CINÉTICA ENZIMÁTICA

E + S SE E + P

• Proteínas con actividad catalítica de los seres vivos.• Unidades del Metabolismo• Regulan la vel. de las reac. quím. espontáneas (G-).• No promueven reacciones no-espontáneas (G +).• Incrementan la Vel. De reacción 103 a 1012 veces sin

afectar el sentido de la reacción.• No forman parte del producto de la reacción.

PROPIEDADES GENERALES• AUMENTAN LA VELOCIDAD DE REACCIÓN

– De 106 to 1012 veces vs sin enzima.– Aún más rápido que los catalizadores químicos.

• CONDICIONES DE REACCIÓN– Temperatura 25-40 oC (algunas hasta 75 oC)– pH neutro (5-9), la mayoría 6.5 – 7.5– Presión atmosférica normal

• CAPACIDAD DE REGULACIÓN– Por concentración de sustrato– Por concentración de enzima– Por inhibidores competitivos (semejantes al sustrato)– Por inhibidores no competitivos (modificación covalente de la enzima)– Por regulación alostérica

• ALTA ESPECIFICIDAD DE REACCIÓN– Interacción estereoespecífica con el sustrato– No hay productos colaterales

ALTA ESPECIFICIDAD DE REACCIÓN

INTERACCIÓNESTEREO

ESPECÍFICA CON SU

SUSTRATO

Los Substratosse acercan a la Enzima

(sitio Activo)

Enzima

Substratos

HO-

H-

Los reactivos

interaccionan

con la enzima

(sitio activo)

Cambia la

configuración de la

enzima

La unión del sustrato produce un cambio conformacional

de la enzima hexoquinasa (cinasa), la cual es monomérica.

Substrato de glucosa

Sitio de enlace

Se realiza la reacción catalítica

Leonor Michelis y Maud Menten (1913)

Tiempo

Co

nc

ent.

ECUACIÓN DE MICHAELIS-MENTENECUACIÓN DE MICHAELIS-MENTEN

Vo = V max [S]

Km + [S]

Cinética enzimática en función de la concentración de sustrato

Vmax

KM

Catalasa H2O2 25.0

Hexoquinasa ATP 0.4

D-Glucosa 0.05

D-Fructosa 1.5

Anhidrasa carbónicoa HCO3- 9.0

Quimotripsina Gliciltirosinilglicina 108.0

N-Benzoiltirosinamida 2.5

-Galactosidasa D-Lactosa 4.0

Treonina deshidrogenasa L-Treonina 5.0

Km de algunas enzimas

ENZIMA SUSTRATO Km (mM)

La KM es un parámetro de Actividad Enzimática

• La KM es inversamente proporcional con la actividad de la enzima.

• Valor de KM grande, baja actividad

• Valor de KM pequeño, alta activida

ATP + Glucosa ADP + 6-fosfato de glucosa

2 Rutas

Enzimas: pueden catalizar reacciones donde hay 2 S =

HexocinasaHexocinasa

•Desplazamiento Simple, los 2 S se unen a la E

A + B + E EAB C + D

•Doble desplazamiento o ping-pong

A + B + E AE BE + C D

Determinación Cuantitativa de la Cinética Enzimática

1. La reacción global

2. Procedimeinto analítico para determinar elS que desaparece o el P que aparece

3. Sí el E requiere Cofactores (iónes o coenzimas)

4. La dependencia de la actividad enzimática con la [S] o se la KM del S.

5. El pH óptimo

6. Un intervalo de temperatura en la que la E es estable y muestra actividad elevada.

Actividad enzimática y variación del pH

1 3 7 11 14 pH

VoPepsina 1.5

Tripsina 7.7

Catalasa 7.6

Arginasa 9.7

Fumarasa 7.8

Ribonucleasa 7.8

Enzima pH óptimo

4 37 85 Temperatura oC)

Vo

10 50 100 Coenzima

Vo

10 30 50 70 100 Tiempo (min)

Vo

1.0 Unidad de Actividad Enzimática (U):

La cantidad que transforma 1.0 mol (10-6 M) de S /min, a 25 0C, en las condiciones de medida óptima.

Actividad específica:

Es el no. de U de una E / mg de proteína.Es decir: una medida de la pureza de la E.Al purificarla, el valor llega a un máximo y es estable.

Número de recambio

No. de moléculas de S transformadas /unidad de tiempo, por una molécula de E ( o por un solo sitio catalítico)

Enzima No. de Recambio

Anhidrasa carbónica 36 000 000B-Amilasa 1 000 000B-Galactosidasa 12 000Fosfoglucomutasa 1 240

¿Vmax?

¿KM?

pendiente

Transformación de los Dobles Recíprocos

(Lineweaver-Burk)

Gráfica de Eadie-Hofstee

Vo[S]

V max KM

Vo

Vmax

Cuando:

Vo= Vmax Todos los sitios activos están ocupados y no hay moléculas de E libre.

KM= [S] Sí... ½ Vmax

KM representa la cantidad de sustrato necesaria para fijarse a la mitad de la E disponible y producir la mitad de la Vmax

KM representa la concentración del sustrato en una célula

Inhibidores

Reactivos químicos específicos que pueden inhibir a la mayor parte de las enzimas.

INHIBIDORESINHIBIDORES

Irreversibles

Reversibles

Inhibidor Irreversible

• Inhibición permanente

• Unión irreversible por medio de enlaces covalentes.

• Modificaciones químicas de los gps. catalíticos.

• Modificada la enzima, está siempre inhibida.

Para distinguirlo de los reversible se someten a diálisis y si no se separan enzima e inhibidor, éste es permanente.

Inhibidor IrreversibleFluorofosfato de diisopropilo

(DFP)

Acetilcolinesterasa

Acetilcolina

Acetato + Colina

Fluorofosfato de diisopropilo (DFP)

Inhibidor Irreversible

Malatión

Acetilcolinesterasa

Tripsina

Elastasa

Fosfoglucomutasa

Cocoonasa (larvas de gusanos de seda

Fluorofosfato de diisopropilo (DFP)

Fluorofosfato de diisopropilo (DFP) Serina

Iodoacetamida Cisteína

Histidina

• La unión del inhibidor y la enzima es reversible.

• Al quitar el inhibidor del medio, se recupera la actividad.

Hay 3 tipos:

Competitiva

No Competitiva

Acompetitiva  (Alostérica)

Inhibidor Reversible

Antibióticos

Insecticidas

Hervicidas

Venenos

Diferentes Medicamentos

Dolor

Inflamación

Infecciones virales

Cáncer

Inhibición enzimática

Inhibición Competitiva

Vmax igualKM diferente

Malonato Deshidrogenasa del ácido succínico

Sulfas Infecciones microbianas

Antihipertensores: Captopril y Enalopril

Alopurinol Controla la gota

Fluoruracilo Cáncer

Malonato Deshidrogenasa del ácido succínico

Sulfas Infecciones microbianas

Antihipertensores: Captopril y Enalopril

Alopurinol Controla la gota

Fluoruracilo Cáncer

Inhibidores Competitivos

El inhibidor NO se une al sitio activo

Inhibición No Competitiva

NO se puede revertir con un exceso de sustrato

Vmax diferente KM igual

Cinéticas de InhibiciónCompetitivoVmax igualKM diferente

No competitivoVmax diferenteKM igual No inhibitor

1V

1/[S]0

Inhibición acompetitiva

I

El inhibidor se une a una SUBUNIDAD reguladora

La subunidad catalítica une al sustrato y cataliza la reacción