CONFERENCIAS PLENARIAS:
Conferencia de APERTURA 1:
“Inmunoterapias en enfermedades neurodegenerativas"
Dr. Fernando Goñi. Department of Neurology, School of Medicine, New York
University, USA
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La mayoría de las enfermedades neurodegenerativas (NDD) incluidas la demencia
senil Enfermedad de Alzheimer (AD), las prionosis (CJD, GSS, TSE) y la enfermedad
de Parkinson (PD) implican un cambio conformacional en un péptido o proteína propia
de un confórmero soluble y fisiológicamente activo a uno con mayor porcentaje de
estructura β-hoja plegada, propensidad a formar multímeros y fibras insolubles con
pérdida de función y ganancia de toxicidad. Al ocurrir en el cerebro, el cambio
conformacional está parcialmente protegido de ser reconocido por el sistema inmune.
Esta opción puede ser superada modulando una respuesta inmune contra el
confórmero patológico. La elección del inmunógeno es de vital importancia para
generar una respuesta eficiente sin generar autoinmunidad tóxica. De las varias
opciones probadas nuestro laboratorio llegó a la utilización de un péptido sintético cuya
secuencia normalmente no existe en ningún mamífero incluídos los humanos; y que al
ser polimerizado adquiere una estructura β-hoja plegada y una asociación oligomérica
que no forma fibras, y tiene similitud con la de los oligómeros patológicos que se
encuentran en NDD. Ratones transgénicos para la enfermedad de Alzheimer y para
prionosis fueron inoculados con el péptido polimerizado (pP) y produjeron una
respuesta inmune de anticuerpos contra pP y contra los oligómeros propios de cada
enfermedad, produciendo una disminución notoria en la patología. Además en el
sistema donde demostró ser efectivo se usaron ratones para producir hibridomas. Por
selección contra confórmeros patológicos obtuvimos 40 clones que tienen reacción
variada contra las proteínas propias de cada enfermedad y que reaccionan
específicamente en inmunohistoquímica contra cerebros humanos de cada
enfermedad. Ambas opciones de inmunización activa o pasiva abren la posibilidad de
usar inmunomodulación para prevenir o tratar enfermedades neurodegenerativas.
Conferencia 2 SBBM-SBBq:
“The flow of conformational information as seen by protein dynamics: membrane recognition and catalysis”
Dr. Fábio Almeida. National Center of Nuclear Magnetic Resonance, Biomolecular
NMR Laboratory - Universidade Federal do Rio de Janeiro, Brasil
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Proteins are dynamic entities that move in a hierarchy of timescales that goes from
picoseconds to seconds. Motions that occur in microseconds to seconds define
biologically relevant events that are frequently involved in binding, allostery and
catalysis. We measured relaxation parameter, relaxation dispersion experiments and
molecular dynamic simulation in order to correlate hydration and slow dynamics. We will
show how conformational dynamics of yeast thioredoxin 1 is correlated with the
hydration equilibrium of a water cavity near the active site. The residue Asp24 that is
well-recognized as a proton acceptor in the catalytic mechanism also controls dynamic
events of the protein that are important for recognition and catalysis. We also probed
the dynamics of plant defensins and correlated to its ability to bind to membrane targets.
Using relaxation dispersion methods we characterized the structural property of the
excited state conformation of sugar cane defensin 5.
ACKNOLEDGEMENTS: FAPERJ, CAPES, CNPq, INBEB-CNPq, Program Science
Without Borders-CNPq
Conferencia 3:
"The Inflammasomes in Host Resistance to Infection by Intracellular Pathogens"
Dr Dario S. Zamboni. Department of Cell Biology. Medical School Ribeirão Preto -
FMRP/USP.University of São Paulo.
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Immune responses to pathogenic microbes are initiated upon recognition of pathogen-associated molecular patterns (PAMPs) and danger-associated molecular patterns (DAMPs) by the pattern recognition receptors (PRRs) present in the innate immune cells. Among PRR are the Toll-like receptors (TLRs), which have being extensively characterized and are well known to recognize intracellular and extracellular parasites. However, the recognition of intracellular protozoan parasites by non-TLR PRR remains largely obscure. A family of cytosolic proteins containing a nucleotide-binding oligomerization domain (NOD)-like receptors (NLRs) has being described as important sensors of microbial infection. Among the well-characterized NLRs are proteins (such as Nod1, Nod2, Naip5, Nlrc4, Nlrp1, NLRP3, Nlrp6 and Nlrp12) that contribute for detection of different PAMPs and DAMPs. In contrast to TLRs, which detect extracellular and vacuole-containing PAMPs, the NLRs detect PAMPs and DAMPs present in host cell cytoplasm. It has being recently demonstrated that in contrast to TLRs, NLRs are able to recognize virulent microorganisms that either lyses the vacuolar membranes or that secretes proteins into the host cell cytoplasm by using specialized secretion system. Although important pathogenic parasites (such as Leishmania, Trypanosoma, Toxoplasma, Plasmodium) inhabit the host cell cytoplasm and show intrinsic associations with host cell membranes, there is no substantial information regarding the recognition of these pathogens by NLRs. Protozoan parasites from the Leishmania genus, the causative agents of human leishmaniasis, are known to be immunologically silent and bypass the PRR-mediated response to infection. We have identified the NLRs and the inflammasome as critical innate immune platform for the recognition of Leishmania spp. in macrophages and in vivo. Activation of the inflammasome leads to autonomous macrophage mechanisms that culminate with the restriction of the intracellular parasite replication. These processes involves IL-1β mediated regulation of NOS2 expression, which in turn facilitate the production of nitric oxide (NO), a molecule that is required and sufficient to restrict the replication of Leishmania parasites in BMDMs. Thus, we have identified the major signaling platform for the host resistance against Leishmania spp. infection and elucidated the molecular mechanisms that explain the Leishmania-induced NO production.
Supported by FAPESP, INCTV/CNPq, PEW and WHO/TDR.
Conferencia de CIERRE 4:
“Biotecnologías aplicadas a la producción de embriones, clonación y
transgénesis en animales”
Dr. Alejo Menchaca. Fundación Instituto de Reproducción Animal Uruguay, IRAUy,
Uruguay
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El avance en diferentes disciplinas como la fisiología de la reproducción, biología del desarrollo, reprogramación celular, embriología y cultivo embrionario, criopreservación de gametos y embriones, ingeniería genética, transgénesis, proteínas recombinantes y biofarmacéutica han hecho posible la oferta de nuevas biotecnologías emergentes. Algunas de ellas como la producción de embriones in vitro, la clonación y la transgénesis han pasado del ámbito experimental a su aplicación comercial por pequeñas y grandes compañías. La producción de embriones in vitro es una herramienta de uso corriente en algunas especies como los bovinos, superando en estos últimos años a la producción de embriones por métodos convencionales. Consiste en utilizar ovocitos y espermatozoides para generar embriones bajo condiciones de laboratorio, haciendo uso además de técnicas de micromanipulación embrionaria como la inyección intracitoplásmica de espermatozoides. La producción de embriones in vitro se vio también potenciada por nuevas estrategias de criopreservación de ovocitos y embriones como la vitrificación que permite curvas ultrarápidas en la caída de la temperatura, mejorando las técnicas convencionales de congelación. Mediante estas tecnologías es posible multiplicar rápidamente una población de animales, logrando una descendencia cientos de veces mayor que con los procedimientos tradicionales. También en estos últimos años, mediante la identificación de los espermatozoides X e Y a partir al tamaño de cada cromosoma determinado por citometría de flujo, es posible producir descendencia hembras o machos de manera predeterminada. Esta herramienta asociada a la producción de embriones in vitro se utiliza actualmente a gran escala en producción animal, generando de cada individuo un gran número de descendencia del sexo más conveniente para cada sistema de producción de carne o leche. Por su parte la clonación mediante transferencia nuclear de células somáticas fue desarrollada en los últimos años. Es una tecnología que está disponible en varios países y se utiliza a nivel comercial en el sector privado, fundamentalmente por compañías que dominan el mercado mundial de semen bovino, así también como abre posibilidades para la conservación de especies amenazadas. Asimismo ha abierto un nuevo campo de investigación vinculado a la reprogramación celular, producción de células madre embrionarias y regeneración de tejidos. Por otra parte, los avances en ingeniería genética y micromanipulación embrionaria han permitido el desarrollo de la transgénesis en animales de interés productivo, inyectando un gen exógeno en etapas tempranas del desarrollo del embrión. Esta tecnología está disponible en algunos países utilizándose en ciertos casos con fines experimentales básicos así como también es manejada por compañías privadas. La producción de proteínas recombinantes en la leche de ovejas, cabras y vacas transgénicas es una
realidad en algunas compañías biotecnológicas para la producción de medicamentos. Asimismo es posible la generación de animales genéticamente modificados para la producción de alimentos funcionales, o simplemente para mejorar ciertas aptitudes productivas de una población, o hacerla resistente a enfermedades de alto impacto. En suma, a partir del conocimiento en diversas disciplinas las biotecnologías reproductivas permiten la producción de embriones in vitro, la clonación y la transgénesis, con aplicación tanto en el ámbito científico como empresarial.
SIMPOSIOS:
SIMPOSIO I:
“ESTRUCTURA Y FUNCIONALIDAD DE PROTEÍNAS”
Coordinadores: J.M Souza, M. Moller.
Expositores:
MECANISMOS DE REGULACIÓN ALOSTÉRICA EN SISTEMA DE SEÑALIZACIÓN BACTERIANOS. F. Trajtemberg
REDEFINIENDO INTERACCIONES EN EL SITIO ACTIVO DE LAS CATEPSINAS.
I.Corvo
NITRACIÓN Y SOBREOXIDACIÓN DE Prx2: EFECTOS EN SU ESTRUCTURA Y ACTIVIDAD. LM. Randall CARACTERIZACIÓN DE CITOCROMO C CARBOXIMETILADO Y FORMACIÓN DE COMPUESTO I DE PEROXIDASA EN PRESENCIA DE CARDIOLIPINA. V. Demicheli GLUCOSA-6-FOSFATO DESHIDROGENASA DE TRYPANOSOMA CRUZI, COMO POTENCIAL BLANCO PARA EL DISEÑO RACIONAL DE FÁRMACOS ANTICHAGÁSICOS. C. Ortíz
RESUMENES:
“Mecanismos de regulación alostérica en sistema de señalización bacterianos”
Dr. Felipe Trajtemberg,
Instituto Pasteur Montevideo.
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La capacidad de los microorganismos de adaptarse rápidamente a los cambios del
entorno es una función biológica esencial y clave para su supervivencia. Durante los
últimos años nos hemos enfocado en la caracterización estructural y funcional
del sistema termosensor DesK-DesR de Bacillus subtilis. Los estudios realizados sobre
la región citoplasmática de DesK permitieron proponer un mecanismo por el cual la
señal es transmitida desde el dominio sensor hasta la región catalíticamente
competente. Más recientemente, la caracterización del regulador de respuesta DesR
nos ha permitido proponer un modelo de regulación funcional de este factor de
transcripción. Los resultados obtenidos permiten proponer que la fosforilación de la
proteína provoca cambios conformacionales específicos que controlan la dimerización
a través de una nueva superficie de interacción, al mismo tiempo que por una ruta
alostérica diferente, se libera el dominio de unión al ADN y se expone otra superficie
que está involucrada en la tetramerización.
“Redefiniendo interacciones en el sitio activo de las catepsinas"
Dra. Ileana Corvo.
Facultad de Medicina.
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Las catepsinas son cisteína proteasas pertenecientes a la superfamilia de la papaína
que se encuentran presentes en todos los organismos. Son proteínas globulares
pequeñas con dos dominios (izquierdo y derecho) que delimitan un surco en la
superficie de la enzima donde se encuentra el sitio activo. Su especificidad está
determinada por interacciones entre determinados residuos de la enzima, que forman
los bolsillos o subsitios (S) del sitio activo, y los aminoácidos del sustrato (P). Las
proteasas producidas por diferentes organismos muestran una especificidad de
sustrato solapada pero diferente. Si bien en general las catepsinas hidrolizan sustratos
con residuos hidrofóbicos como fenilalanina y leucina en P2, algunas tienen una
especificidad inusual y pueden acomodar también prolina en P2. Al comparar la
estructura de los bolsillos S2 y S3 del sitio activo de distintas catepsinas encontramos
que determinados residuos son compartidos por las enzimas con especificidad similar.
Estudiando las catepsinas L del parásito Fasciola hepatica nos sorprendió encontrar
que la sustitución de un mismo residuo produce cambios drásticos en la interacción con
el sustrato en una enzima, mientras en otra los cambios que se observan son más
sutiles. Observamos que un residuo de la enzima influye en la interacción con más de
un aminoácido del sustrato, volviendo borrosa la distinción entre bolsillos en el sitio
activo de las catepsinas.
“Nitración y sobreoxidación de prx2: efectos en su estructura y actividad”
L.M. Randall1,2, B. Manta3, M. Hugo2,4, M. Gil2,5, K. Nelson6, Carlos Batthyány2,4,5, . Trujillo2,4, L.B. Poole6, A. Denicola1,2.
1Instituto de Química Biológica, Facultad de Ciencias, Universidad de la República (UdelaR), Uruguay; 2Centro de Investigaciones Biomédicas, UdelaR; 3Laboratorio de Biología Redox de Tripanosomátidos, Institut Pasteur de Montevideo; 4Laboratorio de Bioquímica, Facultad de Medicina, UdelaR; 5Laboratorio de Bioquímica y Proteómica Analíticas, Institut Pasteur de Montevideo; 6Biochemistry Department, Wake Forest
University, NC, USA.
Las peroxirredoxinas (Prx) son una amplia familia de peroxidasas que reducen peróxidos mediante un mecanismo dependiente de tioles a expensas de tiorredoxina u otras disulfuro reductasas. La Prx2, una Prx típica de 2 cisteínas (2-Cys Prx), es un homodímero con un centro redox activo para la reducción de peróxidos que forma un disulfuro intermolecular, y que se encuentra, por lo menos, en dos estados oligoméricos: homodímeros cabeza-cola o decámeros. La oxidación de la Cys reactiva en la proteína reducida decamérica resulta en cambios conformacionales en el sitio activo necesarios para el ataque de la Cys resolutiva para formar el disulfuro. Esta transición conformacional necesaria para la catálisis impone una pausa cinética que puede resultar en la sobreoxidación de la Cys peroxidática previo a la formación del disulfuro1, modificación que ha sido vinculada a vías de señalización redox. Recientemente, demostramos que la Prx2 humana es una peroxidasa crítica para el eritrocito que reduce eficientemente tanto H2O2 como peroxinitrito2. Ambos oxidantes pueden sobreoxidar a la enzima, inactivándola, y el peroxinitrito puede además nitrar algunas de sus tirosinas. En base a estudios cinéticos, estructurales, y a experimentos con inmunodetección, nuestro trabajo sugiere que la nitración proteje a la Prx2 de la sobreoxidación favoreciendo el ataque de la Cys resolutiva al ácido cisteinsulfénico de la Cys peroxidática.
1Wood, ZA. et al. Science. 2003. 300(5619):650-3; 2Manta, B. et al. Arch Biochem Biophys. 2009.484(2):146-54.
Agradecimientos: CSIC-UdelaR, ANII y PEDECIBA por la financiación.
“Caracterización de citocromo c carboximetilado y formación de compuesto i de
peroxidasa en presencia de cardiolipina”
V. Demicheli1, D. Capdevilla2, D. Murgida2, R. Radi1
1 Departamento de Bioquímica, Facultad de Medicina y CEINBIO, Universidad de la
República, Montevideo, Uruguay 2INQUIMAE y Departamento de Química Inorgánica,
Analítica y Química Física. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de
Buenos Aires. Pabellón 2, Ciudad Universitaria, 1428 - Buenos Aires, Argentina.
El citocromo c es una proteína que participa en la cadena respiratoria mitocondrial y en
procesos de muerte celular. El citocromo c presenta, bajo diferentes condiciones tales
como modificaciones post-traduccionales (nitración) o tras la interacción con lípidos
aniónicos, la aparición de una actividad peroxidasa la cual no ha sido completamente
caracterizada. En particular hasta la fecha no se ha logrado detectar directamente la
formación de un Compuesto I de peroxidasa. En un artículo reciente, Prasad y
colaboradores demostraron la formación de un Compuesto I de peroxidasa en
citocromo c carboximetilado a nivel de la Metionina 80, ligando axial del grupo hemo del
citocromo c, con peróxido de hidrógeno. Es de interés entonces caracterizar esta
proteína así como investigar la formación de Compuesto I en diferentes condiciones,
tales como la presencia de cardiolipina. En este trabajo se purificó y caracterizó esta
proteína modificada utilizando técnicas de espectrometría de masa, HPLC, técnicas
electroquímicas y de resonancia Raman y se estudió la formación de Compuesto I de
peroxidasa de esta proteína expuesta a peróxido de hidrógeno en presencia de
cardiolipina, lípido aniónico que induce la actividad peroxidasa en citocromo c. Los
resultados muestran un aumento de la forma de alto espín de la proteína modificada y
tras la reacción con peróxido de hidrógeno, muestra un aumento de la formación de
Compuesto I al co-incubarse con liposomas conteniendo cardiolipina.
“Glucosa-6-fosfato deshidrogenasa de trypanosoma cruzi, como potencial blanco
para el diseño racional de fármacos antichagásicos”.
C. Ortíz1, H. Botti2, A. Buschiazzo2, A. Medeiros1,3, M. Comini1. 1Grupo de Biología Redox de los Tripanosomas, Institut Pasteur de Montevideo,
Uruguay;2 Unidad de Cristalografía de Proteínas, Institut Pasteur de Montevideo,
Uruguay;3 Departamento de Bioquímica, Facultad de Medicina, Universidad de la
República, Uruguay.
Como tratamiento actual de la enfermedad de Chagas se utilizan fármacos que
presentan problemas de toxicidad y limitada eficacia. La caracterización de blancos
moleculares que cumplen un rol importante en la biología del parásito puede contribuir
con el desarrollo de nuevos medicamentos y mejores estrategias terapéuticas. En este
sentido, la enzima glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (G6PDH), ha demostrado ser un
factor determinante para la supervivencia del tripanosoma Africano y de virulencia para
las formas infectivas de T. cruzi. La G6PDH es una enzima ubicua, cataliza la primera
reacción de la vía de las pentosas-5-fosfato que suministra metabolitos esenciales
(ribosa-5-fosfato y NADPH) empleados en la proliferación celular así como en el
mantenimiento de la homeostasis redox, las defensas antioxidantes y síntesis de lípidos.
Con el objetivo final de validar la G6PDH como un blanco de fármacos, se determinó la estructura oligomérica y se estudió su estabilidad en solución. Se resolvieron las estructuras cristalográficas para la forma salvaje y para el mutante truncado (Δ37) en su forma apo y en complejo con substrato. Se llevó a cabo un estudio comparativo exhaustivo con su contraparte humana que nos permitió identificar regiones exclusivas de T. cruzi que podrán ser explotadas como blancos de fármacos. En lo que refiere a estudios bioquímicos se generaron y analizaron mutantes de sitio activo, interface dímero-dímero y de cisteínas, que cumplen un rol estructural importante para la G6PDH.
Contamos con información bioquímica-estructural, que creemos contribuiría a la generación de fármacos anti-chagásicos de mayor especificidad y potencia.
Agradecimientos: Apoyo financiero de ANII, CSIC y PEDECIBA.
SIMPOSIO II:
“Bioquímica y Biología Molecular de Microorganismos”
Coordinadores: S. Castro, N. Bajsa.
Expositores:
METAGENÔMICA APLICADA EM AMBIENTES DE INTERESSE AGROPECUÁRIO COM INTERESSE BIOTECNOLÓGICO. JA. Marcondes de Souza.
VIRUS DEL PAPILOMA HUMANO Y CÁNCER. E. Boccardo.
DOMINIOS DE MEMBRANA PLASMATICA Y EISOSOMAS. A. Olivera-Couto.
POSIBLE EFECTO DE MUTACIONES SINONIMAS SOBRE EL CORRECTO DIRECCIONAMIENTO DE UREA HACIA LA MEMBRANA. M.Sanguinetti
METABOLITOS SECUNDARIOS ANTIFUNGICOS PRODUCIDOS POR PSEUDOMONAS FLUORESCENS C119: CARACTERIZACION Y APLICACION COMO BIOFUNGICIDA. ML. Yanes
RESUMENES:
“Metagenômica aplicada em ambientes de interesse agropecuário com interesse
biotecnológico.”
“Metagenómica aplicada a ambientes agrícolas con interés biotecnológico.”
Dr. Jackson A. Marcondes de Souza. Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias,
Universidade Estadual Paulista, Brasil.
Mail de contacto: [email protected]
Las actividades de los microorganismos influyen en el medio ambiente, ya que son
componentes importantes de los ciclos biogeoquímicos y el ciclo de nutrientes. El
desarrollo de la agricultura asociada a acciones antropogénicas para la gestión de las
plantas y los animales afectan a las comunidades microbianas autóctonas, sobre todo
en los suelos. La intensidad con que el suelo puede verse afectada de diferentes
maneras afectan a la dinámica de la comunidad microbiana, causando cambios a largo
plazo que es probable que nunca se recuperó. En este contexto, además de la pérdida
de la riqueza y la diversidad genética de los microorganismos, los recursos biológicos
funcionales como los genes y enzimas dejan de ser explorado en su momento. Con la
disponibilidad de técnicas de secuenciación de ADN a gran escala y bajo costo,
muestras ambientales y consorcios microbianos pueden ser analizados para el
descubrimiento metagenomico de genes estructurales y funcionales, incluyendo de los
microorganismos que no pueden ser cultivadas o aisladas. La secuenciación
metagenómica y 16S ARNr por Illumina para muestras de suelo en cultivo de la caña
de azúcar y para muestras del rumen bovino se ha realizado en nuestro laboratorio con
la perspectiva en la búsqueda de nuevos recursos biológicos implicados en la
producción de etanol de segunda generación. El perfil fisiológico de la comunidad
microbiana del suelo permitió observar la habilidad con que los microorganismos
degradan sustratos de carbono importantes, lo que representa un valor considerable en
relación con la mitigación de las emisiones de CO2 a la atmósfera y la capacidad de
obtener energía. Se identificaron varios genes, entre ellos varios de unión de ATP,
hidrolasas, oxidorreductasas y otros. En las muestras del rumen bovino análisis
molecular y microscópico indicó la presencia de especies relacionadas con los géneros
Prevotella y Ruminococcus, que son fermentadores potentes implicadas en la
degradación directa de la fibra de la planta.
"Virus del papiloma humano y cáncer".
Dr. Enrique Boccardo.
Departamento de Microbiología, Instituto de Ciencias Biomédicas, Universidad de San
Pablo, Brasil.
Mail de contacto: [email protected]
El carcinoma de cuello uterino es una de las principales causas de muerte en mujeres
de países en desarrollo. Este tipo de neoplasia está etiológicamente asociado a la
infección con el virus del papiloma humano (HPV). Son virus pequeños de ADN que
infectan epitelios estratificados de piel y mucosas. Algunos tipos de HPV, conocidos
como HPV de alto riesgo, son responsables por casi el 100% de los cánceres de cuello
uterino. Además, datos recientes indican que estos virus están asociados a más del
50% de otros cánceres de la región ano-genital y a un porcentaje importante de
tumores malignos de cabeza y cuello tanto en mujeres como hombres. Los HPV
codifican dos oncoproteínas, E6 y E7, que actúan sobre factores celulares específicos
alterando la homeostasis celular y tisular. La expresión de estas proteínas en la célula
huésped induce la proliferación celular, aumenta la resistencia a la muerte celular por
apoptosis, activa mecanismos de evasión inmunológica y favorece la acumulación de
alteraciones cromosómicas numéricas y estructurales. En conjunto, estas alteraciones
favorecen la transformación celular in vitro y la aparición de tumores in vivo. Durante
las últimas décadas se han realizado importantes avances en el estudio de la
epidemiología de estos virus así como las bases moleculares de su virulencia, lo que
ha llevado al desarrollo de una serie de estrategias de prevención.
“Dominios de membrana plasmática y eisosomas”.
A. Olivera-Couto1, M. Digman2, V. Salzman1, M. Mailhos1, E. Gratton2, P.S.
Aguilar1.
1. Laboratorio de Biología Celular de Membranas, Institut Pasteur de Montevideo.
2. Laboratory for Fluorescence Dynamics, University of California Irvine.
Si bien actualmente se acepta la existencia de dominios de membrana en células
eucariotas y procariotas, los mecanismos que explican su formación y mantenimiento
son prácticamente desconocidos. Mi proyecto de tesis aborda el estudio de dominios
de membrana plasmática, denominados eisosomas. En un primer trabajo (1) hemos
evidenciado que los componentes principales de los eisosomas, las proteínas Pil1 y
Lsp1, tienen la capacidad de autoensamblarse y de modificar la curvatura de
membranas (tanto in vivo como in vitro), estando dichas capacidades asociadas a la
generación de dominios de membrana. Nuestros resultados sostienen la hipótesis de
que la generación de curvatura en membrana, lograda a través de la formación de
ensambles de Pil1 y Lsp1, es un mecanismo necesario para la formación de dominios
(1). Con el fin de aportar más evidencia que desafíe esta hipótesis, estamos trabajando
en la descripción cuantitativa del comportamiento dinámico de los eisosomas in vivo.
Para esto utilizamos técnicas de microscopía de fluorescencia y de espectroscopía de
correlación de fluorescencia que nos permiten determinar los estados oligoméricos, las
concentraciones y las velocidades de difusión de Pil1 y Lsp1 en células vivas. También
aplicamos FRET-FLIM con el objetivo de determinar si existen interacciones directas
entre los diferentes componentes proteicos eisosomales.
1. Olivera-Couto A., et al. (2011) Molecular Biology of the Cell 22, 2360-2372.
“Posible efecto de mutaciones sinónimas sobre el correcto direccionamiento de
urea hacia la membrana”
1M. Sanguinetti, 2A. Iriarte, 3S. Amillis, 1M. Marín, 2H. Musto 1A. Ramón.
1Sección Bioquímica, Facultad de Ciencias, UdelaR; 2Laboratorio de Organización y
Evolución del Genoma, Facultad de Ciencias, UdelaR; 3Departamento de Botánica,
Facultad de Biología, Univ. Atenas, Grecia.
Nuestro grupo ha desarrollado un modelo in vivo para contribuir al conocimiento de
cómo el uso de codones y la cinética de traducción pueden determinar la estructura y
funcionalidad de proteínas de membrana. Utilizando una versión de UreA, el
transportador de urea del hongo ascomicete Aspergillus nidulans, fusionado a la GFP,
podemos realizar fácilmente mutagénesis dirigida y analizar los efectos de las
mutaciones sobre la funcionalidad y la localización subcelular del transportador.
Mediante un análisis evolutivo in silico hemos identificado codones “raros” y
“frecuentes” conservados en ortólogos de UreA de otros miembros del género
Aspergillus. El cambio de dos codones “raros” localizados en el extremo N-terminal de
la proteína por codones “frecuentes”, provoca en la cepa mutante una disminución en la
capacidad de crecimiento en urea a 37 ºC. Este defecto no se observa a 25 ºC.
Ensayos de cinética de transporte con 14C-urea avalan estos resultados. El análisis de
este mutante mediante Western Blot y ensayos de microscopía de epifluorescencia
muestran una disminución de la cantidad de proteína en la membrana. Por otra parte,
tenemos evidencia de que este fenotipo no se debería a una mayor degradación de la
proteína mutante, ni a una modificación de la estructura secundaria del ARN
mensajero.
Nuestra hipótesis es que estos dos codones “raros” podrían tener un rol en el
establecimiento de una pausa a nivel traduccional la cual podría ser importante en las
primeras etapas de síntesis y salida hacia la membrana.
“Metabolitos secundarios antifúngicos producidos por pseudomonas
fluorescens αC119: caracterizacion y aplicación como biofungicida”
ML Yanes1, L Braga1, D. Davyt1, N Altier2, Alicia Arias1.
1 Instituto de Investigaciones Biológicas Clemente Estable. Montevideo, Uruguay.
2 Instituto Nacional de Investigación Agropecuaria. Las Brujas, Uruguay
El control biológico mediante Pseudomonas fluorescentes es una alternativa viable
para disminuir el daño provocado por patógenos vegetales y promover el crecimiento
de las plantas. La cepa nativa P. fluorescens αC119, aislada de rizósfera de alfalfa
presenta un gran potencial como agente de biocontrol y promoción del crecimiento
vegetal. Ha mostrado un efecto protector significativo contra el damping-off de alfalfa
causado por Pythium debaryanum y el aumento de biomasa vegetal tanto en
condiciones controladas como de campo. Dicha cepa produce metabolitos secundarios
con actividad antifúngica tales como ácido cianhídrico, proteasas y un antibiótico de
tipo biosurfactante. El objetivo del presente trabajo fue determinar los metabolitos
involucrados en el biocontrol y el impacto de la inoculación de la cepa sobre plantas de
alfalfa y la comunidad microbiana de la raíz. El genoma bacteriano fue secuenciado y
los genes que sintetizan los metabolitos antifúngicos identificados. Mutantes incapaces
de producir algunos de estos metabolitos no fueron capaces de antagonizar in vitro al
patógeno. Se realizó un ensayo donde las semillas fueron bacterizadas con la cepa
αC119. Como control se usaron semillas tratadas con un inoculante comercial de
rizobio. El efecto biocontrolador y promotor directo sobre las plantas fue evaluado
observándose un aumento del 40% de la biomasa vegetal. La cepa introducida fue
capaz de colonizar y perdurar en las raíces durante al menos 120 días. El impacto
sobre la estructura de la comunidad bacteriana de la raíz de alfalfa se determinó
mediante DGGE (Denaturing Gradient Gel electrophoresis) del ADNr 16S y TRFLP.
SIMPOSIO III:
“Neurobiología”
Coordinadores: C. Scorza, S. Olivera.
Expositores: ATAXIA DE FRIEDREICH: UN MODELO DINÁMICO DE LAS PROTEÍNAS QUE FORMAN LOS CLUSTERS DE HIERRO-AZUFRE. J.Cedano
RELACIÓN ENTRE LA ESTRUCTURA MOLECULAR DE FLAVONAS NATURALES Y LA PROTECCIÓN NEURONAL FRENTE A UN DAÑO OXIDATIVO. C. Echeverry
TRANSFERENCIA DE ARN DESDE LA CELULA DE SCHWANN AL AXON DURANTE LA REGENERACION DEL SISTEMA NERVIOSO PERIFERICO. L.
Canclini
BÚSQUEDA DE PROTEÍNAS RESPONSABLES DE LA REACTIVACIÓN DE LA PLASTICIDAD EN LA CORTEZA VISUAL DE RATÓN ADULTO. L. Ruiz
ALTERACION DE LA BARRERA HEMATOENCEFÁLICA EN UN MODELO DE ACIDEMIA GLUTÁRICA TIPO I. E. Isasi
RESUMENES:
“Ataxia de Friedreich: un modelo dinámico de las proteínas que forman los clusters de hierro-azufre”.
Isaac Amela1, Pedro Delicado2, Antonio Gómez1, Enrique Querol1, Juan Cedano3
1 Institut de Biotecnologia i Biomedicina, Universitat Autònoma de Barcelona, España; 2 E Departament d’Estadística i Investigació Operativa. Universitat Politècnica de Catalunya. Barcelona. España; 3 Laboratorio de Inmunología “Dr. Alberto Nieto”
Regional Norte-Salto (UDELAR)
La ataxia de Friedreich (FRDA) es la más común de las enfermedades
neurodegenerativas autosómicas y afectan al equilibrio, la coordinación y los músculos
del corazón. Esta asociada con la falta de producción de una proteína que se conoce
como Frataxina. Esta proteína ha sido asociada a la formación de clusters de hierro-
azufre (ISC) mitocondrial el interior de la mitocondria. Se han sugerido que existe un
alto grado de similitudes entre los mecanismos moleculares en los que interviene la
Frataxina en humano y en levadura. En levadura, la contribución de la Frataxina en la
formación de cluster hierro-azufre ha sido demostrada experimentalmente. Para
completar su función requiere de la intervención de otras proteínas cuya forma de
actuar no se conoce suficientemente desde el punto de vista estructural.
A la Yeast Frataxin (Yfh1) la encontramos con la proteína Isu, que también interacciona
con Nfs1-Isd11 formando complejos.
El objetivo de este trabajo es modelar que el complejo, a fin de comprender mejor su
función biológica. Este objetivo ha sido realizado por la aplicación de ciertas
herramientas bioinformáticas, diferentes programas de Docking de proteína y análisis
exhaustivos de los resultados. Finalmente podemos sugerir una posible estructura del
complejo de proteína y el tipo de comportamiento dinámico de sus componentes para
la biogénesis de ICS. Esta hipótesis podría ser una semilla para comprender mejor la
función y propiedades moleculares de Frataxina y sus proteínas asociadas. Puede
contribuir a conocer el procedimiento exacto de generación de los ISC y da pistas para
el diseño de futuros tratamientos.
“Relación entre la estructura molecular de flavonas naturales y la protección neuronal frente a un daño oxidativo”
C. Echeverry1, F. Arredondo1, M. Martínez1, JA. Abin-Carriquiry1, J. Midiwo2, F.
Dajas1.
1Departmento de Neuroquímica, Instituto de Investigaciones Biológicas Clemente Estable, Montevideo, Uruguay; 2Departmento de Química, Universidad de Nairobi,
Kenya.
El estudio de la relación entre la estructura química de flavonoides con la protección
neuronal son de gran importancia para el desarrollo de nuevas moléculas para el
tratamiento de neuropatologías. Un estudio previo de relación estructura-actividad,
evaluando la capacidad protectora de flavonas naturales en cultivo primario de
neuronas granulares del cerebelo contra un estímulo oxidativo, mostró que solo 4
flavonas fueron neuroprotectoras (de 13 estudiadas), indicando la existencia de
características estructurales específicas para neuroprotección en el modelo utilizado. El
objetivo del presente trabajo fue explorar posibles mecanismos de acción que podrían
estar implicados en la protección tales como: capacidad antioxidante, especies
reactivas del oxígeno intracelular, lipoperoxidación, niveles de calcio intracelular y el
pool de hierro lábil celular. También se evaluó la biodisponibilidad de las diferentes
flavonas. Los resultados mostraron que todas las flavonas presentan una buena
actividad antioxidante, sin una correlación directa con la capacidad de protección
neuronal. Además, tanto las flavonas protectoras como no protectoras fueron capaces
de prevenir el aumento de especies reactivas del oxígeno y de la lipoperoxidación
producido por el estímulo oxidativo. Por otro lado, mientras que el pool de hierro lábil no
parece estar afectado, resultados preliminares muestran que los niveles de calcio
podrían explicar la acción no protectora de algunas de las flavonas.
Por último, los estudios de biodisponibilidad celular muestran que las flavonas
neuroprotectoras sin el grupo catecol en el anillo B son más estables, propiedad
interesante para la potencialidad de estas flavonas como modelos moleculares de
posible uso clínico.
“Transferencia de arn desde la célula de schwann al axón durante la
regeneración del sistema nervioso periférico”
L. Canclini1, A. Kun1,2, A. Di Paolo1, A.Calliari1,3, K. Cal1, H. Wallrabe4, J.R. Sotelo-
Silveira5,6, J. Mercer7, J.R.Sotelo1
1. Departamento de Proteínas y Acidos Nucleicos, IIBCE; 2. Sección Bioquímica,
Facultad de Ciencias; 3. Departamento de Bioquímica y Biología Celular y
Molecular, Facultad de Veterinaria; 4. Departamento de Biología Celular,
Universidad de Virginia, USA; 5. Departamento de Genética, IIBCE; 6.
Sección Biología Celular, Facultad de Ciencias; 7. Centro Nacional de
Ciencias Biológicas, Bangalore, India.
Con el fin de entender mejor el rol de la síntesis local de proteínas en el axón,
hemos identificado una fuente complementaria al soma neuronal de los ARN axonales.
En el presente trabajo mostramos la acumulación axonal de ARN neosintetizado
marcado con Bromouridina (BrU) en la porción proximal de nervios ciáticos
seccionados de ratas. Debido a que los ARN son marcados con BrU en completa
ausencia del soma neuronal tanto in vitro como in vivo, estos ARN sólo pueden haber
sido sintetizados en la célula de Schwann, desde donde son transferidos al axón. La
transferencia de ARN neosintetizados no se observa cuando se desestabilizan los
microtúbulos o el citoesqueleto de actina. Así mismo, los ARN neosinetizados co-
localizan con kinesinas y miosina Va, dando además señales positivas en ensayos de
microscopía FRET entre estos motores moleculares y el ARN marcado con BrU.
Demostramos además que la transferencia de ARN marcados con BrU no ocurre en
fibras periféricas de ratones nulos en miosina Va (dilute lethal). Por último, hemos
identificado la presencia de los ARNm que codifican para las subunidades de
neurofilamentos y el ARNm que codifica para anquirina-G, conocidos marcadores
neuronales, en la población de ARN marcados con BrU sintetizados en la célula de
Schwann. Nuestros resultados demuestran la transferencia célula-célula de ARN e
identifican parte del mecanismo requerido para dicha transferencia en fibras del
sistema nervioso periférico de mamíferos.
“Búsqueda de proteínas responsables de la reactivación de la plasticidad en la corteza visual de ratón adulto”.
L. Ruiz, G. Vierci, N. Bornia, F.M. Rossi
Laboratorio de Neurociencias, Instituto de Biología,
Facultad de Ciencias, UdelaR
La escasa recuperación del sistema nervioso adulto luego de una lesión o de una patología es en gran parte debida a la reducción fisiológica de su capacidad plástica, la habilidad de modificar y adaptar su organización anatomo-fisiológica en función de la experiencia. Afortunadamente, en los últimos años se han identificado algunas estrategias que potencian la plasticidad neuronal en el adulto y así facilitan la recuperación de determinadas funciones. Estudios pioneros en la corteza visual primaria (CV1) de roedores han demostrado que el tratamiento crónico con fluoxetina, ampliamente conocido por su uso como anti-depresivo, potencia la plasticidad en el adulto y determina la recuperación de la visión en animales ambliopes. Sin embargo, los mecanismos subyacentes a la restauración de la plasticidad en el adulto son aún desconocidos. El presente trabajo tiene como objetivo contribuir a la caracterización de dichos mecanismos a nivel molecular. En particular, desarrollamos ensayos de proteómica mediante electroforesis bidimensional seguida por espectrometría de masa sobre muestras de CV1 de ratones C57B6 adultos tratados con fluoxetina (plasticidad restaurada) y controles (bajo nivel de plasticidad). Resultados preliminares nos han permitido identificar de un total de 300 spots, 41 con expresión diferencial entre las dos condiciones. De estos, se han podido identificar 31 proteínas mediante espectrometría de masa. Estas proteínas están implicadas en diversos procesos celulares (proteínas mitocondriales, enzimas metabólicas, regulación de la estructura neuronal). Esperamos poder confirmar próximamente el rol de algunas de estas proteínas en la restauración de la plasticidad cortical inducida por la fluoxetina in vivo.
“Alteración de la barrera hematoencefálica en un modelo de Acidemia Glutárica tipo I”
E. Isasi1, M.N. Sarlabós1, L. Barbeito2, S. Olivera-Bravo1
1Laboratorio de Neurobiología Celular y Molecular, IIBCE; 2Laboratorio de Neurodegeneración, Insitut Pasteur de Montevideo
La acidemia glutárica tipo I (GAI) es una enfermedad
neurometabólica/neurodegenerativa hereditaria producida por la deficiencia en la
enzima mitocondrial glutaril-CoA deshidrogenasa que participa del catabolismo de los
aminoácidos lisina, hidroxilisina y triptófano y su deficiencia produce acumulación de
ácido glutárico (GA) y metabolitos asociados en el cerebro y fluidos corporales. Los
pacientes GAI sufren degeneración estriatal, atrofia frontotemporal, leucoencefalopatía
espongiforme difusa, disrupción de la barrera hematoencefálica (BHE), hemorragias
subdurales y retinianas y enlentecimiento del flujo sanguíneo cerebral por causas
mayormente desconocidas. Nuestro grupo ha desarrollado un modelo farmacológico de
la enfermedad, inyectando intracerebralmente, a nivel del IV ventrículo, una dosis
fisiopatológica de GA (2.5 umol/g) en ratas Spargue Dawley de 1 día de vida. A los 14 y
30 días post-inyección (DPI), los animales fueron perfundidos con Evans Blue 1% y
paraformaldehído 4%, observándose un aumento de la extravasación de este colorante
en estriado y corteza de animales inyectados con GA. Además, por
inmunohistoquímica, se observó una disminución de la inmunorreactividad de laminina,
acuaporina 4 (presente en podocitos astrocitarios) y PDGFR (marcador de pericitos),
asociada a la vasculatura. Las células EB+ en el estriado co-localizaron
fundamentalmente con la proteína nuclear neuronal (NeuN) y a los 30 DPI, se observó
una muerte neuronal apoptótica significativa en el estriado, evidenciada por la
inmunomarcación de Anexina V. En conclusión, el modelo de inyección neonatal de
GA, produce una alteración o retardo en la maduración de la BHE, asociada a cambios
en las células perivasculares y en la membrana basal.
SIMPOSIO IV:
“Biotecnología Humana y Animal”
Coordinadores: A. Chabalgoity, JM. Verdes.
Expositores:
DESARROLLO DE TERAPIAS DIRIGIDAS EN ONCOLOGÍA: DE LA INVESTIGACIÓN
BÁSICA A LA CLÍNICA. PhD. Daniel Alonso. Laboratorio de Oncología Molecular, Universidad Nacional de Quilmes, Argentina
DIVERSIDAD DE PEQUEÑOS ARNS SECRETADOS POR CÉLULAS TUMORALES Y NO TUMORALES EN DISTINTAS FRACCIONES EXTRACELULARES: ESTUDIOS PRELIMINARES POR NGS. JP Tosar
ESTUDIO COMPARATIVO DE NANO-VECTORES MODULARES RECOMBINANTES Y LENTIVECTORES PARA LA TRANSDUCCIÓN DEL SISTEMA NERVIOSO LESIONADO.
M.L. Negro Demontel
RESUMENES:
“Desarrollo de terapias dirigidas en oncología: de la investigación básica a la
clínica”.
Daniel F. Alonso, MD PhD
Laboratorio de Oncología Molecular, Departamento de Ciencia y Tecnología,
Universidad Nacional de Quilmes, Buenos Aires, Argentina
Mail de contacto: [email protected]
Los paulatinos avances en la lucha contra el cáncer han sido el resultado de la suma
de conocimientos y de la combinación de métodos comprobados en la prevención y
tratamiento para cada variante tumoral. Incluso las nuevas terapias dirigidas -como
anti-angiogénicos, anti-señales e inmunoterapia- requieren de un complejo desarrollo
para cada indicación, debiendo encontrar una “ventana de oportunidad” para aportar un
beneficio clínico al combinarse a los tratamientos estándar, la cirugía y la
quimio/radioterapia. Nuestro grupo es responsable a nivel científico de un consorcio
público-privado, integrado por entidades académicas, universitarias y hospitalarias
junto a empresas farmacéuticas argentinas, que en los últimos ha consolidado un
pipeline de productos innovadores en oncología que se encuentran en distintas fases
preclínicas o clínicas. Recientemente, el anticuerpo monoclonal anti-idiotipo
racotumomab, desarrollado con el Centro Inmunología Molecular de La Habana, fue
registrado en Cuba y Argentina tras un protocolo de Fase II/III con resultados
favorables en pacientes con cáncer pulmonar avanzado, en su variante de células no
pequeñas (NSCLC). Por otra parte, un panel de análogos peptídicos de vasopresina
con propiedades antitumorales y hemostáticas diseñados en nuestro laboratorio, se
encuentra en estudios de Fase II como adyuvante perioperatorio en cánceres
localmente avanzados o lesiones sangrantes. Alcanzar los estudios en seres humanos
y la posibilidad de registro de nuevas opciones terapéuticas en oncología llevó más de
15 años, requiriendo un abordaje multidisciplinario que integró saberes básicos, clínicos
y tecnológicos.
“Diversidad de pequeños arns secretados por células tumorales y no tumorales en distintas fracciones extracelulares: estudios preliminares por NGS”
Juan Pablo Tosar1,2, Julia Sanguinetti1, Braulio Bonilla1, Gonzalo Greif3, Alfonso Cayota1,4
1 Laboratorio de Genómica Funcional, Institut Pasteur de Montevideo 2 Unidad de Bioquímica Analítica, CIN – Facultad de Ciencias (UdelaR) 3 Unidad de Biología Molecular, Institut Pasteur de Montevideo 4 Departamento Básico de Medicina, Facultad de Medicina (UdelaR)
Mediante la generación de moléculas de ARN de pequeño tamaño (ARNs-p; 19-40nt)
las células son capaces de establecer un control fino de la expresión génica. El caso
paradigmático lo constituyen los micro-ARNs (21-22nt), los cuales median el
silenciamiento de ARNs mensajeros de secuencia complementaria. Recientemente,
otras familias de ARNs no codificantes han sido reconocidas como fuentes de ARNs-p.
En particular, nuestro grupo ha venido estudiando la presencia en distintos organismos
de fragmentos derivados de ARNs de transferencia, cortados a nivel de la horquilla
anti-codón. Además del rol que los ARNs-p ejercen dentro de la célula en la que son
generados, también se ha demostrado su secreción dentro de vesículas extracelulares.
Más aún, al ser internalizadas estas vesículas por parte de células receptoras, los
ARNs-p retienen su capacidad de silenciamiento. Por consiguiente, las células poseen
la capacidad de regularse mutuamente mediante la secreción y captación de algunos
de estos ARNs-p. La implicancia de estos mecanismos en procesos como el cáncer
reviste un singular interés. No obstante, poco se sabe sobre la secreción de ARNs-p
más allá de los micro-ARNs. Tomando como modelo una línea celular de cáncer de
mama y una línea celular no tumoral, hemos comenzado la caracterización por
secuenciado masivo del perfil de ARNs pequeños (19-60nt) secretados, discriminando
además entre distintas fracciones extracelulares: ectosomas, exosomas y fracción
ribonucleoproteica. Nuestros resultados evidencian gran diversidad de familias de
ARNs-p, con secreción diferencial entre células y entre distintas poblaciones
extracelulares.
“Estudio comparativo de nano-vectores modulares recombinantes y lentivectores
para la transducción del sistema nervioso lesionado”.
M.L. Negro Demontel1,2, J.Domingo-Espín4,5,6, Esther Vazquez4,5,6, Neus Ferrer4,5,6,
A. Villaverde4,5,6, Rafael Yañez-Muñoz3, L. Barbeito1, H. Peluffo1,2
1Department of Histology and Embryology, Faculty of Medicine, UDELAR, Montevideo,
Uruguay; 2Neurodegeneration Laboratory, Institut Pasteur de Montevideo, Montevideo,
Uruguay, 3School of Biological Sciences, Royal Holloway-University of London, Egham,
UK,4Institute for Biotechnology and Biomedicine, Barcelona, Spain; 5Department of Genetics
and Microbiology, Universitat Autònoma de Barcelona, Barcelona, Spain; 6Networking Research
Center on Bioengineering, Biomaterials and Nanomedicine (CIBER-BBN), Instituto de Salud
Carlos III.
Existe una gran variedad de vectores capaces de transferir ADN al sistema nervioso,
capaces algunos de una expresión sostenida en el tiempo para la corrección de
patologías crónicas, mientras que otros presentan una expresión transitoria más acorde
al tratamiento de daños agudos.
Los vectores virales, aún siendo muy eficientes como vehículos de transferencia
génica, presentan limitaciones en su uso, entre las cuales cabe destacar la toxicidad e
inmunogenicidad así como la posible mutagénesis insercional y los riesgos de
bioseguridad.
Los polipéptidos recombinantes modulares fueron diseñados imitando características
relevantes del ciclo de vida viral para optimizar la entrega de ADN en células blanco
específicas. Su modo de acción se basa en la presencia de módulos funcionales
específicos para la asociación y condensación del ADN, interacción con la superficie
celular, escape endosomal, e importación nuclear.
En el presente proyecto nos propusimos comparar la eficiencia de transducción, el
potencial neuroprotector y los posibles efectos inmunogénicos o neurotóxicos de
lentivectores de tercera generación (LV) vs. vectores recombinantes modulares HKRN
y HRNK, tanto in vitro como in vivo, en un modelo de trauma cerebral inducido por
contusión cortical controlada en rata.
Los animales tratados con HNRK o con LV luego de una lesión cerebral, mostraron
niveles considerables de expresión del transgén GFP tanto a los 3dpl como a los 14dpl.
Estos animales mostraron una notable recuperación funcional y una baja inflamación
medida por la expresión de IL1b en comparación con los controles.
SIMPOSIO V:
“Metabolismo, regulación y señalización”
Coordinadores: H. Rubbo, A. Trostchansky
Expositores:
SIRT1 COMO BLANCO TERAPÉUTICO EN ENFERMEDADES METABÓLICAS. A Denicola
LA ACTIVACIÓN DE LA VÍA NRF2 COMO ESTRATEGIA TERAPÉUTICA EN ENFERMEDADES NEURODEGENERATIVAS. P Díaz INCREMENTO DEL CAMP EN RESPUESTA A LA DESPOLARIZACIÓN DEL POTENCIAL DE MEMBRANA PLASMÁTICA EN ENDOTELIO DE CÓRNEA DE BOVINO. F. Evans
MTCH2: CARACTERIZACIÓN MOLECULAR DE SU EXPRESIÓN DURANTE LA ESPERMATOGÉNESIS DE LA RATA Y RELACIÓN CON LA MUERTE CELULAR PROGRAMADA. A. Goldman
ESTUDIO DE LOS MECANISMOS INVOLUCRADOS EN EL TRANSPORTE DE PROTEÍNAS ENTRE EL NÚCLEO Y LA CILIA. B. Torrado
RESUMENES:
“SIRT1 como blanco terapéutico en enfermedades metabólicas”.
Dra. Ana Denicola
Mail de contacto: [email protected].
Las sirtuinas son enzimas desacetilasas NAD-dependientes, pertenecientes a un grupo
de Histona Desacetilasas HDAC. En mamíferos hay siete isoformas de las cuales
SIRT1, la nuclear, es la más estudiada. SIRT1 actúa no sólo sobre histonas acetiladas
sino sobre varios factores de transcripción que participan en rutas metabólicas
conservadas; de ahí la conexión de SIRT1 con regulación del metabolismo de lípidos,
carbohidratos y homeostasis mitocondrial. En 2003 (Nature, 425:191-196) aparece el
resveratrol (polifenol de origen vegetal presente en uvas) como fuerte activador de
SIRT1 y en 2006 el grupo de Sinclair publica resultados sorprendentes en modelo
murino de obesidad y trastornos metabólicos asociados (Nature, 444:337-342). Los
estudios en ratones claramente demuestran los efectos beneficiosos del resveratrol en
revertir la resistencia a la insulina, la acumulación de grasa a nivel hepático, la
recuperación de niveles normales de glicemia, con mejor funcionalidad mitocondrial,
incluso biogénesis mitocondrial. La acción del resveratrol a nivel celular está asociada
con una mayor actividad de SIRT1, pero lo que se pensó inicialmente, una activación
directa de la enzima parece no ser el mecanismo sino que depende de la interacción
con proteínas reguladoras de la actividad desacetilasa. Si bien los ensayos clínicos en
humanos de intervención con resveratrol, hasta ahora, no son concluyentes, hay una
intensa investigación en la búsqueda de nuevos activadores de SIRT1, los llamados
STACs (Sirtuin-Activating Compounds).
"La activación de la vía Nrf2 como estrategia terapéutica en Enfermedades
Neurodegenerativas".
Pablo Diaz-Amarilla
Mail de contacto: [email protected].
Instituto de Investigaciones Biológicas Clemente Estable
Los acidos grasos nitrados (NO2-FA; nitro-fatty acids) son moléculas electrofílicas que
se forman en los tejidos debido a la sobreproducción de especies reactivas de
nitrogeno durante la inflamación y que pueden actuar como mediadores de la
señalización celular. Los NO2-FA inducen una variedad de vías citoprotectoras y anti-
inflamatorias a través de la modificación post-traducción de ciertas proteinas y la
activación de factores de transcripción como por ejemplo Nrf2. En ratas SOD1G93A, un
modelo animal de Esclerosis Lateral Amiotrófica (ELA), se demostró que la activación
de Nrf2 específicamente en astrocitos previene la muerte de motoneuronas
característica de esta enfermedad neurodegenerativa fatal. Considerando que los
acidos grasos nitrados son potentes inductores de Nrf2, en este trabajo evaluamos el
efecto protector de dos acidos grasos nitrados, el acido nitro-araquidónico (AANO2) y el
acido nitro-oleico (OANO2), en un modelo celular de ELA. En primer lugar estudiamos
la capacidad de AANO2 y OANO2 de inducir la activación de Nrf2 en astrocitos en
cultivo. Finalmente evaluamos el potencial de AANO2 y OANO2 de revertir la toxicidad
de los astrocitos SOD1G93A sobre motoneuronas en un sistema de co-cultivo. Los
resultados obtenidos confirman que los acidos grasos estudiados son potentes
inductores de Nrf2 y que la activación de dicho factor de transcripción en astrocitos
podría constituir una estrategia terapéutica relevante para el tratamiento de la ELA.
“Incremento del camp en respuesta a la despolarización del potencial de membrana plasmática en endotelio de córnea de bovino”
F. Evans1, J.A. Hernández2, S. Chifflet3
Departamentos de 1Histología y Embriología y 3Bioquímica, Facultad de Medicina
(UDELAR), 2Sección Biofísica, Facultad de Ciencias (UDELAR)
Nuestro laboratorio encontró que la despolarización del potencial de membrana plasmática (DPMP) de células de endotelio de córnea de bovino (BCEC) en cultivo provoca la remodelación de la actina‐F cortical, lo que finalmente conduce a la pérdida
de los contactos célula‐célula. Asimismo hallamos que la cadena liviana de la miosina no muscular II monofosforilada (pMLC) disminuye en respuesta a la DPMP. Aquí investigamos si la vía del cAMP/PKA está implicada en los cambios observados en la actina-F y la p-MLC frente a la DPMP en BCEC. Las DPMP se indujeron mediante soluciones salinas despolarizantes. Los niveles del cAMP y el estado de fosforilación de la MLC se determinaron utilizando anticuerpos anti-cAMP y anti-pMLC respectivamente. La PKA se inhibió con un péptido específico comercial, iPKA. Se realizaron controles con forscolina. En monocapas de BCEC en cultivo la DPMP determinó un incremento del cAMP. Este
aumento se observa a los 10 minutos, cuando aún no se evidencian grandes cambios
en la actina-F cortical, y se prolonga en el tiempo aún cuando se produce una pérdida
en los contactos celulares. En presencia de iPKA, no se observó una disminución de la
pMLC ni tampoco una remodelación del citoesqueleto de actina-F en respuesta a la
DPMP. Estos resultados sugieren que la vía de la cAMP/PKA podría ser una de las
vías implicadas en los cambios del citoesqueleto de actina-F cortical en respuesta a la
DPMP. La intervención en esta vía podría ser una estrategia interesante para modular
las uniones celulares.
“MTCH2: caracterización molecular de su expresión durante la espermatogénesis de la rata y relación con la muerte celular programada”
A. Goldman1, E.González-López1, A. Geisinger1,2
1Departamento de Biología Molecular IIBCE, 2Sección Bioquímica Facultad de Ciencias (UDELAR)
El gen Mtch2 codifica para una proteína presuntamente apoptótica involucrada
en la interconexión entre las vías extrínseca e intrínseca de apoptosis. En la rata descubrimos que Mtch2 se expresa diferencialmente en el testículo adulto respecto a otros tejidos, y respecto a etapas previas del desarrollo de la línea germinal. Es más, hallamos diferencias cuantitativas en la expresión de Mtch2 entre diferentes estadios del epitelio seminífero y entre los distintos tipos de células germinales. Determinamos que aquellas células donde se expresan mayores niveles de Mtch2 son los espermatocitos (células en profase meiótica I), y que en este tipo de célula se expresa una variante transcripcional con una región 3´UTR mucho más corta. Caracterizamos además el patrón subcelular de localización de Mtch2 en el testículo, determinando que se trata de una proteína mitocondrial. Mediante el empleo de metodologías para el estudio de muerte celular programada (MCP), detectamos que en células que se encuentran sufriendo apoptosis, Mtch2 presenta un perfil peculiar de expresión y que bajo condiciones de inducción de la MCP a nivel testicular, se observa un aumento en la expresión de la proteína, junto con un incremento en la aparición de marcadores apoptóticos clásicos. Los resultados expuestos indican que Mtch2 representa un gen con un perfil de expresión particular, añadiendo nueva evidencia acerca de la peculiaridad en los perfiles de expresión génica que presenta el testículo, e introduciendo a Mtch2 en el panorama de la regulación de la MCP a nivel de este órgano.
“Estudio de los mecanismos involucrados en el transporte de proteínas entre el núcleo y la cilia”
B. Torrado1, JL. Badano1 y F. Irigoín1,2
1Laboratorio de Genética Molecular Humana, Institut Pasteur de Montevideo, Montevideo, Uruguay; 2Departamento de Histología y Embriología, Facultad de
Medicina, Universidad de la República, Montevideo, Uruguay
La cilia primaria es un organelo que participa en la transducción de diversas vías de señalización. Los mecanismos de selección y transporte de las proteínas destinadas a la cilia no se conocen, pero varias evidencias sugieren similitudes con el transporte de proteínas al núcleo: i) algunas nucleoporinas han sido localizadas en la base de la cilia (zona de transición), que actuaría como un “poro ciliar”; ii) al menos dos proteínas ciliares entran a la cilia utilizando la maquinaria de importación nuclear, en particular,
Importina 2 y el gradiente de Ran-GTP/Ran-GDP entre el citosol y la cilia; iii) varias proteínas se han localizado tanto en el núcleo como en la cilia, por ejemplo los factores de transcripción Gli, efectores de la vía de Shh que son activados en la cilia, y algunas proteínas del síndrome de Bardet-Bield, BBS7 y BBS2, que nuestro grupo ha identificado en ambos compartimientos. En este trabajo estudiaremos algunas de estas proteínas con localización ciliar y nuclear, a fin de identificar aspectos compartidos entre el transporte a la cilia y al núcleo y características que sean diferentes y determinen la localización final de la proteína. Así, nos encontramos
analizando el papel de las importinas 1 y 2 en el transporte de Gli2 a la cilia, utilizando tanto inhibidores químicos de las importinas como disminuyendo su expresión a través de ARNi. Además, planeamos purificar Gli2 ciliar y nuclear a fin de buscar, por espectrometría de masa, modificaciones post-traduccionales y/o interactores potencialmente responsables del destino final de la proteína.
SIMPOSIO VI:
“Educación en Ciencias”
Coordinadores: MN. Alvarez, A. Medeiros
Expositores:
QUE NOS ENSEÑA UN CAMPAMENTO CIENTÍFICO SOBRE EL APRENDIZAJE
CIENCIA. G. Gellon.
UNA NUEVA CURRICULA DE GRADO EN BIOTECNOLOGÍA: ACIERTOS Y DESACIERTOS. C. Sanguinetti
APRENDIZAJE BASADO EN PROBLEMAS: METODOLOGÍA DE APRENDIZAJE CENTRADA EN EL ESTUDIANTE. V. Tortora
PRESENTACIÓN DE REVISTA BRASILERA EDUCACIÓN EN BIOQUÍMICA. A. Cassina
RESUMENES:
“Que nos enseña un campamento científico sobre el aprendizaje ciencia.”
Dr. G. Gellon.
Mail de contacto: [email protected]
Ministerio de Ciencia, Tecnologia e Innovacion Productiva de la Nacion
Argentina, a cargo de proyectos educativos en el Programa de Popularización de
la Ciencia y la Innovacion. Profesor invitado en la Universidad de San Andres.
Asociación Civil Expedicion Ciencia, miembro fundador.
Hablaré con ustedes sobre la experiencia en enseñanza del pensamiento científico
recogida en diez años de trabajo en campamentos científicos con el equipo de
Expedición Ciencia. En este abordaje se combinan atención a los vínculos sociales y
afectivos de lsos participantes, el contacto intenso y estetico con la naturaleza, el
trabajo en equipo. Ademas trabajamos con una técnica que llamamos "desde cero"
para estimular el contacto cognitivamente genuino de los estudiantes con los
problemas suscitados en ciencia.
“Aciertos y desaciertos en 4 años de dictado de la Licenciatura en
Biotecnología”.
Carlos Sanguinetti. Coordinador Académico
Mail de contacto: [email protected]
La creación de una nueva carrera supone un gran desafío. En particular la enseñanza
en un área de creciente impacto para el país, novedosa pero aún no sólidamente
posicionada implica un desafío aún mayor. En estos primeros cuatro años de carrera
hemos tenido grandes aciertos pero también se han cometido inevitablemente errores.
Dentro de los principales aciertos podemos destacar que la curricula contiene gran
carga horaria destinada a la adquisición de destrezas técnicas, lo que hace qu el
egresado necesite muy poco tiempo de inducción cuando se inserta en el mercado
laboral. El segundo gran acierto es la creación de la figura del "director de carrera",
esto permite la visión global e la formación y la adecuación constante de la curricula. El
tercer acierto resultó ser la enseñanza curricular de la actitud emprendedora y su
complementación con materias empresariales.
Otro gran acierto fue la creación en paralelo del laboratorio de Investigación. En dicho
laboratorios se trabaja en temas de interés de la industria nacional y regional en
biotecnología y ha generado proyectos y alianzas con empresas a nivel nacional e
internacional. En la mayoría de estas líneas de investigación se han incorporado
alumnos avanzados de la carrera y no sólo de ORT sino también de UdelaR. .
Los desaciertos han sido muchos, de ellos hemos aprendido y seguimos aprendiendo
de forma de mejorar no sólo la formación de los alumnos sino también el
posicionamiento de la biotecnología a nivel nacional.
“Aprendizaje basado en problemas: Metodología de aprendizaje centrada en el
estudiante”
V. Tórtora1, R. Barce1,2, A. Rodriguez2, M. Placeres2, N. Nion2, M. Cora2, M.N.
Alvarez1
1Departamento de Bioquímica, Facultad de Medicina, Universidad de la República; 2Departamento de Educación Médica, Facultad de Medicina, Universidad de la
República
La reforma del plan de estudios de la carrera de Doctor en Medicina implicó, entre otras
modificaciones, la incorporación de nuevas metodologías de enseñanza y aprendizaje.
Una de ellas es la de “aprendizaje basado en problemas” (ABP), que se caracteriza por
colocar al estudiante en el centro del proceso de aprendizaje, promoviendo que este
sea significativo, además de desarrollar habilidades y competencias indispensables en
el ejercicio profesional.
El ABP se realiza en grupos de aproximadamente 20 estudiantes, en dos instancias. El
problema es diseñado por un equipo docente interdisciplinario, en función a los
objetivos del curso. En la primera instancia se presenta el problema y los estudiantes
discuten en función de sus conocimientos previos, identificando las áreas de saber y de
no saber sobre el problema, e intentan plantear hipótesis explicativas sobre las
dificultades identificadas. Lugo deben determinar qué competencias y nuevos
conocimientos necesitan para comprobarlas. Este proceso es realizado de manera
autónoma por los estudiantes, bajo la dirección de un docente tutor que actúa como
facilitador del aprendizaje. Entre una instancia y otra buscan la información necesaria
para lograr los objetivos de estudio definidos por el grupo, y regresan al problema en la
segunda instancia. La información encontrada es compartida entre los integrantes del
grupo, mediante discusión en foros en la plataforma de aprendizaje virtual (EVA) y
durante las clases presenciales, haciendo que el aprendizaje sea además cooperativo.
En esta presentación se expondrá esta metodología de trabajo junto con un ejemplo de
un problema específico con objetivos de bioquímica.
SIMPOSIO VII:
“Parasitología Molecular”
Coordinadores: L.Piacenza, P.Berasain
Expositores:
ALVOS PARA O CONTROLE DO CARRAPATO BOVINO. I.Da Silva Vaz.
LYSOSOMES AND CHOLESTEROL: 2 PLAYERS ON T. CRUZI HOST CELL INVASION. L Oliveira Andrade.
ESTUDIO DE LA RESPUESTA CELULAR TEMPRANA A LA INFECCIÓN POR Trypanosoma cruzi. ML Chiribao
OPTIMIZACIÓN DE LA INTERFERENCIA DE ARN EN JUVENILES DE Fasciola
hepática. N. Dell’Oca AISLAMIENTO DE POSIBLES “NEOBLASTOS” DE CESTODOS Y ESTUDIO DE GENES CLAVES PARA EL ENTENDIMIENTO DE SU REGULACIÓN. S Estrade
RESUMENES:
" Alvos para o controle do carrapato bovino". Dr. Itabajara Da Silva Vaz.
Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Faculdade de Veterinária, Departamento
de Patologia e Clínica Veterinária.
Mail de contacto:[email protected]
Os carrapatos são ectoparasitas e existe necessidade de novos métodos para o seu
controle. Uma seleção racional de moléculas alvos poderá ser obtida através do estudo
de vias fisiológicas do parasita.
“Lysosomes and cholesterol: 2 players on T. cruzi host cell invasion". Dra
Luciana de Oliveira Andrade.
Universidade Federal de Minas Gerais, Instituto de Ciências
Biológicas,Departamento de Morfologia
Mail de contacto: [email protected]
Trypanosoma cruzi is an obligatory intracellular parasite, which is able to infect a wide range of cell types. This pathogen enters cells by stimulating cell plasma membrane and enhancing intracellular calcium, which causes lysosomal exocytosis at parasite’s attachment site and internalization of T. cruzi. Since the interrelation between trypomastigotes and plasma membrane is crucial for a successful infection and cholesterol had been shown to be somehow important for T. cruzi invasion, we decided to study the role of host cell cholesterol in T. cruzi entry. Our results showed that cholesterol depletion, due to methyl-beta cyclodextrin (MBCD) treatment, diminishes both parasite invasion and lysosomal association for the formation of the parasitophorous vacuole. Cholesterol depletion provokes precocious exocytosis of lysosomes localized near the cell cortex, diminishing lysosomes available for T. cruzi invasion. Cholesterol removal also changed mechanical properties of cells. We observed, using tether extraction with optical tweezers (OT) and defocusing microscopy (DM), that cells become stiffer when treated with MβCD, a drug that sequesters cholesterol from cell membranes. These changes in membrane dynamics involved not only the actin cytoskeleton rearrangement, but also its polymerization de novo and stress fiber formation through Rho activation. Additionally, we have shown that changes in cellular mechanics is involved with peripheral lysosome exocytosis triggered by cholesterol removal. This specific pool of peripheral lysosomes corresponds to the pool used by T. cruzi to enter host cells. These data strongly support the existence of at least two different pools of lysosomes with different exocytosis dynamics and regulation. Additionally, we found that lysosomal specific proteins, such as LAMP are very important in parasite cell entry and intracellular development, reinforce the role of lysosomal membrane in the process of T. cruzi host cell infection.
Animal experimentation approved protocol: CETEA- UFMG 045/2009. Funding: CNPq, FAPEMIG and CAPES/ INCT-FCx.
“Estudio de la respuesta celular temprana a la infección por Trypanosoma cruzi”
ML Chiribao 1,2, G Libisch 2, A Parodi-Tálice 3,2 G Greif 2, C Robello 1,2
1 – Departamento de Bioquímica, Facultad de Medicina (UDELAR), 2-Unidad de
Biología Molecular, Institut Pasteur de Montevideo, 3- Sección Genética, Facultad de
Ciencias (UDELAR)
La enfermedad de Chagas constituye un importante problema de salud en el continente
americano, y es causada por el protozoario parásito Trypanosoma cruzi. T. cruzi infecta
y se replica en tejidos cercanos al sitio de entrada para luego diseminarse por el
torrente sanguíneo hacia tejidos más distales. Si bien se conocen algunas de las
estrategias utilizadas por el parásito para invadir e infectar células de mamíferos, la
respuesta de la célula a dicha infección es menos conocida, particularmente no existen
trabajos a gran escala que estudien dicha respuesta a tiempos cortos de infección en
modelos celulares humanos. Este tipo de análisis podría llevar a descubrir la relevancia
de algunas vías y genes requeridos para lograr una eficiente infección por el parásito.
En este trabajo se realizaron microarreglos de expresión de células Hela infectadas
con T. cruzi a tiempos cortos de infección, abarcando principalmente los procesos de
adhesión, internalización del parásito y escape al citosol de la célula. Se identificaron
aproximadamente 1250 genes con diferencias de expresión significativas (p≤0.01) a las
0, 3 y 6 horas post infección en comparación a células sin infectar, siendo el 65 % de
dichos genes sobreexpresados. Pudimos observar que T. cruzi dispara una importante
respuesta inflamatoria y proliferativa en las células hospederas así como también una
inhibición de la apoptosis. Este análisis global aporta nuevo conocimiento en cuanto a
los mecanismos mediante los cuales T. cruzi genera patogenicidad
“Optimización de la interferencia de arn en juveniles de Fasciola hepática”
N. Dell’Oca1, T. Basika1, G. Rinaldi1,2, E.Castillo3, P. J. Brindley2, J.F. Tort1
1Departamento de Genética, Facultad de Medicina (UDELAR); 2 Department of Microbiology, Immunology & Tropical Medicine, George Washington University Medical Center, Washington, DC, USA; 3Seccion Bioquimica, Instituto de Biologia, Facultad de
Ciencias (UDELAR)
Mientras crece exponencialmente el conocimiento de los genomas y/o transcriptomas
de platelmintos parásitos, también aumenta el problema de validar funcionalmente los
genes putativos identificados. La ausencia de herramientas clásicas de genética
reversa puede ser resuelta mediante la interferencia de ARN (ARNi), aunque esta
herramienta esta optimizada apenas en Schistosoma mansoni. Estudios previos de
nuestro grupo han mostrado que la ARNi es viable en Fasciola heptica, por lo que
avanzamos en la optimización de esta tecnología en este parasito, de alta prevalencia
en el ganado uruguayo.
Utilizando un gen de copia única la Leucin- Aminopeptidasa (LAP) como blanco
ajustamos condiciones de delivery, identificando al electro-soaking (electroporación e
incubación posterior) como el método más eficiente de incorporación de moléculas
interferentes. Logramos efectos reproducibles con concentraciones de ARN doble
cadena (ARNdc) menores a la utilizadas anteriormente, lo que reduce la posibilidad de
efectos off-target. Comparamos los efectos de ARNdc largos con short interfering RNA
(siRNA) observando que si bien ambos tipos de moléculas son igualmente efectivas en
tiempos cortos, solo persiste el silenciamiento utilizando ARNdc. Logramos mantener la
supresión génica hasta al menos 21 días post tratamiento, lo que sugiere que
mecanismos de amplificación de la señal interferente pueden estar presentes en este
parásito. Este silenciamiento persistente a partir del estadio invasivo por hasta 3
semanas (próximo a lo que demora el parasito en llegar al hígado) abre la posibilidad
de utilizar esta herramienta en la validación de la búsqueda de nuevos blancos
terapéuticos.
“Aislamiento de posibles “neoblastos” de cestodos y estudio de genes claves para el entendimiento de su regulación”.
Estrade Soba, S.1, Dominguez, F.1, Koziol, U.1,2, Costábile, A.1, Porro, V.3, Bollati,
M.3, Tort, J.4, Castillo, E.1 1 Sección Bioquímica y Biología Molecular, Facultad de Ciencias – Universidad de La República, Uruguay; 2 Institute for Hygiene and Microbiology, University of Würzburg; 3
Unidad de Biología Celular, Instituto Pasteur – Montevideo; 4 Departamento de Genética, Facultad de Medicina – Universidad de La República.
Nuestro trabajo busca profundizar en aspectos de la biología de cestodos, particularmente en el aislamiento y caracterización de células proliferantes (“neoblastos”) de Mesocestoides corti como primer paso hacia el cultivo de líneas celulares de este organismo. En estudios previos logramos caracterizar histológicamente dichas células, concluyendo que tanto la localización como las características de éstas son conservadas en la clase cestoda. Basados en los antecedentes mencionados, es que actualmente estamos trabajando en la caracterización de dichas células mediante el aislamiento en fase S y G2/M por citometría de flujo, y en la expresión de marcadores moleculares específicos de éstas que permitan seguir su destino a lo largo de los ciclos biológicos. Hasta el momento hemos conseguido aislar poblaciones celulares en las distintas etapas del ciclo celular y hemos realizado ensayos de incorporación de EdU y posterior separación celular como forma de corroborar las poblaciones celulares aisladas. A su vez, clonamos y caracterizamos en M. corti dos genes tipo Pumilio, marcadores moleculares de neoblastos, sobre los cuales realizamos estudios de expresión en las diferentes etapas de desarrollo de Echinococcus multilocularis. También logramos caracterizar un homólogo del gen nanos que en todos los animales estudiados se expresa exclusivamente en la línea germinal y un gen PL10. Por otro lado, teniendo como base avances recientes en el cultivo celular de E. multilocularis, estamos poniendo a punto técnicas de cultivo de células de M. corti.
SIMPOSIO VIII:
“Temas emergentes”
Coordinadores: C.Dartayete, P.Diaz.
Expositores:
QUE PREGUNTAR, QUE CONTESTAR Y QUE CONTROLAR CON LOS ABOGADOS/GESTORES QUE VAYAN A TRAMITAR UNA POSIBLE PATENTE. EXPERIENCIA DE EXITOS Y FRACASOS. F. Goñi.
EXPERIENCIAS EN PATENTAR DESARROLLOS BIOTECNOLÓGICOS EN CÁNCER GENERADOS EN URUGUAY. E. Osinaga
POR QUÉ, PARA QUÉ Y CÓMO PROTEGER LA PROPIEDAD INTELECTUAL EMERGENTE DE LOS PROYECTOS DE INVESTIGACIÓN. A. Barrios. A. Mayer. C. Dartayete
RESUMENES:
"Que preguntar, que contestar y que controlar con los abogados/gestores que vayan a tramitar una posible patente. Experiencia de exitos y fracasos".
Dr. Fernando Goñi. Department of Neurology, School of Medicine, New York University, USA
Mail de contacto: [email protected]
El proceso de experimentación cinetífica lleva a adelantos en distintos campos que llamamos descubrimientos o creaciones. A diferencia de hace 100 o 50 años los avances biotecnológicos o básicos pueden ser generadores rápidos de recursos económicos. Para preservar esa posibilidad el inventor necesita protegerlos y en consecuencia hoy frente al resultado de un experimento parece ser mas importante consultar si es patentable que asegurarse es el curso correcto de la experimentación. Como el proceso científico implica la transmisión de conocimientos, toma ahora importancia cuando se efectúan dependiendo de la “patentabilidad” de los mismos. Una palabra pública escrita o almacenada en otro medio implica anticipación y determinará si posteriormente una parte de los experimentos puede ser patentado. Se analizará la experiencia del “día después” implicando pérdida de derechos. Se analizará también la importancia de tener equipos de abogados especializados tanto en el conocimiento técnico científico como en el legal. Se analizará el problema de la palabra equivocada en el reclamo a patentar y de la palabra faltante en la petición original. Por último la importancia del trabajo estrecho entre el inventor y el gestor y el análisis correcto de las bases de datos para evitar pérdidas de tiempo con las consecuencias que ello trae aún en el caso de la obtención de una patente.
SIMPOSIO IX:
“BIOCATÁLISIS”
Coordinadores: P.Menedez, C. Giacomini.
Expositores:
BIOCATALISIS: ÁREA EN CRECIENTE Y DINÁMICA EXPANSIÓN. G. Irazqui
BIOTRANSFORMACIONES MEDIADAS POR VEGETALES. UNA HERRAMIENTA ÚTIL EN LA BÚSQUEDA DE MICROORGANISMOS ENDÓFITOS CON ACTIVIDAD BIOCATALÍTICA ESPECÍFICA. P. Rodriguez
W-TRANSAMINASAS Y MONOAMINO-OXIDSAS EN LA SINTESIS REGIO- Y ESTEREO- SELECTIVA DE PIRROLIDINAS 2,5 DISUSTITUIDAS. C. Iglesias
UNA ETAPA CRÍTICA PARA SINTETIZAR CICLODEXTRINAS MEDIANTE UN PROCESO CONTINUO: LA CARACTERIZACIÓN DEL DERIVADO CGTASA-TSI-TOYOPEARL. G. Peralta Altier
PURIFICACION Y CARACTERIZACION DE AntA, PROTEASA CISTEÍNICA
EXTRAIDA DE FRUTOS DE Bromelia antiacantha Bertol. D. Vallés Presenta
A.Cantera
RESUMENES:
“Biocatalisis: área en creciente y dinámica expansión”
G. Irazoqui
Mail de contacto: [email protected]
Cátedra de Bioquímica, Departamento de Biociencias, Facultad de Química, UdelaR
En su definición más simple la biocatálisis, también conocida como catálisis enzimática
o biotransformación, es el uso de enzimas para catalizar reacciones químicas. Dado
que la diversidad natural está siendo cada vez más explotada, el número de enzimas
disponibles ha aumentado enormemente, y como consecuencia la investigación en
esta área ha recibido mucha atención.
Esta disciplina abarca áreas de estudio muy amplias y diferentes como son:
- búsqueda y caracterización de nuevas enzimas, con propiedades de biocatálisis prometedoras, ya sea mejoradas o diferentes a las ya conocidas
- ingeniería del biocatalizador que permite mejorar las propiedades de las enzimas, cambiarlas, o adaptarlas a procesos determinados
- ingeniería del medio de reacción - aplicaciones de estos biocatalizadores en áreas diversas como química fina,
síntesis de fármacos, industria alimentaria, bioenergética, etc A lo largo de varios años nuestro grupo de investigación se ha focalizado en el estudio
de diversas enzimas (glicosidasas, proteasa, quitosanasa, lipasa,
ciclodextrinaglucosiltransferasa, etc), profundizando en la caracterización del sistema,
en la ingeniería del catalizador enzimático, y en las aplicaciones biotecnológicas de los
mismos. El estudio de estos sistemas enzimáticos desde las diferentes áreas
complementarias de la biocatálisis nos ha permitido el diseño adecuado de cada
sistema según la aplicación final buscada. Se presentaran brevemente los ejemplos
que mejor ilustran los avances alcanzados en esta área por nuestro grupo de
investigación.
Biotransformaciones mediadas por vegetales. Una herramienta útil en la
búsqueda de microorganismos endófitos con actividad biocatalítica específica.
Paula Rodríguez,a Cynthia Magallanes-Noguera,b David Gonzalez,a Marcela Kurina-
Sanz,b Sonia Rodrígueza
a Facultad de Química, UdelaR, Montevideo, Uruguay. b INTEQUI, UNSL, San Luis,
Argentina.
Mail de contacto: [email protected]
Los microorganismos endófitos constituyen una interesante fuente de metabolitos
secundarios y consecuentemente también una fuente potencial de enzimas y actividad
biocatalítica novedosa. Sin embargo, no han sido explorados suficientemente desde
este último aspecto [1-3]. El uso de fragmentos de plantas fue descrito por primera vez
en 1998 [4] y desde entonces se conocen numerosos informes abarcando numerosos
vegetales y condiciones de reacción. En trabajos previos hemos demostrado que los
microorganismos endofíticos participan en las reducciones mediadas por vegetales [5]
y a lo largo de esa línea de trabajo nos cuestionamos si la presencia de una
determinada actividad biocatalítica en un vegetal puede ser indicativa de una actividad
semejante en endófitos aislados de la misma planta.
En esta oportunidad presentamos los resultados obtenidos en la reducción de cetonas
y cetoésteres con diferentes formas del vegetal Raphanus sativus y microorganismos
endófitos aislados del mismo. La selección del vegetal se basó en que raíces
transformadas de R. sativus han exhibido inusual actividad reductasa anti-Prelog frente
a una serie de cetonas proquirales [6]. Se estudió la biotransformación mediada por
raíces transformadas, plántulas y raíz comercial de rabanito así como la
correspondiente reacción por medio de endófitos aislados de las mismas con presión
selectiva de sustrato. Los resultados obtenidos se compararon y se seleccionaron las
cepas de mayor interés, destacándose una cepa de Bacillus megaterium que exhibió
actividad reductasa anti-Prelog. Los resultados obtenidos indican que el screening de la
actividad biocatalítica de vegetales resulta indicativo de la actividad de sus endófitos y
resulta una herramienta interesante para la búsqueda de microorganismos con
actividad biocatalítica determinada.
[1] Borges, W. d. S.; Borges, K. B.; Bonato, P. S.; Said, S.; Pupo, M. T. Curr. Org. Chem. 2009, 13, 1137-1163. [2] Pedrini, P.; Giovannini, P. P.;
Mantovani, M.; Andreotti, E.; Colalongo, C. J. Mol. Cat. B Enzym. 2009, 60, 145-150.[3] Rodriguez, P.; Reyes, B.; Barton, M.; Coronel, C.;
Menéndez, P.; Gonzalez, D.; Rodríguez, S. J. Mol. Cat. B Enzym. 2011, 71, 90-94.[4] Mironowicz, A. Phytochemistry 1998, 47, 1531-1534.[5]
Rodríguez, P.; Barton, M.; Aldabalde, V.; Panizza, P.; Onetto, S.; Menendez, P.; Gonzalez, D.; Rodríguez, S. J. Mol. Cat. B Enzym. 2007, 49, 8-
11.[6] Orden, A. A.; Magallanes-Noguera, C.; Agostini, E.; Kurina-Sanz, M. J. Mol. Cat. B Enzym. 2009, 61, 216-220.
“W-transaminasas y monoamino-oxidsas en la sintesis regio- y estereo-
selectiva de pirrolidinas 2,5 disustituidas”
Cesar Iglesias, Elaine O´Reilly, Nicholas J. Turner
School of Chemistry, Manchester Institute of Biotechnology, University of Manchester,
Manchester, United Kingdom; La capacidad de las enzimas para mediar en transformaciones con excelentes niveles
de quimio-, regio-y estéreo-selectividad ha conducido a su aplicación generalizada
como catalizadores para la síntesis orgánica [1]. Dado que estos biocatalizadores
generalmente operan bajo condiciones de reacción similares, y muestran una excelente
especificidad, existe un gran potencial para desarrollar procesos en cascada de
múltiples etapas, en el que el producto formado por la acción de la primera enzima se
convierte en el material de partida para la posterior transformación por otro
biocatalizador.
En este trabajo se describe la conversión de una serie de 1,4-dicetonas aquirales a las
correspondientes pirrolidinas 2,5-disustituidas a través de un proceso de cascada
enzimática que implica una ω-transaminasa (ω-TA) y una monoamino oxidasa (MAO-
N). El primer paso se realiza por mono-aminación con la ω-TA de las dicetonas con
excelente regio-y enantioselectividad. La aplicación de una (R) - o (S) transaminasa
proporciona acceso a cualquiera de los enantiómeros de la imina cíclica resultante.
Posteriormente, se somete el producto obtenido de la primera reacción a un proceso de
resolución cinética dinámica quimio enzimático, catalizado por NH3BH3 y variantes de
MAO-N obtenidas por ingeniería genética. Se establece así el segundo centro quiral de
las pirrolidinas a través de un procedimiento que implica desracemizacion en rondas
secuenciales de oxidación enantioselectiva y reducción química no selectiva. El centro
asimétrico inicial formado por la ω-TA no se ve afectado por esta segunda etapa
quimioenzimática. (Figura 1)
En general, el trabajo que se presenta demuestra el potencial de procesos de cascada
enzimática estéreo-selectiva en la síntesis de importantes estructuras diana.
[1] Kohler,V., et al., Enantioselective Biocatalytic Oxidative Desymmetrization of substituted
Pyrrolidines. Angewandte Chemie International Edition, 2010. 49(12):p 2182-2184
“Una etapa crítica para sintetizar ciclodextrinas mediante un proceso continuo:
la caracterización del derivado cgtasa-tsi-toyopearl”
G. Peralta Altier, C. Manta, K. Ovsejevi
Cátedra de Bioquímica, Departamento de Biociencias, Facultad de Química (UDELAR)
La enzima ciclodextringlicosil transferasa (CGTasa; EC 2.4.1.19) cataliza diferentes
reacciones de transferencia; entre ellas, una transglicosilación intramolecular donde el
almidón es convertido a ciclodextrinas (CDs). Estos oligosacáridos cíclicos poseen una
cavidad interna apta para encapsular moléculas hidrofóbicas, por ello son ampliamente
utilizados en las industrias alimentaria, cosmética y farmacéutica. Sin embargo, el
empleo de CDs esta limitado debido al costo e inestabilidad de la CGTasa soluble. El
diseño de procesos que empleen CGTasa inmovilizada posibilita superar este
problema, permitiendo el reuso de la enzima y simplificando la purificación de los
productos de reacción. Recientemente se ha desarrollado un derivado de CGTasa de
Thermoanaerobacter sp por inmovilización covalente reversible en Tiolsulfinato-
Toyopearl. Con la finalidad de seleccionar las mejores condiciones para su empleo en
el diseño de un proceso continuo para la síntesis de CDs se realizó su caracterización
bioquímica. Su rango de pH óptimo se situó entre 5.0-6.0 y su temperatura óptima entre
75.0-92.5C. Presentó una Energía de activación de 18.3Kcal/mol, correspondiente a
un incremento del 60% en la estabilidad térmica con respecto a la enzima en solución.
El aumento del KM observado para la enzima inmovilizada concuerda con el uso de
sustratos macromoleculares (almidón) en sistemas heterogéneos, la Vmáx fue del
mismo orden que la obtenida en solución. El derivado mantuvo el 100% de su actividad
luego de 4h a 60 C (condiciones empleadas en la síntesis de CDs) en el rango de pH
5.4-7.0. Luego de 12 meses a 4C el derivado mantuvo el 100% de su capacidad
catalítica.
“Purificacion y caracterizacion de anta, proteasa cisteínica extraida de frutos de
Bromelia antiacantha Bertol”.
D. Vallés,1, A.M.B Cantera1,2
1Laboratorio de Enzimas Hidrolíticas, Instituto de Química Biológica, Facultad de Ciencias (UDELAR); 2Cátedra de Bioquímica, Departamento de Biociencias, Facultad
de Química (UDELAR)
El extracto crudo obtenido de pulpa sin semillas de frutos maduros de Bomelia antiacantha
Bertol. (Banana do mato), planta perteneciente a la familia de las Bromeliaceaes, contiene al
menos 3 proteasas cisteínicas con alta actividad proteolítica. La función de estas enzimas no
ha sido determinada, se piensa que pueden actuar como protección contra agentes patógenos.
Por cromatografía de intercambio catiónico (SP-Sepharose HP), se aisló la proteasa de menor
punto isoeléctrico que denominamos Antiacanthaína A (AntA). La Antiacanthaína A presenta
una actividad específica de 80 UE/mg (utilizando azocaseína como sustrato). Muestra el
máximo de actividad a pH 8,9, manteniendo una actividad superior al 75% en un amplio rango
de pH (6-9). El efecto de la temperatura sobre la actividad de la AntA, muestra un incremento
constante de la actividad hasta los 65° (temperatura máxima ensayada). La incubación con
Urea 8M no afecta la actividad, permaneciendo inalterada por tiempo prolongado (18hs). La
incubación con Cloruro de Guanidinio (GndHCl) 6M muestra una disminución de 41% de la
actividad a los 30min de incubación, manteniéndose en este valor a lo largo del tiempo (18hs).
La especificidad de hidrólisis de la AntA sobre la cadena Beta de la insulina, muestra 11 sitios
de corte, 9 de los cuales coinciden con los de la Papaína. Los estudios cinéticos de la AntA, se
realizaron utilizando p-Glu- Phe-Leu-p-nitroanilide (PFLNA), sustrato específico para proteasas
cisteínicas (KM = 0,235mM, kcat = 2,88 x 10-3 s-1, kcat/Km = 12,3 x 10-3 s-1 mM-1).
SIMPOSIO X:
“INMUNOLOGÍA Y BASES BIOQUÍMICAS DE LA
INFLAMACIÓN”
Coordinadores: M.Moreno, V.Fernandez.
Expositores:
INTRACELLULAR INNATE IMMUNE RECOGNITION OF PATHOGENIC BACTERIA.
D. Zamboni. Department of Cell Biology, Medical School Ribeirão Preto - FMRP/USP. University of São Paulo
REGULACIÓN DE LA INFLAMACIÓN A TRAVÉS DEL METABOLISMO IÓNICO EN CÉLULAS DENDRÍTICAS. M. Hill
NITROALQUENOS: NUEVOS MEDIADORES LIPÍDICOS CON PROPIEDADES INMUNOMODULADORAS. AM.Ferreira
INHIBICIÓN DE LA RESPUESTA DE CÉLULAS DENDRÍTICAS A IL-4 POR PARTÍCULAS DE LA CAPA LAMINAR DE Echinococcus granulosus. PI. Seoane
DESARROLLO DE NUEVOS FÁRMACOS ANTI-ATEROGÉNICOS: NITROALQUENOS ELECTROFÍLICOS ANÁLOGOS DE LA VITAMINA E (alpha-TOCOFEROL). J. Rodríguez
RESUMENES:
"Intracellular Innate Immune Recognition of Pathogenic Bacteria".
Prof. Dario S. Zamboni, Ph.D.
Department of Cell Biology, Medical School Ribeirão Preto - FMRP/USP, University of São Paulo.
Mail de contacto: [email protected]
Innate immune cells, such as macrophages, are highly adapted to rapidly recognize infections by distinct pathogens, including viruses, bacteria, fungi and protozoa. This recognition is mediated by pattern recognition receptors (PRRs), which are found in host cell surface membranes and the host cell cytoplasm. PRRs include protein families such as the Toll-like receptors (TLRs), Nod-like receptors (NLRs), RIG-I-like receptors (RLRs) and sensors of cytosolic DNA. The activation of these PRRs by pathogen-associated molecular patterns (PAMPs) leads to transcriptional responses and specific forms of cell death. These processes effectively contribute to host resistance to infection either via cell-autonomous processes that lead to the intracellular restriction of microbial replication and/or by activating pathogen-specific adaptive immune responses. L. pneumophila, the causative agent of Legionnaires’ Disease, is a Gram-negative bacterium that triggers responses by multiple PRRs. Data to be presented will comprise recent studies that have contributed to our understanding of the molecular mechanisms by which innate immune cells recognize and respond to L. pneumophila and the importance of these processes to the outcome of infection. Supported by FAPESP, INCTV/CNPq, PEW and WHO/TDR.
"Regulación de la inflamación a través del metabolismo iónico en células
dendríticas”.
Dr. Marcelo Hill. Laboratorio de Inmunorregulación e inflamación. Institut Pasteur de
Montevideo. Departamento de Inmunobiología. Facultad de Medicina.
Mail de contacto: [email protected].
Las células dendríticas constituyen una población heterogénea de leucocitos especializados en desencadenar respuestas inmunes efectoras y reguladoras. El control de la inflamación así como la generación de células T reguladoras son mecanismos a través de los cuales las DCs impactan en la homeostasis inmune. El flujo de iones a nivel intracelular regula diferentes procesos biológicos en la DC como la capacidad de procesar antígenos o la producción de citoquinas pro-inflamatorias. La producción de las citoquinas IL-1beta e IL-18 se encuentra fuertemente regulada en DCs y en macrófagos a través del complejo proteico denominado “inflamasoma”. El contenido citosόlico de iones como K+ y Ca++ es un parámetro fundamental que controla la activación de inflamasomas. La caracterización de nuevos actores moleculares implicados en estos procesos nos permitirá profundizar su comprensión generando al mismo tiempo potenciales blancos terapéuticos.
Nuestro trabajo ha caracterizado la función de una proteína intracelular, Tmem176b, como un nuevo canal iónico. Tmem176b es capaz de regular el procesamiento de antígenos por parte de células dendríticas tolerogénicas para inducir células T reguladoras CD8+. Tmem176b es una proteína transmembrana localizada a nivel del fagosoma. El flujo iónico dependiente de Tmem176b regula el pH fagosomal y el procesamiento de antígenos por parte de DCs tolerogenas. Estudios preliminares sugieren que a nivel citosolico, Tmem176b es capaz de controlar la liberación de Ca++ y la producción de IL-1beta por las DCs, actuando probablemente a nivel del inflamasoma.
En conclusión, las DCs tolerogenas son capaces de inducir células Treg y controlar la liberación de IL-1beta a través de la regulación de la homeostasis iónica del fagosoma y del citosol de una manera dependiente de Tmem176b.
“Nitroalquenos: nuevos mediadores lipídicos con propiedades inmunomoduladoras”
Minarrieta L, Seoane P, Marques JM, Freeman B, Rubbo H, Schopffer F y Ferreira AM. Los nitroalquenos (NO2-FA) son productos derivados de la nitración de ácidos grasos
insaturados de cadena larga que actúan como mediadores lipídicos desplegando una
variedad de efectos anti-inflamatorios sobre células de la inmunidad innata de origen
mieloide. Nuestros estudios iniciales sobre monocitos y macrófagos demostraron que
no sólo disminuyen el potencial inflamatorio inducido por PAMPs sino que además
potencian la inducción mediada por IL-4 de Arginasa-1, una enzima asociada a efectos
anti-inflamatorios. Estas propiedades de los NO2-FA se han relacionado con
modulación de la activación de los factores de transcripción NF-κB y Nrf2, y con la
activación del receptor nuclear PPARγ. Dentro del conjunto de los ácidos grasos
poliinsaturados, el ácido linoleico conjugado experimenta mayor predisposición a la
nitración in vivo, tanto en homeostasis como durante respuestas inflamatorias,
sugiriendo que su producto nitrado NO2-CLA podría cumplir un papel fisiológico
actuando como un regulador endógeno de estas respuestas. Como las células
dendríticas constituyen un componente central del desarrollo de la respuesta inmune,
resultó interesante analizar el efecto del NO2-CLA sobre la diferenciación de estas
células. Para esto, se caracterizó el fenotipo de BMDC diferenciadas en presencia o
ausencia de NO2-CLA, midiendo la expresión de marcadores celulares asociados a la
activación celular (MHC de clase II, CD80, CD86 y CD40) en condiciones basales o
luego de la estimulación con LPS. Los resultados mostraron que las BMDC
diferenciadas en presencia de NO2-CLA expresaron en su membrana niveles menores
de MHC-II y moléculas coestimuladoras, y además fueron refractarias a la activación
por PAMPs ya que mantuvieron niveles bajos de estas moléculas luego de la
estimulación con LPS. Más aún, estas alteraciones tuvieron repercusión a nivel
funcional, ya que el condicionamiento con NO2-CLA inhibió la capacidad de las BMDC
de activar células T CD4+ vírgenes en forma antígeno-específica. El conjunto de estos
resultados sugiere que el NO2-CLA tiene potencial inmunomodulador sobre las células
dendríticas, ampliando los mecanismos por los cuales este nitroalqueno tendría
potencial terapeútico para patologías asociadas a deficiencias en la regulación de la
respuesta inmune.
“ Inhibición de la respuesta de células dendríticas a il-4 por partículas de la capa
laminar de Echinococcus granulosus”
P.I. Seoane1, C. Casaravilla1, A. Pittini1, A.S. MacDonald2,3, J.E. Allen2, A.M. Ferreira1,
A.Díaz1
1Cátedra de Inmunología, Dept. de Biociencias, F. de Química e IQB, F. de Ciencias, UdelaR, Uruguay; 2Institutes of Immunology and Infection Research, University of
Edinburgh, Reino Unido; 3Manchester Collaborative Centre for Inflammation Research, University of Manchester, Reino Unido
Echinococcus granulosus es el parásito helminto causante de la hidatidosis. Esta
infección crónica se caracteriza por la formación de hidátides en el parénquima de
órganos internos, principalmente en ungulados domésticos. Como sucede con otros
helmintos, la infección induce una respuesta polarizada hacia Th2. La IL-4, clave en
esta respuesta, induce la activación alternativa de macrófagos y células dendríticas,
caracterizada por la expresión de Ym1 y Relm- entre otros marcadores. El receptor
de IL-4 señaliza a través de STAT6 y de la vía de la fosfaditilinositol-3-quinasa (PI3K).
Esta última es una vía central en la biología de la célula, participando en fenómenos tan
diversos como proliferación, metabolismo glucídico y síntesis proteica. Un efector
central de esta vía es la proteína quinasa Akt, activada por fosforilación luego del
reclutamiento a membrana plasmática por unión a fosfaditilinositol-3,4,5-trifosfato.
Nuestro grupo trabaja con una preparación particulada de la capa más externa de la
hidátide, la capa laminar, a la que denominamos pLL. Observamos que la exposición a
pLL de células dendríticas derivadas de médula ósea de ratón, inhibe la activación
alternativa inducida por IL-4 (Ym1 y Relm- . Asimismo, pLL inhibe la fosforilación de
Akt inducida por IL-4. Ya que está bien establecido que la vía de PI3K es indispensable
para la activación alternativa de macrófagos, nos planteamos investigar si en nuestro
modelo ambos efectos están conectados en una relación causal.
Financiación: Fundación Wellcome, ANII (beca de Maestría a PS).
“Desarrollo de nuevos fármacos anti-aterogénicos: nitroalquenos electrofílicos análogos de la vitamina e (α-tocoferol)”
J. Rodríguez1,2, G. Ferrer-Sueta3, N. Khoo4, M. Gil2, L. Malacrida2,5, F. J. Schopfer4,
G.V. Lopez1, C. Batthyány2,6
1 Grupo de Química Medicinal, Departamento de Química Orgánica, Facultad de Química y Facultad de Ciencias, UDELAR; 2Unidad de Bioquímica y Proteómica
Analíticas, Institut Pasteur de Montevideo; 3Laboratorio de Fisicoquímica Biológica, Facultad de Ciencias, UDELAR; 4Departament of Pharmacology & Chemical Biology,
University of Pittsburgh, PA, United States; 5Departamento de Fisiopatolgía, Hospital de Clínicas, Facultad de Medicina, UDELAR; 6Departamento de Bioquímica, Facultad de
Medicina, UDELAR La aterosclerosis y sus complicaciones constituyen la principal causa de morbi-
mortalidad en nuestro país. Es una patología de las principales arterias del organismo, caracterizada por la formación de una placa fibro-adiposa como consecuencia de un proceso inflamatorio crónico vascular que lleva a la modificación y oxidación de la LDL. En el presente trabajo desarrollamos una nueva estrategia farmacológica para esta enfermedad, basada en el papel patogénico principal que juegan las partículas de LDL y el proceso inflamatorio crónico. Diseñamos un compuesto híbrido formado por una estructura mimética del α-tocoferol (Vitamina E) y un nitroalqueno, juntos en una misma molécula. Debido a la presencia de la estructura del α-tocoferol, el compuesto híbrido se debería incorporar a las lipoproteínas durante el metabolismo normal de las mismas. Estas transportarían el compuesto híbrido hasta el seno de las lesiones ateroscleróticas, donde la presencia del grupo funcional nitroalqueno la dotaría de las propiedades anti-inflamatorias y anti-aterogénicas previamente descritas para los nitroalquenos. Se sintetizó y realizó la caracterización fisicoquímica por cromatografía, espectrofotometría y espectrometría de masa. Estudios de cinética rápida de flujo detenido nos permitieron determinar la constante de reacción de segundo orden con tioles de baja masa molecular en presencia de diferentes detergentes. En macrófagos (RAW264.7) en cultivo se demostraron sus propiedades anti-inflamatorias y su capacidad de activar la vía de protección celular y antioxidante Nrf2/Keap-1. Finalmente, se obtuvieron resultados preliminares confirmando estas propiedades farmacológicas en un modelo animal in vivo.
SIMPOSIO XI:
“BIOLOGÍA Y BIOTECNOLOGÍA VEGETAL”
Coordinadores: S. Vidal, S. Signorelli.
Expositores:
DIFERENTES ESTRATEGIAS DE RESPUESTA EN LEGUMINOSAS CON TOLERANCIA CONTRASTANTE A LA SEQUÍA. O Borsani
LA PLANTA PHYSCOMITRELLA PATENS COMO MODELO PARA EL ESTUDIO FUNCIONAL Y EVOLUTIVO DE LOS MECANISMOS DE DEFENSA VEGETAL FRENTE A PATÓGENOS. I. Ponce de Leon
UNA SMALL HEAT SHOCK PROTEIN DE PHYSCOMITRELLA PATENS INVOLUCRADA EN LA RECUPERACIÓN AL ESTRÉS OSMÓTICO, SALINO Y POR
ALTAS TEMPERATURAS. C. Ruibal
EVALUACIÓN FUNCIONAL DE UNA DE UNA ACUAPORINA DE SOJA. E. Casaretto
GENOTIPADO POR SECUENCIACIÓN EN TRIGO (Triticum aestivum) B. Lado
RESUMENES:
“Diferentes estrategias de respuesta en leguminosas con tolerancia contrastante
a la sequía”.
Omar Borsani.
Laboratorio de Bioquímica. Depto. Biología Vegetal. Facultad de Agronomía.
Mail de contacto: [email protected]
La identificación de los blancos metabólicos del estrés ambiental es un paso crítico en
la mejora de la tolerancia al estrés en plantas. El estudio de las respuestas bioquímicas
y fisiológicas de las plantas con diferentes capacidades para lidiar con el estrés es un
enfoque válido para alcanzar este objetivo. Lotus corniculatus (lotus) y Triofolium
pratense (trébol) son leguminosas con tolerancia contrastante al estrés inducido por
sequía estival. En esta condición donde se manifiesta la falta de agua, las altas
temperaturas o la combinación de ambos, se encontró que las respuestas bioquímicas
podrían explicar el comportamiento diferencial frente al estrés. Lotus y trébol mostraron
diferencias en el control de la pérdida de agua, acumulación de prolina y la capacidad
antioxidante enzimática. Mientras que lotus, la especie tolerante, acumuló altas
concentraciones de prolina en todas las condiciones de estrés, el trébol, la especie
sensible, fue incapaz de acumular prolina bajo el estrés por calor. En lotus, Mn-SOD y
Fe-SOD fueron inducidas por la sequía, pero en el trébol, el perfil de las isoforma de
SOD no se vio afectada por el estrés. Por otra parte, el lotus tiene más isoformas SOD
y una actividad total más alta en comparación con el trébol. La funcionalidad y
proteínas de fotosistema II (PSII) bajo estrés también mostraron diferencias entre las
dos especies. En lotus, la actividad PSII se vio afectada drásticamente por el estrés
combinado y esto se correlacionó con la degradación de proteína D2. Las posibles
implicaciones de estas diferencias en los mecanismos de adaptación de las especies
tolerantes es discutida.
“La planta Physcomitrella patens como modelo para el estudio funcional y
evolutivo de los mecanismos de defensa vegetal frente a patógenos”
Inés Ponce de León Departamento de Biología Molecular, IIBCE.
Mail de contacto: [email protected]
Durante la evolución, las plantas han desarrollado mecanismos que les han permitido adaptarse a diferentes condiciones de estrés, incluyendo las infecciones con microorganismos patógenos. Los musgos son plantas no vasculares que divergieron de las angiospermas hace 450 millones de años, lo que permite hacer estudios comparativos de la evolución de genes relacionados con la defensa y metabolitos producidos luego de la infección. Nuestro grupo de investigación está utilizando al musgo Physcomitrella patens como sistema modelo para realizar estudios moleculares, celulares y fisiológicos de los mecanismos de defensa vegetal que se activan frente a la infección con microorganismos patógenos. Esto se debe a la posición ancestral de Physcomitrella en el linaje de las plantas terrestres, la disponibilidad del genoma secuenciado, y su gran potencial para realizar estudios de genómica funcional dada su alta eficiencia de recombinación homóloga, lo que facilita la generación de mutantes knockout y la generación de mutaciones sitio específicas en genes de interés. Physcomitrella es también una fuente potencial de genes novedosos, ya que los musgos presentan una alta tolerancia a diversos tipos de estrés, probablemente debido a la presencia de una gran diversidad de metabolitos secundarios. Hemos estudiado la activación de los mecanismos de defensa de Physcomitrella en respuesta a patógenos necrótrofos de amplio rango de hospedero, que causan enfermedades en cultivos de interés, incluyendo el hongo Botrytis cinerea, los oomicetes Pythium irregulare y Pythium debaryanum y la bacteria Pectobacterium carotovorum. Al igual que ocurre en plantas vasculares, Physcomitrella activa luego de la infección, la acumulación de especies reactivas del oxígeno, el fortalecimiento de la pared celular, la inducción de una respuesta tipo HR (respuesta de hipersensibilidad) y la activación de genes de defensa como los que codifican para una fenilamonio liasa (PAL), una chalcona sintasa (CHS) y una lipoxigenasa (LOX). También se acumulan hormonas de defensa como el ácido salicílico, ácido abscísico y auxinas en respuesta a algunos de estos patógenos. Sin embargo, Physcomitrella no sintetiza el ácido jasmónico y sólo se detecta su precursor, el ácido 12-oxo-fitodienoico (OPDA), sugiriendo que esta hormona tan importante en la defensa de las angiospermas surgió más tardíamente en la evolución de las plantas. Mediante análisis funcionales hemos identificado varios genes cuya sobreexpresión aumenta la resistencia a patógenos en esta planta. Estos resultados posicionan a Physcomitrella como una excelente planta para el estudio funcional y evolutivo de los mecanismos de defensa frente a patógenos y los conocimientos generados pueden ser transferidos a plantas de interés.
“Una small heat shock protein de physcomitrella patens involucrada en la recuperación al estrés osmótico, salino y por altas temperaturas”
C. Ruibal1, A. Castro1, S. Vidal1
1Laboratorio de Biología Molecular Vegetal, Facultad de Ciencias (UDELAR)
Los musgos (briofitas) fueron las primeras plantas en adaptarse a la vida terrestre, para lo cual han tenido que desarrollar eficientes mecanismos de tolerancia al estrés hídrico. El musgo Physcomitrella patens es una planta modelo tolerante al estrés hídrico, salino, oxidativo y por frío. Esta planta tiene además características ideales que facilitan las estrategias de genética reversa para estudiar la función de genes, debido a la alta frecuencia de recombinación homóloga que permite la alteración dirigida de secuencias genómicas. En este trabajo se identificó un gen que codifica una proteína de heat shock pequeña, PpHsp16.4, de respuesta al estrés osmótico y al tratamiento de P. patens con la hormona ácido abscísico. Se generaron mutantes knockout de este gen y de un segundo gen idéntico, y se analizó el fenotipo frente a diversas condiciones de estrés abiótico. Los resultados mostraron que la proteína PpHsp16.4 es necesaria para la recuperación de las plantas del estrés salino, osmótico y por altas temperaturas. A su vez, se generaron plantas transgénicas que expresan PpHsp16.4 fusionada a una variante de la proteína GFP, regulada por el promotor endógeno de este gen. Se observó que las proteínas de fusión se localizan en el citoplasma formando estructuras tipo granulares. Estas estructuras están asociadas a la superficie de los cloroplastos, sugiriendo una función relacionada con estos organelos.
“Evaluación funcional de una de una acuaporina de soja”
E. Casaretto y O. Borsani
Departamento de Bioquímica, Facultad de Agronomía (UDELAR)
Las acuaporinas son pequeñas proteínas intrínsecas de membrana (24-30 kDa),
pertenecientes a la familia de las Major Intrinsic Proteins (MIP), que permiten el pasaje
selectivo del agua y otras moléculas pequeñas sin carga. En el presente trabajo se
evaluaron plantas transgénicas de arabidopsis que sobreexpresan un gen de una
acuaporina de soja. Los resultados mostraron en las plantas transgénicas una mayor
área foliar y conductancia estomática respecto a los genotipos salvajes de arabidopsis
cuando el suministro de agua no es limitante. El mayor desarrollo del área foliar en las
plantas que sobreexpresan la acuaporina podría estar explicado por el incremento del
flujo de agua hacia la parte aérea. El mayor flujo de agua favorecería el incremento de
la conductancia estomática a través de un aumento de la presión de vapor sobre la
superficie foliar, lo que explicaría la menor temperatura foliar en las plantas
transgénicas en condiciones no limitantes de agua. Sin embargo este mayor flujo de
agua hacia la parte aérea parece tener un efecto negativo en condiciones de déficit
hídrico, lo que se manifiesta en una mayor velocidad de pérdida de agua. A su vez, con
microscopia confocal se localizó la acuaporina en raíces de plantas transformadas con
GFP::ACUAPORINA, lo que mostró un claro incremento en la zona central de la raíz, y
en las membranas plasmáticas.
“Genotipado por secuenciación en trigo (triticum aestivum)”
B. Lado1, M. Quincke2 , I. Matus3, , M. Castro2, J. von Zitzewitz4
1Departamento de Bioquímica, Facultad de Ciencias (UDELAR); 2Programa Nacional de Investigación Cultivos de Secano, Instituto Nacional de investigación Agropecuaria, Est. Exp. La Estanzuela, Colonia 70000, Uruguay; 3Instituto de Investigaciones Agropecuarias, Centro Regional de Investigación Quilamapu, Casilla 426, Chillán, Chile; 4SECOBRA Saatzucht GmbH, Feldkirchen 3, 85368 Moosburg, Germany
El genotipado por secuenciación (GBS) es una metodología para identificar marcadores
a gran escala, muy útil para genomas complejos como el de trigo. GBS tiene como
objetivo disminuir costos y pasos de manipulación, reduciendo la complejidad del
genoma con enzimas de restricción que evitan cortar en zonas repetidas. Los
fragmentos que han sido digeridos son identificados de forma diferencial para cada
muestra, esto permite realizar un multiplex de 96 o más muestras para secuenciar
conjuntamente. En este trabajo se genotiparon 384 líneas experimentales provenientes
de los programas de mejoramiento de trigo de Uruguay y Chile. Una vez extraído el
ADN utilizando el kit Qiangen® se enviaron a construir las librerías de GBS a la
Universidad Laval, Canadá que se secuenciaron en la Universidad McGill, Canadá. Los
datos se analizaron por dos metodologías bioinformáticas (pipelines) para identificar
polimorfismos en una sola base (SNPs). Los métodos de validación utilizados fueron
interpretación de la similitud genética entre líneas, mapeo en base de datos y cálculo
de desequilibrio de ligamiento de los SNPs mapeados. El método que mostró mejores
resultados fue el pipeline de Tassel
(http://www.maizegenetics.net/tassel/docs/TasselPipelineGBS.pdf) identificándose
28.199 SNPs. Los métodos de validación utilizados permitieron concluir que la
metodología es adecuada para genotipar líneas experimentales de trigo. El siguiente
paso es la utilización de los datos en la asociación con el fenotipo.
SIMPOSIO XII:
“CENTRO DE INVESTIGACIONES BIOMEDICAS”
Coordinadores: B.Alvarez, M.Trujillo.
Expositores:
MODIFICACIÓN DE PROTEÍNAS POR 3-NITROTIROSINA COMO ÍNDICE DE RIESGO CARDIO/PULMONAR. L. Thomson
CONTROL DE APOPTOSIS POR PROTEINAS DE ESTRÉS. M. Boiani
DIFERENTES SUSCEPTIBILIDADES Y RELEVANCIA BIOLÓGICA EN LA INACTIVACION PEROXINITRITO-DEPENDIENTE DE LAS FE-SODs DE TRYPANOSOMA CRUZI. A. Martínez
S-GLUTATIONILACIÓN DE LA ENZIMA eNOS MEDIADA POR PEROXINITRITO Y PERÓXIDO DE HIDRÓGENO. N. Subelzú
RUTAS DEL SUPERÓXIDO EN LA INFECCIÓN DE MACRÓFAGOS POR Trypanosoma cruzi. C. Prolo
RESUMENES:
“Modificación de proteínas por 3-nitrotirosina como índice de riesgo
cardio/pulmonar”.
Leonor Thomson
Mail de contacto: [email protected]
Enzimología, Facultad de Ciencias, Universidad de la República y CEINBIO.
La nitración de residuos tirosilo es una modificación proteica postraduccional que
depende fundamentalmente de la generación del radical •NO2. Esta modificación se ha
encontrado en proteínas claves para la homeostasis cardiovascular y pulmonar. En
particular, reportamos la presencia de fibrinógeno y apolipoproteína A-1 nitradas en el
plasma de pacientes con enfermedad cardiovascular, habiendo relacionado su
presencia con un mal pronóstico. Esta modificación a nivel del fibrinógeno supone un
cambio profundo en las características cinéticas y mecánicas del coagulo de fibrina,
que lleva a un aumento en el riesgo tromboembólico. Por su parte, la nitración de la
apolipoproteína A-1 resulta en inhibición selectiva del eflujo de colesterol dependiente
de ABCA-1. Además, reportamos la presencia del receptor de esfingosina-1-fosfato
(S1PR3) nitrado en el plasma de individuos afectados por injuria pulmonar aguda (IPA).
El S1PR3 es una molécula de señalización crítica para la proliferación celular y la
permeabilidad vascular, y su nitración disminuyó la resistencia eléctrica transendotelial,
consistente con el aumento de permeabilidad observado en los pacientes. A estos
cambios a nivel de la función de proteínas claves se le suma la capacidad del grupo
nitro de actuar como neo-epítope activando la respuesta inmune tanto celular como
humoral. En tal sentido reportamos la presencia de altos niveles de anticuerpos anti-
nitrotirosina en el plasma de pacientes portadores de enfermedad coronaria, así como
en individuos que desarrollaron una IPA. En ambos casos, el título de anticuerpos se
correlacionó con el grado de evolución así como con el desenlace final.
“Control de apoptosis por proteinas de estrés”
Mariana Boiani
Mail de contacto: [email protected]
Centro de Investigaciones Biomédicas (CEINBIO); Facultad de Medicina (UDELAR),
Montevideo, Uruguay
Las proteínas de estrés, también denominadas proteínas de estrés térmico, son
reguladas por el factor de transcripción HSF1. Éste factor se activa en diversas
situaciones de estrés celular como ser, aumento de temperatura, estrés oxidativo y
estrés electrofílico. Si bien se ha descrito la capacidad anti-apoptótica de HSF1, no
existen mecanismos definidos. Nuestro trabajo se enfocó en el rol de BAG3, una co-
chaperona de Hsp70 también regulada por HSF1. Estudios realizados con células de
neuroblastoma mostraron que BAG3 interactúa con Mcl-1, un miembro de la familia de
las Bcl-2 que inhibe la apoptosis intrínseca. De esta manera BAG3 estabiliza Mcl-1
evitando su degradación vía proteosoma y potenciando su actividad anti-apoptótica.
Además, en células dependientes de Mcl-1 la reducción de los niveles de BAG3 por
RNAi induce apoptosis y aumenta la sensibilidad a antagonistas de Bcl-2, remarcando
el potencial terapéutico de esta interacción. Estudios con diversas líneas celulares de
cáncer mostraron que este mecanismo de control de apoptosis tiene un papel
importante en cáncer, donde Mcl-1 es un factor de resistencia. Dado que Mcl-1 cumple
un papel importante en células cardíacas, este mecanismo puede ser también
relevante en patologías del miocardio, como ser la cardiomiopatía Chagásica, tema que
nos encontramos investigando actualmente.
“Diferentes susceptibilidades y relevancia biológica en la inactivacion peroxinitrito-dependiente de las fe-sods de Trypanosoma cruzi”
Martinez A.1, Peluffo G.1, Petruk A.2, Estrada D.1, Piñeyro D.1,3, Hugo M.1, Demicheli V.1, Batthyany C.1,4, Durán R.4, Robello C.1,3, Martí, M.2, Moreno D.5,
Buschiazzo A.6, Trujillo M.1, Radi R.1 and Piacenza L.1
1Departamento de Bioquímica and Center for Free Radical and Biomedical Research, Facultad de Medicina (UDELAR); 2Instituto Superior de Investigaciones Biológicas e
Instituto de Química del Noroeste Argentino, Universidad Nacional de Tucumán, Tucumán, Argentina; 3Unidad de Biología Molecular, Instituto Pasteur de Montevideo;
4Unidad de Bioquímica y Proteómica Analíticas, Instituto Pasteur de Montevideo; 5Instituto de Química Inorgánica Estructural, Rosario, Argentina; 6Unidad de
Cristalografía de Proteínas, Instituto Pasteur de Montevideo.
Trypanosoma cruzi contiene exclusivamente superoxido dismutasas dependientes de hierro (Fe-SODs). El oxidante peroxinitrito reacciona con la isoforma mitocondrial (Fe-SODA) y citosólica (Fe-SODB) con una constante cinética de 3.8±0.3 y 3.3±0.2 x 104M-
1s-1 respectivamente, siendo ambas inactivadas y nitradas en forma dosis dependiente. Sorpresivamente, la isoforma citosolica es significativamente más resistente a la inactivación. Mediante análisis de EM se detectó que la tyrosina-35 es el sitio preferencial de nitración. Para dilucidar estas diferencias desde el punto de vista estructural, se resolvió la estructura cristalográfica de la Fe-SODA con una resolución de 2.2Å. Se encontraron diferencias importantes en las posiciones de residuos de cisteínas y triptófanos entre ambas isoformas. El bloqueo por alquilación de las cisteínas presentes en la Fe-SODB la vuelve más susceptible a la inactivación, mostrando la participación de estos residuos en la resistencia observada. La mutación de la cysteina-83 (ausente en la Fe-SODA) aumenta la susceptibilidad a la inactivación por peroxinitrito. Análisis de dinámica molecular y determinaciones in silico de los pKa de las cisteínas en la Fe-SODB revelan que el tiolato de la cisteina-83 actúa como un dador de electrones que reparan la tirosina-35 previniendo la nitración e inactivación. Estas diferencias en las susceptibilidades sugieren diferentes roles durante la infección. Parásitos sobrexpresantes de la Fe-SODB son más exitosos en infecciones a macrófagos (J77A.1) mientras que sobrexpresantes de la Fe-SODA con más resistentes a la apoptosis. Estos resultados indican que los niveles de Fe-SODs podrían influir en la MCP y sobrevida durante el proceso de infección.
“S-glutationilación de la enzima enos mediada por peroxinitrito y peróxido de hidrógeno”
N. Subelzú, G. Peluffo, R. Radi y N. Romero
1Departamento de Bioquímica y Centro de Investigaciones Biomédicas (CEINBIO), Facultad de Medicina, Universidad de la República.
El óxido nítrico (.NO) se sintetiza en las células endoteliales por la enzima óxido nítrico
sintasa endotelial (eNOS) utilizando como sustratos L-arginina, NADPH y O2.
Fisiopatologías comunes como hipertensión, tabaquismo y diabetes producen un
aumento en la formación del radical/anión superóxido (O2.-) el cual puede reaccionar
con .NO llevando a la formación de peroxinitrito, un fuerte oxidante capaz de causar
modificaciones oxidativas y cambios de actividad en biomoléculas, promoviendo la
disfunción endotelial. La enzima eNOS es un homodímero de 135 kDa por subunidad
conteniendo los dominios reductasa donde se produce el transporte de electrones por
los cofactores NADPH/FAD/FMN, cediendo los electrones al dominio oxigenasa donde
se produce la catálisis. Estudiamos el mecanismo de la oxidación de tioles del dominio-
reductasa de la enzima eNOS recombinante bovina y el dominio-reductasa aislado por
bolos de peroxinitrito y peróxido de hidrógeno (H2O2). Estos tioles reaccionan con una
constante de 2x104M-1s-1 con peroxinitrito y estudiamos los productos radicalares
proteicos por espectroscopía de resonancia electrónica (EPR) y por inmunodetección
utilizando el atrapador de espín DMPO. El H2O2 puede oxidar 2 tioles y la posterior
adición de glutatión reducido (GSH) promueve la formación de un disulfuro mixto
conocido como S-glutationilación. Se estudiaron los cambios de actividad en la enzima
mediante los métodos de consumo de NADPH y oxidación de la oxi-hemoglobina. Los
resultados obtenidos demuestran que la eNOS es un blanco celular de oxidantes
celulares y la comprensión del mecanismo de oxidación es necesario para el desarrollo
de estrategias que mejoren la función endotelial.
“Rutas del superóxido en la infección de macrófagos por Trypanosoma cruzi”
C. Prolo, R. Radi, MN. Álvarez
Centro de Investigaciones Biomédicas, Departamento de Bioquímica, Facultad de
Medicina, UdelaR
La formación intrafagosomal de peroxinitrito (ONOO-) durante la invasión de macrófagos por T.cruzi, es uno de los principales mecanismos citotóxicos desencadenados contra el patógeno invasor. El peroxinitrito es el producto de la reacción entre el radical superóxido (O2
•-) y el óxido nítrico, que son formados enzimáticamente por la NADPH oxidasa 2 y la óxido nítrico sintasa, respectivamente. Sin embargo, el rol de la Nox2 in vivo es controversial, dado que reportes de infección con T.cruzi en ratones Nox2-/-, muestran similares parasitemias a las de los wt. En la búsqueda de fuentes alternativas de O2
•-, encontramos que la Nox1 también se expresa en macrófagos. Además, esta enzima se induce tras la infección con T.cruzi y detectamos niveles bajos de superóxido dependiente de la actividad Nox1. Dado que se desconoce el rol de la Nox1 durante la infección, estudiamos su efecto en la viabilidad del parásito. Sorprendentemente, la infección es pobremente controlada cuando se induce la actividad Nox1. Esta observación podría explicarse por efectos de señalización celular mediados por peróxido de hidrógeno (H2O2), derivado de la dismutación del superóxido. De hecho, encontramos que la exposición de T.cruzi a bajas concentraciones de peróxido de hidrógeno resultó en una mayor proliferación de los parásitos. Es necesario revisar la contribución del superóxido derivado de la Nox2 y la Nox1 en el control de la invasión de T.cruzi a macrófagos en el contexto de la formación de productos secundarios (tanto ONOO- como H2O2).
PRESENTACIONES ORALES DE GRADO SELECCIONADAS:
MESA I
Coordinadores: L. Castro, A. Richeri Salón de Seminarios. Facultad de Ciencias
POSIBLE PARTICIPACIÓN DE SIRT1 Y DBC1 EN EL EFECTO NEUROPROTECTOR MEDIADO POR RESVERATROL .MN. Bobba
POTENCIAL NEUROPROTECTOR DE UNA FRACCIÓN NEUTRA DE Achyrocline satureioides (“MARCELA”) EN LA ISQUEMIA CEREBRAL EXPERIMENTAL. V. Ruiz-Viroga
ACCIÓN CARDIOPROTECTORA DE ANESTÉSICOS OPIOIDES (REMIFENTANILO), EN CORAZÓN AISLADO. C.Costa GENERACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE LA LINEA CELULAR CACO2
REPORTERA DE LA ACTIVIDAD DEL FACTOR NFB (NUCLEAR FACTOR KAPPA ). G. Mastropietro
RESUMENES:
“Posible participación de sirt1 y dbc1 en el efecto neuroprotector mediado por
resveratrol” A. Calliari 1,2, M N. Bobba 2, C. Escande 3, E N. Chini 3
1Departmento de Biología Celular y Molecular, Facultad de Veterinaria (UDELAR); 2Departmento de Proteínas y Ácidos Nucleicos, IIBCE; 3Laboratory of Signal
Transduction, Department of Anesthesiology and Kodog Aging Center Mayo Clinic College of Medicine.
Resveratrol es un polifenol capaz de ejercer una amplia gama de respuestas fisiológicas y retrasar el inicio de enfermedades asociadas con el envejecimiento. Por otro lado, el hecho de que efectos similares puedan ser reproducidos mediante la activación de la proteína SIRT1, sugiere que esta podría ser blanco de su regulación. Se ha reportado que la administración de resveratrol ejerce un efecto neuroprotector en situaciones patológicas, como isquemia cerebral y enfermedades neurodegenerativas; no obstante, su efecto en el curso de la Degeneración Walleriana es aún un tema controversial. Mediante la utilización de un modelo in vitro de Degeneración Walleriana basado en cultivos de ganglio de raíz dorsal (DRG), nosotros pudimos observar que el resveratrol produce un enlentecimiento en el curso de la degeneración axonal, de un modo dependiente de NAD+. Además, observamos que dicho efecto neuroprotector queda suprimido ante la presencia de suramina, un inhibidor de SIRT1. Interesantemente, un fenotipo neuroprotector similar al generado por la administración de resveratrol fue observado en cultivos de DRG provenientes de animales knockout para DBC1, un inhibidor endógeno de SIRT1, a la cual se encuentra asociado. Pudimos mostrar que el resveratrol es capaz de disociar el complejo SIRT1/DBC1 e inducir la consecuente activación de SIRT1. Ante estos resultados, proponemos que resveratrol ejerce un efecto neuroprotector en la Degeneracion Walleriana al activar SIRT1 mediante la disociación de su inhibidor DBC1.
“Potencial neuroprotector de una fracción neutra de Achyrocline satureioides
(“MARCELA”) en la isquemia cerebral experimental”.
V. Ruiz-Viroga1, F. Rivera1,2, C. Echeverry1, M. Martínez-Busi1,3, JA. Abin-
Carriquiry1,3, F Dajas1.
1Dpto. Neuroquímica. Instituto de Investigaciones Biológicas “Clemente Estable”.
Unidad Asociada a Facultad de Ciencias. Avenida Italia 3318. Montevideo. Uruguay; 2Facultad de Ciencias. Universidad de la República. Iguá 4225. Montevideo. Uruguay; 3
Plataforma de Servicios Analíticos, Instituto de Investigaciones Biológicas “Clemente
Estable”
Achyrocline satureioides (As) es una planta de amplio uso popular en Sudamérica, que
ha presentado en diversos modelos experimentales una alta capacidad antioxidante y
antiinflamatoria. Resultados previos de nuestro grupo mostraron que un pre-tratamiento
con una decocción de As al 2% logró disminuir las deficiencias motoras y el volumen
del infarto cerebral causado por la isquemia en ratas. Numerosos estudios apuntan a
que sus efectos se deberían a su alto contenido en flavonoides. El objetivo del
presente trabajo es esclarecer las acciones de estos polifenoles en los efectos
beneficiosos de As frente a la patología isquémica. Para ello, se obtuvo fracción
neutra (FN), enriquecida en polifenoles, mediante una extracción líquido-líquido
de la decocción de As al 2%. La misma fue caracterizada determinando el contenido en
polifenoles totales (Folin-Ciocalteu ), el perfil cromatográfico (HPLC-DE) y la capacidad
antioxidante (ABTS). Fueron evaluados los efectos de un pre-tratamiento de 14 días
con FN sobre las deficiencias motoras y tamaño del infarto, utilizando un test
comportamental y una sal de tetrazolio respectivamente.
Los resultados mostraron que los principales flavonoides de As fueron concentrados en
la FN y que dicha fracción presentó una mayor capacidad antioxidante que la
decocción de As (IC50 15,12 y 37,23 µg/mL EAC; respectivamente). Además, el
pretratamiento con FN redujo las deficiencias comportamentales y el tamaño del infarto
cerebral de las ratas, evidenciando un potencial beneficio de los flavonoides
constitutivos de As frente a la isquemia cerebral.
“Generación y caracterización de la linea celular caco2 reportera de la actividad
del factor NFB (nuclear factor kappab)”
G. Mastropietro1,2, K. Perelmuter1, I. Tiscornia1, V. Porro1, M. Bollati-Fogolín1 1Unidad de Biología Celular; Institut Pasteur de Montevideo, Mataojo 2020, 11400
Montevideo, Uruguay; 2Facultad de Ingeniería, Universidad ORT, Montevideo.
El NFB es un factor de transcripción que desempeña un papel clave en la regulación
del sistema inmune. En células sin estimular, los complejos de NFB están en su forma
inactiva en el citoplasma unido a proteínas inhibidoras IBs. La activación del NFB se
produce por fosforilación de IB, disociándose del dímero NFB, éste trasloca al núcleo e induce la expresión de genes específicos. Los efectos anti-inflamatorios de diferentes probióticos y compuestos naturales o sintéticos pueden vincularse con la
modulación de la activación de NFB. En nuestro laboratorio, hemos obtenido una línea
celular reportera de la actividad del NFB derivada de las células HT-29, empleadas como modelo de epitelio intestinal no polarizado. Por otro lado, la línea celular Caco-2, es utilizada como modelo de epitelio polarizado para estudiar los mecanismos de diferenciación celular en el intestino. El objetivo del presente trabajo fue generar y caracterizar una línea reportera a partir de células Caco-2 para ser utilizada como herramienta de screening primario de compuestos o probióticos con actividad anti-
inflamatoria. Para ello, las células fueron transfectadas con el plásmido pNFB-hrGFP y seleccionadas con higromicina. Posteriormente, se enriqueció mediante un separador celular, la fracción de células que respondió específicamente a la citoquina pro-
inflamatoria TNF-α. Se estudió la cinética de activación NFB en los clones obtenidos luego de estimularlos con TNF-α y se determinó que 48 h fue el tiempo donde se obtiene máxima expresión de GFP. Actualmente se están evaluando dichos clones frente a distintos estímulos pro-inflamatorios y en co-cultivo con bacterias.
“Accion cardioprotectora de anestesicos opioides (remifentanilo), en corazon aislado”.
C.Costa 1, H. Piriz2, F.Battaglia1, F.Cristiani 2,3, G. Tamosiunas3 , G. Ferreira1,2
1 Laboratorio de Canales Iónicos. Departamento de Biofísica, Facultad de Medicina UDELAR (Universidad de la República). 2 ProInBio 3 Departamento de Farmacología.
El remifentanilo (RF), es un anestésico opiode de acción ultra corta, agonista de los receptores opiáceos tipo . Aunque se le describe también efectos y los explicarían su acción protectora. Las dosis empleadas para anestesia general son variables, rondando los 0.1-0.4 ug/Kg/min.. Como otros anestésicos generales, presenta un marcado efecto cardioprotector. La cardioprotección son el conjunto de mecanismos por los cuales se preserva la función cardíaca ante distintas circunstancias de stress a las que se somete el corazón. En corazón aislado, estudiamos los efectos del RF y evaluamos su capacidad de cardioprotección ante situaciones de isquemia cardíaca. La exposición aguda a RF origina un efecto cronotrópico negativo e inotrópico positivo, con IC50 de aproximadamente 4 pM/gr/min (aprox. 1 ug/Kg/min). La cinética del efecto inotrópico positivo es bifásica, aumentando la contractilidad sobre todo al inicio (t<2 min), de la exposición aguda a RF, para decaer luego (t>2min). La respuesta eléctrica obtenida muestra un alargamiento de los potenciales de acción monofásicos, en concordancia con el aumento del inotropismo, sugiriendo que los canales de Ca L son blanco central de RF. Ante isquemia cardíaca, RF previene cambios de frecuencia, inotropismo y arritmias respecto a situación control, en dosis próximas o menores a su IC50, exhibiendo un marcado efecto cardioprotector. Los resultados indican indican que RF, actuando sobre receptores opioides , y causa sus efectos y origina cardioprotección, en parte modulando los canales de Ca L. Financiado CSIC PAIE.
MESA II
Coordinadores: C. Manta, P. González. Salón de Actos. Facultad de Ciencias COLÁGENO NITRADO COMO INMUNÓGENO EN LA ARTRITIS EXPERIMENTAL. N. Cataldo NITRACIÓN Y OXIDACIÓN DE TIROSINA POR PEROXINITRITO MEDIADA POR METALES DE TRANSICIÓN: MECANISMOS DE REACCIÓN Y RELEVANCIA BIOLÓGICA. N. Campolo EXPRESIÓN Y PURIFICACIÓN DE ALBÚMINA SÉRICA HUMANA RECOMBINANTE Y SU DOMINIO I EN PICHIA PASTORIS. R. Lombide ELUCIDACIÓN DE LOS CARBOHIDRATOS DE LA CAPA LAMINAR DE LA LARVA DE ECHINOCOCCUS MULTILOCULARIS. R. Rovetta
RESUMENES:
“Colágeno nitrado como inmunógeno en la artritis experimental”
N. Cataldo1, M. Santos2, M. Navilliat3, N. Tamilia4, V. Beovide4, L.Thomson1, 5
1Laboratorio de Enzimología, Facultad de Ciencias, Universidad de la República; 2Unidad de Reactivos y Biomodelos de Experimentación, (URBE); 3Cátedra de Reumatología, Facultad de Medicina, Universidad de la República; Cátedra de Anatomía Patológica, Facutlad de Odontología, Universidad de la República; 5CEINBIO, Universidad de la República La artritis reumatoidea es una enfermedad autoinmune, que ataca a la sinovial y genera destrucción articular. Si bien su etiología no ha sido completamente caracterizada, la nitración de proteínas del líquido y la membrana sinovial han sido reportadas. En este trabajo, se comparó el conocido efecto inmunogénico del colágeno, respecto del mismo modificado por nitración en un modelo de artritis experimental. Para ello, se utilizaron ratones DBA/1 de 8 a 12 semanas de vida, inmunizados con colágeno heterólogo tipo II nativo y modificado por nitración. Aplicando un sistema de scores, para evaluar severidad clínica de la inflamación, se obtuvieron medianas de 5 (rango 3-13) y 8 (rango 3-12) para colágeno nativo y nitrado respectivamente, sin diferencias estadísticamente significativas entre los tratamientos. Por otra parte, la evaluación de productos lipoperoxidación en plasma, medida mediante HPLC con el método de TBARS, rindió concentraciones de 0.16±0.04 µM en ratones inmunizados con colágeno nativo y 0.37±0.08 µM cuando los ratones fueron inmunizados con colágeno nitrado. Dichos valores, presentan diferencias significativas (p<0.05) respecto del grupo control (0.05±0.01 µM), y entre ambos. Por último, cortes de patas obtenidos de los individuos con mayor score, demostraron la formación de pannus a nivel articular, así como marcada infiltración celular y edema, lo cual confirma la severidad de la artritis desarrollada. Abordajes histológicos e inmunohistoquímicos futuros brindarán un patrón de comparación respecto de estos resultados y ayudarán a demostrar la influencia o no de esta modificación postraduccional en la artritis.
“Nitración y oxidación de tirosina por peroxinitrito mediada por metales de transición: mecanismos de reacción y relevancia biológica”
N. Campolo 1,3, S. Bartesaghi 1,2,3, Radi. R 1,3
1Departamento de Bioquímica; 2Departamento de Educación Médica; 3Centro de Investigaciones Biomédicas, Facultad de Medicina, Universidad de la República
El peroxinitrito (ONOOˉ) es un potente oxidante que se forma in vivo por la reacción controlada por difusión entre el óxido nítrico ( NO) y el superóxido (O2 ˉ). Es capaz de oxidar biomoléculas ya sea por reacciones directas o a través de radicales derivados del mismo, tales como dióxido de nitrógeno ( NO2) o radical carbonato (CO3 ˉ). En particular, puede producir distintas modificaciones postraduccionales oxidativas en proteínas, como la nitración de tirosina a 3-nitrotirosina mediante procesos radicalares. Dichos procesos llevan también a la formación de productos de oxidación secundarios, como 3,3’-ditirosina y 3-hidroxitirosina. Las reacciones del ONOOˉ con metales de transición pueden llevar a la formación de
oxidantes secundarios potentes, tales como complejos oxo-metálicos (Me(n+1)+=O) y
NO2, en altos rendimientos, capaces de promover la nitración y oxidación de tirosina.
En este trabajo, se evaluó la capacidad de diversos complejos de bajo peso molecular
de metales de transición (Fe3+, Mn3+ y Cu2+) para promover la nitración y oxidación
de tirosina por ONOOˉ. Entre los compuestos que lo hicieron se destaca, por su
relevancia biológica, la hemina, que en el rango de concentraciones utilizado (0.5-25
μM) incrementó de manera dosis-dependiente los rendimientos de nitración de tirosina
de 8 a 17% en fase acuosa y de 3 a 15% en liposomas de fosfatidilcolina. Esto podría
constituir un nuevo mecanismo de toxicidad de la hemina libre, capaz de operar tanto
en fase acuosa como en membranas, en particular en situaciones patológicas que
involucran la liberación de grandes cantidades de hemina, como anemias hemolíticas o
hemorragias.
“Expresión y purificación de albúmina sérica humana recombinante y su dominio i en pichia pastoris”
R. Lombide1, I. López2, M. Marín2, B. Alvarez1, L. Turell1,3 1Laboratorio de Enzimología; 2Sección Bioquímica; 3 Laboratorio de Fisicoquímica
Biológica, Facultad de Ciencias, Universidad de la República
La albúmina sérica humana (HSA) es la proteína más abundante del plasma. Se trata
de una proteína monomérica que presenta tres dominios homólogos. En el dominio I se
encuentra el único tiol reducido de la proteína, la Cys34, el cual es un importante
blanco de especies reactivas. Este residuo, así como sus derivados oxidados, están
siendo caracterizados por nuestro grupo. Como parte de esta línea de trabajo
planteamos generar mutantes en residuos claves del entorno del tiol y obtener
estructuras cristalográficas de las distintas formas oxidadas. Para ello, en primer lugar,
hemos expresado la proteína salvaje utilizando la levadura metilotrófica Pichia pastoris.
Para la purificación se ensayaron, entre otros métodos, una cromatografía de afinidad
utilizando una resina de Cibacrón Blue, obteniéndose una purificación parcial de la
proteína. Adicionalmente se ensayó una cromatografía de exclusión molecular donde sí
se lograron altos niveles de pureza. Por mapeo tríptico y espectrometría de masas se
determinó que la única contaminación que coeluye es un fragmento incompleto de la
HSA. Actualmente estamos trabajando en la producción en forma recombinante del
dominio I con el objetivo de facilitar estudios de estructura para las formas oxidadas de
la Cys34. En este sentido hemos clonado la secuencia codificante del dominio I.
Mediante electroporación se transformó la cepa GS115 de Pichia pastoris. Actualmente
estamos trabajando en la puesta a punto de la expresión y purificación de dicho
dominio.
“Elucidación de los carbohidratos de la capa laminar de la larva de echinococcus multilocularis”.
R. Rovetta1, G. Lin1, K. Brehm2, F. Ferreira3, A. Díaz1
1Cátedra de Inmunología, Departamento de Biociencias de Facultad de Química e IQB de Facultad de Ciencias (UDELAR); 2
Institut für Hygiene und Mikrobiologie, Universität Würzburg, Alemania; 3LCG, DQO de Facultad de Química y DPDB del
Instituto de Higiene de la Facultad de Medicina (UDELAR)
Las larvas de los parásitos cestodes del género Echinococcus causan equinococosis quística (E. granulosus) y alveolar (E. multilocularis). Estas larvas están protegidas por una gruesa capa de matriz extracelular, llamada capa laminar (CL). El componente principal de la CL son mucinas, cuyos abundantes glicanos hemos elucidado en el caso de E. granulosus. Se trata de O-glicanos mucínicos basados en los cores convencionales 1 y 2, decorados con motivos ricos en galactosa. En el caso de E. multilocularis, existía solamente una elucidación parcial de los glicanos de una fracción mucínica purificada con un anticuerpo, que mostraba estructuras emparentadas con las de E. granulosus. En el presente trabajo encaramos el glicoma de la CL cruda de E. multilocularis. Encontramos que, como en E. granulosus, la CL está constituida por
O-glicanos sin contribución significativa de N-glicanos. Luego de -eliminación reductiva, purificación por gel filtración y columna de grafito, y análisis por MALDI-TOF-TOF, observamos que: (i) los glicanos alcanzan 5 residuos de tamaño, en lugar de los 18 residuos observados para E. granulosus; (ii) en forma similar a E. granulosus, los cores 1 y 2 sin decorar son componentes abundantes; (iii)
contrariamente a E. granulosus, el core 1 decorado con Gal1-3 no es abundante; (iv)
el core 2 decorado con Gal1-4Gal1-4 sobre el residuo de GlcNAc representa un 10% de la masa total, contra solo un 1% en E. granulosus; (v) hasta el momento no surgen diferencias con los datos de la fracción mucínica mencionada. Estamos analizando la estructura de los restantes glicanos.
MESA III
Coordinadores: A. Ramon, A. Kun. Salón de Actos. Instituto Pasteur ANÁLISIS FUNCIONAL DE MUTACIONES SINÓNIMAS EN EL SUPRESOR DE TUMORES TP53. D. Segovia
EVALUACIÓN DE LA CAPACIDAD DE INTERACCIÓN CON ADN Y RELACIÓN ESTRUCTURA-ACTIVIDAD BIOLÓGICA DE DERIVADOS DE N5,N10-DIÓXIDO DE FENAZINA. A. Berchesi CARACTERIZACIÓN DE LA RESPUESTA INMUNE HUMORAL ANTI-Clostridium chauvoei EN BOVINOS. M. Rivera EVALUACION DE BLANCOS MOLECULARES EN UN MODELO DE ARTRITIS. F.
Bentancor
RESUMENES:
“Análisis funcional de mutaciones sinónimas en el supresor de tumores TP53” M.J. Lista1,2, D. Segovia1, I. López1, C. Voisset2, M. Blondel2, M. Marin1
1Sección Bioquímica-Biología Molecular, Facultad de Ciencias, UdelaR; 2UMR1078, Faculté de Medicine et Sciences de la Santé, UBO, Francia.
La proteína supresora de tumores TP53 es un factor transcripcional que regula vías centrales del ciclo celular, apoptosis y senescencia. En el cáncer, el gen TP53 está mutado en casi 50% de los tumores. 90% de las mutaciones son puntuales y afectan principalmente el dominio de unión al ADN. Las mutaciones sinónimas, que no generan un cambio de aminoácido en la proteína, son entre 20 y 100 veces más frecuentes de lo esperado si fueran realmente neutras. El objetivo general de nuestro trabajo es comprender el efecto de las mutaciones sinónimas en la funcionalidad de P53. En este proyecto nos propusimos analizar el efecto de 12 mutaciones sinónimas en la actividad transcripcional de este factor, empleando el sistema FASAY en Saccharomyces cerevisiae. Dos cepas de levadura que contienen en su genoma elementos de respuesta a P53 (p21y RGC) y controlan la expresión de un gen reportero, fueron transformadas con el cDNA de los mutantes sinónimos. Los resultados obtenidos indican que algunas mutaciones sinónimas afectan la actividad transcripcional de P53 en p21 y RGC, en comparación con la proteína salvaje. En algunos casos se detectan variaciones del nivel de expresión de la proteína, lo que sugiere que diferentes mecanismos pueden estar involucrados. Agradecimientos: Programa ECOS-Sud, Embajada de Francia, UdelaR.
“Evaluación de la capacidad de interacción con adn y relación estructura-actividad biológica de derivados de N5,N10-dióxido de fenazina”.
A. Berchesi1, L. Becco2, M. Nieves1, H.Cerecetto1, M. González1, ML. Lavaggi1, B. Garat2.
1 Grupo de Química Medicinal, Laboratorio de Química Orgánica, Facultad de Ciencias-Facultad de Química, Universidad de la República, Montevideo, Uruguay; 2 Laboratorio
de Interacciones Moleculares, Facultad de Ciencias, Universidad de la República, Montevideo, Uruguay.
El desarrollo de nuevos agentes antineoplásicos para tumores sólidos es dificultoso, debido a las escasas dianas terapéuticas nuevas y selectivas. Quizás la hipoxia, sigue siendo la diferencia bioquímica más relevante, ya que los tumores sólidos se caracterizan por la formación de una masa celular que tiene características biológicas únicas como resultado de la insuficiente neovascularización. En ese sentido se desarrollaron profármacos citotóxicamente selectivos en condiciones de hipoxia. La función N-óxido en condiciones de hipoxia es bio-reducida en un proceso vía uno o dos electrones, pudiendo ser generados metabolitos que resulten citotóxicos por diversos mecanismos. Basándonos en los antecedentes de nuestro grupo, sobre una serie de profármacos derivados de N5,N10-dióxido de 2-amino y 2-hidroxifenazina1, nos propusimos sintetizar nuevos derivados potencialmente interactuantes con ADN para mejorar su actividad como profármacos citotóxicos selectivos en condiciones de hipoxia. En los nuevos compuestos se propone incorporar al sistema fenazina, cadenas laterales que favorezcan la interacción con el ADN. En el presente trabajo se muestra la evaluación de la capacidad de interacción de los compuestos con ADN mediante estudios de electroforesis. Además se realizó un estudio de la relación estructura de la molécula y la capacidad de interacción con el ADN, en donde se muestra la influencia de las diferentes cadenas laterales incorporadas a los derivados de N5,N10-dióxido de fenazina. Referencias
1. Lavaggi, M.L.; Nieves, M.; Cabrera, M.; Olea-Azar, C.; López de Ceráin, A.; Monge, A.; Cerecetto, H.; González, M. Structural modifications on the phenazine N,N´-dioxide-scaffold looking for new selective hypoxic cytotoxins. Eur. J. Med. Chem., 45, 5362, 2010.
Agradecimientos CSIC-ANII
“Caracterización de la respuesta inmune humoral anti-clostridium chauvoei en bovinos”
M. Rivera1, A. Rossi1, M. Breijo2, J.A. Chabalgoity1. 1Departamento de Desarrollo Biotecnológico, Facultad de Medicina, (UDELAR). 2Unidad de Reactivos y Biomodelos de Experimentación, Facultad de Medicina,
(UDELAR).
El carbunclo sintomático es una enfermedad infecciosa no contagiosa causada por Clostridium chauvoei, que afecta al ganado, provocándole la muerte a los días y para la cual no existe un tratamiento eficaz. El principal mecanismo de control es su prevención, mediante vacunación. Los programas de Sanidad Animal incorporan al esquema de vacunación a las vacunas policlostridales, que contienen a C. chauvoei en forma de bacterina. Para el funcionamiento satisfactorio de dichos programas es imprescindible contar con vacunas puras, inocuas, potentes y eficaces. En las vacunas clostridiales, la eficacia está dada por el nivel de inmunidad protectiva inducida en la especie de destino. La confirmación de protección contra C. chauvoei se evalúa en ensayos de vacunación mediante el análisis de la respuesta inmune humoral y en ensayos de desafío. A partir de un ensayo de vacunación y otro de desafío contra C. chauvoei en bovinos realizado por una empresa local, optimizamos un ELISA que permitió evaluar la respuesta inmune humoral específica inducida por la vacunación a corto y largo plazo. Los resultados concuerdan con lo esperado ya que se observa un alto título de anticuerpos 15 días después de la vacunación. Sin embargo, al día 360 los títulos disminuyeron drásticamente, recuperándose con la revacunación anual. Asimismo, se correlacionaron los mayores títulos de anticuerpos con una menor sintomatología clínica frente al desafío. Además, se analizaron los posibles antígenos de C. chauvoei por Western Blot y se observó que los animales vacunados reconocen antígenos que no son reconocidos por los animales no vacunados.
“Evaluación de blancos moleculares en un modelo de artritis”
F. Bentancor1, N. Cataldo1, M. Santos2, M. Naviliat3, L. Thomson1 1Laboratorio de Enzimología, Facultad de Ciencias (UDELAR) y Centro de
Investigaciones Biomédicas (CEINBIO); 2Unidad de Reactivos y Biomodelos de Experimentación, Facultad de Medicina (UDELAR), 3Cátedra de Reumatología,
Facultad de Medicina (UDELAR)
La artritis reumatoidea (AR) es una enfermedad crónica, sistémica y autoinmune caracterizada por inflamación articular, la cual liberada a su evolución puede llevar a la destrucción y pérdida de función. En la etiopatogenia de la AR se encuentra involucrada la generación desmedida de especies reactivas derivadas tanto de la reducción parcial del oxígeno, como formadas a partir de óxido nítrico; siendo los productos del óxido nítrico, capaces de oxidar y nitrar moléculas biológicas. La formación de estas especies reactivas, se refleja en un estado antioxidante bajo con una disminución de los niveles de glutatión reducido, uno de los antioxidantes intracelulares más importantes. Adicionalmente, la generación de modificaciones oxidativas en blancos moleculares (en especial proteínas), estaría en la base del daño articular. Si bien la nitración de proteínas en la sinovial artrítica es un hecho conocido, no identificamos anticuerpos anti-nitrotirosina en el plasma de los ratones afectados. Adicionalmente, no se encontraron diferencias significativas en el nivel de antioxidantes plasmáticos totales medidos con la técnica de FRAP, ni en la concentración de glutatión intraeritrocitario. Sin embargo, la peroxirredoxina II, la enzima antioxidante más relevante en el glóbulo rojo, mostró un alto grado de sobreoxidación y asociación a la membrana en los animales afectados, típico de glóbulos rojos envejecidos y/o expuestos a condiciones de estrés. Agradecimientos: F. Bentancor es Becaria de Iniciación de la ANII.
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