Post on 11-Apr-2015
BIOLOGIA MOLECULAR BIOLOGIA MOLECULAR
APLICADA AL LABORATORIO APLICADA AL LABORATORIO
DE MICROBIOLOGIADE MICROBIOLOGIA
BIOLOGIA MOLECULAR BIOLOGIA MOLECULAR
APLICADA AL LABORATORIO APLICADA AL LABORATORIO
DE MICROBIOLOGIADE MICROBIOLOGIA
Dra Daniela CentrónDepto de Microbiología, Parasitología e Inmunología
de la Facultad de Medicina de la Universidad de Buenos Aires
CONICET
Que es la biología molecular?
• Estudio de la biología a nivel molecular
Se superpone con áreas de la biología y la química, en
particular genética y bioquímica
• Estudio de los procesos celulares
De la genética clásica a la biología molecular
al diagnóstico especializado……
CONTENIDOS
I. CONCEPTOS BASICOS INTRODUCTORIOS A. Biosíntesis de ácidos nucleicos: replicación, transcripción. B. Biosíntesis de proteínas: traducción. C. Marcos de lectura abiertos. Operones y regulones.
II. TECNOLOGIA DEL ADN RECOMBINANTE A. Enzimas utilizadas en biología molecular. B. Vectores de clonado y de expresión. C. Construcción de bibliotecas genómicas.
III. CONCEPTOS BASICOS DE GENETICA MICROBIANA A. Mutaciones y mutantes. B. Elementos extracromosómicos. Plásmidos. C. Adquisición de material genético exógeno.
IV. METODOLOGIAS BASADAS EN LA IDENTIFICACION DE SECUENCIAS DE A. NUCLEICOS
A. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR). B. Hibridización de ácidos nucleicos. C. Epidemiología molecular bacteriana. D. ADN ramificado (branched DNA). E. Secuenciación de ácidos nucleicos.
VI. SEMINARIOS DE INTEGRACION
V. DIAGNOSTICO MOLECULAR DE AGENTES ETIOLOGICOS MICROBIANOS
A. Bacterias B. Virus C. Hongos D. Mecanismos de resistencia a antibióticos
CRONOLOGÍA
Mendel 1866
Genética AM y DM
GENÉTICA AM
Las partículas de la herencia se mezclaban
Un parental aporta más que el otro
Herencia de caracteres adquiridos
MENDEL Y LOS “FACTORES” DE LA HERENCIA
LA GENÉTICA Y
LOS GENES......
GENÉTICA DM
Que características debería presentar el material hereditario?
Perpetuarse (replicarse) Manifestarse (expresarse) Cambiar (mutar) Combinarse (recombinarse)
ADN o PROTEÍNAS?
….en busca del material hereditario….
1902-Theodore Boveri- William Sutton
Establecen la hipótesis según la cual los cromosomas, segregados de modo mendeliano, son unidades hereditarias.
1865
1865 1915 - T.H. Morgan
Los genes se disponían linealmente en el cromosoma
Se comienza a hablar de genética.....
1865 1928 - Frederick Griffith
Bacteria
Inyección
Resultados
Células L vivas
Células R vivas
Células L muertas por
calor
Células L muertas por calor junto a celular R
vivascápsula
Transformación de Streptococcus pneumoniae
Colonias “Rugosas” Colonias “Lisas”
“factor de transformación”
1865 1944 - Avery, MacLeod & McCarty
Oswald Avery Colin MacLeod Maclyn McCarty
El ADN de las células lisas transformaba a las rugosas
El ADN purificado es “el factor de transformación”
Su teoría fue rechazada por dos razones:
De ser así cada especie debería tener un tipo diferente de ADN
La composición química del ADN era demasiado simple para contener toda la información para la vida
1865 1952 - Hershey & Chase
El ADN viral (no las proteínas) programa las células
Martha Chase & Alfred Hershey Bacteriófagos
… “los genes se componen de ADN, base química de la herencia”…
LA ESTRUCTURA DEL ADN...
1865 1947 - Erwin Chargoff
Las bases de ADN siguen ciertas reglas
La composición es especie específica
A = T, C = G en todas las especies
AT GC
1865 1953 - Franklin & Wilkins
La naturaleza helicoidal del ADN
Fuente de rayos X
DNA cristalizado
Rosalind Franklin
Maurice Wilkins
Film fotográfico
1953 - Watson & Crick1865
Descripción de la estructura tridimensional del ADN
Francis Crick & James Watson
1953 - Watson & Crick1865
Que dedujeron de:
Datos de R. Franklin• hélice doble• ancho uniforme de 2 nm• bases separadas por 0.34 nm
Chargoff• la adenina se aparea con la timina• la citocina se aparea con la guanina
1953 - Watson & Crick1865
Que dedujeron ellos mismos?
• Las bases están hacia adentro, y los fosfatos y las azúcares hacia afuera
• Enlaces de hidrógeno
• Hebras antiparalelas
• Sugirieron un modo semi-conservativo de replicación
ESTRUCTURA DEL ADN
J. D. WATSON and F. H. C. CRICK
... 2 de abril de 1953, Molecular Structure of Nucleic Acids.A Structure for Deoxyribose Nucleic Acid. Nature 171: 737.No más de 900 palabras…..
POLÍMERO LARGO,
NO RAMIFICADO,
COMPUESTO PORCUATRO TIPOS
DE SUBUNIDADES
Bases nitrogenadas
QUE ES EL ADN???
Se combinan con azúcares y fosfatos
DESOXIRIBONUCLEÓTIDOS
Nucleótido=base+azúcar+fosfatoNucleósido=base+azúcar
MONÓMERO
5´
5´
ENLACE FOSFODIESTER ENTRE EL CARBONO 5´ DE UNA DESOXIRRIBOSA CON EL GRUPO FOSFATO DEL SIGUIENTE NUCLEÓTIDO FORMANDO UN NUCLEÓTIDO MONOFOSFATO.
EL POLÍMERO SE FORMA AL ENLAZAR LOS FOSFATOS AL 3´ DEL OTRO NUCLEÓTIDO
Del nucleótido al ADN
DIRECCIÓN(5´a 3´)
Estructura estabilizada por puentes hidrógeno •Doble hebra
•Antiparalela
5´
3´
3´
5´
ESTRUCTURA PRIMARIA
Apareamiento: A-TG-C
Polímero uniformeSurco menor
Surco mayor
10 bases por vuelta
ESTRUCTURA SECUNDARIA
REGIONREGULATORIA
Codón de iniciación Codón de terminación
ADN en Procariotas
Cromosoma bacteriano ADN doble cadena (1mm long)circular cerrado Condensado y ordenado (“supercoiled” o superenrollado)
1865
ESTRUCTURA TERCIARIA
Plásmidos en Procariotas
• Tamaño de 1 a 400Kb• Cantidad variable de copias en una célula• Origen de replicación propio• Pueden movilizarse a otros genomas• Puede integrarse al cromosoma bacteriano
1865
•1 o más cromosomas de ADN (hasta 1200 en helechos)•Localizado en núcleo •Empaquetado por histonas y otras proteínas cromatina
Moléculas de ADN en mitocondrias y cloroplastos
ADN en Eucariotas 1865
Semiconservativa:dos hebras generan una copia cada
una
Replicación del ADN1865
comienza siempre en una secuencia específica de nucleótidos conocida como origen de replicación,
en el que hay un gran contenido de adenina y timina.
Iniciación1865
Unión de iniciador
iniciador
Síntesis de primers de ARN
Formación de dos hebras de replicación
ADN circulares(Procariotas)
Origen de replicación (oriC)
1865
Iniciación de la replicación
Horquillas se mueven en dirección opuesta
ADN lineales(Eucariotas)
Varios replicones
Iniciación
ADN primasa
ARN primer
ADN ligasaADN polimerasa
III
Frag. de Okazaki
Topoisomerasa
Proteínas de unión al ADNssHelicasa
Hebra líder
Hebra retrasada
ADN polimerasa III
1865Elongación
La ADN polimerasa sintetiza las nuevas cadenas, complementarias a cada una de las cadenas primitivas, en sentido 5´ → 3´ partiendo de un ARN corto específico llamado ARN cebador –molécula formada por nucleótidos de ARN
catalizados por ARN primasas- que determina el punto por donde la ADN polimerasa comienza a añadir nucleótidos.
“Proof-reading”
Incorporación de G X A
Pol III escinde G con actividad exonucleasa 3´ a 5´
Incorporación de A
DNA polimerasa comete un error cada 10DNA polimerasa comete un error cada 1088 – 10 – 101010 bases bases
Fragmentos de Okazaki
Cuando una ADN polimerasa hace contacto con el extremo de otro fragmento de Okazaki contiguo, el ARN cebador de este es eliminado y otra enzima, la ADN ligasa,
conecta los dos fragmentos de Okazaki de ADN recién sintetizado, catalizandolas reacciones de condensación que unen los grupos fosfato y azúcar de los
nucleótidos contiguos y así, una vez unidos todos los fragmentos de Okazaki se completa la doble hélice de ADN.
Terminación
Ligasa
1865
1865 1957 - Francis Crick
Propuso el dogma central
ADN
ARN
PROTEINAS
Transferencia de informaciónTransferencia de informaciónbiológicabiológica
•Ácidos nucleicos•Macromoléculas
•Polímeros (monómero de nucleótidos)•Uniones fosfodiéster
•Moléculas más grandes que se conocen.
El ADN y el ARN 1865
Diferencias entre la química del ADN y el ARN
El ARN tiene como carbohidrato a la ribosa
en lugar de la desoxirribosa.
El ARN tiene como base el uracilo en lugar
de la timina.
Una célula típica contiene 10 veces más ARN que ADN.
El ARN no es una doble cadena excepto en algunos virus.
1865
Estructura del ARN1865
Tipos de ARN según sus funciones
ARNrARNr(ribosomal)(ribosomal)
Componente principal del ribosoma
•Decodifica el ARNm para sintetizar las proteínas•Interacciona con ARNt durante la traducción•En Procariotas, dos subunidades principales 30Sy 50S•En Eucariotas, 40S y 60
1865
Tipos de ARN según sus funciones
ARNtARNt(de transferencia)(de transferencia)
•Encargados de transportar los aminoácidos a los ribosomas para incorporarlos a las proteínas, durante el proceso de síntesis proteica. •Decodificación mediante apareamiento con el codón del ARNm
anticodónanticodón
aaaa
1865
ARNnc o ARN no codificante: ARN funcional que no codifica para síntesis proteica (ARNr y ARNt)
ARN corto de interferencia (siARN: del inglés: small interfering RNA ): son componentes de una gran respuesta antiviral denominada interferencia del ARN involucrados en la regulación.
Ribo-llaves (ribo-switches): son formas de ARN que actúan como llaves "encendido-apagado" de gran precisión.
ARN catalíticos o ribozimas: ARN con estructura secundaria que le confiere a la molécula propiedades catalíticas como corte de ARN o ADN y ligación.
El ARN posiblemente fue el primer biopolímero
que apareció en la corteza terrestre durante el transcurso de la evolución.
Tipos de ARN según sus funciones1865
Como se leen los ARNm??
1961- Nirenberg y Ochoa
Sistema libre de células
UUUUUUUU fenilalaninaAAAAAAAA lisinaCCCCCCCC prolinaGGGGGGG glicina
1865
43=64
El código genético
ARNm
Demostraron que hay 61 tripletes -o codones- que codifican aminoácidos,
muchos de los cuales son codificados por más de un codón,por lo que se dice que el código está degenerado.
y los tres restantes no son codificantes sino que son utilizados como señales de terminación.
TRANSCRIPCIÓN
Requerimientos:
Cadena de ADN
como matriz ARN polimerasa Ribonucleósidos
trifosfatos Región promotora
1865
ADN
ARN
PROTEINAS
TRANSCRIPCION
ARN polimerasa
Principio de un genADN
La ARN polimerasa junto a factores de transcripción se une a sitio donde va a iniciar la transcripción
Iniciación
Promotor
•Dos regiones conservadas en el ADN (-10 y -35) que son reconocidas por factor sigma.•ARN polimerasa luego se une y sintetiza ARN de 5´ a 3´•Un promotor expresa varios genes (OPERÓN)
En bacterias
Promotor en Eucariotas
•Región promotora
•Involucra varios factores de transcripción (proteínas)
•Cada gen tiene su promotor
TRANSCRIPCION
Hebra antisentido
Dirección de la transcripción5´del gen
3´del gen
ARNm
ElongaciónUna cadena de ARN se une por apareamiento de bases a la cadena de ADN
y la ARN polimerasa es la encargada del enlace fosfodiéster.
Hebra sentido: contiene la información
genéticaHebra antisentido:
provee el molde para la síntesis del ARNm
3´ del ARNm
5´del ARNm
TRANSCRIPCIÓNLa ARN polimerasa
deja el ADN
ARN mensajero liberado
El ADN se aparea nuevamente
•Rho-independiente (Secuencias palindrómicas del ADN que en estadio de ARN adopta una estructura en horquilla) •Rho-dependiente (mediada por la proteína)
TerminaciónDesestabilización del complejo ARN-ADN
TRANSDUCCIÓN1865
ADN
ARN
PROTEÍNAS
El nombre proteína proviene de la palabra griega proteios,
que significa lo primero.
Las proteínas son macromoléculas formadas por aminoácidos
TRADUCCION
ARNt Sitio de unión al aminoácido
Uniones hidrógeno entre pares de bases
La iniciación procariótica es el resultado de la asociación de las subunidades pequeña y grande del ribosoma y el acoplamiento del primer aminoacil-ARNt (fmet-ARNt) con el codón de iniciación mediante el emparejamiento de bases anticodón-codón.
Iniciación
TRADUCCION
Elongación
La elongación de la cadena polipeptídica consiste en la adición de aminoácidos al extremo carboxilo de la cadena.
TRADUCCION
Continua la elongación
Este proceso continua hasta que llega a un codón stopPolipéptido
Creciente
TRADUCCION
La terminación ocurre cuando se llega a uno de los tres codones de terminación del ARNm, que no son reconocidos por ningún ARNt.
Terminación
Nueva proteína sintetizada
Carboxilo terminalAmino terminal
Un segmento de ADN que contribuye a un fenotipo/función. En ausencia de una función
demostrable, un gen puede ser caracterizado por secuencia, transcripción u homología.
Human Gene Nomenclature Committee
QUÉ ES UN GEN ?
En Procariotas.....
OperónTranscripción policistrónica (ARNm de varios genes)
En Eucariontes...
REGIONREGULATORIA
+1FIN
TRANSCRIPCION
EXONES
INTRONES
Un promotor para cada gen
LA DECADA DE LOS 70
1865 1970 - Smith & Nathans
Descubrimiento de las enzimas de restricción
Hamilton Smith• Descubrió HindII en Haemophilus influenzae
Daniel Nathans• Utilizó HindII para hacer el primer mapa de restricción del SV40
1865 1972 - Paul Berg
El primer ADN recombinante utilizando EcoRISitios de reconocimientoEcoRI
DNA plasmidico
EcoRI corta el DNA en fragmentos
Extremos pegajosos SV40 DNA
DNA ligasaDNA
recombinante
1865 1973 - Boyer, Cohen & Chang
Stanley Cohen & Annie Chan
Herbert Boyer
Gen resistente a la canamicina
Plasmid pSC101
Gen resistente a la tetraciclina
E. coli transformada con plásmidos recombinantes
Medio con canamicina y tetraciclina
Sólo crecen colonias recombiantes
Transformación de E. coli con plásmidos recombinantes
1865 1977 - Genentech, Inc.
• Compañía fundada por Herbert Boyer y Robert Swanson en 1976
• Considerada el advenimiento de la edad de la biotecnología
La primera proteína humana producida por una bacteria transgénica (somatostatina)
LA DECADA DE LOS 80
1865
1980• La suprema corte de U.S. permite patentar formas de vida
1985• Se prueban plantas modificadas genéticamente
En 1988 el National Center for Biotechnology Information (NCBI) y el GenBank
Margaret Dayhoff
LA DECADA DE LOS 90
1865
1995• primer genoma: Haemophilus influenzae.
1996• Genoma de Saccharomyces cerevisiae
•1997 • Se clona Dolly
1998• Genoma de C. elegans
LOS 90: GENOMAS Y CLONES
COMO FUNCIONA UN GENOMA?
GENÓMICA Y PROTEÓMICA
26 de junio del 2000: se concluyó el proyecto del GENOMA HUMANO, en el cual se invirtió más de 3.000 millones de dólares…..
EL FUTURO......
Genómica biológica
Genómica y salud
Genómica y sociedad
MUCHAS GRACIAS!!!!!!!!!!!
dcentron@gmail.com