Post on 25-Jul-2015
Benemérita Universidad Autónoma de Puebla
GENÉTICA MICROBIANA
FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICAS
TEMA: TECNOLOGÍA DEL ADN RECOMBINANTE
Alumno: José Alberto García Orozco
Definición de ADN recombinante
Es una molécula de ADN formada por la unión de dos moléculas de diferente origen.
unión in vitro de ADN
Dos organismos diferentes que no se encuentran juntos
Introducir ADN
recombinante
Modificación genética
Adición de un nuevo AND
Modificación de rasgos existentes
ADN RECOMBINANTE
HERRAMIENTAS
ADN cromosómico
COPIA DE PLÁSMIDO RECOMBINANTE
LINEARICEN LOS
VECTORES MULTIPLICARSE
BACTERIA
DIVISIÓN Y FORMACIÓN DE UN
CLON
APLICACIONES
Industria farmacéutica y química: se
usan bacterias para producir
sustancias de interés para el
hombre, como por ejemplo insulina
Industria alimentaria: se usan
bacterias para producir colorantes
alimenticios.
Agricultura y ganadería: producción de plantas y animales transgénicos.Medicina: técnicas de diagnostico
molecular y terapia génica.
CLONACIÓN GENÉTICA
Tipos de clonación
Clonación molecular Clonación celular Clonación de organismos Clonación de organismos de
manera artificial
Es el procedimiento de obtener una población de varios individuos genéticamente homogéneos a partir de uno solo mediante reproducción asexuada.
CLONACIÓN
Clonación molecular
Método mas
conocido
Extraer una parte del
ANDInstarlo
donde sea conveniente
Clonación celular
De una sola célula se
forma una cierta
población
Su uso a partir de aros o cilindros de
clonación
Agente mutagénico
Clonación de organismos
amebas
Característica fundamental
Se produce una copia de un organismo ya existente
Misma información
genética
Reproducción asexuada
CLONACIÓN DE ORGANISMOS DE MANERA ARTIFICIAL
encontramos don tipos de células las cuales participan activamente en la clonación de manera artificial
La primera de ellas es la que dona su material genético (ADN)
la segunda esla que lo recibe
Se basa en que el citoplasma del ovocito receptor tenga las cualidades necesarias para reorientar el control genético de la célula donadora para poder crear el nuevo organismo.
electrochoques se fusionanambas células
son los encargados de incitar al desarrollo de lanueva célula formada
injertada en el útero de la hembra donde se le permite un ambiente apto para su crecimiento.
Vectores de clonación Aquellos que permiten mantener el ADN exógeno en la célula hospedadora.
DIFIEREN
especificidad de la célula huésped
tamaño de los insertos que pueden transportar
número de copias que producen
número y tipo de genes marcadores que contienen
PLÁSMIDOS
CARACTERISTICAS
primeros vectores que se desarrollaron
proceden de moléculas de ADN de
doble cadena extracromosómicas
se replican autónomamente
dentro de las células bacterianas
Portan fragmentos pequeños de ADN pasajero, de entre
0,1 y 8 kb
pBR322, pUC18, pBluescript
Tienen un origen de replicación (ORI).
Se sirven de las enzimas de la célula bacteriana para replicarse, pero contienen genes reguladores de la replicación
Pueden transferirse por conjugación de una bacteria a otra, puesto que poseen genes tra (transferencia) y genes mob (movilidad)
Éstos no están presentes en los plásmidos usados como vectores, pues no interesa que se transfieran de una célula a otra
primer plásmido utilizado en biotecnología
Diseñado en 1977 por Bolívar y Rodríguez
un gen de resistencia a la ampicilina (ampr) y otro de resistencia a la tetraciclina (tetr)
Dianas de restricción: EcoRI, PstI y BamHI
Fagos Bacteriófago O Fago lambda
virus complejo de ADN lineal bicatenarioSe conoce la secuencia completa de sus48.502 pares de nucleótidos y la función desus genes
El tercio central del cromosoma contiene genes que son requeridos para lalisogenia
ciclo lítico
Parte central (de aproximadamente15 kb) del cromosoma puede ser cortada con enzimas de restricción y substituida por un fragmento de ADN foráneo
Molécula resultante de ADN recombinante puede ser empaquetada en las cabezas del fago in vitro.
ciclo lisogénicovirus se inserta en un puntoconcreto del genoma de labacteria. virus se replica cuando lo
hace la bacteria
su genoma a las réplicas deE. coli.
ciclo lítico
se producenpartículas virales
liberadas al medioBacteria hospedadora eslisada
Genoma del fago lambda
Cartografiado y secuenciado completamen
te
Eliminar partes no útiles del genoma
Introducir el ADN exógeno
Vector
Cápside sólo hay hueco para 50 kb,
vectores de sustitución se sustituye toda la región prescindible del genoma del fago por el ADN de interés
moléculas exógenas de mayor tamaño (de hasta 20-25 kb).Dos sitios de restricción
Flanquean el segmento de ADN que es sustituido por el ADN que se va a clonar.
Genoma del fago enzima de restricción
Tres fragmentos
brazo izquierdo, brazo derecho y región stuffer
Cósmidos
Permiten la introducción de insertos de ADN de hasta 45 kb
un plásmido segmentos del genoma de un bacteriófago como el fago λ
¿QUÉ CONTIENE UN CÓSMIDO?
El origen de replicación y genes marcadores de resistencia a antibióticos
plásmido
Gen lacZOrígenes de replicación para fagos como el M13
SuperCosDos sitios cos, entre los cuales se sitúa la diana de restricción Xba I
Un origen de replicación (ori).
Un sitio de clonaje múltiple (MCS), es un polylinker que no interrumpe ningún gen marcador, incluye la diana de restricción BamH I.
Dos genes marcadores: uno de resistencia a ampicilina y otro de resistencia a neomicina
SV40 ori: origen de replicación del virus animal SV40, usado para replicar el vector cuando se introduce en células animales.
¿CÓMO SE PRODUCEN LOS CÓSMIDOS RECOMBINANTES?
Enzima de restricción
BamHI
Hidroliza los grupos P de los extremos
5'
Cortar el vector y
linealizarlo
Extremos 5' OH
Emplea la enzima
fosfatasa alcalina
Evita que el plásmido se circularice de nuevo
BAC cromosoma artificial bacteriano
Usado para clonar fragmentos de ADN de 300 kb de tamaño medio
BAC
PACs BACs
Plásmido factor-F
Escherichia coli
Integrarse en el cromosoma bacteriano y es responsable de la conjugación bacteriana.
BAC(factor de fertilidad)
Genes
oriS: origen de replicación
rep: control de la replicación del plásmido
parA, parB, parC: genes implicados en el mantenimiento de un número bajo de copias (1 o 2) del plásmido en la bacteria.
No proceden del factor-F
gen de resistencia al cloranfenicol
Minigen lacZ con un polylinker (MCS) en su interior.
sitio reconocido por la enzima recombinasa, permite linealizar el vector
PAC Cromosomas artificiales
bacterianos derivados del fago P1
Alojan menos cantidad de ADN pasajero
permiten el empaquetamiento in vitro
Intervienen en la circularización del vector
Un origen de replicación
Gen marcador de resistencia a la canamicina
Gen marcador sac implicado en el metabolismo de la sacarosa
sitio de clonaje múltiple
YAC cromosoma artificial de levaduras
mayor capacidad (hasta 2 Mb) Son utilizados en construcción de genotecas genómicas
son más inestables ADN que se inserta puede proceder de dos regiones distintas del genoma
CARACTERISTICAS
BACTERIAS
LEVADURA
Origen de replicación (ori) de tipo plasmídico.
Gen marcador de resistencia a ampicilina (ampr).
Secuencia de replicación de levaduras (SRA).
Genes marcadores de selección
TRP
URA
metabolismo
Gen marcador de inserción sup adenina
Centrómero permite la segregación durante la división celular
Dos secuencias teloméricas (TEL), procedentes de un ciliado del género Tetrahymena