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CARRERA DE ESPECIALIZACION EN CARRERA DE ESPECIALIZACION EN

BIOTECNOLOGIA INDUSTRIALBIOTECNOLOGIA INDUSTRIAL

FCEyNFCEyN--INTIINTI

Materia de Especialización CEBI_E11

RECUPERACIÓN Y PURIFICACIÓN DE MACROMOLÉCULAS

Docente a cargo: Mariano GRASSELLI

CEBI_E11_7 : CEM y CIH

Cromatógrafo de proteínas

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Size Exclusion Chromatography

(SEC)

Diferencias entre Cromatografías

adsortivas y NO adsortivas

• Volumen de separaciónen los métodos no adsortivos toda la separación de los

componentes de la muestra se efectúa en un volumen

que como máximo es igual al volumen total de la

columna.

• Dilución/concentración de la muestra:

los no adsortivos diluyen la muestra.

• Volumen de siembra

la cantidad de muestra en los no adsortivos siempre

es menor que el volumen de la columna.

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Nombre de la cromatografía de

exclusion molecular

Luego de su descubrimiento en los años '50,

esta técnica recibió distintos nombres

Cambió de nombre con los años

– Cromatografía de filtración en geles

(gel filtration-Nombre elegido por fabricantes)

– Cromatografía de permeación de geles.

– Cromatografía en tamices moleculares.

– Cromatografía de exclusión molecular.

(de acuerdo al principio cromatografico)

Características de la

cromatografía de exclusión

molecularLos factores (ventajas) que la hacen importante para la purificación de proteínas en gran escala son:1) Es el único método cromatográfico para el fraccionamiento

de proteínas basado únicamente en el tamaño molecular.

2) Las únicas limitaciones en cuanto a la concentración de soluto son su solubilidad y la viscosidad de la solución.

3) Es un proceso muy suave y las recuperaciones son altas.

4) La operación es isocrática.

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En los laboratorios de investigación(según 2 encuestas realizadas en 1968 y 1982)

Journal of Biological Chemistry

60% incluyen un paso de CEM.

En la industria hay cierta reticencia por los problemas (desventajas) siguientes:1) Bajas productividades por la escasa capacidad

de las columnas.

2) Bajas eficiencias de columna.

3) Provoca dilución del soluto.

4) Falta de información acerca de los costos de las operaciones en gran escala.

Estructura química y propiedades de

las matrices cromatográficas de CEM

En base a Dextrano• SEPHADEX (Dextrano + epiclorhidrina) Pharmacia.

• SEPHACRYL (alil-dextrano + bisacrilamida) Pharmacia.

En base a AgarosaSEPHAROSE (Agarosa sin entrecruzamiento) Pharmacia.

SEPHAROSE CL (Agarosa + 2,3 dibromopropanol) Pharmacia.

En base a CelulosaCELLUFINE (Celulosa sin entrecruzamiento) Amicon.

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De composición mixtaSUPERDEX (dextrano y agarosa entrecruzados) Pharmacia.

En base a polímeros sintéticosTRISACRYL (metacrilatos) IBF.

ULTROGEL AcA (Acrilamida + bisacrilamida) IBF.

FRACTOGEL (copolímero de oligoetilenglicol, glicidil

metacrilato y pentaeritol dimetacrilato) Merck.

BIOGEL (acrilamida-metilenbisacrilamida) Bio-Rad.

El volumen total de una columna (volumen de lecho o "bed volume") es la suma de 3 componentes: V0, Vi y Vm.

•V0 (volumen muerto)

es el volumen de líquido exterior a las partículas de la matriz cromatográfica.

•Vi (volumen de imbibición):

es el volumen de solvente que está dentro de los poros de las partículas de la matriz cromatográfica.

•Vm (volumen de matriz):

es el volumen ocupado por la matriz cromatográfica en sí.

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Representación gráfica

Me independizo del vol de la columna

Me independizo del vol de la columna

y empaque

Volumen de elucion (Ve)

Depende de las dimensiones de la columna y del empaque

(si las partículas de matriz cromatográfica están más o menos compactadas.

Ve/Vt, Ve/V0, y R

Son valores independientes de las dimensiones de la columna pero dependientes de cómo se la haya empacado.

Kd y Kav

Son expresiones del comportamiento de un soluto independientes de las dimensiones de la columna y del empaque.

Kd representa la fracción de la fase estacionaria a la que puede acceder por difusión una determinada sustancia.

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Compresibilidad de las matrices

Superosa 6

Superosa 12

> entrecruzamiento > rigidez pero < rango de fracc

Tipos de matrices de SEC

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Relación entre Tpo ret y peso molecular

Optimización del volumen de

muestraOperación: desalado

Aumento del

volumen de

muestra

Volumen óptimo

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Efecto de la viscosidad sobre la

Rs

Aumento de

la viscosidad

de muestra

Modo de funcionamiento

Siempre se trabaja en columna

•Batch

•Continuo

Columnas

• Verticales

• Radiales

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Columnas radiales

Entrada por centro Entrada por exterior

Operación de sistemas continuos

Columna anular con rotación

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Aplicaciones de la CEM

Hay 3 aplicaciones potenciales de la

CEM a nivel industrial:

– Separación de grupos

– Fraccionamiento

– Concentración de macromoléculas

Separación de grupos

Desalificación

Cambio de buffer

Se trabaja con dos sustancias (o grupos) de muy diferente Ve.

Kd = 1 (sal) y otra con Kd = 0 (macromolécula).

Se usan matrices cromatográficas de:

– Alto grado de entrecruzamiento

– Poros pequeños

– Alta resistencia mecánica.

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Condiciones de trabajo

(que atentan contra la resolución) – Flujos altos (2-3 volúmenes de columna/hora)

– Volúmenes de muestra grandes

(hasta 30% del volumen total de la columna)

– Columnas cortas

El largo de columna normal => 60-90 cm.

Para el escalado debe optimizarse la separación a escala de laboratorio

⇒se aumenta el tamaño de la columna en función del volumen de muestra

⇒Aumentar el diámetro

⇒Altura constante

⇒Flujo lineal constante

Diámetro = 5 cm Diámetro = 40

cm

Longitud de columna (cm) 60 60

Volumen total de columna

(l)

1,2 75

Volumen de muestra (l) 0,3 X=18,75

Flujo lineal (cm/h) 192 192

Flujo volumétrico (l/h) 3,8 240

Flujo volumétrico (Vt/h) 3,2 3,2

Ejemplo de escalado

columna para desalado

Constante

Constante

Constante

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Ejemplo: Eliminación de etanol de

la fracción V de Cohn

• Columna: 40cm (d) x 60 cm (h) => 75 L

• Relleno Sephadex G-25 coarse

• Flujo Lineal 240 cm/h

• Muestra: 12 L fracción V90mg/ml HSA + 9% etanol

• Factor de dil 1,5-1,9

• Vol buffer 56 L

• Tiempo del proceso 15 min

16 % muestra

• Sanitización

– 2% NaOH

– 1% formaldehido

• Nro de ciclos útiles

– > 7000 o dos años de producción

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Fraccionamiento

Hay que separar sustancias de tamaños no tan distintos, dentro del rango de fraccionamiento de la matriz cromatográfica.

Las macromoléculas deben entrar parcialmente en los poros, por lo que deben usarse matrices cromatográficas de poros más grandes que para la separación de grupos

(en gral. Matrices poco entrecruzadas, baja resistencia mecánica).

Columnas de laboratorio => efecto pared

Como debe discriminarse entre 2 ó más sustancias no tan distintas, los flujos a utilizar son menores y el volumen de muestra sembrada también menor que en la separación de grupos (no más del 10% del volumen total de la columna).

Soluciones a la compresibilidad

columnas modulares en pilas (stack). Los módulos son de 15 cm de alto y se unen por cañerías

delgadas, con lo que se llega a la altura deseada por suma de módulos sin que haya problemas con el gel.

Si en primer modulo se tapa, se la puede reemplazar fácilmente.

La CEM en modo fraccionamiento sólo se usa al final de un proceso de purificación como acondicionamiento final (polishing) para eliminar los agregados de una preparación de una macromolécula.

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Escalado

• Usar soluciones con una viscosidad <=

4 cP (aprox 40 mg/ml de proteínas)

• Ajustar el largo de la columna para

obtener la Rs necesaria

• Ajustar el flujo para satisfacer el tiempo

del ciclo

• Aumentar el volumen de muestra

Aumentar el diámetro de la columna

Manteniendo

el mismo flujo lineal

la misma relación Vmtra/Vcol

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Diámetro = 5 cm Diámetro = 37

cm

Longitud de columna (cm) 60 60 (4 x 15 cm)

Volumen total de columna

(l)

1,2 64

Volumen de muestra (l) 0,09 X= 5

Flujo lineal (cm/h) 16,2 11,25

Flujo volumétrico (l/h) 0,32 12

Flujo volumétrico (Vt/h) 0,27 0,18

Ejemplo de escalado

columna para fraccionamiento

Constante

Constante?

Constante?

Otros contaminantes de

bajo PM

Albúmina

Agregados

macromoleculares

Ejemplo industrial: último paso de la purificación de albúmina de plasma.

La muestra viene de CII y deben eliminarse los polímeros (agregados de albúmina) a

la vez que cambiarse el buffer para llevarlo al de la formulación de venta.

Previo al pasaje por columna la muestra se concentra por UF.

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Optimización del tiempo del

proceso

• El tiempo del proceso se puede reducir hasta en un 33%

– Estrategia 1: aplicar una nueva muestra después que 2/3 del volumen de la columna haya eluido.

(solo cuando los contaminantes eluyencerca)

– Estrategia 2: aumentar el flujo al máximo una vez que la proteína ha eluido.

Esta cromatografía explota las pequeñas

diferencias en parches hidrofóbicos

dispuestos en la superficie de las proteínas.

CIH se descubrió por casualidad durante el desarrollo de la

cromatografía de afinidad.

las proteínas se unían fuertemente a los brazos espaciadores

de hexametileno ( -(CH2)6-), aún sin extremos cargados (NH2

ó COOH).

Cromatografía de interacción

hidrofóbica (CIH)

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De la superficie de un proteína,

aproximadamente el 45 % corresponde a

residuos hidrofobicos y estos no están

distribuidos homogéneamente sino en

pequeños “parches hidrofobicos”.

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aumento de la entropía (∆S>0)

resultado de la eliminación de agua en estado ordenado a un

estado desordenado.

El objetivo que se persigue en esta

cromatografía es:

• Reducción de contaminantes críticos,

• Reducción de volumen de muestra

• Preparación para otra cromatografía de

alta resolución.

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Comparación de la resolución en la

separación de sustancias entre

cromatografías

Caf CII CIH CEM

Mayor resol. Menor resol.

Ligandos más comunes

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Incremento de la hidrofobicidad

fuerza de interacción

Metil < Etil < Propil < Butil < Fenil < Pentil < Hexil < Heptil < Octil

selectividad de adsorción

Tipo de ligando

También se ha encontrado que el hetero-átomo que une el ligando es importante en la selectividad.

Ej En la purificación de el antígeno de la Hepatitis B recombinante

la matriz S-butil > selectividad que el O-butil

Condiciones para la adsorción

Alta fuerza iónica

(p/mtra desconocida: Sulfato de amonio 1 M)

pH bajo para ligandos aromáticos y alto para ligandos alifáticos cargados positivamente.

(p/mtra desconocida: fosfato 50mM pH 7.0)

Alta temperatura.

Alto grado de sustitución.

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Sulfato de amonio

MAB de líquido ascítico

Efecto de la concentración

salina en la adsorción

% adsorcion

NaCl (M)

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Efecto de la temperatura en

el tpo de retención

Condiciones para la elución

Baja fuerza iónica.

Baja temperatura.

Solventes orgánicos.

Polioles (como el etilenglicol).

Detergentes no iónicos.

Iones caotrópicos (como el SCN)

pH alto para ligandos aromáticos y bajo para

los alifáticos cargados positivamente.

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Grado de sustitución

�Concentración de ligando

Es un parámetro a optimizar

Se pueden encontrar comercialmente matrices con

el mismo ligando y diferente grado de sustitución.

aumenta la fuerza de interacción

Matriz de base

Según la hidrofobicidad del soporte puede ser

necesario cambiar las condiciones de la HIC.

En gral. Las matrices tienen que ser muy

hidrofilicas para evitar una interacción

adicional (al ligando) y evitar la

desnaturalización proteica.

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Tipo de sal

Series de Hofmeister

> Efecto caotropico< Efecto salting out

Esquema de las superficies

de las matrices

Zona hidrofilicaZona hidrofóbica

RPRP HICHIC

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RP HIC

Grado de sustitución ciento µmoles/ml 10-50 µmoles/ml

Longitud de ligandos C3-C18 C3-C8

Soporte silica-polímeros Hidrogeles y polímeros

Eluyente Solvente / agua Soluciones acuosas

Estructura 3D proteica Se pierde parcialmente Se conserva

Resolución Alta Baja

Residuos que

interaccionan

Aa superficiales e

interiores

Aa superficiales

Aplicación Analítica Preparativa

Similitudes y diferencias

entre HIC y RP

Cromatografía de Fase

Reversa de proteínas

Se agrega al buffer de corrida TFA para neutralizar las cargas a

través del mecanismo de formación de pares iónicos

Se utilizan columnas de sílica-C18 de alta porosidad

(poros de 300 A)

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Ejemplo de cromatografía RP

Aplicaciones industriales: proteínas terapéuticas de bajo PM

estabilizadas por puentes disulfuro

Cambiar pH

Cambiar ligando

Cambiar densidad ligando

Ejemplo de cromatografía CIH

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Gradientes

Ligandos tiofílicos

• Interacción a través de Trp y Pheaccesibles al solvente

• Elución en condiciones suaves

• Regeneración

– NaOH 0,1 a 0,5 M

– 50% etilenglicol

– Etanol 20%

– Urea 6 M

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Tiofilico tipo 3-S

Muestra IgG humana

Matrices de interacción mixta

Mercapto etil piridina

Ligando para IgG

Adsorción en fuerza iónica fisiológica (0,1 – 0,20 M)

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Matrices para eliminar

detergentes