Clonación

Manipulación de DNA

Curso 2011-12

El problema básico

¿Cómo mantener estable un fragmento de DNA dentro de una célula?

Uniéndolo a un vector de clonacion

Vector de clonacion

Fenotipo seleccionable

Dianas de restricción unicas

Multicopia

DNA de replicación autónoma

Diana única

Plásmidos recombinantes

Quimeras

Pasos en la clonación

•Ligación

•Crecimiento en placas de agar en medio selectivo

•Restricción del vector y del inserto

•Transformación

Fragmentación de DNA

Enzimas de restricción

Werner Arber

Premio Nobel de Medicina en 1978

"for the discovery of restriction enzymes and their application to problems of molecular genetics".

Eje de simetría doble

dabalearrozalazorraelabad

DIANAS de restricción

Secuencias palindrómicas

ana anna

Romos Protuberantes

Probabilidad de corte

1/4 x 1/4x 1/4 x1/4= (1/4)4 =1/256

(1/4)6 = 1/4096

(1/4)8 = 1/65536

~ 12.5x106 fragmentos

~ 781250 fragmentos

~ 48828 fragmentos

Nº fragmentos en genoma humano

Enzimas de restricción

nomenclatura

4

4

8

6

6

1/4

IsosquizómerosEnzimas de restricción que reconocen la misma sequencia

Pueden cortar en el mismo sitio

Como NdelI y MboI GATC

O no

NarI GG CGCC

BbeI GGCGC C

EheI GGC GCC

KasI G GCGCC

Ligación de DNA

5´3´

Animaciones> manipulación de DNA> techniques> cutting & pasting

Truco para favorecer laformación de recombinantes

Impedir la religación del vector

Extremos cohesivos compatibles

¿Podríamos digerir el recombinante con BamHI?

….NGAT ATCN…..

….NCTA TAGN…..

….NGAT….NCTA

ATCN…..TAGN…..

….NCTA….NGAT CCTN…..

GGAN…..

….NCTA….NGATCCTN…..

GGAN…..

Animación > Manipulation >Revolution > Players

http://www.dnaftb.org/34/concept/index.html

Premio Nobel de Química 1980

Vectores de clonacion

Vectores plasmídicos

Características de los vectores de clonación

•Pequeño tamaño

•Marcador genético de selección

•Sitios únicos de restricción

ColE1

•Mutación en las secuencias control de la replicación de ColE1 resultantes en más de 500 copias/célula

•Adición de múltiples sitios de clonaje únicos (MCS) (“poly-linker”)

Vectores mejorados

MCS (Multi Cloning Site)

(polylinker)

MCS de pUC18

MCS de pUC19

•MCS (polylinker) en secuencia codificante para el fragmento N-terminal de la -galactosidasa.

pUCPlac O N-lacZ

pUCPlac O N-lacZ

IPTGXGal

pUCPlac O N-lacZ

pUCPlac O N-lacZ

IPTGXGal

Allolactosa

Isopropil D tiogalctósido IPTG

INDUCTORno hidrolizable

Inductor

X-gal

Ensayo de -galactosidasa

•MCS (polylinker) en secuencia codificante para el fragmento N-terminal de la -galactosidasa.

•Selección de plásmidos con inserto: colonias blancas en placas con IPTG y X-Gal.

Colonias blancas Colonias azules

+ X-gal + X-gal

+ IPTG

Animación> clonación / clonación (vectores plasmídicos)

+ inserto

- inserto

Vectores lanzadera

Shuttle