BIOLOGIA MOLECULAR BIOLOGIA MOLECULAR

APLICADA AL LABORATORIO APLICADA AL LABORATORIO

DE MICROBIOLOGIADE MICROBIOLOGIA

BIOLOGIA MOLECULAR BIOLOGIA MOLECULAR

APLICADA AL LABORATORIO APLICADA AL LABORATORIO

DE MICROBIOLOGIADE MICROBIOLOGIA

Dra Daniela CentrónDepto de Microbiología, Parasitología e Inmunología

de la Facultad de Medicina de la Universidad de Buenos Aires

CONICET

Que es la biología molecular?

• Estudio de la biología a nivel molecular

Se superpone con áreas de la biología y la química, en

particular genética y bioquímica

• Estudio de los procesos celulares

De la genética clásica a la biología molecular

al diagnóstico especializado……

CONTENIDOS

I. CONCEPTOS BASICOS INTRODUCTORIOS A. Biosíntesis de ácidos nucleicos: replicación, transcripción. B. Biosíntesis de proteínas: traducción. C. Marcos de lectura abiertos. Operones y regulones.

II. TECNOLOGIA DEL ADN RECOMBINANTE A. Enzimas utilizadas en biología molecular. B. Vectores de clonado y de expresión. C. Construcción de bibliotecas genómicas.

III. CONCEPTOS BASICOS DE GENETICA MICROBIANA A. Mutaciones y mutantes. B. Elementos extracromosómicos. Plásmidos. C. Adquisición de material genético exógeno.

IV. METODOLOGIAS BASADAS EN LA IDENTIFICACION DE SECUENCIAS DE A. NUCLEICOS

A. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR). B. Hibridización de ácidos nucleicos. C. Epidemiología molecular bacteriana. D. ADN ramificado (branched DNA). E. Secuenciación de ácidos nucleicos.

VI. SEMINARIOS DE INTEGRACION

V. DIAGNOSTICO MOLECULAR DE AGENTES ETIOLOGICOS MICROBIANOS

A. Bacterias B. Virus C. Hongos D. Mecanismos de resistencia a antibióticos

CRONOLOGÍA

Mendel 1866

Genética AM y DM

GENÉTICA AM

Las partículas de la herencia se mezclaban

Un parental aporta más que el otro

Herencia de caracteres adquiridos

MENDEL Y LOS “FACTORES” DE LA HERENCIA

LA GENÉTICA Y

LOS GENES......

GENÉTICA DM

Que características debería presentar el material hereditario?

Perpetuarse (replicarse) Manifestarse (expresarse) Cambiar (mutar) Combinarse (recombinarse)

ADN o PROTEÍNAS?

….en busca del material hereditario….

1902-Theodore Boveri- William Sutton

Establecen la hipótesis según la cual los cromosomas, segregados de modo mendeliano, son unidades hereditarias.

1865

1865 1915 - T.H. Morgan

Los genes se disponían linealmente en el cromosoma

Se comienza a hablar de genética.....

1865 1928 - Frederick Griffith

Bacteria

Inyección

Resultados

Células L vivas

Células R vivas

Células L muertas por

calor

Células L muertas por calor junto a celular R

vivascápsula

Transformación de Streptococcus pneumoniae

Colonias “Rugosas” Colonias “Lisas”

“factor de transformación”

1865 1944 - Avery, MacLeod & McCarty

Oswald Avery Colin MacLeod Maclyn McCarty

El ADN de las células lisas transformaba a las rugosas

El ADN purificado es “el factor de transformación”

Su teoría fue rechazada por dos razones:

De ser así cada especie debería tener un tipo diferente de ADN

La composición química del ADN era demasiado simple para contener toda la información para la vida

1865 1952 - Hershey & Chase

El ADN viral (no las proteínas) programa las células

Martha Chase & Alfred Hershey Bacteriófagos

… “los genes se componen de ADN, base química de la herencia”…

LA ESTRUCTURA DEL ADN...

1865 1947 - Erwin Chargoff

Las bases de ADN siguen ciertas reglas

La composición es especie específica

A = T, C = G en todas las especies

AT GC

1865 1953 - Franklin & Wilkins

La naturaleza helicoidal del ADN

Fuente de rayos X

DNA cristalizado

Rosalind Franklin

Maurice Wilkins

Film fotográfico

1953 - Watson & Crick1865

Descripción de la estructura tridimensional del ADN

Francis Crick & James Watson

1953 - Watson & Crick1865

Que dedujeron de:

Datos de R. Franklin• hélice doble• ancho uniforme de 2 nm• bases separadas por 0.34 nm

Chargoff• la adenina se aparea con la timina• la citocina se aparea con la guanina

1953 - Watson & Crick1865

Que dedujeron ellos mismos?

• Las bases están hacia adentro, y los fosfatos y las azúcares hacia afuera

• Enlaces de hidrógeno

• Hebras antiparalelas

• Sugirieron un modo semi-conservativo de replicación

ESTRUCTURA DEL ADN

J. D. WATSON and F. H. C. CRICK

... 2 de abril de 1953, Molecular Structure of Nucleic Acids.A Structure for Deoxyribose Nucleic Acid. Nature 171: 737.No más de 900 palabras…..

POLÍMERO LARGO,

NO RAMIFICADO,

COMPUESTO PORCUATRO TIPOS

DE SUBUNIDADES

Bases nitrogenadas

QUE ES EL ADN???

Se combinan con azúcares y fosfatos

DESOXIRIBONUCLEÓTIDOS

Nucleótido=base+azúcar+fosfatoNucleósido=base+azúcar

MONÓMERO

5´

5´

ENLACE FOSFODIESTER ENTRE EL CARBONO 5´ DE UNA DESOXIRRIBOSA CON EL GRUPO FOSFATO DEL SIGUIENTE NUCLEÓTIDO FORMANDO UN NUCLEÓTIDO MONOFOSFATO.

EL POLÍMERO SE FORMA AL ENLAZAR LOS FOSFATOS AL 3´ DEL OTRO NUCLEÓTIDO

Del nucleótido al ADN

DIRECCIÓN(5´a 3´)

Estructura estabilizada por puentes hidrógeno •Doble hebra

•Antiparalela

5´

3´

3´

5´

ESTRUCTURA PRIMARIA

Apareamiento: A-TG-C

Polímero uniformeSurco menor

Surco mayor

10 bases por vuelta

ESTRUCTURA SECUNDARIA

REGIONREGULATORIA

Codón de iniciación Codón de terminación

ADN en Procariotas

Cromosoma bacteriano ADN doble cadena (1mm long)circular cerrado Condensado y ordenado (“supercoiled” o superenrollado)

1865

ESTRUCTURA TERCIARIA

Plásmidos en Procariotas

• Tamaño de 1 a 400Kb• Cantidad variable de copias en una célula• Origen de replicación propio• Pueden movilizarse a otros genomas• Puede integrarse al cromosoma bacteriano

1865

•1 o más cromosomas de ADN (hasta 1200 en helechos)•Localizado en núcleo •Empaquetado por histonas y otras proteínas cromatina

Moléculas de ADN en mitocondrias y cloroplastos

ADN en Eucariotas 1865

Semiconservativa:dos hebras generan una copia cada

una

Replicación del ADN1865

comienza siempre en una secuencia específica de nucleótidos conocida como origen de replicación,

en el que hay un gran contenido de adenina y timina.

Iniciación1865

Unión de iniciador

iniciador

Síntesis de primers de ARN

Formación de dos hebras de replicación

ADN circulares(Procariotas)

Origen de replicación (oriC)

1865

Iniciación de la replicación

Horquillas se mueven en dirección opuesta

ADN lineales(Eucariotas)

Varios replicones

Iniciación

ADN primasa

ARN primer

ADN ligasaADN polimerasa

III

Frag. de Okazaki

Topoisomerasa

Proteínas de unión al ADNssHelicasa

Hebra líder

Hebra retrasada

ADN polimerasa III

1865Elongación

La ADN polimerasa sintetiza las nuevas cadenas, complementarias a cada una de las cadenas primitivas, en sentido 5´ → 3´ partiendo de un ARN corto específico llamado ARN cebador –molécula formada por nucleótidos de ARN

catalizados por ARN primasas- que determina el punto por donde la ADN polimerasa comienza a añadir nucleótidos.

“Proof-reading”

Incorporación de G X A

Pol III escinde G con actividad exonucleasa 3´ a 5´

Incorporación de A

DNA polimerasa comete un error cada 10DNA polimerasa comete un error cada 1088 – 10 – 101010 bases bases

Fragmentos de Okazaki

Cuando una ADN polimerasa hace contacto con el extremo de otro fragmento de Okazaki contiguo, el ARN cebador de este es eliminado y otra enzima, la ADN ligasa,

conecta los dos fragmentos de Okazaki de ADN recién sintetizado, catalizandolas reacciones de condensación que unen los grupos fosfato y azúcar de los

nucleótidos contiguos y así, una vez unidos todos los fragmentos de Okazaki se completa la doble hélice de ADN.

Terminación

Ligasa

1865

1865 1957 - Francis Crick

Propuso el dogma central

ADN

ARN

PROTEINAS

Transferencia de informaciónTransferencia de informaciónbiológicabiológica

•Ácidos nucleicos•Macromoléculas

•Polímeros (monómero de nucleótidos)•Uniones fosfodiéster

•Moléculas más grandes que se conocen.

El ADN y el ARN 1865

Diferencias entre la química del ADN y el ARN

El ARN tiene como carbohidrato a la ribosa

en lugar de la desoxirribosa.

El ARN tiene como base el uracilo en lugar

de la timina.

Una célula típica contiene 10 veces más ARN que ADN.

El ARN no es una doble cadena excepto en algunos virus.

1865

Estructura del ARN1865

Tipos de ARN según sus funciones

ARNrARNr(ribosomal)(ribosomal)

Componente principal del ribosoma

•Decodifica el ARNm para sintetizar las proteínas•Interacciona con ARNt durante la traducción•En Procariotas, dos subunidades principales 30Sy 50S•En Eucariotas, 40S y 60

1865

Tipos de ARN según sus funciones

ARNtARNt(de transferencia)(de transferencia)

•Encargados de transportar los aminoácidos a los ribosomas para incorporarlos a las proteínas, durante el proceso de síntesis proteica. •Decodificación mediante apareamiento con el codón del ARNm

anticodónanticodón

aaaa

1865

ARNnc o ARN no codificante: ARN funcional que no codifica para síntesis proteica (ARNr y ARNt)

ARN corto de interferencia (siARN: del inglés: small interfering RNA ): son componentes de una gran respuesta antiviral denominada interferencia del ARN involucrados en la regulación.

Ribo-llaves (ribo-switches): son formas de ARN que actúan como llaves "encendido-apagado" de gran precisión.

ARN catalíticos o ribozimas: ARN con estructura secundaria que le confiere a la molécula propiedades catalíticas como corte de ARN o ADN y ligación.

El ARN posiblemente fue el primer biopolímero

que apareció en la corteza terrestre durante el transcurso de la evolución.

Tipos de ARN según sus funciones1865

Como se leen los ARNm??

1961- Nirenberg y Ochoa

Sistema libre de células

UUUUUUUU fenilalaninaAAAAAAAA lisinaCCCCCCCC prolinaGGGGGGG glicina

1865

43=64

El código genético

ARNm

Demostraron que hay 61 tripletes -o codones- que codifican aminoácidos,

muchos de los cuales son codificados por más de un codón,por lo que se dice que el código está degenerado.

y los tres restantes no son codificantes sino que son utilizados como señales de terminación.

TRANSCRIPCIÓN

Requerimientos:

Cadena de ADN

como matriz ARN polimerasa Ribonucleósidos

trifosfatos Región promotora

1865

ADN

ARN

PROTEINAS

TRANSCRIPCION

ARN polimerasa

Principio de un genADN

La ARN polimerasa junto a factores de transcripción se une a sitio donde va a iniciar la transcripción

Iniciación

Promotor

•Dos regiones conservadas en el ADN (-10 y -35) que son reconocidas por factor sigma.•ARN polimerasa luego se une y sintetiza ARN de 5´ a 3´•Un promotor expresa varios genes (OPERÓN)

En bacterias

Promotor en Eucariotas

•Región promotora

•Involucra varios factores de transcripción (proteínas)

•Cada gen tiene su promotor

TRANSCRIPCION

Hebra antisentido

Dirección de la transcripción5´del gen

3´del gen

ARNm

ElongaciónUna cadena de ARN se une por apareamiento de bases a la cadena de ADN

y la ARN polimerasa es la encargada del enlace fosfodiéster.

Hebra sentido: contiene la información

genéticaHebra antisentido:

provee el molde para la síntesis del ARNm

3´ del ARNm

5´del ARNm

TRANSCRIPCIÓNLa ARN polimerasa

deja el ADN

ARN mensajero liberado

El ADN se aparea nuevamente

•Rho-independiente (Secuencias palindrómicas del ADN que en estadio de ARN adopta una estructura en horquilla) •Rho-dependiente (mediada por la proteína)

TerminaciónDesestabilización del complejo ARN-ADN

TRANSDUCCIÓN1865

ADN

ARN

PROTEÍNAS

El nombre proteína proviene de la palabra griega proteios,

que significa lo primero.

Las proteínas son macromoléculas formadas por aminoácidos

TRADUCCION

ARNt Sitio de unión al aminoácido

Uniones hidrógeno entre pares de bases

La iniciación procariótica es el resultado de la asociación de las subunidades pequeña y grande del ribosoma y el acoplamiento del primer aminoacil-ARNt (fmet-ARNt) con el codón de iniciación mediante el emparejamiento de bases anticodón-codón.

Iniciación

TRADUCCION

Elongación

La elongación de la cadena polipeptídica consiste en la adición de aminoácidos al extremo carboxilo de la cadena.

TRADUCCION

Continua la elongación

Este proceso continua hasta que llega a un codón stopPolipéptido

Creciente

TRADUCCION

La terminación ocurre cuando se llega a uno de los tres codones de terminación del ARNm, que no son reconocidos por ningún ARNt.

Terminación

Nueva proteína sintetizada

Carboxilo terminalAmino terminal

Un segmento de ADN que contribuye a un fenotipo/función. En ausencia de una función

demostrable, un gen puede ser caracterizado por secuencia, transcripción u homología.

Human Gene Nomenclature Committee

QUÉ ES UN GEN ?

En Procariotas.....

OperónTranscripción policistrónica (ARNm de varios genes)

En Eucariontes...

REGIONREGULATORIA

+1FIN

TRANSCRIPCION

EXONES

INTRONES

Un promotor para cada gen

LA DECADA DE LOS 70

1865 1970 - Smith & Nathans

Descubrimiento de las enzimas de restricción

Hamilton Smith• Descubrió HindII en Haemophilus influenzae

Daniel Nathans• Utilizó HindII para hacer el primer mapa de restricción del SV40

1865 1972 - Paul Berg

El primer ADN recombinante utilizando EcoRISitios de reconocimientoEcoRI

DNA plasmidico

EcoRI corta el DNA en fragmentos

Extremos pegajosos SV40 DNA

DNA ligasaDNA

recombinante

1865 1973 - Boyer, Cohen & Chang

Stanley Cohen & Annie Chan

Herbert Boyer

Gen resistente a la canamicina

Plasmid pSC101

Gen resistente a la tetraciclina

E. coli transformada con plásmidos recombinantes

Medio con canamicina y tetraciclina

Sólo crecen colonias recombiantes

Transformación de E. coli con plásmidos recombinantes

1865 1977 - Genentech, Inc.

• Compañía fundada por Herbert Boyer y Robert Swanson en 1976

• Considerada el advenimiento de la edad de la biotecnología

La primera proteína humana producida por una bacteria transgénica (somatostatina)

LA DECADA DE LOS 80

1865

1980• La suprema corte de U.S. permite patentar formas de vida

1985• Se prueban plantas modificadas genéticamente

En 1988 el National Center for Biotechnology Information (NCBI) y el GenBank

Margaret Dayhoff

LA DECADA DE LOS 90

1865

1995• primer genoma: Haemophilus influenzae.

1996• Genoma de Saccharomyces cerevisiae

•1997 • Se clona Dolly

1998• Genoma de C. elegans

LOS 90: GENOMAS Y CLONES

COMO FUNCIONA UN GENOMA?

GENÓMICA Y PROTEÓMICA

26 de junio del 2000: se concluyó el proyecto del GENOMA HUMANO, en el cual se invirtió más de 3.000 millones de dólares…..

EL FUTURO......

Genómica biológica

Genómica y salud

Genómica y sociedad

MUCHAS GRACIAS!!!!!!!!!!!

dcentron@gmail.com