cada tratamiento y tiempo evaluado. El uso de mínimo 3 réplicas

biológicas en este tipo de estudios es necesaria para obtener información consistente del

fenómeno biológico en estudio (Valledor & Jorrín 2011).

El análisis comparativo de las bandas presentes en las diferentes muestras se realizó

mediante densitometría de acuerdo a las condiciones citadas previamente (numeral

3.2.4). Se usó para efectos de normalización la banda que presentaba un peso molecular

de 84 kDa y una intensidad similar para todos los tiempos de muestreo en ambos

órganos de la planta. La comparación entre tratamientos de los valores de intensidad

normalizados para las diferentes bandas detectadas, se realizó usando herramientas de

análisis multivariado. En general este tipo de aproximaciones estadísticas son las más

convenientes en el análisis de datos obtenidos mediante experimentos proteómicos,

permitiendo evaluar de manera conjunta los resultados y su relación con los tratamientos

objeto de estudio (Valledor & Jorrín 2011; Valero-Galván et al. 2011)

237

56Figura No. 56. Electroforesis 1D (SDS PAGE) en geles grandes 20x20cm de proteínas extraídas de raíces (A) y tallos (B) de clavel, usando el método TCA/Acetona/fenol. Se usaron 100 µg de proteína para cada pozo.1: T1 0hpi; 2: T3 0 hpi; 3: T1 6hpi; 4: T2 6hpi; 5: T3 6hpi; 6: T4 6 hpi; 7: T1 24hpi; 8: T2 24hpi; 9: T3 24hpi; 10: T4 24 hpi; 11: T1 96hpi; 12: T2 96hpi; 13: T3 96hpi; 14: T4 96 hpi. T1: resistente control, T2 resistente inoculado, T3 susceptible control, T4 susceptible inoculado. Al lado derecho del gel se encuentran señaladas las bandas de interés que serán discutidas en la tabla No. 25 y 28 respectivamente.

Análisis comparativo 1D en raíz

El análisis de los resultados obtenidos en este órgano de la planta, se realizó usando

PCA (figura No. 57) y permitió determinar que para este caso (figura No. 57 A), el primer

componente PC1 explicaba el 44 % de la variación y diferenciaba del resto de

tratamientos, aquellos ubicados en el lado derecho de la gráfica: los controles a cero

horas y los tratamientos de la variedad susceptible a las 6 y 24 hpi. Así mismo, para el

PC2 que explicaba el 32% de la variación, se encontró un comportamiento similar, en

donde se agrupaban en la parte inferior de la gráfica, los tratamientos a tiempo cero (T1-

0hpi y T3-0hpi) y los tratamientos de la variedad resistente inoculada a 6hpi (T1 y T2 hpi).

En general, el análisis de los componentes PC1 y PC2, coincidió en que la variación

encontrada (un 76% del total), se encuentra determinada por diferencias propias en los

perfiles de las variedades y a cambios asociados al tratamiento de inoculación y las

condiciones ambientales del ensayo in vivo. De hecho, este análisis multivariado permitió

agrupar y por tanto diferenciar, los tratamientos correspondientes de la variedad

Marcador

(KDa) Marcador

(KDa) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

200

116 97

66

45

31

22

14

6.5

200

116

97

66

45

31

22

14

6.5

32

39

55

51

238

resistente con respecto a los de la variedad susceptible (figura No. 57 B). Estos

resultados son de esperarse considerando que los cambios en los proteomas son

sensibles a las condiciones ambientales y al genotipo en estudio para diferentes especies

vegetales (Valero-Galván et al. 2011; Kosová et al. 2011).

57Figura No. 57. Análisis estadístico por PCA (A) y agrupamientos jerárquicos “hierarchical clustering” (B) para los resultados obtenidos en 1D a nivel de la raíz durante la infección con el patógeno. T1: resistente control, T2 resistente inoculado, T3 susceptible control, T4 susceptible inoculado

Los grupos encontrados mediante agrupación jerárquica de estos mismos resultados,

generaron información similar a la encontrada mediante PCA, en donde se definen

grupos en función de la variedad vegetal y el tiempo posinoculación (figura No. 57 B). Se

ha determinado por ejemplo, que esta misma herramienta en el estudio de la variabilidad

genética en bellota de encina (Quercus ilex subesp. ballota), permite agrupar y

diferenciar los genotipos de esta especie en función de su procedencia, de acuerdo a las

diferencias encontradas en sus perfiles en 1D (Valero-Galván et al. 2011).

De acuerdo a este análisis estadístico se encontró que la respuesta al patógeno no tenía

un efecto evidente en los perfiles electroforéticos para las variedades estudiadas; ningún

componente diferenciaba controles e inoculados para ninguno de los tiempos evaluados.

Sin embargo, el análisis estadístico comparativo para las diferentes bandas encontradas

(ANOVA) indicó que de las 60 bandas detectadas 13 presentaban diferencias

R

S

R

T1 y 2 6hpi

T1 y 2 96hpi

T1 0hpi

T3 0hpi

T1 y 2 24hpi

T 3 y 4 6hpi

T 3 y 4 24hpi

T 3 y 4 96hpi Susceptible

Resistente

T1 0hpi

T2 6hpi

T1 6hpi

T4 24hpi

T3 24hpi

T3 0hpi

T4 6hpi

T3 6hpi

T4 96hpi

T3 96hpi

T2 96hpi

T1 96hpi

T2 24hpi

T1 24hpi

A B

239

significativas entre al menos dos tratamientos y que entre éstas las bandas 33, 39 y 55,

aumentaban en la variedad resistente inoculada con el patógeno (tabla No. 25).

Tabla No. 25. Resumen de las bandas que presentaron aumento en su intensidad en la variedad resistente por efecto de la inoculación con el patógeno.

Número

de la

Banda

Peso

molecular

(kDa)

Banda y resultados de la densitometría

32 40,5

39 34,1

55 19,9

La intensidad normalizada se expresa como la relación porcentual de la banda de interés con respecto a la

intensidad de la banda control (Intensidad banda de interés/banda control)*100. T1: resistente control, T2

resistente inoculado, T3 susceptible control, T4 susceptible inoculado.

0

100

200

300

400

T1-0hpi T3-0 hpi T1-6 hpi T2-6 hpi T3- 6 hpi T4-6 hpi

Inte

ns

ida

d

no

rma

liza

da

0

20

40

60

80

100

120

140

160


Inte

ns

ida

d

no

rma

liza

da

0

50

100

150

200

250

300

350


Inte

ns

ida

d

no

rma

liza

da

240

El aumento diferencial de la intensidad de estas bandas en la variedad resistente por

efecto de la inoculación, permitió proponer que contenían proteínas que se inducen como

parte de los mecanismos de defensa de la planta. Con el fin de obtener información

sobre dichas proteínas, se realizó el análisis de identificación correspondiente mediante

MALDI-TOF/TOF, de acuerdo a las condiciones previamente descritas en la parte

experimental (Numeral 5.2.7). Considerando que estas bandas contenían probablemente

más de un tipo de proteína, se optó por realizar el correspondiente análisis de la banda

de interés, tanto en el tratamiento inoculado como en su correspondiente control. De esta

manera, al comparar los resultados obtenidos, aquellas proteínas que se encuentran

únicamente en el tratamiento inoculado (diferencias cualitativas), serían consideradas

proteínas candidatas para ser asociadas con los mecanismos de defensa que se activan

a nivel de raíz en la variedad resistente. Los resultados correspondientes a estos

cambios cualitativos, se presentan en la tabla No. 26.

Tabla No. 26 Resumen de las diferencias cualitativas encontradas para las bandas 32, 39 y 55 entre inoculados y controles a 6 hpi a nivel de la raíz

Número de la

banda

Peso molecular calculado por SDS-

PAGE

MASCOT Protein score

MASCOT Protein

score (%) Nombre de la proteína y fuente

PM (KDa)

Número de la accesión

32

40,5 67 99,3 Protein kinasa (Predicted protein) Physcomitrella patens sub. Patens 49

Gi 168005752

40,5 62 97,4 Factor de elongación Tu Nephroselmis olivácea

44 GI 11467799

39

34,1 65 98,8 Similar a Proteina Rica en

Hidroxyprolina Oryza sativa Grupo Japonica

119 GI 55297400

34,1 65 98,8 C2orf4 Extradiol dioxygenasa

Ricinus communis 33,8 GI

255548834

34,1 64 98,7 Ribokinasa (Predicted protein)

Vitus vinífera 78,2 GI

225440578

55

19,9 64 98,6 Estructural en mantenimiento de cromosomas (Predicted Protein)

Micromonas sp. 374

GI 255089032

19,9 61 96,8 Proteína relacionada con

patógenesis PR-10 Cicer arietinum

16,7 GI 499171

19,9 66 96,5 Proteína probablemente

relacionada con transporte vesicular Arabidopsis Thaliana

35,9 GI 21595428

Las proteínas que están marcadas con verde, presentan coincidencia con respecto al peso molecular reportado

para la accesión correspondiente identificada

241

De acuerdo a los resultados obtenidos, en ninguno de los casos se pudo realizar una

identificación 100% certera que permitiera confirmar la participación de dichas proteínas

en los mecanismos de defensa del clavel a nivel de la raíz; la búsqueda del MASCOT

considera significativos los “protein scores” > 71, y además que alguno de los péptidos

haya sido fragmentado, es decir, que se le haya hecho el MS/MS aparte de la huella

peptídica. Esta baja coincidencia se debe muy probablemente al bajo número de

secuencias que a la fecha han sido anotadas y publicadas para el caso del clavel, esto

disminuye la posibilidad de que el motor de búsqueda MASCOT encuentre coincidencias

con los puntajes adecuados. Otra posibilidad puede ser también que la calidad de la

mancha proteica no sea buena para obtener espectros de calidad; una baja

concentración de la proteína de interés puede generar problemas en la digestión y

posterior fragmentación para la identificación de péptidos.

A pesar de este panorama, la búsqueda realizada generó accesiones que además de

tener un “protein score” cercano a 71, presentaban pesos moleculares cercanos al

encontrado experimentalmente. Si bien es cierto que dichas proteínas no pueden ser

consideradas en el análisis final de este estudio, es interesante comentar que estas han

sido involucradas en los mecanismos de defensa que se activan en las plantas ante

diferentes tipos de patógenos. Este es el caso, por ejemplo, de la proteína PR-10 y las

proteínas quinasas, las cuales ha sido involucradas en defensa a patógenos del género

Fusarium (Katilé et al. 2010; Zambounis et al. 2012; Asano et al. 2012). La confirmación

del aumento de estas proteínas por efecto de la inoculación con el patógeno Fod en el

clavel, debe ser objeto de investigación en próximos estudios.

Para el caso de la banda 55 en los experimentos de raíz, es importante comentar que si

bien no se presentaron diferencias cualitativas entre el control y el correspondiente

inoculado con unos puntajes estadísticamente significativos, si se encontró en ambos

tratamientos la presencia de la ciclofilina (tabla No. 27), enzima que se encuentra a nivel

constitutivo y ha sido asociada con la correcta conformación tridimensional de las

proteínas considerando su actividad Peptidil prolil cis-trans isomerasa, la cual le permite

modificar estructuras tridimensionales durante diversos procesos celulares (Sekhar et al.

2010). Se ha determinado por ejemplo que el papel de estas enzimas puede estar

asociado con la mitigación de diferentes tipos de estrés biótico o abiótico, minimizando el

plegamiento de las proteínas por efecto del estrés, promoviendo la disociación de

242

agregados proteícos bajo las mismas condiciones y la correcta conformación de

proteínas relacionadas con patógenesis (PRs Pathogenesis Related) (Dwivedi et al.

2003; A. V Godoy et al. 2000; Fernández et al. 2012). Es probable que los cambios que

se presentan en esta banda (tabla No. 25), se deban a cambios cuantitativos en los

contenidos de esta proteína constitutiva de las raíces del clavel y que aumenta sus

niveles para llevar a cabo la correcta activación de la respuesta de defensa contra el

patógeno.

Tabla No. 27. Identificaciones realizadas para la banda 55 tanto en el inoculado como en el control no inoculado a las 6 hpi

Número de la

banda


PAGE

MASCOT Protein score

MASCOT Protein

score (%)

Nombre de la proteína y fuente

Peso Molecular

(KDa)


55*

19,9 85 99.99 Ciclofilina A-1 de Triticum

aestivum 18,7 gi|13925731

19,9 77 99,93 Ciclofilina 2 de Dasypyrum

villosum 18,6 gi|156193311

19,9 77 99,93 Ciclofilina Gerbera hybrid

cultivar 18,3 gi|157272141

*Esta banda corresponde a la misma descrita en las tablas No. 25 y 26

Dentro de los resultados encontrados era evidente que el mayor cambio en los perfiles de

proteínas en 1D en raíces del clavel, se presentaba a las 6 hpi., por lo que se

seleccionaron dichas muestras para realizar los análisis en 2D, en donde se buscaba

conocer más sobre los cambios a nivel del proteoma en este órgano de la planta por

efecto de la inoculación con el patógeno causal del marchitamiento vascular.

Análisis comparativo en 1D en tallo

Con el fin de conocer los cambios que se presentaron en los perfiles de proteínas en

electroforesis en 1D, durante la inoculación con Fod a nivel del tallo, se realizaron los

análisis densitométricos con fines comparativos de los extractos obtenidos a partir de los

tejidos a 6, 24 y 96 hpi (figura No. 56). Se encontró, de acuerdo al análisis estadístico

multivariado realizado (figura No. 58), que la mayor parte de la variación (PC1 45% y

PC2 30%) estaba determinada por diferencias entre las variedades usadas y los tiempos

posinoculación, tal y como había sido encontrado previamente en raíces de la planta. La

distribución de los diferentes tratamientos en función de las variedades fue similar al

243

encontrado previamente en este otro órgano (figura No. 57 A). De la misma manera, los

agrupamientos jerárquicos encontrados para estos resultados (figura No. 57B), son

dependientes principalmente de la variedad objeto de estudio y del tiempo

posinoculación. Este resultado está de acuerdo con el conocido efecto que tienen las

condiciones ambientales en los proteomas vegetales y que ha sido previamente

discutido.

58Figura No. 58. Análisis estadístico por (A) PCA y (B) agrupamientos para los resultados obtenidos en 1D a nivel

del tallo durante la infección con el patógeno. T1: resistente control, T2 resistente inoculado, T3 susceptible control, T4 susceptible inoculado

Con respecto al análisis estadístico (ANOVA) de la intensidad de las diferentes bandas

encontradas, se encontró que de las 60 detectadas en este órgano de la planta, 17

presentaban diferencias significativas en al menos dos tratamientos comparados y dentro

de éstas, se detectó un aumento significativo en la banda No. 51 en la variedad

resistente (L.P Candy) inoculada a las 24 hpi. Esta banda que no fue detectada en el

correspondiente control a este tiempo posinoculación, presentó un aumento en sus

niveles en la misma variedad resistente a las 96 hpi en controles e inoculados (tabla No.

28)

S

R

S

R

T1 y 2 6hpi

T1 y 2 96hpi

T1 0hpi

T3 0hpi

T1 y 2 24hpi T 3 y 4 6hpi

T 3 y 4 24hpi

T 3 y 4 96hpi

Susceptible

Resistente

T4 24hpi

T3 24hpi

T3 0hpi

T4 6hpi

T3 6hpi

T1 0hpi

T2 6hpi

T1 6hpi

T2 24hpi

T1 24hpi

T4 96hpi

T3 96hpi

T2 96hpi

T1 96hpi

244

Tabla No. 28. Banda que presentó cambios asociados con resistencia en la variedad L.P Candy a nivel del tallo

Número

de la

Banda

Peso

molecular

(kDa)

Banda y resultados de la densitometría

51 17,5

Esta banda fue picada e identificada mediante MALDI-TOF-TOF y se determinó que

corresponde a una ciclofilina (tabla No. 29), proteína que había también sido asociada

previamente a los mecanismos de defensa que se activan en raíces de clavel (tabla No.

27). Este resultado era evidencia que un aumento en los niveles de esta proteína estaba

asociado a la resistencia al marchitamiento vascular a las 24 hpi, siendo un mecanismo

conservado para ambos órganos de la planta. El aumento encontrado en el control a 96

hpi indica que esta proteína también está asociada con la adaptación a las condiciones

ambientales en este tiempo, fenómeno que ha sido también descrito en otras especies

vegetales para mitigar los efectos asociados al estrés abiótico (Kambakam 2010).

Tabla No. 29 Identificaciones realizadas para la banda 51 en tallos de la variedad resistente L.P. Candy a las 24hpi con Fod

Número de la

banda


PAGE

Protein score

Protein score

(%)

Nombre de la proteína y fuente

Peso Molecular

(KDa)


51

17,8 106 100 Ciclofilina putativa Ricinus communis 18,3 gi|255538956

17,8 105 100 Ciclofilina

Gerbera hybrid cultivar 18,3 gi|157272141

0

100

200

300

400

500

T1-0hpi

T3-0hpi

T1-6hpi

T2-6hpi

T3- 6hpi

T4-6hpi

T1-24hpi

T2-24hpi

T3- 24hpi

T4-24hpi

T1-96hpi

T2-96hpi

T3- 96hpi

T4-96hpi

Inte

nsid

ad

no

rmalizad

a

245

El mayor cambio en los perfiles de proteínas en 1D en tallos de clavel, se presenta a las

24 hpi por lo que este tiempo fue el seleccionado para realizar los análisis en 2D en

donde se buscaba conocer más sobre los cambios a nivel del proteoma, en este órgano

de la planta por efecto de la inoculación con el patógeno.

En general, los resultados obtenidos en el análisis comparativo por electroforesis en 1D

en tallos y raíces de la planta, permitieron realizar un acercamiento a aquellas proteínas

que durante la infección con Fod aumentan sus niveles en la variedad L.P. Candy y están

por tanto probablemente involucradas en los mecanismos asociadas a la resistencia a la

enfermedad. Sin embargo, la resolución limitada de este tipo de análisis no permite

evaluar cambios en algunas proteínas que se encuentran en bajas proporciones en los

extractos y genera la necesidad del uso de una técnica de mayor resolución como la

electroforesis 2D.

5.3.3. Análisis comparativo entre tratamientos usando electroforesis en 2D

Análisis en raíz usando 2D

Durante este estudio de proteómica comparativa mediante electroforesis 2D realizado en

raíces de clavel, es importante recordar que la selección del tiempo de análisis (6 hpi) se

realizó teniendo en cuenta la fase inmediatamente anterior y lo obtenido en trabajos

previos realizados en este modelo(Ardila & Higuera 2005; Cuervo et al. 2009; Ardila et al.

2011). Si bien es cierto que estudios llevados a cabo para otros modelos que involucran

patógenos del género Fusarium, han citado que los cambios a nivel de proteoma en

estos tiempos tempranos, son de menor intensidad y por tanto de mayor dificultad de

análisis si se comparan con los encontrados en fases posteriores de la interacción

(Palomares-Rius et al. 2011), el objetivo de este estudio era determinar precisamente

aquellos pequeños cambios tempranos que se presentan durante las primeras fases de

la interacción y que están asociados a la resistencia a patógenos vasculares (Beckman

2000).

246

En la figura No. 59 A se presenta el gel master, el cual incluye todas las manchas de

proteínas que fueron detectadas en todos los tratamientos evaluados (T1 0hpi, T3 0hpi,

T1 6hpi, T2 6hpi, T3 6hpi y T4 6hpi) usando el programa PD-Quest Biorad ® y dos

muestras de geles obtenidos con extractos de la variedad resistente a las 6 hpi control T1

6hpi (B) e inoculado T2 6hpi (C).

59Figura No. 59. Gel master definido por el programa PD-Quest para la comparación en raíz (A) y muestra de geles para los tratamientos T1 6hpi (B) y T2 6hpi (C). La separación se realizó según las condiciones descritas (numeral

5.2.5) usando 400 µg de proteína en cada caso.

Se encontró que el número de manchas proteicas consistentes en los tratamientos

evaluados (que se encontraban en las tres réplicas), varió de manera importante como

efecto del proceso de inoculación en las dos variedades estudiadas (tabla No. 30). Era

evidente de acuerdo a los resultados encontrados, que los cambios que se presentaron

entre dichos tratamientos fueron principalmente de tipo cualitativo (aparición de nuevas

manchas de proteínas) entre el control correspondiente a tiempo cero y los tratamientos

control e inoculado a las 6 hpi. Estos cambios muestran la sensibilidad que tiene el

proteoma del clavel al proceso de inoculación y siembra, el cual incluye cambios en

temperatura, humedad y condiciones de siembra.

Marcador

(KDa)

pH 3 10 pH 3 10 pH 3 10

200

116 97

66

45

31

22

14

6.5

C B A

247

Tabla No. 30 Resumen de la variación en el número de manchas electroforéticas para los diferentes tratamientos para el análisis comparativo en 2D a nivel de la raíz

Tratamientos

Número

de

manchas

de

proteínas

Manchas

consistentes

Cambios

cualitativos

“aparición”

Cambios

cualitativos

“desaparición”

Cambios

cuantitativos

aumento

Cambios

cuantitativos

disminución

T1 0hpi 469+/- 50 405 - - - -

T3 0hpi 566 +/- 3 537 - - - -

T1 6hpi 886+/- 23 798 470* 28* 1* 1*

T2 6hpi 831 +/- 5 788 437* 58* 1* 0*

T3 6hpi 732 +/- 5 689 262* 89* 3* 2*

T4 6hpi 763 +/- 20 689 297* 91* 4* 1*

Análisis realizado comparando el número de machas proteicas para cada tratamiento contra lo

encontrado en el control para cada variedad a 0 hpi. T1: resistente control, T2 resistente inoculado, T3

susceptible control, T4 susceptible inoculado

El análisis correspondiente de PCA (figura No. 60 A), confirmó el efecto que tuvo el

proceso de inoculación, al comparar los tratamientos a 6 hpi con el control a tiempo cero

para ambas variedades; mientras que el componente PC1 (41% de la variación) permitía

diferenciar los tratamientos de la variedad resistente a las 6hpi, el PC2 (32% de la

variación) hacia la misma diferenciación para el caso de la variedad susceptible. Estos

resultados indicaban que los cambios presentes en la aparición de manchas proteicas

por el proceso de inoculación, eran respuestas dependientes de la variedad en estudio.

Esto nos muestra que los cambios en el proteoma por efecto de condiciones de estrés

abiótico en el clavel, dependen del genotipo vegetal en estudio, tal y como ha sido

sugerido para otras especies vegetales (Kosová et al. 2011; X.-J. Liu et al. 2013).

Este análisis multivariado también permitió agrupar los tratamientos resistentes y

susceptibles en zonas diferentes en el diagrama de variación (PC1 vs PC2) indicando

que una parte de la variación está determinada por diferencias propias entre variedades.

Dichas diferencias en términos de la distribución de manchas proteicas, eran de

esperarse considerando la dependencia que tienen en función del genotipo vegetal

(Valero-Galván et al. 2011). En general, los resultados obtenidos por PCA fueron

corroborados usando herramientas de agrupamiento jerárquico, considerando que bajo

esta herramienta estadística, los diferentes tratamientos se agruparon de la manera muy

248

similar, primero en función del tiempo posinoculación y luego en función de la variedad

(figura No. 60 B).

60Figura No. 60. Análisis estadístico por (A) PCA y (B) agrupamientos para los resultados obtenidos en 2D a nivel de la raíz durante la infección con el patógeno. T1: resistente control, T2 resistente inoculado, T3 susceptible control, T4 susceptible inoculado

El análisis estadístico para los resultados obtenidos para todas las manchas

electroforéticas detectadas se realizó mediante ANOVA, teniendo en cuenta las

recomendaciones hechas para otros estudios cuando se trabaja con datos proteómicos

(Valledor & Jorrín 2011). El uso de ANOVA convencional tiene sus desventajas, ya que

cuando se trabaja con un nivel de significancia del 95% se presume un posible error del

5%, es decir que de 100 análisis de varianza es probable que se presenten 5 falsos

positivos, durante la negación de la hipótesis nula planteada. Cuando se trabajan con

1000 manchas de proteínas en un estudio proteómico, el error se puede cometer en 50

de estas; un número importante que exige el uso de herramientas estadísticas alternas.

Por esta razón se usan estadísticos como el FDR “False Discovery Rate” que permiten

controlar la proporción de las hipótesis nulas incorrectamente rechazadas permitiendo a

su vez evaluar de manera simultánea, múltiples hipótesis evitando hacer múltiples

comparaciones (Valledor & Jorrín 2011). Para esta investigación se pudo determinar que

de las 1108 manchas electroforéticas encontradas en el gel master, (este incluye todas

aquellas manchas que se encontraron en los diferentes tratamientos propuestos), 793

presentaban diferencias significativas en al menos dos de los tratamientos evaluados

(FDR<0,05). Dentro de estas manchas de proteína significativamente diferentes, se

S

R

T 2 6hpi

T1 0hpi

T3 0hpi T1 6hpi

T4 6hpi

Susceptible

Resistente

T3 6hpi

T3 0hpi

T1 0hpi

T4 6hpi

T3 6hpi

T2 6hpi

T1 0hpi

B A

249

incluían aquellas que variaban en función de la variedad, por efecto del proceso de

inoculación y por respuesta a la infección con el patógeno. La evaluación realizada

mostró una alta proporción de manchas de proteína variables, lo cual está de acuerdo

con el importante número de cambios a nivel cualitativo que se encontraron al comparar

los tratamientos a 6 hpi con respecto a los controles de cada variedad a 0 hpi (tabla No.

30).

No hay que olvidar que en el presente estudio eran de particular interés solamente

aquellas diferencias asociadas con resistencia a la enfermedad, es decir aquellas que

diferenciaban las dos variedades en estudio, ya sea a nivel constitutivo o durante su

respuesta a la infección con el patógeno. Por esta razón se compararon los tratamientos

inoculados y controles correspondientes usando un análisis dos a dos “parwise

comparation”, el cual permite comparar de manera específica dos de los tratamientos

objeto de estudio y encontrar aquellas manchas proteicas que determinan las diferencias

entre los mismos con un FDR<0,05. De esta manera se identificaron y seleccionaron

aquellas señales que presentaban diferencias significativas y eran por tanto interesantes,

desde el punto de vista de la interacción de la planta con el patógeno; las que varían

estadísticamente (aumento o disminución) en la variedad resistente inoculada (T2), con

respecto al control no inoculado (T1) a 6 hpi y aquellas que eran superiores a nivel

constitutivo (0hpi) en la variedad resistente (T1) con respecto a la susceptible (T3).

Estas manchas proteícas fueron comparadas en los demás tratamientos evaluados, para

posteriormente seleccionar aquellas que presentaban un patrón asociado con resistencia

y ser finalmente clasificadas en 3 grupos. Para el caso de las que presentaban

diferencias constitutivas (Grupo 1), se seleccionaron aquellas en donde dichas

diferencias se mantenían también a las 6 hpi en los tratamientos de la variedad resistente

y para el caso de las diferencias inducibles, en donde las diferencias encontradas en

términos de aumento (Grupo 2) o disminución (Grupo 3), no se presentaban o eran

menores en la variedad susceptible a este mismo tiempo. Esta selección disminuyó de

manera importante el número total de manchas que eran de interés en los diferentes

grupos (figuras No. 61, 62 y 63). En estas figuras se presenta también, la información

obtenida de los resultados de la densitometría obtenidas para las manchas proteicas

mediante el programa P.Quest Biorad ®.

250

61Figura No. 61. Gel máster con las manchas proteicas asociadas a diferencias a nivel constitutivo entre las variedades de clavel L.P. Candy (R) y Tasman (S) en raíces (Grupo I). Dentro del gel se señala el correspondiente número de identificación para cada una de las manchas de proteínas señaladas. Se presentan para cada uno de ellas, los resultados correspondientes a la densitometría, en gráficas de los promedios de tres replicas biológicas para cada tratamiento, de acuerdo al programa PD-Quest.

Intensidad

máxima

obtenida

ID mancha

proteica

Variedad Susceptible control 0hpi

Variedad Resistente control 0hpi

Variedad Resistente control 6hpi

Variedad Resistente inoculado 6hpi

Variedad Susceptible control 6hpi

Variedad Susceptible inoculado 6hpi

251

62Figura No. 62. Gel máster con las manchas proteicas que aumentaron en la variedad resistente inoculada a las 6hpi con el patógeno en raíces (Grupo 2). Dentro del gel se señala el correspondiente número de identificación para cada una de las manchas de proteínas señaladas. Se presenta para cada uno de ellas, los resultados correspondientes a la densitometría, en gráficas de los promedios de tres replicas biológicas para cada tratamiento, de acuerdo al programa PDquest. La correspondiente codificación de colores se encuentra descrita en la figura No. 61.

Considerando que las bandas de estos tres grupos, eran de interés particular para el

estudio de la interacción clavel-Fod, se realizó la identificación mediante análisis de

MALDI-TOF-TOF. Los resultados correspondientes se presentan en la tabla No. 32,

resumiendo algunas de las propiedades de aquellas manchas proteicas identificadas.

252

63Figura No. 63. Gel máster con las manchas proteicas que disminuyeron su intensidad en la variedad resistente inoculada a las 6 hpi con el patógeno en raíces (Grupo 3). Dentro del gel se señala el correspondiente número de identificación para cada una de las manchas de proteínas señaladas. Se presenta para cada uno de ellas, los resultados correspondientes a la densitometría, en gráficas de los promedios de tres replicas biológicas para cada tratamiento, de acuerdo al programa PD-Quest. La correspondiente codificación de colores se encuentra descrita en la figura No. 61.

La correspondiente discusión sobre la función biológica de las proteínas identificadas y

su posible papel a nivel de la raíz en la interacción clavel-Fod, se presenta en próximos

apartes de este estudio. A continuación se detallan los resultados y su discusión

obtenidos en la comparación realizada a nivel del tallo.

253

Análisis en tallo usando 2D

Durante el análisis proteómico realizado a nivel del tallo se compararon los controles a

cero horas posinoculación, con respecto a los tratamientos controles e inoculados a 24

hpi, bajo las mismas condiciones previamente descritas en raíz. Este tiempo

posinoculación fue seleccionado teniendo en cuenta los resultados del análisis en 1D en

donde se determinó, se presentaban los mayores cambios en términos de los perfiles de

proteínas. El gel máster obtenido para este análisis se presenta en la figura No. 64, en

conjunto con geles representativos al control e inoculado a las 24 hpi para la variedad

resistente L.P Candy.

64Figura No. 64. Gel máster definido por el programa PD-Quest para la comparación en raíz (A) y muestra de geles para los tratamientos T1 6hpi (B) y T2 6hpi (C). La separación se realizó usando las condiciones descritas (numeral

5.2.5) usando 400 µg de proteína en cada caso.

Al respecto se encontró usando el programa PD-Quest, que la variación del número de

manchas proteicas para los tratamientos a las 24 hpi (control e inoculado) con respecto al

control a cero horas en tallo, está determinado principalmente por cambios cualitativos de

manera similar a lo encontrado en raíz previamente. Por ejemplo, de las 597 y 656

manchas encontradas en los tratamientos para la variedad resistente control e inoculado

a 24 hpi respectivamente, entre 150 y 190 corresponden a nuevas señales que no se

encuentran en el control a 0 hpi. Sin embargo, la variación encontrada en este órgano es

mucho menor que la encontrada en raíces en donde los cambios cualitativos se

encuentran entre 430 y 470 (tabla No. 31). Esto es de esperarse considerando que sobre

este último órgano se realizó el proceso de inoculación y es donde se espera un mayor

efecto por el estrés que implica la inmersión durante el proceso de inoculación. En

general, los cambios por el tratamiento de inoculación implementado y la puesta de los

Marcador

(KDa) pH 3 10 pH 3 10 pH 3 10

200

116 97

66

45

31

22

14

6.5

A B C

254

esquejes en las condiciones del ensayo in vivo, tiene un efecto importante sobre el

proteóma de ambos órganos de la planta, tal y como ha sido propuesto para otras

especies vegetales (Kosová et al. 2011).

Tabla No. 31. Resumen de la variación en el número de manchas electroforéticas para los diferentes tratamientos encontrados para el análisis comparativo en 2D a nivel del tallo

Tratamientos

Número

de

manchas

de

proteínas

Manchas

consistentes

Cambios

cualitativos

“aparición”

Cambios

cualitativos

“desaparición”

Cambios

cuantitativos

aumento

Cambios

cuantitativos

disminución

T1 0hpi 541+/- 18 519 - - - -

T3 0hpi 574 +/- 6 458 - - - -

T1 24hpi 684+/- 11 656 187* 25* 7* 2*

T2 24hpi 624 +/- 3 597 149* 53* 2* 4*

T3 24hpi 618+/- 9 577 118* 67* 4* 3*

T4 24hpi 602 +/- 8 578 108* 79* 3* 9*

Análisis realizado comparando el número de manchas proteicas para cada tratamiento contra lo

encontrado en el control para cada variedad a 0 hpi. T1: resistente control, T2 resistente inoculado, T3

susceptible control, T4 susceptible inoculado

Mediante inspección visual se encontró que la distribución de las diferentes manchas de

proteína fue similar para la mayoría de los geles obtenidos de una misma variedad

(controles e inoculados) en cada tiempo de evaluación. Esto efectivamente se comprobó

estadísticamente de acuerdo a los resultados obtenidos en el análisis por PCA de los

datos obtenidos por densitometría, en donde se presenta una agrupación bastante

definida entre los tratamientos de una misma variedad a cada tiempo posinoculación

(figura No. 65 A). Se determinó que el componente PC1 que explica el 46% de la

variación, está determinado por diferencias propias entre variedades; los tratamientos

correspondientes a la variedad resistente se agrupan al lado derecho de la gráfica,

mientras que los susceptibles lo hacen al izquierdo, se manera similar a lo encontrado

previamente en las raíces de la planta (figura No. 60).

Así mismo, el efecto que tiene el tiempo posinoculación se evidencia en el componente

PC2 (33% de la variación), en donde los tratamientos a 0 hpi se encuentran en la parte

inferior de la gráfica, mientras que en la parte superior lo hacen los de 24 hpi. Estos

resultados están de acuerdo con el efecto previamente documentado sobre los cambios

en el proteoma debido a cambios en las condiciones ambientales (Kosová et al. 2011; X.-

255

J. Liu et al. 2013). Por otro lado, el análisis por agrupamiento jerárquico coincidió en

estos resultados y permitió generar grupos asociados a las dos variedades usadas y a

los tiempos posinoculación objeto de estudio (figura No. 65 B).

65Figura No. 65. Análisis estadístico por (A) PCA y (B) agrupamiento para los resultados obtenidos en 2D a nivel de la raíz durante la infección con el patógeno.

En general, es evidente que las herramientas estadísticas de análisis multivariado y

agrupamiento, coinciden en determinar que los cambios más importantes de los

resultados se presentan debido a las condiciones previamente mencionadas y que el

efecto que tiene la respuesta al patógeno es estadísticamente menor. A pesar de ello,

considerando que el objetivo del presente estudio era encontrar diferencias asociadas

con la resistencia a la enfermedad, se realizaron comparaciones pareadas “parwise

comparation” entre los tratamientos controles e inoculados en el caso de la variedad

resistente a las 24 hpi. Se encontraron de esta manera, manchas proteicas que

aumentaban o disminuían significativamente en el tratamiento inoculado y eran por tanto,

de interés para este estudio (FDR<0,05).

La posterior comparación de éstas con los demás tratamientos, permitió seleccionar

aquellas manchas proteicas que presentan un comportamiento que puede estar asociado

con la resistencia de la planta. Se encontraron 10 manchas proteicas con un aumento

diferencial en la variedad resistente inoculada (figura No. 66 y grupo 4), mientras que se

T 2 6hpi

T1 0hpi

T3 0hpi

T1 6hpi

T4 6hpi

Susceptible Resistente

T3 6hpi

T2 24 hpi

T1 24hpi

T3 0hpi

T1 0hpi

T4 24hpi

T3 24hpi

R

S

B A

256

encontraron solo 4 manchas proteicas en donde una disminución de su intensidad estaba

asociada con la resistencia de la planta (figura No. 67 y grupo 5)

66Figura No. 66. Gel máster con las manchas proteicas que aumentaron en la variedad resistente inoculada a las

6hpi en tallo (Grupo 4). Dentro del gel se indica el correspondiente número de identificación para cada una de las manchas de proteínas seleccionadas. Se presenta para cada uno de ellas, los resultados correspondientes a la densitometría, en gráficas que presentan los promedios de tres replicas biológicas para cada tratamiento, de acuerdo al programa PD-Quest. La correspondiente codificación de colores se encuentra descrita en la figura No. 61.

Se realizó la comparación pareada “pairwise comparation” entre la variedad resistente

(T1 0hpi) y la susceptible (T3 0hpi) a nivel constitutivo, con el fin de encontrar posibles

diferencias que estuviesen asociadas con mecanismos de defensa pasiva en este órgano

de la planta y se determinó que existían 36 manchas proteicas que presentaban una

intensidad superior en la variedad resistente. Sin embargo, dichas diferencias en ninguno

de los casos se mantenían a las 24 hpi; estas manchas proteicas no se encontraban para

la variedad resistente a este tiempo posinoculación o presentaban un aumento en alguno

de los tratamientos de la variedad susceptible. Se esperaba encontrar aquellas proteínas

257

constitutivas asociadas a la resistencia a la enfermedad, también a tiempos tempranos

de la interacción en donde se llevan a cabo los fenómenos de activación de las

respuestas de defensa de la planta. Estos resultados indicaban por tanto, que con las

condiciones de separación y detección trabajadas, no se encontraban entidades

proteicas asociadas con resistencia a la enfermedad en este órgano de la planta a nivel

constitutivo.

67Figura No. 67. Gel máster con las manchas proteicas que disminuyeron en la variedad resistente inoculada a las 6hpi en tallo (Grupo 5). Dentro del gel se indica el correspondiente número de identificación para cada una de las manchas de proteínas seleccionadas. Se presenta para cada uno de ellas, los resultados correspondientes a la densitometría, en gráficas que presentan los promedios de tres replicas biológicas para cada tratamiento, de acuerdo al programa PD-Quest. La correspondiente codificación de colores se encuentra descrita en la figura No. 61.

258

5.3.4. Resultados de la identificación de proteínas por MALDI-TOF/TOF

El paso final de esta secuencia de experimentos fue el correspondiente análisis de

identificación usando técnicas basadas en espectrometría de masas, tal y como se

describió previamente en el numeral 3.2.7. Es importante comentar que aunque el

análisis de identificación se realizó para todas las manchas proteicas de interés (Grupos

del 1 al 5), la identificación solo fue certera en algunas de ellas; la mayor parte de los

resultados generó identificaciones con scores no significativos debido a bajas

coincidencias en las bases de datos o a mala calidad en los espectros de masas

obtenidos. Esto último se puede presentar en ciertos casos, cuando la mancha proteica

de interés a pesar de ser detectada con los método de tinción, se encuentra a bajos

niveles y la cantidad de proteína que se requiere para los análisis de identificación, no se

alcanza a obtener del gel en el momento en que se pica con el sistema de estación

investigator ProPic (Genomic Solutions).

Por otro lado, es probable que los resultados de la búsqueda que realiza el motor de

búsqueda MASCOT esté limitada solamente a aquellas proteínas altamente

conservadas, cuando se trabaja con especies en donde el número de secuencias

anotadas es baja como es el caso del clavel. Para esta especie vegetal, apenas se está

generando información en masa sobre secuencias expresadas en diferentes órganos

(Tanase et al. 2012). En general estos factores hicieron que la identificación obtenida en

esta investigación sea baja y solamente se haya realizado la identificación de 14 de un

total de 48 análisis realizados de las muestras obtenidas de geles en 2D. A pesar de ello

se obtienen la identificación para algunos miembros de los grupos de interés en este

estudio, a excepción del grupo 5 (disminución en tallo en la variedad resistente

inoculada) en donde no se realizó ninguna identificación (tabla No. 32). La

correspondiente discusión sobre la función biológica de las proteínas identificadas y su

posible papel en la interacción clavel-Fod, a nivel del órgano que fueron encontrados, se

presenta en el siguiente aparte de este estudio 5.3.5.

Tabla No. 32. Datos identificación por MALDI-TOF-TOF de las proteínas presentes en las manchas proteicas de los grupos de interés

Datos experimentales Resultados de la identificación

Grupo ID PM PI Mascot Score

ProteinScore/ péptidos

coincidentes (% cobertura)/ secuencia péptidos por MS-MS (ion

score)

Nombre de la proteína y fuente Función biológica

PM PI Número de la accesión

1

5524 77,8 6,9 153 100/9 (15)/LLNDEFYIGLR (110) Putative Malic enzyme [Ricinus

communis]

Metabolismo de

carbohidratos 65,4 5,9 255546341

7216 41,8 8,2 120 100/3 (13)/ QCPGIVSCADILAFAAR

(109)

Predicted peroxidase [Physcomitrella patens subsp.

patens]

Respuesta a estrés

oxidativo 35,9 4,98 168019891

2412 60 5,9 71 99,7/13 (34) Predicted Resistance plant protein

(The NB-ARC domain) [Oryza sativa] Respuesta de

defensa 48,7 8,4 218185531

2

3208 44,1 6,1 147 100/8 (29)/ VPEGFDYELYNR (47),

GYPFSLR (30)

Alpha-1,4-glucan-protein synthase [UDP-forming]

[Ricinus communis]

Biosíntesis de pared cellular

41,5 5,82 255547137

5315 56,6 6,8 101 100/4 (13)/ SFTSEFPHVER (27), VPVLETPDGPVFESNAIAR (67)

Glutathione S-transferase Translation Elongation Factor EF1 [Medicago

truncatula]

Biosíntesis de proteínas

47,8 6,4 92893885

4507 72,6 6,4 78 99,9/8 (15)/

GIIEPISSSFINLVNADFTAK (51) Phosphoglycerate dehydrogenase hypothetical protein [Vitis vinifera]

Biosíntesis de aminoácidos

66,7 8,4 225443272

6737 97,2 7,2 114 100/8 (15)/ YGAGIGPGVYDIHSPR

(53), YLFAGVVDGR (34)

Cobalamine-independent methonine synthase

[Arabidopsis thaliana]

Biosíntesis de aminoácidos

84,6 6,0 47600741

5427 61,8 6,7 236 100/19 (27)/ VKFTAEELR (33),

VIYASQLTAKPR (29), NATLTNEKEVDAHPIR (76)

Eukaryotic translation elongation factor, putative EF2 [Ricinus

communis]

Biosíntesis de proteínas

95,0 5,7 255544686

260

3

1306 51,5 5 195 100/9 (29) / IGTPEALDLR (34),

VTSVASFFVSR (43), YEAVIDAYLDGLEASGLSDLSR (68)

Transaldolase [Solanum lycopersicum]

Metabolismo de

carbohidtratos “Ruta pentosas

fosfato “

48,0 5,6 32481059

4310 49,3 6,6 184 100/7(24)/ AYLFPEGTAR (44),

LPGFHVCVGSGGER (107) Monodehydroascorbate reductase

[Acanthus ebracteatus] Regulación

redox celular 46,6 5,3 117067068

5527 76 7 75 99.86/8 (18)/ YQGVVIPEAYER (45) Glucose-6-phosphate dehydrogenase

[Nicotiana tabacum]

Metabolismo de

carbohidtratos “Ruta pentosas

fosfato “

58,8 6,3 3021508

4

5427 50,8 6,4 117 100/7 (23)/ TIFHLNPSGR (33),

FVIGGPHGDAGLTGR (28) Adenosylmethionine synthase 1

[Solanum tuberosum] Metabolismo de un carbon

43,7 5,5 122211500

2737 80 4,3 168 100/12 (23)/ TTPSYVAFTDSER (28),

NAVVTVPAYFNDSQR (25), IINEPTAAAIAYGLDKK (60)

Heat shock protein [Spinacia oleracea]

Respuestas a estres

71,0 5,2 425194

6716 90,5 7,1 279

100/7 (11)/ WAVHSFR (30), YLFAGVVDGR (68),

AGINVIQIDEAALR (78), YGAGIGPGVYDIHSPR (71)

Cobalamin-independent methionine synthase isozyme

[Mesembryanthemum crystallinum]

Biosíntesis de aminoacidos

85,0 5,9 8134568

Las proteínas identificadas se clasificaron en las diferentes funciones biológicas de acuerdo a los términos generados en la búsqueda

en Gene Ontology. Los grupos correspondientes se encuentran clasificados de acuerdo a su comportamiento descrito anteriormente:

diferencias a nivel constitutivo en raíces (grupo 1), cambios en este mismo órgano a nivel inducible (aumento grupo 2) ó disminución

(grupo 3) y aumento asociado a la resistencia en tallo (Grupo 4). Se presentan primero los resultados obtenidos a nivel experimental y

luego los obtenidos durante la identificación correspondiente (Mascot score >71)

5.3.5. Análisis de los resultados de identificación

Las proteínas que fueron identificadas para los cuatro grupos de interés en este estudio

(tabla No. 32), fueron clasificadas de acuerdo a la terminología del Gene ontology, a

diferentes procesos biológicos como lo son: metabolismo de carbohidratos (3),

biosíntesis de aminoácidos (3), biosíntesis de proteínas (2), biosíntesis de pared celular

(1), respuesta a estrés oxidativo (1), respuestas de defensa (1), respuesta a estrés (1),

metabolismo de 1C (1) y regulación redox celular (1). La discusión correspondiente del

papel de estas proteínas se presentará para cada órgano y grupo de manera

independiente, con el fin de asociarlas con los diferentes mecanismos que actúan en la

variedad L.P Candy, resistente al patógeno causal del marchitamiento vascular.

Con respecto a los resultados encontrado a nivel de la raíz, se determinó que entre las

proteínas que se encuentran a nivel constitutivo y están posiblemente asociadas a la

resistencia (Grupo 1) se encuentran la enzima málica o NAD(P) malato deshidrogenasa

(ID 5524). Se ha determinado que la enzima NAD malato deshidrogenasa (E.C 1.1.1.39)

tiene un papel central en el metabolismo de carbohidratos a nivel mitocondrial ya que

permite la descarboxilación de malato para generar piruvato, el cual es finalmente

oxidado en el ciclo de Krebs (Jenner et al. 2001). Así mismo se ha encontrado que la

enzima NADP malato deshidrogenasa (E.C 1.1.1.40), se encuentra principalmente

asociada a diferentes procesos fisiológicos que ocurren a nivel del citoplasma y en

plastidos, como la generación de poder reductor NADPH para diversos procesos como la

biosíntesis de lípidos y metabolitos secundarios (Wheeler et al. 2005). La identificación

correspondiente de esta proteína en raíces de clavel de la variedad resistente, coincidió

de manera particular con una accesión correspondiente a esta última familia de enzimas

(GI 255546341), indicando que la identificada en clavel es probablemente una isoforma

NADP malato deshidrogenasa. Es interesante que esta última familia de proteínas haya

sido asociada a procesos de defensa en otras especies vegetales y se ha determinado

que participa en la generación de poder reductor y ácido pirúvico para la biosíntesis de

fenilalanina y flavonoides (Casati et al. 1999). Este resultado coincide con lo encontrado

previamente en el capítulo I de este estudio en donde se determinó que las variedades

resistentes de clavel presentan una biosíntesis más activa de flavonoides en este órgano

de la planta a nivel constitutivo. Es probable que altos niveles de las enzimas

biosintéticas como las CHS y CHI (Ardila, S. T. Martinez, et al. 2013) y de precursores

262

como la fenilalanina, estén asociados a una mayor biosíntesis de flavonoides y a la

resistencia al patógeno. Este resultado muestra nuevamente la importancia que a nivel

constitutivo tiene la biosíntesis de metabolitos secundarios para la generación de

fitoanticipinas a nivel de la raíz en este modelo.

Otra de las proteínas que fue encontrada a nivel constitutivo en la variedad resistente L.P

Candy, es una peroxidasa de clase III (ID 7216), la cual puede estar asociada a la

regulación de especies altamente oxidantes que se generan durante diversos procesos

fisiológicos de la planta, como puede ser la respuesta a patógenos (Almagro et al. 2009).

Sin embargo, este resultado no es consistente con lo encontrado previamente (Capitulo

4) en donde a nivel de la raíz, no se encontró asociación entre los niveles de la actividad

guayacol peroxidasa constitutiva y la resistencia a la enfermedad (Fig 39). Es probable

que la proteína que se encontró mediante herramientas proteómicas no se encuentre

activa y requiera procesos adicionales que le permitan realizar su activación; se ha

determinado que durante la biosíntesis de estas enzimas se requiere de diversos pasos

como la unión a cofactores y posterior localización para realizar sus funciones en la

planta (Huystee 1987). Así mismo, sí esta enzima se encuentra activa, otra posibilidad es

que no haya sido detectada en la fase anterior de esta investigación debido a una baja

afinidad por el guayacol usado como sustrato. La presencia de isoenzimas con afinidad a

sustratos diferentes a este compuesto, como pueden ser algunos flavonoides, es un

hecho que ha sido documentado en otras especies vegetales (Ferreres et al. 2011). En

general estos resultados muestran la necesidad de profundizar sobre los mecanismos

que involucran a las peroxidasas en este órgano de la planta.

Dentro de las diferencias que se encuentran asociadas con la resistencia a la

enfermedad a nivel constitutivo se encontró la presencia de una proteína (ID 2412) que

presenta un dominio del tipo NB-ARC, el cual es altamente conservado en proteínas de

diferentes organismos como el APAF-1 (Apoptotic protease activating factor 1), proteínas

R en plantas y CED-4 (Caenorhabditis elegans death-4 protein) (van der Biezen and

Jones 1998). Este dominio está definido por la presencia de un sitio de actividad kinasa

asociado a la unión de nucleótidos (NB Nucletotide Binding) ATP/GTP o dATP/dGTP,

además de otros dominios más cortos de función no determinada (Ellis & D. A. Jones

2003). Estas características estructurales propias de este tipo de proteínas se

263

constituyen como una de los dominios regulatorios de muchas de las proteínas de

resistencia en plantas (Gerben Van Ooijen et al. 2008). De acuerdo a estas evidencias,

esta proteína encontrada de manera constitutiva en raíces de la variedad resistente L.P

Candy, se constituiría en el primer reporte de una proteína candidata de resistencia en

clavel. Es probable que esta proteína haga parte del sistema de reconocimiento de Fod

por parte del hospedero y permita la activación de respuestas de defensa de la planta a

este nivel. Diferentes proteínas que presentan esta característica estructural, han sido

previamente identificadas en otras plantas como proteínas de resistencia a patógenos del

género Fusarium (Berrocal-Lobo & Molina 2008; Palomares-Rius et al. 2011).

Sin embargo, es necesario realizar otros estudios que permitan confirmar esta evidencia

experimental ya que de acuerdo al análisis bioinformático realizado sobre la proteína

hipotética de arroz (Oryza sativa) con la cual se realizó esta identificación (GI

218185531) no se encuentran otras características estructurales propias de las proteínas

R como lo son la presencia de dominios ricos en leucina LRR (Leucine-Rich Repeats). Es

por ello necesario profundizar sobre la secuencia completa de la proteína ID2412 para

conocer si presenta otros dominios característico de las proteínas de resistencia y

confirmar su papel como proteína que participa en los mecanismos de reconocimiento y

señalización durante la activación de la respuesta de defensa del clavel.

Con respecto a la respuesta diferencial que se presentó por parte de la variedad L.P

Candy a la inoculación con el patógeno (Grupo 2), se pudo determinar que dentro de la

respuesta a las 6 hpi se presenta un aumento en los niveles de la proteína ID 3208, que

corresponde a una α-1,4- glucano-proteína sintasa (E.C. 2.4.1.113), glicosiltransferasa

asociada a la biosíntesis de componentes hemicelulósicos de la pared celular (Dhugga et

al. 1991). El aumento encontrado en los niveles de esta proteína por efecto de la

inoculación del patógeno, demuestra que dentro de las respuestas de defensa a estos

tiempos tempranos se encuentra un aumento en las enzimas asociadas con la biosíntesis

de pared celular. Estos resultados están de acuerdo con lo encontrado en estudios

previos realizados en raíces clavel, en donde usando microcopia electrónica, se

determinaron cambios a nivel de la ultra estructura celular debidos a la inoculación con el

patógeno (Higuera, 2001). Así mismo, coincide con lo encontrado en otros estudios en

donde se ha descrito un aumento en los niveles de esta enzima, como respuesta al

264

tratamiento con fracciones elicitoras de levadura en células en suspensión de Mendicago

truncatula (Gokulakannan & Niehaus 2010) o en la inoculación con Trichoderma

harzianum en raíces de maíz (Shoresh & Harman 2008).

Dentro de las identificaciones realizadas para otros integrantes del grupo 2, se encontró

que la infección con el patógeno generó un aumento en las proteínas (ID5315 y 5427) las

cuales corresponden a los factores de traducción en eucariotas (eEFB1 y eEF2),

componentes básicos de la maquinaria de traducción en la biosíntesis de proteínas. El

aumento encontrado en los niveles de estos factores, es evidencia de la activación en la

traducción durante la generación de novo de cadenas polipeptídicas durante la respuesta

temprana de la variedad resistente L.P Candy. Así mismo, el aumento encontrado para

las proteínas (ID 4507 y 6737) que corresponden a las enzimas fosfoglicerato

deshidrogenasa (E.C. 1.1.1.95) y a metionina sintetasa independiente de cobalamina

(E.C. 2.1.1.14), está también asociado con la biosíntesis de proteínas considerando su

papel en la biosíntesis de los aminoácidos serina y metionina, respectivamente (Ho et al.

1999; Jean-Luc Ferrer et al. 2004). Para la proteína metionina sintasa, diversos estudios

proteómicos la han asociado con la adaptación a condiciones de estrés considerando

que la metionina es el precursor para la S-adenosil metionina (SAM), compuesto

considerado el principal precursor para procesos entre los que se destaca la biosíntesis

de fitoalexinas, precursores de lignificación y etileno (Roeder et al. 2009), esta última,

molécula señal que ha sido involucrada en la activación de diferentes respuestas a estrés

incluyendo la infección con patógenos a nivel de la raíz (Okubara & Paulitz 2005). En

general estos resultados indican que una activación temprana de la maquinaria celular

asociada a la biosíntesis de proteínas, aminoácidos y moléculas señal debe estar

asociada con el correcto reconocimiento del patógeno y posterior activación de los

mecanismos de defensa a nivel de la raíz del clavel durante su interacción con Fod.

Dentro de las proteínas clasificadas en el grupo 3, las cuales corresponden a aquellas

que disminuyeron en la variedad resistente por efecto de la inoculación con el patógeno,

se encuentran las enzimas transaldolasa ID 1306 (E.C 2.2.1.2) y glucosa 6-fosfato

deshidrogenasa ID 5527 (E.C. 1.1.1.49). Estas proteínas participan en la ruta de las

pentosas fosfato, encargada de suministrar pentosas y NADPH para diversos procesos

celulares. Es probable que la disminución en los niveles de estas enzimas a las 6 hpi

265

este asociado a la inactivación de esta ruta metabólica con el fin de dirigir el flujo de la

glucosa 6-fosfato citoplasmática, a la glicólisis y posteriormente al ciclo de Krebs para

favorecer la generación de energía, la cual se requiere para los diversos procesos

metabólicos que se activan como parte de la respuesta de defensa en estos tiempos

tempranos. Es probable que los niveles de estas enzimas, aumenten posteriormente con

el fin de activar nuevamente esta ruta y generar aquellos precursores que se requieren

para la biosíntesis de metabolitos de tipo fenólico (por ejemplo, ácido shikimico) y el

NADPH necesario para la generación de peróxido de hidrógeno como parte de la

respuesta de defensa por las RBOHs, tal y como ha sido encontrado a tiempos más

tardíos 24-96 hpi en otros modelos (F.-X. Wang et al. 2011; Xianping Fang et al. 2012).

Otra de las proteínas que disminuyó en raíces de la variedad resistente por efecto de la

inoculación con el patógeno corresponde a la monodehidroascorbato reductasa ID 4310

(E.C 1.6.5.4), oxidoreductasa que participa en el ciclo glutatión-ascorbato, el cual se

constituye en el mecanismo antioxidante de mayor importancia a nivel citosólico para las

células vegetales. Es importante comentar que la disminución en los niveles de esta

proteína encontrada a las 6 hpi, está probablemente asociada a una inactivación de esta

ruta antioxidante en las primeras horas posinoculación con el fin de mantener unos

niveles de peróxido de hidrógeno a nivel citosólico altos, para que de esta manera, se

presente la correspondiente activación de las respuestas de defensa vegetal. Estos

resultados están de acuerdo con lo encontrado en términos de las actividades

enzimáticas APX y GPX en este mismo órgano de la planta en donde se determinó, que

la inoculación con el patógeno, no afectan sus niveles de actividad y por tanto tampoco

los ciclos antioxidantes en los cuales participan.

Finalmente, entre las proteínas pertenecientes al grupo 4, que corresponden a aquellas

que presentaron un aumento en sus niveles a nivel del tallo a las 24 hpi para la variedad

resistente inoculada, se destacan las proteínas metionin sintasa independiente de

cobalamina ID 6716 (E.C. 2.1.1.14) y la adenosil metionina sintasa ID 5427 (E.C 2.5.1.6).

Esta última enzima participa en el metabolismo de un carbono y está involucrada en la

transmetilación de diferentes moléculas del metabolismo secundario. Estas dos enzimas

participan en la ruta biosintética para la generación de S-adenosil metionina (SAM), la

cual como se citó anteriormente, es un precursor para la biosíntesis de moléculas como

266

la hormona etileno (K. L. Wang et al. 2002; Roeder et al. 2009). Este resultado evidencia

la importancia que tiene para la planta a nivel de este órgano, la generación de esta

hormona, frecuentemente implicada en la activación de la resistencia a patógenos

necrotróficos (Mengiste 2012). Estudios asociados a la activación de esta ruta

biosintética han sido realizados en otros modelos planta patógeno usando acercamientos

proteómicos y transcriptómicos permitiendo proponer un papel para esta ruta en la

defensa vegetal (D.-M. Li et al. 2009; Palomares-Rius et al. 2011; Rodrigues et al. 2012)

El aumento encontrado para una proteína de choque térmico HSP70 (ID 2737) en tallos

de la variedad resistente inoculada, permite proponer que ésta se encuentra también

involucrada en los mecanismos de defensa que se activan en este órgano de la planta.

Las heat shock proteins (HSP) son un conjunto de proteínas altamente conservadas que

actúan como chaperonas protegiendo a la célula vegetal del efecto que pueden presentar

diferentes condiciones de estrés (Efeoğlu 2009). Se ha determinado por ejemplo, que la

inoculación con patógenos también tiene un efecto sobre los niveles de esta proteína

para diferentes patógenos (Byth et al. 2001; Rodrigues et al. 2012; Xianping Fang et al.

2012). Se ha propuesto que el papel de esta proteína en la respuesta de defensa vegetal,

está asociada al mantenimiento de las conformaciones adecuadas a las proteínas de

defensa que se sintetizan en la primera etapa de la interacción (Xianping Fang et al.

2012). Es probable que así como fue encontrado en los análisis en 1D iniciales para este

mismo órgano de la planta, el aumento detectado a las 24 hpi en los niveles de

ciclofilinas, el correcto plegamiento durante la síntesis de las proteínas que se generan

de novo por efecto de la infección es un factor importante que debe controlar la planta

para generar una respuesta efectiva contra el patógeno.

En general el estudio proteómico de los cambios a nivel de las proteínas que se

presentan a tiempos tempranos de la interacción con el patógeno en el clavel, permitió

ampliar el panorama actual sobre el conocimiento que se tiene de los mismos. Si bien es

cierto que considerando los resultados obtenidos en apartes anteriores de esta

investigación (Capítulos 2, 3 y 4), se esperaba encontrar proteínas asociadas con la

biosíntesis de flavonoides y algunas peroxidasas en esta aproximación proteómica, estas

no se encontraron bajo las condiciones experimentales de separación y detección

usadas en el presente estudio. Es probable que dichas condiciones no sean favorables

267

para el análisis en 2D de estas proteínas; una baja resolución en la separación de las

mismas puede enmascarar posibles cambios en sus niveles. No se puede descartar que

correspondan a algunas de aquellas manchas proteicas que presentaron cambios, pero

que no fueron identificadas. A pesar de ello, mediante ésta aproximación proteómica se

han identificado otras proteínas (ID 5524 y 4310) asociadas a procesos que están de

alguna manera relacionados con la biosíntesis de flavonoides y la regulación de especies

altamente oxidantes. Una discusión sobre estos mecanismos se presentará en el próximo

capítulo de esta investigación en donde se contrastarán todos los resultados obtenidos a

lo largo del estudio y permitirán plantear aquellos fenómenos que pueden ser claves en la

interacción entre el clavel y el agente causal del marchitamiento vascular.

5.4. Conclusiones

Las condiciones seleccionadas para análisis proteómicos en tallos y raíces de clavel

incluyen una extracción total de proteína mediante el método TCA/Acetona/fenol y para

los análisis en electroforesis en 2D, el uso de 400 µg de proteína en un gradiente de pH

no lineal de 3 a 10 para la separación en la primera dimensión y una posterior detección

usando el método de tinción combinado Sypro-Comassie.

En el análisis diferencial por 1-DE de extractos obtenidos a partir de tallos y raíces de

clavel durante la inoculación con el patógeno, se presentó la separación de

aproximadamente 60 bandas, de las cuales 13 presentaron diferencias significativas en

al menos dos tratamientos. El análisis estadístico correspondiente permitió determinar

que la variación encontrada está asociada principalmente a diferencias entre variedades

y al tiempo de muestreo.

La comparación entre controles e inoculados en los perfiles electroforéticos en 1D

permitió encontrar 3 bandas en raíces (32, 39 y 55) y 1 en tallo (51), que presentan

variaciones significativas en sus intensidades asociadas a respuestas de defensa. La

identificación realizada de éstas bandas permitió determinar que la banda No. 55 en

raíces y la 51 en tallo corresponden a la proteína ciclofilina, asociada al mantenimiento

de la estructura terciaria de proteínas.

268

El análisis comparativo usando 2-DE de extractos de plantas infectadas con el patógeno,

permitió resolver para raíces, 1108 manchas proteicas consistentes y 813 para tallo, de

las cuales 793 y 388 presentaron respectivamente, algún tipo de variación estadística en

al menos dos de los tratamientos evaluados.

Como parte de las proteínas que presentan niveles constitutivos superiores a nivel de la

raíz en la variedad resistente L.P. Candy (Grupo 1), se identificaron la enzima málica,

NADP malato deshidrogenasa (E.C 1.1.1.40), involucrada en el metabolismo de

carbohidratos y una proteína que presenta un dominio NB-ARC altamente conservado en

proteínas de resistencia en plantas.

Dentro de las proteínas que aumentaron de manera diferencial en raíces de la variedad

resistente a las 6 hpi con el patógeno (Grupo 2), se encuentran algunas asociadas con la

biosíntesis de moléculas importantes en la respuesta de defensa como: 1) componentes

de la pared celular (α-1,4-glucan-proteína sintasa E.C. 2.4.1.113), 2) de aminoácidos

(fosfoglicerato deshidrogenasa E.C. 1.1.1.95 y metionina sintasa E.C. 2.1.1.14) y 3) de

proteínas (factores de elongación eF1 Y eF2).

Como parte de las proteínas que en raíces de la variedad resistente L.P Candy,

disminuyen sus niveles por efecto de la inoculación (Grupo 3), se encontraron algunas

que participan en el ciclo de las pentosa fosfato (transaldolasa E.C 2.2.1.2 y glucosa 6-

fosfato deshidrogenasa E.C. 1.1.1.49) y con mecanismos de actividad antioxidante

(monodehidroascorbato reductasa E.C 1.6.5.4)

Se identificaron como proteínas que aumentan a nivel del tallo por efecto de la

inoculación en la variedad resistente (Grupo 4), a proteínas asociadas a la biosíntesis de

la hormona de etileno (metionin sintasa independiente de cobalamina E.C. 2.1.1.14 y la

adenosil metionina sintasa E.C 2.5.1.6) y la proteína de choque térmico (HSP70).

Se determinó mediante herramientas proteómicas que como parte de la respuesta de

defensa que se presenta en la variedad resistente al patógeno Fod se destaca un

aumento en proteínas que participan en la biosíntesis de proteínas, de componentes de

pared celular, aminoácidos y hormonas de señalización.

269

6. Discusión final

El presente estudio profundizó sobre algunos mecanismos que a nivel bioquímico y

molecular, están relacionados con respuestas de resistencia del clavel (Dianthus

caryophyllus L) al patógeno causal del marchitamiento vascular Fusarium oxysporum f.

sp. dianthi raza 2.

Para ello, se estudió desde diferentes aproximaciones experimentales, si la biosíntesis de

flavonoides y la actividad antioxidante, estaban asociadas a dicha expresión de

resistencia. La comparación que se realizó en la primera fase de esta investigación y

que buscó conocer si los compuestos fenólicos presentes de manera constitutiva estan

asociados a los mecanismos de defensa pasiva de la planta, se centró principalmente en

los compuestos flavonoides y permitió determinar que efectivamente estos metabolitos

en raíz están asociados con la resistencia de las variedades a la enfermedad (Capítulo

2). Las diferencias estadísticas encontradas tanto en el contenido de metabolitos,

actividades enzimáticas y niveles de mRNA, relacionadas con su síntesis en este órgano

de la planta y los análisis estadísticos multivariados, indicaron que la ruta de biosíntesis

de flavonoides, se encuentra más activa en raíces de variedades resistentes al comparar

con las susceptibles.

Se han planteado algunas inquietudes sobre el papel que en resistencia, cumplen los

flavonoides presentes en las raíces de las plantas; en algunas especies vegetales la

presencia de estos en exudados a nivel de la raíz, se han asociado con la estimulación

de la germinación de estructuras fúngicas y por tanto con susceptibilidad. (Steinkellner et

al. 2007). De acuerdo con la presente investigación, en el clavel altos niveles

constitutivos de estos metabolitos en las raíces, están asociados con resistencia al

marchitamiento vascular. Es probable que su presencia en este órgano, primer punto de

270

contacto natural entre la planta y el patógeno, retrase en alguna medida la entrada de

éste a los tejidos vasculares, más si se consideran las propiedades antifúngicas que han

sido previamente descritas para flavonoides aislados de este órgano de la planta (Curir et

al. 2001; Curir et al. 2005).

Estos resultados muestran relación con la evidencia encontrada a nivel proteómico

(Capítulo 5), en donde se determinó que al comparar con la variedad susceptible, la

variedad L.P Candy (R) en raíces presenta mayores niveles constitutivos de la enzima

málica (E.C 1.1.1.39), la cual participa en el metabolismo de carbohidratos para generar

ácido pirúvico y NADPH, a partir de ácido málico. Considerando que la generación de

poder reductor NADPH, es necesario para la acción de enzimas de la biosíntesis de

flavonoides (Casati et al. 1999), estos resultados muestran que las rutas del metabolismo

secundario asociadas con la resistencia a la enfermedad, requieren de la expresión de

diversos tipos de proteínas, lo que está de acuerdo con la naturaleza multigénica de la

resistencia a este patógeno.

Dentro de los resultados interesantes encontrados en la investigación de parámetros a

nivel constitutivo, se destaca la presencia de una proteína en raíces de la variedad

resistente, con un dominio conservado en proteínas de resistencia (NBS-ARC). Este se

constituye en el primer reporte de una proteína candidata de resistencia en clavel y

genera por tanto, la necesidad de próximos estudios que permitan profundizar sobre su

secuencia completa y función biológica. Es muy probable que ésta sea una de las varias

proteínas que pueden estar asociadas con reconocimiento, lo que debe confirmarse con

estudios adicionales, que permitan avanzar, con el apoyo de las evidencias acá

acumuladas, en la identificación de marcadores asociados con la resistencia a la

enfermedad.

La presente investigación también hizo un importante aporte sobre el conocimiento de

algunos componentes de la defensa activa de la planta. Entre ellos, se destaca el

hallazgo de que inoculación con el patógeno Fusarium oxysporum f. sp. dianthi raza 2,

genera un aumento en la biosíntesis de flavonoides en las variedades resistentes

(Capítulo 3). Se evidenció, además, que no existe generación de nuevos metabolitos de

tipo flavonoide en tallos y raíces durante la infección con el patógeno, sino cambios en

los niveles totales de metabolitos preexistentes.

271

Se había planteado en estudios previos, que la naturaleza química de los metabolitos

que se acumulan como parte de la respuesta de defensa en el clavel, dependía en gran

medida del órgano de la planta involucrado (Higuera 2001). Con los hallazgos del

presente estudio se propone que la acumulación de flavonoides es un mecanismo de

defensa común en ambos órganos de la planta (raíz y tallo), tal y como había sido

planteado previamente por Curir et al (2005). Es probable que las diferencias en los

perfiles de estos metabolitos encontradas entre tallos y raíces (Capitulo 3), estén

asociadas a diferencias en algunas enzimas que participan en la diversificación

estructural de estos compuestos. Esto se propone con base en los resultados obtenidos

de la aproximación estructural usando HPLC-MS, en donde se encontró que la variedad

resistente L.P Candy acumula probablemente en tallo el compuesto Kaemferol 3-O-β-D –

glucopiranosil (1→2)-O--L-ramnopiranosil-(1→6)- β-D–glucopiranosido, mientras que

en raíz lo hace su correspondiente derivado 3´metilado. Se presume por tanto, que la

acción de O-metil transferasas en este órgano estaría asociada con la diversificación

estructural de este tipo de compuestos.

Existe discusión si el papel de los flavonoides en defensa vegetal se limita solamente a

su actividad antifúngica o si también están asociados a otros procesos como la

regulación de los niveles de especies oxidantes (Agati 2012). En el caso del clavel, ya

sea a nivel constitutivo (Capitulo 2) o a nivel inducible (Capitulo 3), se encontró que los

niveles de estos metabolitos están también correlacionados positivamente con la

actividad antioxidante. Se ha encontrado que altos niveles constitutivos de actividad

antioxidante conseguidos no solo por el aumento en los niveles de flavonoides, sino

también de otros compuestos como los carotenoides (Boba et al. 2011), presentan

correlación positiva con la resistencia a la enfermedad. Esto permite plantear que la

actividad antioxidante es importante para la resistencia a este patógeno,

independientemente del tipo de moléculas involucradas en su generación. De acuerdo al

presente estudio, los flavonoides en el clavel pueden ser potenciales generadores de la

actividad antioxidante que se requiere para regular la acción adversa de aquellas

especies altamente oxidantes que se presentan a nivel subcelular durante la señalización

de la respuesta, además de su conocido papel inhibitorio sobre el crecimiento del

patógeno (Curir et al. 2001; Curir et al. 2005).

272

Las evidencias acumuladas permiten proponer además que un aumento en los niveles de

flavonoides durante la infección con el patógeno, está ocasionada en gran medida por el

aumento en los niveles de actividad y de transcripción para algunas de las enzimas

involucradas en su biosíntesis, como es el caso de las enzimas CHS y CHI en raíces y

CHS en tallos (Capítulo 3). Es importante anotar que esto no parece ser una regla a

todos los tiempos posinoculación y que es muy probable la acción de otros mecanismos

de regulación diferentes al transcripcional en el clavel. Este es el caso de las enzimas

PAL (96hpi) y CHS (6 hpi) en raíces de la planta donde el aumento de la actividad

enzimática y la posterior acumulación de metabolitos, estaría determinada por otros

mecanismos de regulación que, probablemente, se activan por efecto de la inoculación

con el patógeno. En general, la complejidad de la respuesta bioquímica asociada a la

biosíntesis de estos metabolitos durante la interacción, parece ser alta y requerir la

biosíntesis de novo de diferentes proteínas. Esto está de acuerdo con los resultados

observados a nivel proteómico en los que, a nivel de las raíces de variedad resistente, se

encontró a las 6 hpi un aumento importante en proteínas que están involucradas en

procesos, como la traducción (Factores de elongación eEFB1 y eEF2) y la biosíntesis de

aminoácidos como metionina y serina (Capitulo 5).

Es probable, teniendo en cuenta la evidencia acumulada, que el aumento en la

biosíntesis de flavonoides esté asociado a su regulación espacio-temporal durante la

activación de la respuesta basal de la planta, la cual se caracteriza por ser

multicomponente, altamente coordinada que se puede activar como parte del

reconocimiento de patrones moleculares conservados en microorganismos (Kröner et al.

2012). Esto estaría de acuerdo con la resistencia multigénica que ha sido descrita para

esta raza de patógeno (Baayen et al. 1991) y con lo encontrado en otros modelos

(Lorenc-Kukuła et al. 2007; Morkunas et al. 2011; R. S. Sekhon et al. 2006; Arfaoui et al.

2007; A. Dihazi et al. 2011); un aumento en la biosíntesis de estos metabolitos se

presenta al parecer, como parte de una respuesta común a patógenos del género

Fusarium.

En esta investigación se logró tambien tener evidencias significativas del papel del

peróxido de hidrógeno y de algunos mecanismos de regulación enzimática antioxidante,

en el modelo clavel-Fod (Capítulo 4). De acuerdo con los resultados obtenidos, es

probable que al menos en los tiempos tempranos después de la inoculación, la

273

acumulación de H2O2 en el clavel, esté de alguna manera asociada a procesos de

señalización. Esto considerando que el aumento encontrado en sus niveles, se pudo

relacionar con la activación de otras respuestas de defensa en las plantas resistentes,

como lo fue el aumento general de la biosíntesis de flavonoides a nivel de la raíz y de los

niveles de mRNA para la peroxidasa Dcprx02 en tallo. Cabe resaltar que no hay

consenso en el papel que cumplen las EROs en las interacciones con patógenos del

género Fusarium, considerando que en algunos casos se ha propuesto que facilitan la

colonización de estos patógenos necrotróficos y que en otros, pueden participar en la

activación de los mecanismos de defensa de la planta (Berrocal-Lobo & Molina 2008).

A pesar del aumento en los niveles de peróxido de hidrógeno observado en la variedad

susceptible, no se evidenció una activación de las respuestas de defensa estudiadas.

Esto se puede explicar teniendo en cuenta la probable presencia de efectores por parte

del patógeno Fod, que pueden interferir con la activación de las respuestas de defensa,

después de que se lleva a cabo su reconocimiento por parte de la planta susceptible. La

presencia de efectores en patógenos del género Fusarium ha sido descrita y se ha

encontrado que puede afectar de manera importante la respuesta de señalización de

defensa en genotipos susceptibles (Houterman et al. 2008; Houterman et al. 2009). Por

ejemplo, en el caso de Fusarium oxysporum f. sp. licopersici, el efector Avr2 además de

aumentar la incidencia en genotipos susceptibles de tomate (Lycopersicum esculentum),

se ha encontrado que sus blancos pueden estar a nivel citoplasmático en donde se

presenta la transducción de la señal para la activación de genes asociados a la defensa

vegetal (Houterman et al. 2009).

Para el caso de las variedades resistentes, estos mismos efectores pueden ser factores

de avirulencia, que al ser reconocidos por la maquinaria propia del genotipo resistente,

finalmente desencadenan respuestas de defensa asociadas, tal y como ha sido

propuesto para este tipo de patógenos (Houterman et al. 2008; Houterman et al. 2009).

Es probable que dentro de los mecanismos relacionados con el reconocimiento de estas

moléculas efectoras en la variedad resistente a nivel de la raíz, se encuentre la candidata

a proteína de resistencia que presenta dominios NB-ARC detectada en este órgano

mediante la aproximación proteómica utilizada en la presente investigación.

274

Es importante mencionar que los niveles del peróxido de hidrógeno que se requieren

inicialmente para la señalización de respuestas de defensa, pueden posteriormente

afectar el correcto funcionamiento celular y favorecer la acción de patógenos

necrotróficos (Heller & Tudzynski 2011). Según los resultados obtenidos en el modelo

clavel-Fod, al menos en los tiempos más tempranos de la interacción (0-96 hpi), a nivel

de la raíz los mecanismos antioxidantes enzimáticos evaluados en este estudio (APX y

GPX), parecen mantenerse constantes, con el fin de permitir que esta especie reactiva

de oxígeno, actúe como molécula señal en la activación de la respuesta de defensa

vegetal (Capítulo 4). Esto coincide también con los resultados a nivel proteómico que

mostraron que en este órgano de la planta, se presenta una disminución por efecto de la

inoculación con el patógeno, en los niveles de la proteína monodehidroascorbato

reductasa, enzima que participa en el ciclo glutatión-ascorbato que regula a nivel

citoplasmático los niveles de H2O2.

En tallo por el contrario, es probable que la acción de la enzima GPX, tenga un efecto

regulatorio de los niveles de peróxido de hidrógeno a los tiempos tempranos evaluados.

Esta enzima aumentó sus niveles de manera significativa en la variedad resistente

inoculada mientras que no se presentaron cambios en la variedad susceptible. Esto está

de acuerdo con lo encontrado en otros modelos, como es el caso de la interacción

tomate - Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici, en la que la infección genera un aumento

en la actividad GPX a partir de las 24 hpi, que ha sido atribuido a la capacidad de regular

los niveles de peróxido que se acumulan a partir de este mismo tiempo (Mandal, et al.

2008). Otro ejemplo lo constituye la interacción Lycopersicon spp. y Oidium

neolycopersici en donde se ha propuesto que la actividad Guayacol-peroxidasa no

asociada a la pared celular, juega un papel muy importante en la regulación de los

niveles de peróxido de hidrógeno en la planta (Tománková, K. et al 2006).

El consumo de esta especie oxidante por parte de las enzimas GPX, estaría asociada

con resistencia a la enfermedad considerando, además, que la reacción que dicha

enzima cataliza, conduce a la generación de productos de oxidación con notable

actividad antifúngica, los cuales pueden tener un potencial efecto sobre Fusarium

oxysporum f. sp. dianthi (Mayorga & Higuera 2007). Estos productos pueden unirse a

paredes celulares con el fin de fortalecerlas y hacerlas más resistentes al ataque inicial

275

de las enzimas pécticas que el patógeno Fod secreta en presencia de pared celular de

clavel (Gomez & S. Martinez 2005).

Con las evidencias encontradas, se puede proponer que el aumento en los niveles de

peróxido de hidrógeno que se presentó en tallos de la variedad resistente, genera un

aumento en los niveles de mRNA para el gen Dcprx02, que al ser finalmente traducidos a

proteína, pueden participar en la regulación de los niveles de peróxido de hidrógeno y

generar una respuesta de defensa en contra del patógeno (Capítulo 4). La no correlación

con la inducción de la actividad APX y la posible ubicación de la proteína Dcprx02 a nivel

del apoplasto, muestra que es probable que la regulación de dichas especies altamente

oxidantes se presente principalmente en este órgano de la planta, a nivel extracelular y

que la regulación a nivel citoplasmático, mediada principalmente por las APX, no se

active a dichos tiempos para generar respuestas de defensa como puede ser la

activación transcripcional de la enzima CHS (figura No. 37). Es recomendable realizar

estudios adicionales a nivel funcional que permitan confirmar el papel de la enzima GPX

en tallos de clavel durante la interacción con el patógeno. La evaluación de estos

procesos en mutantes de clavel afectados en la producción de peroxidasas, se plantea

como una herramienta para confirmar la participación de la peroxidasa en estos procesos

tal y como se ha realizado en otras especies vegetales (Bindschedler et al. 2006;

Schweizer 2008).

La aproximación proteómica, realizada por primera vez en el estudio de esta interacción

planta-patógeno (Capítulo 5), permitió evidenciar la activación de algunos procesos

asociados con la resistencia en ambos órganos de la planta, los cuales en parte, han sido

descritos y analizados a lo largo de esta discusión final. Se encontró además, que dentro

de los procesos que pueden ser también importantes a nivel de la raíz durante la

interacción con el patógeno, se encuentra un aumento en la biosíntesis de polímeros

estructurales que se acumulan al nivel de las paredes celulares para fortalecerlas y

darles mayor resistencia al ataque de las enzimas secretadas por el patógeno. Es

probable que el aumento encontrado en la proteína α-1,4- glucano-proteina sintasa (E.C.

2.4.1.113) a las 6hpi en raíces, inicie un proceso de fortalecimiento temprano que se

presentará fenotípicamente a tiempos más tardíos, así como fue encontrado para este

276

órgano usando herramientas como microscopia electrónica (Higuera & Ebrahim-Nesbat

1999).

Los resultados encontrados en tallos de la variedad resistente usando esta misma

aproximación (Capítulo 5), permiten proponer que la activación de la expresión de la

respuesta de defensa involucra la biosíntesis de etileno. Esta hormona central en la

expresión de diferentes mecanismos de defensa de las plantas, ya sea por su papel

directo como activador de factores de transcripción de respuesta a etileno (ERFs de su

nombre en inglés Ethylene Response Factors) o por su interacción con otras hormonas

como el ácido jasmónico o el ácido salicílico (Broekaert et al. 2006), podría acumularse a

nivel de este órgano y cumplir algún papel en la señalización de la respuesta de defensa

en la planta. Esta evidencia es de importancia si se tiene en cuenta que a la fecha, no se

conocía ninguna hormona componente de las vías de señalización que están

involucradas en la activación de las respuestas de defensa en esta planta durante su

interacción con Fod.

Dentro de los resultados que se presentaron particular interés en el estudio proteómico

(Capítulo 5), también se encuentra que la expresión de resistencia implica la acumulación

de proteínas que participan en la correcta conformación tridimensional de las proteínas.

Este fue el caso del aumento en los niveles de ciclofilinas en raíces (6 hpi) y tallos (24

hpi), y de una proteína de choque térmico en tallos de la planta (HSP 70) (24 hpi). Este

proceso al parecer puede jugar un papel central en condiciones de estrés en donde se

pueden presentar cambios a nivel conformacional de proteínas y se requiere de

mecanismos que les permitan mantener su estructura tridimensional y por tanto su

funcionalidad. Así mismo, durante la biosíntesis de proteínas, se requiere de este tipo de

procesos que permitan generar las conformaciones adecuadas de las proteínas de

defensa que se sintetizan en estos tiempos tempranos de la interacción.

Considerando la evidencia acumulada a lo largo de este estudio sobre los componentes

de defensa consititutiva (capítulo 2) y las respuestas inducibles de la planta (Capítulos 3-

5), se presenta un resumen de aquellos mecanismos bioquimicos y moleculares que

están asociados con resistencia al marchitamiento vascular (Figura No. 68 y 69). Es

probable considerando estudios en otras plantas, que procesos como el aumento en la

biosíntesis de compuestos flavonoides y de los niveles de peróxido de hidrógeno, se

277

presenten como parte de la respuesta activa asociada a la inmunidad basal conocida

como MTI en raíces (figura No. 68) y tallos de la planta (figura No. 69).

68 Fig. 68. Resumen de algunos de los mecanismos de defensa propuestos en células de raíces de clavel durante la interacción con Fod. Se presentan mecanismos asociados a defensa constitutiva (1), como una mayor biosíntesis de flavonoides mediada por altos niveles de mRNA y actividad de la enzimas chalcona sintasa (CHS), chalcona isomerasa (CHI) (capítulo 2) y la enzima malato deshidrogenasa (ID 5524) (capítulo 5). La presencia de la proteína de resistencia candidata (ID 2412) (capítulo 5), puede probablemente estar asociada a fenómenos de reconocimiento de efectores del patógeno a nivel citoplasmático (2) y activar respuestas de defensa asociadas con ETI (Effector Targered Inmunity). Sin embargo, la mayor parte de las respuestas encontradas en esta investigación se enmarcan dentro de las respuestas de defensa activa asociadas al reconocimiento de MAMPs (Microbial Associated Molecular Paterns), durante la activación de la MTI (MAMPs Targered Inmunity). Este tipo de respuestas ha sido asociado con procesos de señalización en los que participan MAPK (Mitogen-Activated Protein Kinases) y CDPK (Calmodulin-Dependent Protein Kinase). El aumento en los niveles de peróxido de hidrógeno (3) (capitulo 3), ha sido asociado con estas últimas quinasas y se puede presentar tanto a nivel citoplasmático como a nivel extracelular, para finalmente generar la activación de transcripción de genes de defensa mediado por el complejo RNA pol II (4). Dentro de los genes que aumentan su transcripción se presentan los codificantes para las enzimas fenilalanina amonio liasa (PAL), CHS y CHI (capítulo 4). El aumento en la traducción de mRNA mediado por los complejos ribosomales, debe involucrar los factores eIF1 y eIF2 (capítulo 5). Así mismo este proceso requiere de la biosíntesis de aminoácidos como serina y metionina en donde intervienen las proteínas fosfogliceraldehido deshidrogenasa (ID 4507) y la metionin sintasa (ID 6737). La participación de proteínas como las ciclofilinas, se requiere para el correcto plegamiento de las proteínas sintetizadas. Finalmente, un aumento en las actividades enzimáticas de PAL, CHS y CHI (5), que en ciertos tiempos debe estar asociado a mecanismos de regulación postranscripcional (P ejm CHS 6hpi y PAL 96hpi), genera un aumento en los metabolitos de tipo flavonoide y de actividad antioxidante (6) (capítulo 4). Fenomenos como el fortalecimiento de paredes celulares (7), mediado por proteínas como la α 1,4 glucano-proteina sintasa (ID 3208) hace parte de la respuesta multigénica reportada contra este patógeno. Esta propuesta está basada en los resultados obtenidos en el presente estudio y por lo descrito por autores como (Muthamilarasan & M. Prasad 2013; Bent & Mackey 2007).

278

La propuesta sobre los fenomenos de señalización y activación de la respuesta a Fod

que ha sido ampliamente discutida a lo largo de este escrito, ha sido tambien planteada

para otras formas especiales de Fusarium oxysporum (Berrocal-Lobo & Molina 2008), y

es consistente con la resistencia multigénica descrita para esta planta a la raza 2 de este

patógeno.

69 Figura No. 69. Resumen de algunos de los mecanismos de defensa propuestos en células de tallos de clavel durante la interacción con Fod. Se presentan mecanismos de defensa activa como aquellas mediadas por el reconocimiento de MAMPs (Microbial Associated Molecular Patterns) involucrada en la activación de la MTI (MAMPs Targered Immunity), tal y como ha sido previamente descrito en la figura No. 68 para raíces. Para este órgano el aumento en los niveles de peróxido de hidrógeno (3) (capítulo 4), puede estar asociado con las quinasas CDPK y la activación de las proteinas RBOHs (Respiratory Burst Oxidase Homologs) (1). La acumulación de esta molécula señal parece estar asociada a la activación de transcripciòn de los genes chs y dcprx02 (2) (capítulo 3 y 4). Se presume que el aumento en la biosíntesis del aminoácido metionina por acción de la metionina sintasa (ID 6716) puede estar involucrada tanto en el aumento de los nivel citroplasmaticos de este a.a. para procesos como la síntesis de proteínas y para la biosíntesis de etileno (3) mediante la acción de otras enzimas como la adenosilmetionina sintasa (ID 5427). Un aumento en los niveles de ciclofílina y de la proteína de choque térmico HSP70, se requiere para el correcto plegamiento de proteínas durante su síntesis (capítulo 5). El aumento en la actividad enzimática de las POD y CHS (4), debe estar asociado respectivamente, a procesos como, la regulación de peroxido a nivel extracelular (5) y el aumento en los niveles de flavonoides (6). Es probable que para el aumento en los niveles de estos metabolitos a tiempos más tempranos (6, 12 hpi), se presenten otros mecanismos como la liberación a partir de reservas constitutivas localizadas en las vacuolas. El aumento en los niveles de la enzima peroxidasa, puede estar asociado con la regulaciòn de EROs a nivel extracelular y con la correspondiente generación de quinonas antifúngicas que han sido descritas en esta modelo vegetal.

279

Es importante comentar que la acción de otras enzimas que no fueron evaluadas en el

presente estudio, debe jugar también un papel importante en la respuesta de defensa de

la planta. Estudios recientes, le han otorgado a proteínas asociadas a procesos de

localización en vacuolas o apoplasto, un papel relacionado con resistencia, como es el

caso de los transportadores ABC o transportadores MATE (De sus siglas en ingles

Multidrug and toxic compound extrusion (MATE) transporters) (Naoumkina et al. 2007;

Agati et al. 2012; Banasiak et al. 2013). Considerando que estos metabolitos y enzimas

asociadas con su biosíntesis han sido encontrados a nivel nuclear, se ha discutido su

papel como factores de transcripción y/o reguladores de especies altamente oxidantes en

este organelo (Agati et al. 2012). Es por ello que es de particular interés, considerando

los resultados de la presente investigación, evaluar la localización celular de metabolitos

en raíces y tallos de la planta usando herramientas histoquímicas y así mismo, estudiar

los procesos de transporte involucrados en los que participan este tipo de proteínas. El

conocimiento de la ubicación de estos metabolitos a nivel subcelular, permitirá obtener

más información sobre su función en los mecanismos asociados a la resistencia al

patógeno causal del marchitamiento vascular.

La presente investigación permitió aumentar de manera importante la elucidación de los

mecanismos asociados con la resistencia del clavel al marchitamiento vascular causado

por Fod, mediante la comprobación de las diferentes hipótesis que se plantearon al inicio

del estudio. Se evidenció que la complejidad en los diferentes mecanismos asociados

con la resistencia a la enfermedad es alta, e involucra un conjunto de respuestas que se

deben activar de manera espacio y temporalmente coordinada para expresar finalmente

la resistencia al patógeno. La información que ha sido obtenida en la presente

investigación, ha ampliado de manera significativa el conocimiento bioquímico y

molecular de esta interacción, permitiendo plantear a los niveles de flavonoides y a las

enzimas involucradas en su biosíntesis, como potenciales marcadores bioquímicos de

selección de resistencia. El conocimiento aca generado se requiere para el futuro

desarrollo de nuevas alternativas de control al marchitamiento vascular, una evidente

necesidad para el fortalecimiento del sector productor de claveles a nivel mundial.

281

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