20 de Enero 2012

BIOTECNOLOGÍA2012

Clase 4

Prof. Oriana SalazarCentro de Ingeniería Bioquímica y

BiotecnologíaDpto. de Ingeniería Química y Biotecnología

Fac. Ciencias Físicas y MatemáticasUniversidad de Chile

20 de Enero 2012

Endonucleasas de restricción permiten fragmentar el DNA

Las secuencias que son reconocidas por las Enzimas de restricción son palíndromes

Generan extremos cohesivos o romos

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Otras enzimas

de restricción

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ELECTROFORESIS DE DNA: TELECTROFORESIS DE DNA: TÉÉCNICA PARA LA SEPARACICNICA PARA LA SEPARACIÓÓN N DE FRAGMENTOS DE DNA DE DIFERENTE TAMADE FRAGMENTOS DE DNA DE DIFERENTE TAMAÑÑOO

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Los fragmentos de DNA producidos por corte con una misma enzima de restricción

pueden ser ligadospara formar

moléculas de DNA recombinante.

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Muchos vectores de clonamientoson producidos a partir de

plasmidios• Los plasmidios son DNA circular

extracromosomal que existe naturalmente en bacterias y en levaduras; se replica en forma autónoma.

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Origen de replicación

Gen de resistencia a ampicilina

Gen de resistencia a tetraciclina

Sitios de corte por enzimasde restricción

CaracterCaracteríísticas de un vector de clonamientosticas de un vector de clonamiento

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Clonamiento de un gen

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vector

electroporador

Bacterias huésped

Cultivo en placas

TransformaciTransformacióón de bacterias por n de bacterias por ElectroporaciElectroporacióónn

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Sin embargo el procedimiento de Sin embargo el procedimiento de transformacitransformacióón n no es no es 100 % eficiente, por lo tanto se requiere un m100 % eficiente, por lo tanto se requiere un méétodo todo

para seleccionar e identificar las bacterias realmente para seleccionar e identificar las bacterias realmente transformadas con el transformadas con el plasmidioplasmidio

12 h a 37 ºC

Crecimiento de colonias de bacterias resistentes al antibiótico, que por lo tanto tienen el plasmidio

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Cada colonia representa un clon de bacterias genéticamente idénticas.

Cada colonia es un conjunto de bacterias que tienen el mismo fragmento del genoma clonado

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CELULAS USADAS COMO HUESPEDES DE CELULAS USADAS COMO HUESPEDES DE CLONAMIENTOCLONAMIENTO

1. Células procariontes:Ej: Escherichia coli, Bacillus subtilis

Ventajas: crecimiento rápido, cultivo barato, fisiología y genética bien conocida.

2. Células eucariontes:Ej. Levaduras, hongos, células de mamíferos en

cultivo, células de insecto en cultivo.

Ventajas: estas células realizan modificaciones post-traduccionales (ej. Fosforilaciones y glicosilaciones) que son importantes para la actividad de muchas proteínas de eucariontes.

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Un Un vector de expresivector de expresióónn: : usado para producir usado para producir

proteproteíínas recombinantesnas recombinantes

Plac Olacsu gen favorito terminador

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Bacterias bajo estrés metabólico por sobreproducción de unaproteína exógena (recombinante), baja la velocidad de crecimientode las bacterias.

Algunas proteínas recombinantes pueden ser “tóxicas” para lasbacterias.

Es mejor separar la fase de crecimiento de lascélulas de la fase de expresión del gen heterólogo.

Prot recombinante

tiempo

N d

e cé

ls/m

lIPTG

IPTG = Isopropilβ-D galactósido

Análogo de lactosa, inductor del operon lac

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Análisis de la producción de la proteína recombinante mediante electroforesis

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El problema es: El problema es: ¿¿CCóómo identificar y aislar un mo identificar y aislar un gen determinado desde un genoma que gen determinado desde un genoma que

contiene miles de genes?contiene miles de genes?

Gen de interés

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Reacción de polimerización de cadenas de

DNA (PCR)

2.097.152 copias

20 ciclosmas

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REQUERIMIENTOS PARA UNA REACCION DE PCRREQUERIMIENTOS PARA UNA REACCION DE PCR

• Dos oligonucleótidos sintéticos, complementarios a los extremos del DNA de interes

• Una enzima DNA polimerasa termoestable (Taq DNA polimerasa)

• Los cuatro desoxirribonucleótidos (dATP, dCTP, dGTP, dTTP).

• Una secuencia de DNA "blanco“ o molde.

´5'

3'

3'

5'

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Partidores complementarios al DNA de interés

ReacciReaccióón de Polimerizacin de Polimerizacióón de cadenas (PCR)n de cadenas (PCR)

Si el gen que se quiere aislar está en el DNA cromosomal

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El problema es: El problema es: ¿¿CCóómo identificar y aislar un mo identificar y aislar un gen determinado desde un genoma que gen determinado desde un genoma que

contiene miles de genes?contiene miles de genes?

Gen de interés

Dos métodos:

A) PCR

B) Por hibridización en colonias

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TraducciTraduccióón reversa de la n reversa de la secuencia de aminosecuencia de aminoáácidos de una cidos de una

proteproteíínana