Congreso Nacional Laboratorio Clínico 2018 24... · proeritroblasto CD36 H antigeno (GpA) inmaduro...

Pruebas complementarias en el diagnóstico de las leucemias mieloides agudas

Congreso Nacional Laboratorio Clínico

Amphia Hospital, Breda

: Hospitales Universitarios

: Hospitales de medicina especializada:

Holanda

Citometría de flujo

Hemocitometría

Citología de médula ósea

Laboratorio de análisis clinico

Morfología/histologia Citogenética

Citometría de flujo Análisis Molecular

El diagnóstico de LAM

La citología de la médula ósea

Esquema de la hematopoyesis

Lugares con hematopoyesis en el esqueleto

Aspiración de médula ósea

• 1 ml -3 ml en una jeringa

• Hacer extensiones directamente

• Preservar la muestra en EDTA � hacer extensiones en una hora

• Coagulación rápida � leucemia aguda promielocítica?

• “Dry tap” � mielofibrosis?

Aspiración de médula ósea

Preparar los frotis de la médula ósea

� Plankje met preparaten

Tinción de Perl’sTición May Grünwald Giemsa

El estroma Hematopoyesis

GrasaCongreso Nacio

nal Laboratorio Clínico 2018

• Eritroblastos 13-38

• Mieloblastos 1-5

• Promielocitos 0-3

• Mielocitos 3-12

• Metamielocitos 4-6

• Granulocitos neutrófilos bandas 10-15

• Granulocitos neutrófilos 10-25

• Granulocitos eosinófilos 0-4

• Granulocitos basófilos 0-1

• Monocitos 0-3

• Linfocitos 6-20

• Células plasmáticas 0-2

• Predominio mieloide sobre eritroide (M/E) 3-7

Valor normal del medulograma (%)*

* B Bain et al. Bone marrow pathology (4th edition). Wiley Blackwell

Directrices para el recuento celular

- sangre periférica : 200 células

- médula ósea: 500 células, usando al menos 2 frotis

- estimar la cantidad de megacariocitos en 5 campos a 10x10

- evaluar la displasia en la médula ósea:

- 200 células de la granulopoyesis (neutrófilos, eos, basos)

- 200 células de la eritropoyesis

- 30 megacariocitos

- síndrome mielodisplásico: > 10 % displasia

� WHO 2008/2016Congreso Nacio

eritroblasto

basófilo

linfocito

monocito

neutrófilo

eosinófilo

celula madre

mieloblasto

Esquema de la hematopoiesis

eritroblasto

basófilo

linfocito

monocito

neutrófilo

eosinófilo

celula madre

mieloblasto

Efecto de LAM al hematopoiesis

mieloblasto

Efecto de LAM al hematopoiesis

médula ósea normal médula ósea con LAM

Tratamiento de LAM con citostáticos

Leucemia refractaria (día 17 después tratamiento)

tratamiento eficiente leucemia refractaria Congreso Nacio

La histología de

la medula ósea

Las herramientas…..

Una biopsia de médula ósea.

Una selección de las varias tinciónes histoquimicas

y inmunoquimicas para la médula ósea.

Médula ósea normal Médula ósea de LAM

Inmunofenotipo con

citometría de flujo

Esquema de las células hematopoyéticas con expresión

de moleculas extracelular e intracelular específicas

para las diferentes etapas de maduración.

Marcador especifíco

Marcador de maduración

Marcador inmaduro

Marcador pan leucocitarioCongreso Nacional Laboratorio Clínico

Marcador especifíco

Marcador de maduración

Marcador inmaduro

Marcador pan leucocitario

Anticuerpo fluorescente contra

el marcador de maduración

Anticuerpo fluorescente contra

el marcador inmaduro

Detección inmunofenotípica de moleculas extracelular y

intracelular especificas para las diferentes etapas de

maduración.

Espresión de los varios antígenos de membrana y los antígenos intracelulares durante las etapas de la maduración mieloida

MPO MPO MPO

mieloidoprogenitor

HLA-DRCD34CD117(CD13)(CD33)(CD7)

mielo-monocitoido

progenitor

HLA-DRCD34CD117CD13CD33CD65)(CD11c)(CD15)

monoblasto

HLA-DRCD13CD33CD65CD11cCD14CD36

mieloblasto

(HLA-DR)CD13CD33CD65CD15

proeritroblasto

CD36H antigeno

inmaduromegakarioblasto

HLA-DRCD34CD33

(CD36)(CD41/CD61)

(CD42)

megakarioblasto

CD36CD41/CD61

CD42(CD9)

megakariocito

CD36CD41/CD61

CD42CD9

trombocitos

CD36CD41/CD61CD42CD9

eritroblasto

CD36H antigeno

eritrocitos

H antigenoGpA

promielocito

CD13CD33CD65(CD15)

mielocito

CD13CD33CD65CD15CD66b

granulocito

CD13CD65CD15CD66bCD16

promonocito

monocito

macrófago

HLA-DR(CD13)(CD33)CD11c(CD14)(CD36)(CD1)CD68RFD9

MPOCyCD68

El sistema de citometría de flujo

Médula ósea normal

Scatergrama de dispersión lateral con CD45: el mapa general de la médula ósea

Intensidad del marcador CD45

CD45: antígeno universal para células hematológicas

mielopoyesis

monocitos

linfocitos

lugar de los mieloblastos

Aplicaciones de la citometría de flujo

• El diagnóstico de LAM

• Enfermedad mínima residual (EMR)

• Cuantificación de células madre (CD34+)

• PronósticoCongreso Nacio

La citogenética

El cariotipo humano

Esquema de lesiones cromosómicas más frecuentes.

Deleción Duplicación Inversión

Inserción Translocación

Cariotipo clásico con translocación entre las cromosomas 8 y 21. (t 8:21)

Hibridación in situ fluorescente (FISH) de translocación entre cromosoma 8 y 21 ( t8:21)

cromosoma 8 intacto

cromosomas 8 y 21 con intercambio de partes

cromosoma 21 intacto

Supervivencia de LAM con una alteración cromosómica que muestra el valor de la citogenética para el pronóstico

NEJM 2016; 374:2209-2221.

Analisis molecular

Secuenciación masiva de nueva generación (NGS)

Las mutaciones más comunes en LAM

Blood 2016;12: 686-698.

Función del geno:

El efecto del tipo de mutación a la superviviencia en LAM

Blood 2016;12: 686-698.

recaíd

NGS y citometría de flujo (MFC) son complementarios en la detección de enfermedad mínima residual (EMR)

NEJM 2018, M Jongen

Significado del análisis molecular para el tratamiento

� Ayuda en la clasificación de LAM

� Mejora el valor del pronóstico de LAM

� Detección de EMR con alta sensibilidad

� Predicción de LAM algunos años antes del

diagnóstico

� Desarollo de medicamentos nuevos que se basen

en las lesiones moleculares de LAM

Clínico

: mieloblasto : promielocito : neutrófilo

El efecto del tratamiento con un inductor de diferenciación en LAM

Tratamiento de LAM con inhibidor de IDH induce maduración de los blastos leucémicos.

diagnóstico día 17 de terapia día 24 de terapia

El futuro del diagnóstico de LAM (1)

� La citología y la histología mantendrán su

importancia para el diagnóstico inicial.

� La morfología de los blastos leucémicos no importa

mucho para la terapia. (excepto: LAP)

� La clasificación de LAM se basará especialmente en

la citogenética, el análisis molecular y posiblemente

terapias anteriores del paciente.

� La combinación de citometria de flujo y NGS

permite la detección de EMR con alta sensibilidad.Congreso Nacional Laboratorio Clínico

El futuro del diagnóstico de LAM (2)

� El análisis molecular dará la posibilidad de prever los

sujetos con alto riesgo de LAM, tanto en pacientes

con una enfermedad hematológica (PV, TE etc.)

como en personas saludables.

Gracias por su atención.Congreso Nacional Laboratorio Clínico

Clínico

Antígenos importantes para el diagnóstico de LAM

Médula ósea normal Médula ósea con LAM

“El triángulo de las Bermudas”: lugar de los mieloblastos

Intensidad del marcador CD45

CD45: antígeno universal para células hematológicas Congreso Nacional Laboratorio Clínico

Secuenciación masiva de nueva generación (NGS)

Secuenciación de próxima generación del ADN de un

paciente con LAM con una mutación en el gen IDH2

Punción seca� un frotis de una biopsia

Esquema de la hematopoyesis

Lesiones genéticas y cromosómicas en LAM

Blood 2016; 127: 29 - 41.

Las lesiones genéticas y cromosómicas en LAM*

± 50 % de pacientes con LAM no tienen alteraciones cromosómicas

Blood 2016; 127: 29 - 41.

Las lesions genéticas y cromosómicas en LAM

± 50 % de pacientes con LAM no tienen alteraciones cromosómicas

Los procedimientos mas importantes en citología de médula ósea

� - Preparar los frotis

� - La tinción

� - Cómo hacer una fórmula de médula ósea

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