CONCEPTOS BÁSICOS

BIOLOGÍA MOLECULAR I

DR.JP FLORES G.

Biología Molecular en Patología

Las pruebas moleculares permiten examinar la estructura y expresión de genes específicos o proteínas en tejidos normales, anormales o neoplásicos . Con la finalidad de evaluar posibilidades de diagnóstico, tratamiento o pronóstico en una gran variedad de patologías .

DNA

Ácidos NucleicosSecuencias de nucleótidos

unidos consistentes en : Base Nitrogenada

Azúcar de 5 carbonos Grupo fosfato

La secuencia de las bases es la forma en que la información genética es

almacenada

Bases

• Pirimidinas Citosina ( C= )

Timina ( T= ) Uracilo ( U= )• Purinas Adenina ( A= ) Guanina ( G= )

Las bases C= , A= y G=se encuentran en el DNA y en el RNA.Sin embargo la base T= esespecífica para el DNA y el U= es específica para RNA.

Complejo DNA/Proteína

RNA mensajeroRNA ribosomalTranscripciónAmplificación

Cromosoma/Gene

Delecion

Duplicación

Inversión

Traslocación

Replicación celular

Reactivación

6 a 12Hs.

2 a 4 Hs.

3 a 4 Hs.

1 Hr.

• Conceptos sobre replicación celular:

1. Interfase2. Duplicación del material fenotípico

y genético3. Doblar tamaño trascripción y

trasducción de los genes4. Diploide de cromosomas

Replicación celular

Cromosoma/Gene

Conceptos Cancer

• Cancer es una enfermedad genética• Protooncogenes (dominantes)• Genes supresores (Recesivos)• Genes que regulan la muerte celular

programada o Apoptosis• Genes relacionados con la reparación

del ADN. (Inestabilidad ADN)

Conceptos Cancer

1. Inmortalización2. Transformación3. Ventajas de

crecimiento4. Metastasis5. Contenido ADN

aneuploide6. Alts. Genéticas

Biología del crecimiento tumoral

• Transformación

• Crecimiento • Invasión local

• Metástasis

Cinética del crecimiento

Angiogénesis

Heterogeneidad

Masa tumoral: formada por descendientes clonales de una célula transformada .

Cinética del crecimiento

• Regulación del ciclo vital alterado

(Rb, p53 y ciclinas)

Posteriormdisminuye

(20%)Vel

de crecim

Fracción de crecimiento elevada

(# de células tumorales en proliferación, [FC])

Duración de ciclo vital igual o mayor

Crecimiento producción = pérdida celular

Cinética de Crecimiento

• Quimioterapia actúa sobre células que se encuentran en su ciclo celular.

Tumor Factor de crecimiento

Aplicación de

quimiotx

Respuesta

Agresivo

No agresivo

Sin cirugía

Cirugía

Angiogénesis Tumoral

• Elemento Nutritivos y O2• Factores de crecimiento (PDGF, GM-

CSF, IL-1)

• Metástasis

Distancia de máxima difusión de óxígeno (1-2mm)

Normal = p53 Nat sx trombospondina - 1 antiangiogénesis

Tumor =p53 Niveles trombop. Angiogénesismutada libre

Fenotipos deangiogénesis

célula mutaciónclon

tumorMultiples mutaciones

También hay Control de anti-angiogénesis

sxTrombospondina -1

•Angiostatina•Endostatina•Vasculostatina

sxDegradacción del plasminógeno, colágena y transrretina

Progresión y heterogeneidad de los tumores

• Progresión tumoral:

• La malignidad se adquiere de forma progresiva 1

Crecimiento acelerado

Capacidad de invasión

Metástasis

Preneoplásico - tumor benigno -tumor maligno

Biología del crecimiento tumoral

• Transformación

• Crecimiento • Invasión local

• Metástasis

Cinética del crecimiento

Angiogénesis

Heterogeneidad

Invasión de la matríz extracelular

• Proceso activo que se divide en varios pasos 1) Separación de células tumorales del resto

de la masa. 2) Fijación a los componentes de la matríz. 3) Degradación de la matríz extracelular. 4) Emigración de las células tumorales.• Membrana basal y tejido conjuntivo.• Colágeno, proteoglucanos y glucoproteinas.

Disminución de cadherina E r/o Mutación cateninas.

Rc laminina, fibronectina y expresión de integrinas.

Enzimas proteolíticas (propias del huesped) Serina, Cisteina de la matríz (MPM)

Factores de motilidad autocrino (timosina, fc.Crecim. hepatocitario)

Productos de degradación de los componentes de la matríz.

Diseminación vascular y asentamiento de las células tumorales

• Penetran en circulación y se agupan entre ellas y con células sanguineas (plaquetas)

• Viajan como embolo y se extravasan hacia organo diana (moleculas de adherencia - CD44)

• Tropismo orgánico Ca próstata - esqueleto Ca broncogenico - suprarrenal y encéfalo Neuroblastomas - hígado y hueso

Tropismo Orgánico

• Células tumorales: molécula adherencia con preferencia a células endoteliales del órgano diana.

• Célula diana: liberan sustancias quimiotácticas.

• Organo diana: ambiente desfavorable.

Genética molecular de las metástasis

• “Gen metastásico”

• Genes supresores de la metástasis.- Gen de cadherina E.- Gen de inhibidor histico

metaloproteasas.- nm23 ca mamario- KA I-1 (crom IIp II-2) ca próstata

- Kiss-1 (crom IIp) melanoma maligno

Carcinogénesis

• 1.- Cambio en la función de un gen

• 2.- Función anormal de un gen• 3.- Cambios estructurales de

los genes• Sin alteración cromosómica no

existe transformación neoplásica

ProliferaciónCélulasuceptible

Factores ambientalesVirus, radiación

Diferenciación genes

Apoptosis

Genes asociados a proliferación celular

Mutaciones APC Y MCC

Perdida de gpos.Metilo ADN

Mutaciones delGen RAS

Perdida deGen DCC

Perdida deP53

Mecanismos moleculares CA Colon

Adenoma plano

Oncogen Función Tumor

HST Crecimiento Ca.gástrico

NEU/ERB-2 Crecimiento Ovario,mama

TRK Crecimiento Ca.tiroides,Colon

HaRAS,K-RAS, Trasduccion Ca.vejiga,Colon

de proteínas

ABL Cinasas de proteínas Leucemia/Linfoma

MYC/BCL2 Factores de Trasduccion Neuroblastoma

Nucleares Linfomas

Seminars in Oncology Vol.23:4-21 1996

Oncogenes

Gen supresor tumoral

• Alteración de la funcionalidad de ambos alelos de un gen que regula la diferenciación celular o la supervivencia la pérdida de estos resulta en la transformación maligna.

P53 Guardian ADNP53 Guardian ADN

Genes Supresores Tumorales

Gene S. Familiar T.Esporádicos c/Mutación Mx de AcciónRB1 Retinoblastoma RB,OSC,Pulmón,Mama Ciclo CelularP53 S.Li-Fraumeni 50% canceres Daño DNAP16 Melanoma,Ca.Pancreas Ca.pancreas,Gliomas Inhibidor CDK hMSH-2 Ca.Colon Ca.Colon,Endometrio Reparación DNAhMLH-1APC Pólipos adenomatosos Ca.Colon Wnt factores crecimientoBRCA1 Ca.Mama,Ovario Ovario(raro) Reparación DNA ?BRCA2 Ca.Mama,Ovario,Páncreas Ca.Páncreas Reparación DNA?NF-1 Neurofibromatosis tipo 1 Neuroblastoma Melanoma Ras NF-2 Neurofibromatosis tipo 2 Meningioma, Mesotelioma M.Citoesqueleto Shwanoma,Ependimoma

Molecula de

Estrogeno

Receptor de estrogenos

ADN

Respuesta MediadaRNAm

Evidencia a favor de Efecto hormonal en Adenocarcinoma

de Mama1. Pacientes con ooforectomia rara

vez desarrollan cancer de mama2. Pacientes con S de Turner rara vez

desarrollan ca de mama3. Xenoestrogenos favorecen el

desarrollo de ca de mama4. Los pacientes con RE positivos

responden a terapias con tamoxifen

Agentes Carcinógenos

Energía radiante

Químicos

Microorganismos oncogénicos

Carcinogénesis Química

• John Hill - rapé -pólipos

• Percival Pott - hollín - ca escroto

• Hidrocarburos aromáticos policíclicos

• Sustancias sintéticas

• Fármacos

Fase de la carcinogenesis química• Iniciación y promoción

INICIACION

acción directa

Naturales ó sintéticos acción indirecta ó

procarcinógenos

• Activación (carcinogeno) Inactivación (destoxificación)

• Monooxigenosa dependiente de citocromo P-450

• CYP1A1, Stransferasa (BST), edad, sexo, nutrición

CARCINOGENOS QUIMICOS

• Indicador mutágeno• Diana DNA• Cada carcinógeno produce una “huella dactilar” molecular

China y Africa aflatoxina B1

• Ca. Hepatocelular - mutación p53 mutación 249 p53. Otras

Otras regiones V Hepatitis B.

Otras mutaciones en p53

• P/iniciación: Celulas alteradas por carcinógeno deben sufrir

al menos 1 ciclo de proliferación

PROMOCION

• Capacidad carcinogénica de alguna sustacias cuando se administra un promotor que por si mismo no es tumorgénico

• TPA, Acido ocadoico

NUEVAS

INICIADOR PROMOTOR MUTACIONES

Proliferación y

Actividad de un expansion cronal de Tumor

oncogen células indicadas maligno

Nada Lesión Lesión hiperplásica preneoplasica

CARCINOGENOS QUIMICOS

• Agentes alquilantes de acción directa • Hidrocarburos aromáticos policíclicos • Aminas aromáticas y colorantes

nitrogenados • Carcinógenos naturales• Nitrosaminas y amidos• Agentes diversos• Promotores de la carcinogenesis química

CARCINOGENESIS POR RADIACIÓN

• Rayos UV (UVA, UVB, UVC)• R. Ionizante (electomagnetico o

particular)

RAYOS ULTRAVIOLETA

UVA 320-400nmUVB 280-320nm carcinógeno

UVC 200-280nm carcinógeno, filtrado por capa 0Z0NO

• Epidemiología - Ca. Espinocelular, basocelular, melanoma

• Factores: Tipo de UV, Intensidad exposición, cantidad melanina

NER ( nucleotide excision repair)

1) Reconocimiento2) Incision3) Eliminación4) SX parche5) Unión del parch

sobrepasa capacidad sol NER error en DNA transcripción

dañado • Xeroderma pigmentoso

XERODERMA PIGMENTOSUM

• Autosómico recesivo

• Fotosensibilidad extrema

• riesgo ca(2000 veces)

• Anomalías neurológicas

• Incapacidad p/reparar DNA por lesiones UV

• 7 variantes

RADIACIÓN LONIZANTE

• Cualquier célula podrá transformarse en cancerosa si recibe una cantidad suficiente de energía radiante

• Ca provocado por radiación:

• Piel, hueso y TGI: son los menos involucrados

- Leucemias- Ca. Tiroides- Mama, pulmón y glándula salival

EJEMPLOS

• Rayos roetgen - Ca. Piel• Mineros de elem radioactivos –

– Ca. Pulmón (10 v+)

• Bombas Hiroshima y Naggsaki – – 7 a: leucemias – a: tumor solido

• R. Terapeuticos: Cabeza y Cuello = 9% CA tiroides : Columna x E.A= leucemia (10-12

v+)• Accidente Chernobil - Ca. Tiroides

mama, tiroidescolon, pulmón

CARCINÓGENOS VIRALES Y MICROBIANOS

• Virus DNA oncogenicos (VPH, VEB)

• Virus RNA oncogenicos ( VLTH-1)

• Bacterias (Helicobacter pylori)

VIRUS DNA ONCOGENICOS -VPH

• 70 Tipos VPH• 1, 2, 4, 7 prod papilomas escamosos benignos• 6, 11 condiloma genital con escaso pontencial maligno• 16, 18 (31, 33, 35, 51) Ca in situ 85% y Ca invasores• Lesión preneoplásica - Forma episómica del VPH• Lesión neoplásica - Forma integrada del VPH. (clonal) cicloNL - - (-) transcripción - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - normal

E1 / E2 E6/E7 E6 E6 PRB p53-P

INFECT - - - Interrupción - - codifica E6/E7 cant gran afinidadVPH 16, 18, 31

E6 P53-a

VPH - - - - Interrupción - - codifica E6/E7 cant poca afinidad Alteración leve

bajo riesto del ciclo celular

Regulación del ciclo células alterado

7 veces > riesgo de Ca. que

Virus DNA oncogénico VEB

Antigenos Tumorales

• AET - Solo en células tumorales, desencadenan a células T citotóxica y se presentan sobre la celular por molecula I MHC.

• AAT - Genes en células normales (pero no expresado) y en células tumorales. Fam. Genes MAGE, GAGE, BAGE, RAGE.

• Expresión excesiva de antigenos c-erb B2 (o neu) - en células tumorales su expresión y activa a linfos T CD8 citotox.

• Antigenos virales E7 del VPH-16

• Antigenos de diferenciación CD10 (CALLA) - Leucemias y Linfomas B Ag prostático específico

Mecanismos Efectores Antitumorales

Inmunovigilancia

• SIDA, XLP. Otras inmuno del - 220 veces >

prob. de Cancer

• Dx sanos - mecanismos p/evadir inmunodeficiencia

- células tumorales no expresan HLA clase I

- no expresan moleculas coestimulantes

- inhiban respuesta inmune ((+) LT supresor)

- apoptosis de células T citotox. (ligados FAS)

Efectos del tumor en el huesped

• Daño por : - localización y

efecto de masa

- actividad

funcional

- hemorragias o

infecciones

-sintomas agudos

Efectos locales y normales

• Tumor endocrino benigno

endocrinopatia

• Cancer en una glándula insuficiencia

• Cancer colon obstrucción

• Presión tumor benigno

• Erosion y destrucción tumor maligno

Caquexia

• Síndrome: Pérdida de grasa y masa corporal

con dedebilidad, anorexia, anemia

- Alteación: gusto y olfato

- Gasto Calórico e indice metabólico basal

- Es reproducible al administrar FNT

Síndrome Paraneoplásico

Signos y síntomas de un px. con Ca. que no se explica por efecto del tumor local, metástasis ni

actividad funcional.Producción hormonal ectópica (Cushing) 50% Ca. Pulmón

Hipercalcemia (mama, pulmón, riñón, ovario)

Síndrome neuromiopático: Ac anti tumor Rx cruzada c/neuronas

Acantosis Nigricans: 50% con 40 años y Ca.

Osteoartropatía hipertrófica: 1-10% de Ca. Broncogénicos

Graduación y estadificación de los

tumores

• Mediante - grado de diferenciación y mitosis existentes Es proporcianal a la agresividad (I - IV)

2 Sistema 1 UICC = Sistema TNM TO= in situ, T1 - T4 tamaño

NO= no ganglios, N1 - N3 # ganglio afectados

MO= no mets MI - mets presente Mz - Mets Hematógena

2 AJCC - O - n Tamaño, ganglios, metástasis

Diagnóstico del cancer

• Histológico y citológicoInmunotinciónDiganóstico molécularCitometría del FlujoMarcadores Tumorales

• Datos clínicosmuestra adecuada y representativamaterial bien fijadopor BAAF, biopsia, BTOtécnica de apoyo

Historia

Tinción facilita la distinción diferentes componentes celulares.

HyE Weigert, Harris, Mayer

1939 Histoenzimología

1942 Coons Inmunoflourescencia

1972 Nakane-Avrameas Peroxidasa

1980 Hsu Complejo Avidina –Biotina

1972 Stenberg PAP 1992 Adams

Ampificación Tirimidina

Tinción especial

• Subjetividad histopatologia• Identificar célula en particular , tejido

o enfermedad• Técnica auxiliar• Sensibilidad y especificidad aceptable

en el diagnóstico morfológico• Posibilidad de clarificar la histogénesis

1940 1950 1960 1970 1980 1990

ME

Física

Histoquímica

QuímicaBioquímica

IHQ

Inmunología

HIS

Biología Molecular

In situPCR

PCR

Computadoras

Telepatología3D Morfo

Métodos en Patología Qx.

•Macroscopico•Microscopia luz•Histoquimica• Inmunohistoqx.•Ultraesructura•Citopatologia

•CFU•Análisis de

Imagen•Hibridizació

n In situ•PCR•FISH

PAS

melanosomas

HISF

IHQ

Macro

Inf. Clínica

Especimen

Técnica

Resultados

Consideraciones Técnicas

Especimen: • Bloques celulares• Citología o frotis

secado al aire• Citologías teñidas

previamente• Citologías BAAF • Transferencia de

células

Transferencia de celulasPAPHMBE-1

ACE

CK8

Logística de Estudio Lesiones Neoplásicas Citopatología

Citopatólogo

DX.Diferencial

Grupos MorfológicosI. EpitelioidesII. FusocelularesIII. MixtosIV. Células pequeñas

Evaluación Clínicay sitio de la lesión

CA vs. MelanomaCA vs. LinfomaLinfoma vs. TNEPCA sarc. vs. Sarcoma

PanelRacional Inicial

PLAP

Réglas Básicas Interpretación

FilamentosG.secretorios Filamentos

Actina Cromogranina CK8Sinaptoficina

Réglas Básicas InterpretaciónRéglas Básicas InterpretaciónLámina basal

Actina

Filamentos

Filamentos

Filamentos

Colagena IV Desmina

Historia Clinica 1

• Paciente masculino campesino de 58 años de edad con tumor en region cervical

• Tele de Torax normal• TAC normal• Estudios de laboratrio dentro de

limites normales

Diagnosticos diferencialesMelanomaHistocitoma Fibroso MalignoCarcinoma sarcomatideSarcoma epitelioide

CK 13

Cocktail CK

HMB45

CD 68 NegativoProt S-100 negativoCK8 negativoCK 7 NegativoCD 10 NegativoCarcinoma Espinocelular sarcomatoide

Inmunofenotipo Patología Quirúrgica

• Proceso reactivo vs. Neoplásico

• Linfoma vs. Neoplasia no Linfoide

• Inmunotipificación de Linfomas

Protocolo de Estudio Lesiones Neoplásicas Poco

Diferenciadas

Morfología

Panel DxInicial

Evaluación Clínicay sitio de la lesión

Dx. Histogenetico

Panel p/ SC

DxDef.

ME, PCRBM

NoConcl.

G. MorfológicosI. EpitelioidesII. FusocelularesIII. MixtosIV. Células pequeñas

Clasificación de tumores indiferenciados

• CK epitelial• VIM mesenquimatoso• Des muscular• PAGF gliales• ACL linfomas• APE tiroglobulina - ca específico

Diagnóstico molecular

• Diferenciar población polimonoclonal• Detección de traslocaciones por FISH• Detección de transcripción por PCR• Determinar el pronóstico• Detección de enfermedad residual por

PCR• Predisposición hereditaria BRCA1, BRCA2 RET.

Diagnóstico

Pronóstico y R=Tx

Selección y manejo Tx.génico

M 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

Personas normales

M marcador de peso molecular3. 01- 330 B4. 00- 733 A5. 01- 146 M6. 01Q- 1226 HSJ7. GG- 866- a8. 01Q- 6589. GG- 3275D10. 01Q- 815B11. 01Q- 1111B12. 01Q- 978B

1 1 2

1.00- 8030 D 2l de DNA

1. 00- 8030 D 1l de DNA

2. 00- 4572 BZP3

Her-2/NeuZP3

Her-2/Neu

ZP3

Her-2/Neu

1

11

2

3

4

5

6

7

8

9

10

10

24

12

24

12

08

04

PacientesN° de copias

10

02

11

12

10

28

Citometría de flujo

- Identificación de antígenos de superficie

- Aneuploidia pronósticoMarcadores tumorales

- Apoyo al diagnóstico

- Indican recidiva- Establece respuesta al

tratamiento (AFP, CEA, HGC, etc)

Gracias por escucharA mi papá.