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20 de Enero 2012
BIOTECNOLOGÍA2012
Clase 4
Prof. Oriana SalazarCentro de Ingeniería Bioquímica y
BiotecnologíaDpto. de Ingeniería Química y Biotecnología
Fac. Ciencias Físicas y MatemáticasUniversidad de Chile
20 de Enero 2012
Endonucleasas de restricción permiten fragmentar el DNA
Las secuencias que son reconocidas por las Enzimas de restricción son palíndromes
Generan extremos cohesivos o romos
20 de Enero 2012
Otras enzimas
de restricción
20 de Enero 2012
ELECTROFORESIS DE DNA: TELECTROFORESIS DE DNA: TÉÉCNICA PARA LA SEPARACICNICA PARA LA SEPARACIÓÓN N DE FRAGMENTOS DE DNA DE DIFERENTE TAMADE FRAGMENTOS DE DNA DE DIFERENTE TAMAÑÑOO
20 de Enero 2012
Los fragmentos de DNA producidos por corte con una misma enzima de restricción
pueden ser ligadospara formar
moléculas de DNA recombinante.
20 de Enero 2012
Muchos vectores de clonamientoson producidos a partir de
plasmidios• Los plasmidios son DNA circular
extracromosomal que existe naturalmente en bacterias y en levaduras; se replica en forma autónoma.
20 de Enero 2012
Origen de replicación
Gen de resistencia a ampicilina
Gen de resistencia a tetraciclina
Sitios de corte por enzimasde restricción
CaracterCaracteríísticas de un vector de clonamientosticas de un vector de clonamiento
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Clonamiento de un gen
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vector
electroporador
Bacterias huésped
Cultivo en placas
TransformaciTransformacióón de bacterias por n de bacterias por ElectroporaciElectroporacióónn
20 de Enero 2012
Sin embargo el procedimiento de Sin embargo el procedimiento de transformacitransformacióón n no es no es 100 % eficiente, por lo tanto se requiere un m100 % eficiente, por lo tanto se requiere un méétodo todo
para seleccionar e identificar las bacterias realmente para seleccionar e identificar las bacterias realmente transformadas con el transformadas con el plasmidioplasmidio
12 h a 37 ºC
Crecimiento de colonias de bacterias resistentes al antibiótico, que por lo tanto tienen el plasmidio
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Cada colonia representa un clon de bacterias genéticamente idénticas.
Cada colonia es un conjunto de bacterias que tienen el mismo fragmento del genoma clonado
20 de Enero 2012
CELULAS USADAS COMO HUESPEDES DE CELULAS USADAS COMO HUESPEDES DE CLONAMIENTOCLONAMIENTO
1. Células procariontes:Ej: Escherichia coli, Bacillus subtilis
Ventajas: crecimiento rápido, cultivo barato, fisiología y genética bien conocida.
2. Células eucariontes:Ej. Levaduras, hongos, células de mamíferos en
cultivo, células de insecto en cultivo.
Ventajas: estas células realizan modificaciones post-traduccionales (ej. Fosforilaciones y glicosilaciones) que son importantes para la actividad de muchas proteínas de eucariontes.
20 de Enero 2012
Un Un vector de expresivector de expresióónn: : usado para producir usado para producir
proteproteíínas recombinantesnas recombinantes
Plac Olacsu gen favorito terminador
20 de Enero 2012
Bacterias bajo estrés metabólico por sobreproducción de unaproteína exógena (recombinante), baja la velocidad de crecimientode las bacterias.
Algunas proteínas recombinantes pueden ser “tóxicas” para lasbacterias.
Es mejor separar la fase de crecimiento de lascélulas de la fase de expresión del gen heterólogo.
Prot recombinante
tiempo
N d
e cé
ls/m
lIPTG
IPTG = Isopropilβ-D galactósido
Análogo de lactosa, inductor del operon lac
20 de Enero 2012
Análisis de la producción de la proteína recombinante mediante electroforesis
20 de Enero 2012
El problema es: El problema es: ¿¿CCóómo identificar y aislar un mo identificar y aislar un gen determinado desde un genoma que gen determinado desde un genoma que
contiene miles de genes?contiene miles de genes?
Gen de interés
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Reacción de polimerización de cadenas de
DNA (PCR)
2.097.152 copias
20 ciclosmas
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REQUERIMIENTOS PARA UNA REACCION DE PCRREQUERIMIENTOS PARA UNA REACCION DE PCR
• Dos oligonucleótidos sintéticos, complementarios a los extremos del DNA de interes
• Una enzima DNA polimerasa termoestable (Taq DNA polimerasa)
• Los cuatro desoxirribonucleótidos (dATP, dCTP, dGTP, dTTP).
• Una secuencia de DNA "blanco“ o molde.
´5'
3'
3'
5'
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Partidores complementarios al DNA de interés
ReacciReaccióón de Polimerizacin de Polimerizacióón de cadenas (PCR)n de cadenas (PCR)
Si el gen que se quiere aislar está en el DNA cromosomal
20 de Enero 2012
El problema es: El problema es: ¿¿CCóómo identificar y aislar un mo identificar y aislar un gen determinado desde un genoma que gen determinado desde un genoma que
contiene miles de genes?contiene miles de genes?
Gen de interés
Dos métodos:
A) PCR
B) Por hibridización en colonias
20 de Enero 2012
TraducciTraduccióón reversa de la n reversa de la secuencia de aminosecuencia de aminoáácidos de una cidos de una
proteproteíínana