Aislamiento de especies bacterianas productoras de antibióticos y antifúngicos a

partir de muestras de suelo    

Elena Hidalgo Cardeñoso y Marta Pérez Rodríguez

INTRODUCCIÓN En   las   úl(mas   décadas   el   uso   indiscriminado   de   an(bió(cos   ha   desencadenado   la   selección   de   bacterias  mul(rresistentes   frente   a   la   mayoría   de   los   an(bió(cos   descubiertos   hasta   ahora.   El   alarmante   aumento   de  bacterias   resistentes   contrasta   con   un   importante   declive   en   el   descubrimiento   de   nuevos   an(bió(cos.   Esto  supone  un  problema  de  salud  pública  que  es  responsable  de  700.000  muertes  anuales  a  nivel  global,  cifra  que  según  la  OMS  podría  aumentar  a  10.000.000  en  2050  si  siguen  sin  descubrirse  nuevas  terapias  an(microbianas.    De  entre  los  12  grupos  de  bacterias  que  la  OMS  ha  clasificado  como  peligrosas  por  esta  causa,  las  seis  principales  se   agrupan   en   el   acrónimo   ESKAPE:   Enterococcus   faecium,   Staphylococcus   aureus,   Klebsiella   pneumoniae,  Acinetobacter  baumannii,  Pseudomonas  aeruginosa  y  Enterobacter  spp.  

Este  trabajo  ha  sido  realizado  gracias  a  la  par(cipación  del    IES  Gonzalo  Torrente   Ballester   (San   Sebas(án   de   los   Reyes)   en   el   marco   del  proyecto  SWI@UCM,  con   los  estudiantes  de  Ciencias  de  4º  de  ESO   la  supervisados   por   la   profesora   Mar   Ruiz,   con   la   colaboración   de  nuestras   compañeras   Alicia   Sanz   Olivié,   Sandra   Mar(n   Muñoz,   Alba  Nieto  Vicente,  Marta  Carballo  de  la  Cal  y  la  tutorización  del  Dr.  Víctor  Jiménez  Cid  en  la  Facultad  de  Farmacia  UCM.    

PROCEDIMIENTO

CARACTERIZACIÓN DE PSEUDOMONAS AERUGINOSA                      

CARACTERIZACIÓN DE LOS AISLAMIENTOS POSITIVOS MEDIANTE TINCION GRAM Y PRUEBAS BIOQUÍMICAS

CONCLUSIONES            

VERIFICACIÓN DEL EFECTO DE ANTIBIOSIS Y ENSAYO DEL ESPECTRO

E.coli  Enterobacter  

S.  aureus   Saccharomyces  cerevisiae  

En   estría   perpendicular   la   mayoría   de   los   aislamientos   confirmaron   su   capacidad   para  inhibir  a  Staphylococcus,  así  como  el  efecto  an(fúngico  observado  (cuadro).    Observamos   que   de   los   12   microorganismos   posi(vos,   5   tenían   el   mismo   aspecto   y  comportamiento  y  procedían  de  una  misma  muestra  original.  La  producción  de  pigmento  ciánico   nos   hizo   sospechar   que   se   trataba   de   un  Pseudomonas.   Para   salir   de   dudas,   se  realizaron  una  serie  de  ensayos  para  la  iden(ficación.    

Se  observó  un  halo  de  inhibición  en  12  colonias,  sobre  todo  sobre  Staphylococcus,  así  como  un  aislamiento  capaz  de  inhibir  a  la  levadura,  lo  que  indica  que  posee  bioac;vidad  an;fúngica.    

29  alumnos  recogieron  asép;camente  14  muestras  de  suelo  

en  diversas  localizaciones  

Se  sembraron  en  medio  de  cul;vo  TSA  10  diluciones  seriadas  1/10  de  

cada  muestra,  hasta  10-­‐5  

           

Se  seleccionaron  y  reaislaron  16-­‐25  colonias  diferentes  de  cada  muestra  

                   

Se  enfrentaron  a  tres  microorganismos  tes;go:  dos  similares  a  ESKAPE  (Staphylococcus  epidermidis  y  Escherichia  coli)  y  a  la  levadura  Saccharomyces  cerevisiae                    

Staphylococcus  epidermidis  como  

representante  de  las  bacterias  Gram  +  

Escherichia  coli  como  representante  de  bacterias  Gram  –    

Saccharomyces  cerevisae  para  la  búsqueda  de  bacterias  

productoras  de  an(fúngicos  

Posi;vos  en  an;biosis   Nega;vos  en  an;biosis  

Bacilo  Gram  –  Oxidasa  +  Catalasa  +  

Bacilo  Gram  –  Oxidasa  -­‐  Catalasa  +  

Bacilo  Gram  +  Oxidasa  -­‐  Catalasa  +  

Bacilo  Gram  –  Oxidasa  -­‐  Catalasa  +  

Bacilo  Gram  +  Oxidasa  -­‐  Catalasa  +  

Coco  Gram  +  Oxidasa  -­‐  Catalasa  +  

Bacilo  Gram  +  Ramificado:  

Posible  estreptomiceto  

Se   u(lizó   agar   King   para   confirmar   la  producción   de   pigmentos   por   los  aislamientos  3/3,  10/25,  7/8,  10/13  y  2/11.  Tras   incubación   24   h   se   observa   la  aparición   de   color   por   la   presencia   de  piocianina   (pigmento   caracterís(co   de  Pseudomonas  aeruginosa)    

Pseudomonas   aeruginosa   es  uno   de   los   ESKAPE,   el   de  mayor  incidencia  en  nuestros  hospitales.   Realizamos   un  an(biograma   para   estudiar  su   perfil   de   resistencia   a  an(bió(cos  

AM  ampicilina  OX  oxacilina  VA  vancomicina  TC  (carcilina    AN  amikacina  IPM  imipenem  CAZ  Cemazidima  

Se   han   aislado   unas   280   colonias   de   bacterias   procedentes   de   14  muestras   dis(ntas   de  suelo.  Doce  de  ellas,   correspondientes  a  7  bacterias  diferentes  mostraron   fenómenos  de  an(biosis   frente   a   Staphylococcus   aureus,   como   se   observó   mediante   inhibición   del  crecimiento   sobre   agar   tanto   en   césped   como   en   línea.   El   espectro   de   los   posibles  an(bió(cos   producidos   no   es   amplio,   pues   otras   especies   bacterianas   no   resultaron  inhibidas  por  estos  aislamientos.    El  microorganismo  7/25  inhibe  el  crecimiento  de  Saccharomyces  cerevisiae.  

Cinco   de   los   aislamientos   obtenidos   correspondían   al   mismo   microorganismo,   que  iden(ficamos  como  Pseudomonas  aeruginosa  resistente  a  vancomicina,  (carcilina  y  beta-­‐lactámicos   y   productor   de   una   beta-­‐lactamasa   inducible.   Constatamos   que   uno   de   los  microorganismos  ESKAPE  con  alto  nivel  de  resistencia  está  presente  en  uno  de   los  suelos  analizados.    Constatamos,   además   que   existe   un   fenómeno   de   an(biosis   entre   el   Pseudomonas  aeruginosa  aislado  y  Staphylococcus.  

El  aislamiento  solo  es  sensible  a    amikacina  y  a  imipenem.  Es  resistente  a  todos  los  demás  an(bió(cos.    La  deformación  del  halo  de  inhibición  de  la  cemazidima  en  presencia  de  imipinem  indica  un  mecanismo  de  resistencia:  la  inducción  de  β-­‐lactamasas.    

7/6   12/3  8/23  

11/9  

7/25  6/1  5/9  

Acinetobacter  

E.  carotovora  

Pseudomonas   B.  sub:lis  

3/3   12/13  10/23  

8/23  10/25  

7/6  6/1  

5/9  7/6  5/9  

7/8  

2/11  

7/25  

12/13  

8/23  

11/9  10/23  

3/3  2/11  

7/8  

7/25  

6/11  

10/25  

Small  World  Ini(a(ve  es  un  proyecto  internacional  de  inves(gación  y  divulgación  en  el  que  se  explora  la  diversidad  bacteriana  de  los  suelos  en  busca  de  bioac(vidades  an(microbianas  

Sin  embargo,   frente  a   los  otros  ESKAPE  y  otros   tes(gos   (Erwinia  carotovora  como  patógeno   de   plantas   y   Bacillus   sub?lis   como   bacilo   Gram   +)   no   se   observó  inhibición.