UNIVERSIDAD DE CUENCA
Facultad de Ciencias Químicas
Carrera de Bioquímica y Farmacia
“Evaluación de la calidad microbiológica de hot dogs, vendidos de forma ambulante en la ciudad de Cuenca-Ecuador”
Trabajo de titulación previo a
la obtención del título
de Bioquímico Farmacéutico
AUTORES:
Jhoselyn Mishell Vivanco Gallardo
CI: 0704430388
Oscar Martín Yauri Calle
CI: 0302212006
DIRECTORA:
Dra. Silvana Patricia Donoso Moscoso Mgt.
CI: 0102590569
CUENCA-ECUADOR
2019
Universidad de Cuenca
2 Jhoselyn Mishell Vivanco Gallardo Oscar Martin Yauri Calle
RESUMEN
Las ventas ambulantes han crecido en los últimos años en Ecuador. El objetivo de este
trabajo es evaluar el control microbiológico de hot dogs expendidos de forma ambulante
en la Ciudad de Cuenca.
Se seleccionaron a 10 vendedores de hot dogs por medio del Departamento de Control
Urbano del GAD Municipal. Se tomaron 20 muestras en un periodo de 4 semanas. La
muestra consistió en hot dog tipo perrito caliente formado por pan, salchicha, refrito
(cebolla y tomate) y aderezos (mayonesa, salsa de tomate y mostaza).
En la normativa ecuatoriana no existen parámetros para hot dog, por ello el análisis se
basó en las Normas de Dirección General de Salud Ambiental (DIGESA), embutidos con
tratamiento térmico (N°10.11) y comidas preparadas que llevan ingredientes con y sin
tratamiento térmico (N°15.1). Estas exigen la determinación de aerobios mesófilos,
Escherichia coli, Estafilococo aureus, Clostridium perfringens, Salmonella, Listeria
monocytogenes y coliformes totales.
Los resultados indican el incumplimiento de la Norma N° 10.11 de aerobios mesófilos
5%, Escherichia coli 5%, Salmonella spp 45% y Listeria monocytogenes 10%. El
incumplimiento de la Norma N° 15.1 para coliformes totales es de 10%, los demás
parámetros posen los mismos porcentajes de la Norma N°10.11. Por esto el alimento
podría no ser apto para el consumo en un 60% de las muestras.
Se realizó una capacitación a los vendedores ambulantes de hot dogs sobre medidas
de control para evitar las enfermedades transmitidas por alimentos con la finalidad de
mejorar la calidad de este producto.
Palabras claves: Hot dog. Venta ambulante. Control microbiológico.
Universidad de Cuenca
ABSTRACT
Street sales have grown in recent years in Ecuador. The objective of this work is to
evaluate the microbiological control of hot dogs sold in a traveling way in the City of
Cuenca.
Ten vendors of hot dogs were selected through the Urban Control Department of the
Municipal Gad. 20 samples were taken in a period of 4 weeks. The sample consisted of
a hot dog type perrito caliente consisting of bread, sausage, rehash (onion and tomato)
and dressings (mayonnaise, tomato sauce and mustard).
In the Ecuadorian regulations there are no parameters for hot dog, so the analysis was
based on the General Directorate of Environmental Health (DIGESA), sausages with
heat treatment (No. 10.11) and prepared meals that carry ingredients with and without
heat treatment (No. 15.1). These require the determination of mesophilic aerobes,
Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Clostridium perfringens, Salmonella, Listeria
monocytogenes and total coliforms.
The results indicate the non-compliance of Standard No. 10.11 of mesophilic aerobes
5%, Escherichia coli 5%, Salmonella spp 45% and Listeria monocytogenes 10%. The
non-compliance of Standard N ° 15.1 for total coliforms is 10%, the other parameters
have the same percentages of Standard N ° 10.11. Therefore, the food may not be
suitable for consumption in 60% of the samples.
Training was given to street vendors of hot dogs on control measures to prevent
foodborne diseases in order to improve the quality of this product.
Keywords: Hot dog. Peddling. Microbiological control.
Universidad de Cuenca
Contenido RESUMEN 2
INTRODUCCIÓN 15
1. MARCO TEÓRICO 16
1.1 Calidad de los alimentos 16
1.2 Inocuidad alimentaria y Enfermedades transmitidas por alimentos 16
1.3 Principales vías de contaminantes alimentarios 17
1.4 Venta ambulante 17
1.5 Descripción del alimento de análisis: Hot Dog 18
1.6 Requisitos microbiológicos del Hot Dog 20
1.7 Grupo de microorganismos 22
1.7.1 Microorganismos indicadores de alteración. 22
1.7.2 Microorganismos indicadores de higiene 22
1.7.3 Microorganismos patógenos 24
1.8 Factores que influyen directamente sobre el crecimiento microbiano. 27
2 METODOLOGÍA 28
2.1 Tipo de estudio 28
2.2 Área de Estudio y toma de muestra 28
2.3 Materiales, equipos y reactivos 28
2.4 Métodos y técnicas de análisis 29
2.5 Placas compact DRY 29
2.5.1 Aerobios mesófilos, Compact Dry TC 30
2.5.2 Coliformes/Escherichia coli, Compact Dry EC 30
2.5.3 Staphylococcus aureus, Compact Dry X-SA 30
2.5.4 Medio SPS Agar 31
2.5.5 Método Reveal 2.0 para Salmonella 32
2.5.6 Reveal 2.0 para Listeria 32
2.6 Cálculos 33
2.7 Análisis estadístico 33
2.8 Mapeo 33
2.9 Capacitación 34
3 RESULTADOS Y DISCUSIÓN 34
4 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES 37
4.1 Conclusiones 37
4.2 Recomendación 37
Universidad de Cuenca
5 BIBLIOGRAFÍA 39
5. ANEXOS 41
INDICE DE ANEXOS ANEXO 1 Vendedores ambulantes de la ciudad de cuenca ......................................... 41
ANEXO 2 Mapeo ............................................................................................................ 43
ANEXO 3 Metodología de la preparación de diluciones ................................................ 44
ANEXO 4 Descripción del procedimiento e interpretación para aerobios mesófilos en
placas compact dry ......................................................................................................... 45
ANEXO 5 Descripción del procedimiento e interpretación para Escherichia coli en placas
compact dry .................................................................................................................... 46
ANEXO 6 Descripción del procedimiento e interpretación para Estafilococo aureus en
placas compact dry ......................................................................................................... 47
ANEXO 7 Descripción del procedimiento e interpretación para Clostridium perfringes 48
ANEXO 8 Informe técnico de los resultados de Clostridium perfringes del laboratorio
externo ............................................................................................................................ 49
ANEXO 9 Resultados del análisis microbiológico .......................................................... 50
ANEXO 10 Procedimiento para determinación de reveal 2.0 para Salmonella spp ..... 51
ANEXO 11 Procedimiento para determinación de reveal 2.0 para Listeria .................. 52
ANEXO 12 Capacitación ................................................................................................ 53
ANEXO 13 Fotos de carritos de hot dogs ...................................................................... 56
INDICE DE TABLAS Tabla 1 Límites microbiológicos del análisis de embutidos con tratamiento térmico para
hot dogs de la Norma DIGESA N°10.11 ........................................................................ 21
Tabla 2 Límites microbiológicos para comidas preparadas que llevan ingredientes con
y sin tratamiento térmico de la Norma DIGESA 15.1..................................................... 21
Tabla 3 Resultados del análisis microbiológico de embutidos para hot dogs. .............. 34
Tabla 4 Resultados del análisis microbiológico de comida preparada.......................... 35
Tabla 5 Dirección de los vendedores participantes y fecha del análisis. ...................... 41
Tabla 6 Resultados de los análisis microbiológicos....................................................... 50
INDICE DE FIGURAS
Figura 1 Hot dog perrito caliente ................................................................................... 18
Figura 2 Preparación de hot dogs ................................................................................. 19
Figura 3 Mapa del muestreo de hot dogs de la Ciudad de Cuenca ............................. 43
Figura 4 Modelo de los resultados de Clostridium perfringes emitidos por el Laboratorio
extreno ............................................................................................................................ 49
Figura 5 Diapositivas de apoyo para la capacitación ................................................... 53
Figura 6 Tríptico de capacitación sobre medidas de control para evitar las enfermedades
transmitidas por alimentos .............................................................................................. 54
Figura 7 Certificado de asistencia a la capacitación sobre medidas de control para evitar
las enfermedades transmitidas por alimentos................................................................ 55
Figura 8 Foto de los asistentes a la capacitación con sus certificados ........................ 55
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Figura 9 Fotos de carritos de hot dogs ......................................................................... 56
Figura 10 Convenio entre la Universidad de Cuenca y el Municipio de Cuenca ......... 61
INDICE DE FLUJOGRAMAS
Flujograma 1 Forma de preparación de diluciones usadas en el análisis .................... 44
Flujograma 2 Descripción del procedimiento e interpretación para aerobios mesófilos en
placas compact dry ......................................................................................................... 45
Flujograma 3 Descripción del procedimiento e interpretación para Escherichia coli en
placas compact dry ......................................................................................................... 46
Flujograma 4 Procedimiento e interpretación para Estafilococo aureus en placas
compact dry .................................................................................................................... 47
Flujograma 5 Procedimiento e interpretación para Clostridium perfringes ................... 48
Flujograma 6 Procedimiento e interpretación para determinación de reveal 2.0 para
Salmonella ...................................................................................................................... 51
Flujograma 7 Procedimiento para determinación de reveal 2.0 para Listeria ............... 52
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ARADECIMIENTO
Agradecemos en primera instancia a Dios por permitirnos culminar una etapa más en
nuestra vida, a todas las personas, profesores y compañeros que nos acompañaron a
lo largo de nuestra carrera, agradecemos a la Universidad de Cuenca por brindarnos
una educación de calidad y formarnos, no solo a nivel académico sino también como
personas, para llegar a ser profesionales, con amor al trabajo, dedicación, honradez y
sobre todo humildad.
De manera especial agradecer a Felipito por brindar siempre su apoyo y abrir las
puertas, al Nene por su amistad y su trabajo.
De igual manera agradecemos a la Dra. Silvana Donoso por ser parte fundamental del
proyecto, al igual que la Dra. María Augusta Idrovo por su apoyo.
Universidad de Cuenca
DEDICATORIA
Esperanza Gallardo, mi madre, es a quien dedico este
trabajo de manera muy especial, por ser mi motivo
para superarme, por ser quien me enseñó a luchar
ante toda adversidad, por ser mi ejemplo. Mi persona
favorita de carácter fuerte, quien día a día demuestra
amor incondicional para su familia y nos da todo de sí.
A mi padre Luis y a mi hermana Shirley, por apoyarme
y darme su cariño sincero, demostrando que la familia
es lo más importante.
A mis amores chiquitos, Sebastián y Renata, mis
sobrinos, quienes me enseñaron que el amor puro y
real existe, esto me ha inspirado a culminar mis metas
para ayudarlos a conseguir sus sueños.
Agradezco a todos mis amigos y amigas que me han
acompañado en cada paso, por compartir momentos
inolvidables y brindarme la oportunidad de formar
parte su familia.
A mi compañero de tesis por ser mi apoyo en el
transcurso de este trabajo de titulación y por
convertirse en un verdadero amigo.
Dios, te dedico mi vida porque tu tiempo es perfecto.
Mishell Vivanco
Universidad de Cuenca
DEDICATORIA
Es un orgullo dedicarle este trabajo a la
persona más importante en mi vida, mi madre,
una mujer que no decayó por más adversas
que sean las circunstancias y la cual nunca
dejo de luchar por lo más preciado para ella:
“Una educación superior para todos sus hijos”.
Este trabajo llevara su nombre Israel del Rocio
Calle para hacerle llegar mi agradecimiento
más grato a todo su apoyo.
A mis hermanos por ser un apoyo fundamental
en mi proceso de educación, en formar cada
uno un pilar.
A mi compañeros y amigos, principalmente a
mi compañera de tesis por ser un gran apoyo
para este logro.
Martin Yauri
Universidad de Cuenca
15 Jhoselyn Mishell Vivanco Gallardo Oscar Martin Yauri Calle
INTRODUCCIÓN
La Organización Mundial de la Salud (OMS) anualmente declara miles de casos de
enfermedades transmitidas por alimentos (ETAs). Existen muchos alimentos
considerados de alto riesgo como los hot dogs, pues, poseen características que ayudan
a la proliferación de microorganismos, por su alto contenido proteico y alto porcentaje
de humedad, que conjuntamente con una deficiencia de higiene en el proceso de
elaboración o manipulación del alimento resultará un foco de contaminación. Este
alimento se acompaña con salsa de tomate, mostaza y mayonesa que requieren un
almacenamiento y manipulación controlada. (Moreno & Alarcòn, 2015)
El análisis e identificación de los microorganismos presentes en los alimentos ayuda a
determinar la inocuidad y calidad, para así concluir si el alimento es apto o no para el
consumo. (Alvarez, 2014)
Los hot dogs de venta ambulante se han convertido en una fuente de trabajo en la ciudad
de Cuenca, debiendo, por parte de las entidades municipales aumentar el control
sanitario de este tipo de alimentos. Por ello este trabajo va enfocado en detectar la carga
microbiana que poseen las muestras de hot dogs, basados en la Norma DIGESA
N°10.11 y N°15.1 que exige la determinación de aerobios mesófilos, Escherichia coli,
Estafilococo aureus, Clostridium perfringens, Salmonella spp, Listeria monocytogenes
y coliformes totales. (DIGESA, 2015).
A través de un convenio entre la Universidad de Cuenca y el Departamento de Control
Urbano del GAD municipal se efectuó este proyecto, incluyendo capacitación a los
vendedores participantes para garantizar al consumidor productos de calidad, que
cumplan con los parámetros establecidos en la norma antes mencionada.
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16 Jhoselyn Mishell Vivanco Gallardo Oscar Martin Yauri Calle
1. MARCO TEÓRICO
1.1 Calidad de los alimentos
Su definición corresponde a una serie de características y propiedades del alimento que
engloba desde la materia prima, proceso de elaboración, dispensación o servicio que
satisfacen las necesidades, ya sean implícitas o explícitas del consumidor con
características deseadas proporcionando el valor que merece el alimento, en cuanto a
parámetros como estado de descomposición, contaminación, decoloración, olor, color,
aroma, textura y métodos de elaboración. (FAO, 2017)
1.2 Inocuidad alimentaria y Enfermedades transmitidas por alimentos
La inocuidad alimentaria engloba acciones encaminadas a garantizar la máxima
seguridad de toda la cadena alimenticia, desde la producción al consumo, con el objetivo
de evitar las enfermedades transmitidas por los alimentos (ETAs), la que se define
según la OMS como “Un incidente en el que dos o más personas presentan una
enfermedad semejante después de la ingestión de un mismo alimento, y los análisis
epidemiológicos apuntan al alimento como el origen de la enfermedad”. (FAO, 2017)
(OMS, 2016)
Las enfermedades transmitidas por alimentos son producidas por agentes patógenos
que se encuentran contaminando un alimento específico en cantidades tales que
afecten al consumidor, ya sea por una sustancia que se le ha incorporado al mismo
(aderezo, acompañante, agua, etc.) o a su contaminación a través de utensilios
utilizados mientras se prepara o distribuye. (FAO, 2017) (Chadán, 2017)
La OMS ha reportado que una de cada diez personas se enferma cada año tras el
consumo de alimentos contaminados, llegando a 420000 los cuadros fatales, siendo los
grupo más vulnerables los niños, ancianos, enfermos y embarazadas. (FAO, 2017)
(Chadán, 2017)
Existen varios mecanismos por los cuales un microorganismo es capaz de producir una
ETA.
Intoxicaciones causadas por alimentos: se dan por la ingestión de alimentos
que contienen toxinas bacterianas o de mohos en cantidades que afecten a la
salud. Estas toxinas no presentan olor o sabor y son capaces de sobrevivir aun
después de eliminar al microorganismo formador. (Chadán, 2017)
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17 Jhoselyn Mishell Vivanco Gallardo Oscar Martin Yauri Calle
Infecciones transmitidas por alimentos: enfermedades ocasionadas por el
consumo de alimentos y agua contaminada con bacterias o virus
enteropatógenos vivos, que invaden y proliferan en el tracto digestivo. Ejemplo:
Salmonella spp. (Chadán, 2017)
Tóxico infección: se da por la ingesta de agua y alimentos contaminados con
células viables de bacterias patógenas (toxinas, mohos), no proliferan en el
tracto digestivo, pero esporulan, colonizan o mueren y liberan toxinas. Ejemplo:
Clostridium perfringens. (Chadán, 2017)
1.3 Principales vías de contaminantes alimentarios
Contaminación cruzada
Se entiende cuando el alimento entra en contacto con sustancias ajenas
(microorganismos patógenos, toxinas, etc.) y se puede dar de manera directa por
contacto del alimento limpio con un alimento contaminado, o indirecta cuando se da
el contacto del alimento con superficies y/o utensilios contaminados con
microorganismos o sustancias nocivas para la salud. (DIGESA, 2015)
Contaminación de origen
Se da cuando los alimentos entran en contacto con contaminantes del medio
ambiente (tóxicos, insecticidas y/o productos agropecuarios). (DIGESA, 2015)
Contaminación por manipulación
Se da cuando el manipulador contamina directa o indirectamente los alimentos,
siendo este la principal fuente de contaminación. Se puede reducir mediante la
aplicación de buenas prácticas de manipulación de alimentos encaminada al
personal. (DIGESA, 2015)
1.4 Venta ambulante
Es una modalidad de trabajo con el cual los comerciantes expenden sus productos fuera
de un establecimiento permanente, esta forma de trabajo ha tenido un crecimiento
exponencial en los últimos años, principalmente en Ecuador. (Costa & Gregorio, 2016)
La venta ambulante se caracteriza por no presentar una infraestructura adecuada,
sumado a condiciones higiénicas desfavorables, que garanticen una inocuidad de su
Universidad de Cuenca
18 Jhoselyn Mishell Vivanco Gallardo Oscar Martin Yauri Calle
producto. Así, la mayoría de emprendedores en este tipo de negocios no presentan una
capacitación en cuanto al manejo de alimentos, es por esto que presentan varias
inconformidades que permite una proliferación de microorganismos patógenos
causantes de enfermedades. (Jacome, 2017)
Existen varios inconvenientes con el aumento de este tipo de expendedores sobre todo
en la ciudad de Cuenca, pues es necesario un permiso de la entidad municipal para su
labor diario; pues así lo refiere el Art.3 capítulo 1 de la ordenanza que regula las
actividades de comercio ambulatorio del Cantón Cuenca que manifiesta: “ Prohíbase en
las áreas de uso público del Cantón, la exhibición o venta, ambulatoria o estacionaria,
de productos alimenticios primarios, tales como: frutas, verduras, hortalizas, productos
cárnicos y demás que se comercializan al interior de los mercados.” (Muncipio de
Cuenca, 2017)
Este tipo de trabajo ha generado una fuente de ingresos, sin embargo existe un alto
riesgo de contaminación, quedando plasmado en diferentes estudios realizados por la
secretaría de Salud, en los cuales se manifiesta algún grado de contaminación.
(Jacome, 2017)
Existen dos tipos de modalidades de venta ambulante; sedentaria es aquella en la cual
el vendedor presenta una sola ubicación y no sedentaria es aquella en la que el
vendedor presenta una ubicación móvil, ayudado con los medios que le permitan ofrecer
su producto o mercadería en distintos lugares en el tiempo necesario para efectuar su
trabajo. (Cervantes J. , 2014)
1.5 Descripción del alimento de análisis: Hot Dog
Los hot dogs de tipo perrito caliente son un alimento constituido de una salchicha cocida
en refrito (cebolla y tomate), con pan blando y alargado; este se acompaña con algún
aderezo como salsa de tomate, mostaza y mayonesa. (Real academia de la lengua,
2017)
Figura 1 Hot dog perrito caliente
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19 Jhoselyn Mishell Vivanco Gallardo Oscar Martin Yauri Calle
Los hot dogs se preparan de varias maneras, sin embargo a continuación se describe
la forma en la que se realiza según la explicación de los vendedores involucrados en el
estudio:
● La salchicha es cocida en medio de cebolla y tomate picado de 5 a 10 min.
● Se sirve la salchicha en medio de pan alargado conjuntamente con el refrito (cebolla
y tomate).
● Se acompaña con aderezos: mayonesa (industrial o casera), mostaza y salsa de
tomate.
Figura 2 Preparación de hot dogs
El alimento analizado es muy complejo ya que posee varios ingredientes con o sin
tratamiento térmico, descritos a continuación:
Pan
Es un alimento horneado de masa previamente fermentada, elaborado a base de:
harina, agua, sal, azúcar, levadura, leche, mantequilla y huevos. En panificación se
utiliza harinas con alto contenido de proteínas (harinas duras), junto con el agua, lípidos
y el amasado dan la contextura adecuada. Formando un producto final que posee
alrededor de 73,5% hidratos de carbono, 9,8% de proteínas y 9,9% de grasas;
presentando un pH 4.0-4.4 y aw 0,96. Este producto es de fácil deterioro por parte de
mohos y levaduras; El control microbiológico exige el análisis de: Escherichia coli,
Estafilococo aureus, Clostridium perfringens y Salmonella spp. (Falconi & Espin, 2014)
Salchicha
Es un embutido elaborado a base de músculo esquelético de ganado (res y/o cerdo) o
pollo, pudiendo ser crudos, cocidos o ahumados introducidos en tripas. Contiene un
porcentaje de agua entre 60-70%, hidratos de carbono de 19,9%, proteínas 6-13% y
Grasas 12,6-31,9%. El control microbiológico para salchicha es: mohos y levaduras,
aerobios mesófilos, Clostridium perfringens, Escherichia coli, Listeria monocytogenes,
Estafilococo aureus y Salmonella spp. (DIGESA, 2015)
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20 Jhoselyn Mishell Vivanco Gallardo Oscar Martin Yauri Calle
Salsa de tomate:
La salsa de tomate es una salsa elaborada a base de jugo y pulpa de tomates que han
sido previamente cocidos o no, para obtener la consistencia característica. Contiene un
pH inferior a 4,5, acidez 2,5% en ácido acético y aw 0,73. El control microbiológico se
basa en el contenido de mohos (hifas) y bacterias acidúricas (Lactobacilos
homofermentadores y heterofermentadores). (INEN 1026, 2010)
Mayonesa:
La mayonesa es una salsa delgada formada por medio de emulsión de aceites vegetales
comestibles, yema de huevo, vinagre y agua; además se añade ciertos aditivos como:
conservantes, antioxidantes, reguladores de pH, estabilizantes y espesantes. Contiene
un pH inferior a 4,2, acidez 0,2% en ácido acético, aw 0,92 y alto contenido graso (70-
80%). El control microbiológico se basa en el recuento de aerobios mesófilos,
coliformes, Escherichia coli, Estafilococo aureus, mohos y levaduras, y Salmonella spp.
(Navarro, 2015) (Valenzuela, 2016)
Mostaza.
La mostaza es una salsa elaborada a partir de semillas de la planta de mostaza, molidas
y mezcladas con agua. Contiene un pH inferior a 4,0, acidez 0,3% en ácido acético. El
control microbiológico se basa en el recuento de aerobios mesófilos y detección
Salmonella spp. (Paunero, 2015)
1.6 Requisitos microbiológicos del Hot Dog
En la normativa ecuatoriana no existe parámetros microbiológicos para el alimento hot
dog tipo perrito caliente, por lo que el análisis se basa en la Norma Peruana DIGESA
que incluye parámetros microbiológicos para “Embutidos con tratamiento térmico”
(Tabla1) y “Comidas preparadas que llevan ingredientes con y sin tratamiento térmico”
(Tabla 2).
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21 Jhoselyn Mishell Vivanco Gallardo Oscar Martin Yauri Calle
Tabla 1 Límites microbiológicos del análisis de embutidos con tratamiento térmico para hot dogs de la Norma DIGESA N°10.11
Agente microbiano Categoría Clase n C Límite por gramo
M M
Aerobios Mesófilos 3 3 5 1 5x10 4 5x10 5
Escherichia coli 6 3 5 1 10 102
Staphylococcus aureus 6 3 5 1 10 102
Clostridium perfringens 6 3 5 1 10 102
Salmonella spp. 10 2 5 0 Ausencia/25g
Listeria monocytogenes 10 2 5 0 Ausencia/25g
Categoría: Serie de factores que relacionan el peligro de la presencia de determinadas especies o grupos bacterianos
en un alimento (1 a 15 categorías)
Clase: Criterios de decisión (dos categorías o de tres categorías)
n: Número de unidades a analizar
C: Número máximo de unidades defectuosas que se pueden aceptar
m: Número máximo de bacterias pertinentes/g
M: Valor iguales o superiores son inaceptables.
Fuente: (DIGESA, 2015)
Tabla 2 Límites microbiológicos para comidas preparadas que llevan ingredientes con y sin tratamiento térmico de la Norma DIGESA 15.1
Agente microbiano Categoría Clase n C Límite por gramo
m M
Aerobios Mesófilos 2 3 5 2 10 5 10 6
Coliformes 5 3 5 2 10 2 10 3
Escherichia coli 5 3 5 2 10 102
Staphylococcus aureus 5 3 5 2 10 102
Salmonella spp. 10 2 5 0 Ausencia/25g
Categoría: Serie de factores que relacionan el peligro de la presencia de determinadas especies o grupos bacterianos
en un alimento (1 a 15 categorías)
Clase: Criterios de decisión (dos categorías o de tres categorías)
n: Número de unidades a analizar
C: Número máximo de unidades defectuosas que se pueden aceptar
m: Número máximo de bacterias pertinentes/g
M: Valor iguales o superiores son inaceptables.
Fuente: (DIGESA, 2015)
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22 Jhoselyn Mishell Vivanco Gallardo Oscar Martin Yauri Calle
1.7 Grupo de microorganismos
1.7.1 Microorganismos indicadores de alteración.
Son los microorganismos asociados a la vida útil y alteración del producto; pudiendo ser
aerobios mesófilos, mohos y levaduras. Los microorganismos crecen selectiva y
competitivamente en el alimento, iniciando el deterioro con una población heterogénea,
conforme avanza el deterioro del alimento se reduce a poblaciones más homogéneas,
hasta que finalmente sobrevive un solo tipo de microorganismo. De modo que una
variedad inicial de microorganismo indica poco deterioro, al contrario una población
homogénea o un solo tipo de microorganismo presente indica un deterioro avanzado.
(DIGESA, 2015)
Aerobios mesófilos
Estima la microflora total sin especificar el tipo de microorganismo presente, es además
un indicador de calidad del producto, así como las condiciones higiénicas con las que
fueron manipulados los alimentos desde su manufactura hasta su distribución. A este
grupo pertenecen todas las bacterias aerobias, con una temperatura óptima de 30-40ºC.
(Passalacqua & Cabrera, 2015)
Los cálculos estiman el número de microorganismos presentes en un producto, pero la
presencia o ausencia de microorganismos patógenos no depende del alto o bajo número
de colonias. La interpretación de los resultados va a depender de varios factores del
alimento como tipo de alimento (madurados con bacterias o con conservantes),
manipulación, almacenamiento y conservación de los mismos. (Passalacqua & Cabrera,
2015)
Este tipo de microorganismo permite evaluar la calidad de un alimento así como de los
ingredientes del producto final, demostrando; contaminación de la materia prima,
deficiente manipulación durante el proceso de elaboración, inmediata alteración del
producto, prediciendo así la vida útil de un alimento. (Ramiro, 2015)
1.7.2 Microorganismos indicadores de higiene
Son microorganismos no patógenos indicadores de la eficacia de los procesos de
sanitización y desinfección de diversos productos. Ponen en manifiesto deficiencias
microbiológicas de un alimento, el principal son Coliformes. (DIGESA, 2015)
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23 Jhoselyn Mishell Vivanco Gallardo Oscar Martin Yauri Calle
Coliformes
Son microorganismos Gram-negativos, bacilos cortos, aerobios o anaerobios
facultativos, capaces de fermentar la lactosa y sacarosa con producción de ácido y gas
a las 48h de incubación a 37ºC. A este grupo pertenecen los géneros: Escherichia,
Enterobacter, Klebsiella y Citrobacter. Siendo el género más representativo el de
Escherichia la especie coli. (Vázquez, O`Neill, & Legnani, 2013)
Los coliformes se eliminan fácilmente por tratamiento térmico, por lo cual son
particularmente útiles como componentes de criterios microbiológicos para indicar
contaminación postproceso térmico. (Campuzano, 2015)
Escherichia coli
Es un bacilo corto móvil, Gram negativo termotolerantes (35 a 43ºC), que está presente
en el intestino del ser humano y animales de sangre caliente, estos constituyen el 1%
de la flora normal del intestino, es utilizado como indicador de contaminación fecal de
agua y de los alimentos. (Vázquez, O`Neill, & Legnani, 2013)
La ausencia de este microorganismo permite demostrar una eficacia del control a nivel
de cadena de frío así como también de procesos térmicos como pasteurización, ya que
presenta su límite máximo de crecimiento en 7ºC y es sensible a temperaturas
superiores a 70ºC. La congelación no garantiza la destrucción de bacterias viables
presentes en un alimento. Otros factores que influyen en el desarrollo de este
microorganismo son el pH y la aw, así un alimento altamente ácido y/o con aw de 0,94
influirá negativamente en la proliferación de este microorganismo. (Chadán, 2017)
(Vázquez, O`Neill, & Legnani, 2013)
Existen varias cepas de E. coli patógeno como:
a) E. coli enterotoxigénicas: más conocida como “diarrea del viajero”. son
capaces de producir dos tipos de enterotoxinas: una termolábil que se inactiva a
60ºC por 30 min y otra termoestable que resiste a 100ºC por 15 min. (Vázquez,
O`Neill, & Legnani, 2013)
b) E. coli enterohemorrágica: son productoras de citotoxinas capaces de destruir
las células intestinales y causan colitis hemorrágicas caracterizadas por cólicos
graves y diarreas. Puede llegar a desencadenar el síndrome urémico hemolítico
provocado por fallo renal y anemia hemolítica. (Vázquez, O`Neill, & Legnani,
2013)
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24 Jhoselyn Mishell Vivanco Gallardo Oscar Martin Yauri Calle
c) E. coli enteroinvasiva: son productoras de citotoxinas, inducen a enfermedades
graves como colitis y una forma de disentería acompañada de fiebre y heces
sanguinolentas. (Vázquez, O`Neill, & Legnani, 2013)
d) E. coli enteropatógena: es el principal causante de diarrea en niños, aún se
desconoce su mecanismo. (Vázquez, O`Neill, & Legnani, 2013)
e) E. coli enteroagregante: son productoras de toxinas que estimulan la secreción
intestinal capaz de originar diarrea persistente en niños. (Vázquez, O`Neill, &
Legnani, 2013)
1.7.3 Microorganismos patógenos
Corresponde aquellos microorganismos responsables de trastornos gastrointestinales
ya que poseen mayor virulencia o incidencia de causar ETAs, pueden ser bacterias,
virus y parásitos. Las bacterias patógenas más destacables son Staphylococcus aureus,
Bacillus cereus, entre otros, de los cuales la cantidad de células viables condicionan su
peligrosidad. Existen otros microorganismos cuya sola presencia indican peligrosidad
para la salud como: Salmonella spp, Listeria monocytogenes, Escherichia coli.
(DIGESA, 2015)
Staphylococcus aureus
Es una bacteria esférica pequeña, Gram positiva. Son anaerobios facultativos pero
crecen mejor en presencia de aire, todas las estirpes son coagulasa positivo, crecen
entre 7 y 48ºC con una temperatura óptima de 35-37ºC. Son productoras de
enterotoxinas que sobreviven por largos periodos de tiempos en ambientes secos y en
alimentos con alto contenido de sales y azúcares. Estos microorganismos son capaces
de producir rápidamente toxinas resistentes al calor, congelamiento y radiación; por lo
que se considera como una bacteria causante de intoxicación alimentaria, después de
ser ingeridas actúan de forma rápida manifestando síntomas de forma inmediata ya que
resisten a enzimas proteolíticas (pepsina y tripsina). También produce infección de
forma directa por destrucción e invasión tisular local la cual se disemina por vía
sanguínea. (Calderon & Maria, 2010)
Universidad de Cuenca
25 Jhoselyn Mishell Vivanco Gallardo Oscar Martin Yauri Calle
Este microorganismo se lo considera un indicador de deficiencia en la manipulación de
alimentos, pues esta especie se encuentra habitualmente en piel y mucosas de los seres
humanos y animales, formando parte de la flora normal. Los portadores se clasifican en,
portadores sanos ocasionales, intermitentes o permanentes de este microorganismo.
Por lo que no solo indica contaminación por manos sucias o infecciones. (Calderon &
Maria, 2010) (Cervantes & García, 2014)
Clostridium perfringens
Son bacilo Gram positivo, anaerobio y formador de esporas pero aerotolerante, no móvil,
productor de enterotoxinas, crecen entre 20 - 50ºC, con una temperatura óptima de
45ºC. Ampliamente distribuida en la naturaleza (suelo) e intestino de animales y el
hombre. (Renapra & Anmat., 2015)
Es la tercera causa de infección alimenticia, después de Salmonella y Staphylococcus
aureus.
Existen 5 tipos de C. perfringens (A,B,C,D y E), siendo el tipo A el causante de brotes
de ETAs, produce dos tipos de toxinas, una termoresistente (resisten a temperaturas de
ebullición por 1 a 3 horas, equivalente a un 10%) y otra termolábil (se aíslan en un 90%
del intestino animal). El Clostridium perfringens tipo C produce enteritis nefrótica.
Las enterotoxinas se producen al momento de la esporulación del microorganismo, se
unen al receptor de membrana, alterando la permeabilidad calcio dependiente,
desencadenado un daño tisular o lisis por el desequilibrio electrolítico. (Renapra &
Anmat., 2015)
Las temperaturas de cocción deficiente ayudan a la eliminación de las formas
vegetativas más no elimina las formas esporuladas, las cuales proliferan cuando existe
un descenso de temperatura muy lento entre 50 y 25ºC. (Renapra & Anmat., 2015)
Salmonella spp
Son bacterias Gram negativas, anaerobias facultativas, mesófilos, con una temperatura
óptima de 35-37ºC, presenta un límite de crecimiento de 7ºC, aunque a una temperatura
de 15ºC o menos se reduce significativamente. Las serovariedades zoonóticas son
consideradas como Salmonella no Typhi, las cuales se encuentran ampliamente
distribuidas en el reino animal, siendo las aves y los derivados fuente común de
infección, además es responsable de causar millones de casos de ETAs cada año según
la OMS. (Heredia & Vinueza, 2018)
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26 Jhoselyn Mishell Vivanco Gallardo Oscar Martin Yauri Calle
Constituye una de las principales causas de gastroenteritis con cuadros febriles en el
hombre, presenta un período de incubación variado por lo general de 8 a 72 horas, a
veces inferior a 6 horas, y en repetidas ocasiones en períodos mayores a 72 horas.
Salmonella no sobrevive a temperatura de pasteurización, así tampoco a pH por debajo
de los 4.5 y su mayor característica es que resisten a la deshidratación. (Heredia &
Vinueza, 2018)
Este microorganismo tiene la capacidad de producir dos cuadros clínicos, gastroenteritis
causada por varios serotipos como S. enteritidis y S. typhymurium, y fiebre tifoidea
caracterizada principalmente por temperaturas corporales de 39 a 40ºC, es causada por
S. paratyphi A, B y C. En algunas ocasiones estos cuadros clínicos pueden causar
bacteriemia e infecciones focalizadas o sistémicas. (Heredia & Vinueza, 2018)
(Martínez, 2016)
Se ha reportado que los infectados pueden ser un foco de contaminación por varios días
o semanas después, incluso por más de un año. (Heredia & Vinueza, 2018) (Martínez,
2016)
Los principales alimentos portadores o vehículos son carne, leche, aves de corral y
principalmente huevos, este último es utilizado para la preparación de aderezos como
mayonesa, de forma casera puede ser un foco de contaminación pues no posee una
previa cocción. La contaminación del huevo se puede dar de forma transovárica o
después de la puesta, los microorganismos ingresan a través de los poros de la cáscara,
siendo la principal fuente la yema por su alto contenido de nutrientes. (Heredia &
Vinueza, 2018) (Martínez, 2016)
Listeria monocytogenes Es un bacilo corto Gram positivo, no esporulado móvil a 25ºC e inmóvil a 35ºC, aerobio
o anaerobio facultativo, intracelular oportunista, que se desarrolla de 1 a 45ºC con una
temperatura óptima de 30 a 37ºC. Soporta condiciones adversas de frío (<0ºC), calor
(>50ºC), acidez (pH >4.3) y salinidad (12% NaCl). (Price, Jayeola, Niedermer, &
Parsons, 2017)
Produce dos tipos de manifestaciones clínicas, invasiva la cual se da cuando las
bacterias atraviesan la barrera intestinal avanzando a sistemas y órganos que son
blanco de infección; y, no invasiva la cual se caracteriza por gastroenteritis como diarrea
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27 Jhoselyn Mishell Vivanco Gallardo Oscar Martin Yauri Calle
fiebre y mialgias. (Price, Jayeola, Niedermer, & Parsons, 2017) (Svetoslav & Otavio,
2018)
La Listeria monocytogenes es un microorganismo ambiental capaz de formar bio
películas como barrera de protección frente a los agentes antimicrobianos, por ello se
adhieren a las superficies persistiendo en equipos y utensilios por tiempos prolongados,
siendo el único método de eliminación la pasteurización. (Price, Jayeola, Niedermer, &
Parsons, 2017) (Svetoslav & Otavio, 2018) (Muñoz, Chavez, & Rodriguez., 2015)
1.8 Factores que influyen directamente sobre el crecimiento
microbiano.
Factores intrínsecos
● Composición del alimento: hace referencia a la cantidad de nutrientes que posee el
alimento (hidratos de carbono, grasas, proteínas, vitaminas y minerales) y que
requiera el microorganismo para proliferar.
● pH y acidez: cada microorganismo necesita de pH específico para proliferar, y la
acidez inhibe hasta cierto punto el crecimiento bacteriano.
● Actividad acuosa (aw): es la relación que existe entre el agua libre y el agua total
presente en el alimento, a mayor cantidad acuosa mayor será la probabilidad de
crecimiento bacteriano. (Moreno & Alarcòn, 2015)
Factores extrínsecos.
● Concentración de oxígeno: constituye un factor selectivo para los microorganismos,
ya sean aerobios (requieran oxígeno para proliferar), anaerobios (requieren
ausencia) o facultativos (crecen en presencia o ausencia de oxígeno).
● Temperatura: un 60% de microorganismos crecen entre 5-60°C siendo la
temperatura optima de 37 °C, es por esto que se debe mantener a los alimentos por
encima o debajo de estas temperaturas.
● Humedad: mayor humedad mayor proliferación. (Moreno & Alarcòn, 2015)
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28 Jhoselyn Mishell Vivanco Gallardo Oscar Martin Yauri Calle
2 METODOLOGÍA
2.1 Tipo de estudio
Este trabajo de titulación fue un estudio observacional de diseño transversal de tipo
descriptivo.
2.2 Área de Estudio y toma de muestra
Puestos de ventas ambulantes de hot dogs localizados en la Ciudad de Cuenca-
Ecuador. Según el catastro del Departamento de Control Urbano del GAD municipal
constan 10 expendedores de este tipo de alimento, considerando este el número de
muestras base para el estudio, los cuales no fueron localizados en su mayoría por lo
que se buscó nuevos vendedores de diferentes localidades de la Ciudad, descritos en
el ANEXO N°1 y ubicados en el ANEXO Nº 2.
La muestra consistió en el hot dog completo (pan y vienesa), aderezos (mayonesa, salsa
de tomate y mostaza) e ingredientes adicionales (cebolla y tomate cocidos).
Se tomaron 20 muestras, en 10 puestos de venta ambulante. Siendo la unidad muestral
un hot dog, el cual se solicitó al expendedor dividir en dos porciones que fueron
recolectadas en fundas herméticas (ziploc), previamente etiquetadas y transportadas
según la norma NTE INEN 1529-2:2013, en un envase secundario (cooler) con pilas de
hilo a temperatura de refrigeración (2-8°C); la primera porción se utilizó para el análisis
de Clostridium perfringens llevada al laboratorio externo y la segunda porción fue
llevada al laboratorio de microbiología de alimentos de la Facultad de Ciencias
Químicas de la Universidad de Cuenca.
2.3 Materiales, equipos y reactivos
Materiales
Lámpara de alcohol
Pipeta automática
Tubos de ensayo
Matraz
Varilla de vidrio
Probeta 100ml
Puntas con filtros estériles
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Equipos
Autoclave N° serie 919997, marca All American, modelo 930.
Balanza analítica N° serie 14952, marca Ohaus, modelo Scout II
Estufa Fanem N° serie 91974
Refrigeradora N° serie 14342, marca Philco, modelo Br 203
Reactivos
Placas compact Dry TC, EC y X SA
Reveal 2.0 para Salmonella y Listeria spp.
Agua destilada
Agua de peptona
2.4 Métodos y técnicas de análisis
Para el análisis microbiológico de hot dogs, se realizaron ensayos preliminares de
diluciones sucesivas con el fin de determinar las diluciones a utilizar. Las diluciones
preliminares utilizadas fueron: 1/10, 1/100, 1/1000, 1/10000; según los resultados se
llegó a la conclusión de utilizar las diluciones 1/10 y 1/100 para la determinación de
Escherichia coli y Staphylococcus aureus pues no existió crecimiento en menor dilución,
en cambio para la determinación de aerobios mesófilos se utilizó la dilución 1/100 y
1/1000 debido a que la dilución 1/10 dio resultados muy numerosos para contar (MNPC).
Preparación de la muestra para el análisis
Se tomaron 60 g de muestra para el análisis microbiológico: 10 g para el análisis de S.
aureus, A. mesófilos, E. coli; 25g de muestra para análisis de Salmonella y 25 g de
muestra para el análisis de Listeria monocytogenes. Para el análisis de C. perfringens
se envió al laboratorio externo 60 g aproximadamente.
2.5 Placas compact DRY
Son placas cromogénicas para detección y cuantificación de microorganismo de
diversos tipos de muestras, presentan un procedimiento sencillo y seguro, equivalente
a procedimientos tradicionales como recuento en placa. La interpretación en estas
placas es específica, ya que cada microorganismo desarrolla un color característico
debido a indicadores redox y sustratos cromógenos, en los tiempos y temperaturas
correspondientes de incubación. (HyServe, 2018)
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30 Jhoselyn Mishell Vivanco Gallardo Oscar Martin Yauri Calle
Las placas Compact Dry se pueden almacenar a temperatura ambiente hasta un periodo
de 24 meses. La tapa con cierre giratorio permite transportar las muestras con
seguridad. (HyServe, 2018)
2.5.1 Aerobios mesófilos, Compact Dry TC
La determinación de aerobios mesófilos se da mediante las placas compact Dry TC que
presenta un agar base de cultivo estándar, el cual proporciona un medio con nutrientes
necesarios para un recuento bacteriano viable. Formado por sal de tetrazol e indicador
redox que permite una coloración roja de las colonias. (HyServe, 2018).
Antes de la siembra en placa, se realizaron varias diluciones en agua de peptona según
ANEXO N°3. El método de siembra de las placas compact Dry consiste en sembrar 1mL
con pipeta automática de forma perpendicular a la placa. Se incubaron en la estufa a
37°C de 24 a 48 horas. ANEXO N° 4
2.5.2 Coliformes/Escherichia coli, Compact Dry EC
La determinación de coliformes y Escherichia coli se da mediante las placas compact
Dry EC que contiene dos sustratos enzimáticos cromógenos, magenta-GAL específico
para detección de coliformes pues desarrolla coloración rosa salmón y X-Glucoronico
específico para detección de E. coli pues desarrolla coloración azul. La suma total de
las colonias da como resultado la cifra total del grupo coliformes. (HyServe, 2018)
Antes de la siembra en la placa se realizaron varias diluciones en agua de peptona
según ANEXO N°3, se siembra según método para placas compact Dry. Se incuban en
la estufa a 37 +/- 2°C por 24 horas. ANEXO N° 5
2.5.3 Staphylococcus aureus, Compact Dry X-SA
La determinación de Staphylococcus aureus se da mediante las placas compact Dry X-
SA, contiene agar de sal manitol mejorado, la detección se realiza por medio de una
reacción de yema de huevo, a efectuar mediante la suspensión Compact Dry SA Egg
Yolk. El complejo lípido-proteínico (lecitina) de la yema de huevo se desintegra por obra
de cierta lipasa del Staphylococcus aureus, y modifica con ello el color del medio
ambiental de la colonia a verde azulada. (HyServe, 2018)
Antes de la siembra en la placa se realizaron varias diluciones en agua de peptona
según ANEXO N°3, se siembra según método para placas compact Dry. Se incuban en
la estufa a 37°C por 24 horas. ANEXO N°6
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2.5.4 Medio SPS Agar
Permite el aislamiento selectivo de Clostridium, especialmente para C. perfringens y C.
botulinum. Se fundamenta en la utilización de sulfito sódico, el cual es reducido a sulfuro
de hidrógeno por la mayoría de los Clostridium spp, luego este reaccionará con citrato
férrico y formará sulfuro de hierro (precipitado) lo cual le proporcionará un color negro a
las colonias. Este medio posee antibiótico lo cual inhibe el crecimiento de bacterias
acompañantes en la muestra diferentes de Clostridium spp, es selectivo pues si crecen
otros microorganismo no producirán SH2 por lo que no formarán colonias negras.
(Microbiología: Laboratorio de aguas y alimentos, 2014)
Composición:
Peptona de caseína
Extracto de levadura
Citrato de hierro (III)
Sulfito sódico
Polimixina-B sulfato
Sulfadiazina sódica
Agar
Este microorganismo fue analizado por un laboratorio certificado, debido al poco acceso
a los medios de cultivos necesarios. Se trabajó según el método tradicional de siembra
en profundidad usando el agar SPS y para confirmación tioglicolato.
El método consiste en realizar primero diluciones según ANEXO N°3, luego se siembra
por duplicado 1 ml de cada dilución en caja Petri, se agrega 20 ml del agar SPS, se
homogeniza cuidadosamente y se deja solidificar. Es opcional agregar una capa extra
de agar SPS o agar Nutritivo, con el objetivo de sellar el cultivo. Se incuba en
anaerobiosis sin invertir la caja por 20-24 horas a 33 ± 2 ºC.
La confirmación se realiza mediante la siembra en Tioglicolato de dos colonias típicas
(colonias negras) crecidas en el agar SPS, se incuba en anaerobiosis por 24 horas a 33
± 2 ºC; se debe observar bacilos Gram positivos en tinción Gram.
Los cálculos se realizan a través del conteo de las colonias multiplicado por el factor de
la dilución, se expresa en número de Clostridium perfringens /g o mL de muestra.
Los resultados por parte del laboratorio externo fueron emitidos en un informe técnico
según ANEXO N° 8 y resumidos en ANEXO N° 9.
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2.5.5 Método Reveal 2.0 para Salmonella
Este método permite una recuperación rápida del microorganismo en muestras
alimentarias, concentrados para animales y muestras ambientales en un tiempo de 24
horas. Se fundamenta en la presencia de anticuerpos específicos que pertenezcan a los
serotipos somáticos A - E de Salmonella entérica, son los serotipos más comunes en
alimentos y fuentes no alimentarias. Presenta dos medios:
a. Revive.- Contiene nutrientes para recuperar microorganismos sometidos a
estrés o lesión.
b. Rappaport-Vassiliadis (RV).- Favorece el crecimiento de Salmonella spp a
niveles que puedan ser detectables. (NEOGEN, Reveal 2.0 for Salmonella,
2018)
Para su determinación se procede a incubar la muestra en el medio 1 (Revive) y medio
2 (Rappaport Vassiliadis) según el ANEXO N° 10. Se toma 200 uL de muestra de Reveal
y se coloca en un recipiente graduado por 15 min a temperatura ambiente con la tira
reactiva, la cual posee anticuerpos anti-Salmonella conjugados con partículas de oro
coloidales formando un complejo antígeno anticuerpo el que se pronunciará en la zona
de reacción como una línea visible. Este procedimiento se debe realizar dentro de las 6
horas después de la incubación.
El Kit se almacena de 15 a 30 °C, no se debe autoclavar.
Utilizar agua estéril para la hidratación de los medios.
Permitir un flujo de aire que ayudará a la proliferación del microorganismo.
Precalentar agua estéril a 42°C para rehidratación de Revive y 36°C para
rehidratación de RV.
Respetar los periodos y temperaturas de incubación establecidos para evitar
resultados erróneos.
La lectura se debe realizar antes de los 20 min, pues después de ello, se
considera un resultado erróneo por sobre explotación del dispositivo de prueba.
(NEOGEN, Reveal 2.0 for Salmonella, 2018)
2.5.6 Reveal 2.0 para Listeria
Este método permite una recuperación rápida del microorganismo en muestras
alimentarias y ambientales en un tiempo de 27-30 horas. Detecta todas las especies de
Listerias spp, excepto Listeria grayi.
Contiene medio LESS (Enriquecimiento de Listeria en un solo paso), que permiten un
enriquecimiento selectivo de las especies de Listeria ANEXO N° 11, seguido se
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33 Jhoselyn Mishell Vivanco Gallardo Oscar Martin Yauri Calle
neutraliza 2 mL a temperatura de 80°C, después se añade 200 uL de muestra de Reveal
al recipiente graduado y se coloca la tira reactiva o dispositivo Reveal, por 20 min a
temperatura ambiente, la cual posee anticuerpos anti Listeria específicos conjugados
con partículas de oro coloidales formando un complejo antígeno anticuerpo el que se
pronunciará en la zona de reacción como una línea visible.
Un resultado positivo se manifiesta con dos líneas cromogénicas en el dispositivo
Reveal, en cambio el resultado negativo genera una línea cromogénica en la zona de
control, y si no se manifiesta la línea control se considera prueba inválida y se debe
repetir el proceso.
El Kit se almacena de 15 a 30 °C, no se debe autoclavar.
Utilizar agua estéril para la hidratación de los medios.
Debe permitirse un flujo de aire que ayudará a la proliferación del
microorganismo.
La lectura se debe realizar después de 20 min pues antes de ello se considera
un resultado erróneo. (Neogen Reveal 2.0 for Listeria, 2018)
2.6 Cálculos
Los cálculos de los recuentos se realizaron en base de la siguiente fórmula:
𝑁 =(𝑁º)
𝑉(1 + 0.1(𝑛))(𝑑)
Nº = número de colonias
V = Volumen de siembra
n = número de placas sembradas
d = Dilución de siembra
Fuente: (INEN 1529-14, 2013)
2.7 Análisis estadístico
El tipo de análisis empleado fue descriptivo para el cual se utilizó el programa Microsoft
Excel con las siguientes variables: media, desviación estándar y porcentaje de
cumplimiento evaluados en un margen establecidos por las Normas DIGESA para así
establecer un criterio de cumplimiento o no de la misma.
2.8 Mapeo
Se realizó un mapeo de los vendedores ambulantes de los hot dogs que forman parte
de este análisis en la ciudad de Cuenca por lo que existe una distribución geográfica
homogénea. Se utilizó el programa Google Earth pro. ANEXO Nº 2
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2.9 Capacitación
En conjunto con el Departamento de Control Urbano del GAD municipal de Cuenca, se
efectuó una capacitación a los vendedores ambulantes de hot dogs con el tema
“Medidas de control para evitar las enfermedades transmitidas por alimentos”, el día
martes 11 de Diciembre del 2018 en el salón de conferencia del GAD municipal. Se
elaboró un tríptico informativo y diapositivas los cuales fueron aprobados por las
autoridades municipales y entregados a los vendedores el día de la capacitación.
ANEXO N° 12
3 RESULTADOS Y DISCUSIÓN
El estudio fue de varios sectores de la ciudad de Cuenca, en el cual se analizaron a 10
vendedores ambulantes de hot dogs, por duplicado dando un total de 20 muestras
procesadas en 4 muestreos, en un periodo comprendido entre Junio y Julio del 2018.
ANEXO 1
Las muestras analizadas fueron hot dogs tipo perros calientes que consisten en pan,
salchicha, refrito (cebolla y tomate), aderezos (mayonesa, salsa de tomate y mostaza).
Los análisis microbiológicos se analizaron en base a las Normas DIGESA “Embutidos
con tratamiento térmico” y “Comidas preparadas que llevan ingredientes con y sin
tratamiento térmico”. Los resultados obtenidos se presentan en la Tabla N° 3 y 4,
detallados en el ANEXO 9
Tabla 3 Resultados del análisis microbiológico de embutidos para hot dogs.
Microorganismos analizados
Recuento % de Cumplimiento de la Norma
DIGESA N° 10.11
Límites permitidos
Media DE Mínimo Máximo
Aerobios Mesófilos 5,9 x10 2 * 4,18 x10 4 95 5x10 4 5x10 5
Escherichia coli 5,45 x10 3
**
0 95 10 10x 102
Estafilococo aureus 0 0 100 10 10x 102
Clostridium perfringens
< 10 *** 0 100 10 10x 102
Salmonella spp. 9 **** 0 55 Ausencia/25g
Listeria 2 ***** 0 90 Ausencia/25g
* Media tomada de 19 muestras cuantificadas, 1 muestra con recuento MNPC
** Único dato de las 20 muestras analizadas
*** 15 muestras refieren conteo < 10, y 5 muestras ausencia total
**** Representa el número de muestras con resultado positivo
***** Representa el número de muestras con resultado positivo
Fuente: (DIGESA, 2015)
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Tabla 4 Resultados del análisis microbiológico de comida preparada
Microorganismos analizados
Recuento % de Cumplimiento de la Norma
DIGESA N° 15.1
Límites permitidos
Media DE Mínimo Máximo
Aerobios Mesófilos 5,9 x10 2 * 4,18 x10 4 95 5x10 5 5x10 6
Coliformes 8,2 x10 1 ** 1,34 x10 3 90 10 2 10 3
Escherichia coli 5,45 x10 3 *** 0 95 10 10x 102
Estafilococo aureus 0 0 100 10 10x 102
Salmonella spp. 9 **** 0 55 Ausencia/25g * Media tomada de 19 muestras cuantificadas, 1 muestra con recuento MNPC
** Media tomada de 19 muestras cuantificadas, 1 muestra con recuento MNPC
*** Único dato de las 20 muestras analizadas
**** Representa el número de muestras con resultado positivo
.Fuente: (DIGESA, 2015)
El análisis microbiológico de las 10 muestras de hot dogs examinadas con sus
respectivos duplicados denotan un porcentaje de cumplimiento de la Norma DIGESA
“Embutidos con tratamiento térmico”, para aerobios mesófilos 95%, Escherichia coli
95%, Clostridium perfringens y S. aureus 100%, Salmonella spp 55% y Listeria
monocytogenes 90%.
En base a la Norma DIGESA “Comidas preparadas que llevan ingredientes con y sin
tratamiento térmico” los porcentajes de cumplimientos son los mismos, a pesar de que
los límites en cuanto a aerobios mesófilos son mayores. Además, se incluye la
determinación de coliformes totales. El cambio de estos dos parámetros se puede basar
en que existirá una mayor manipulación debido a los diversos ingredientes que poseen,
sometidos o no a tratamiento térmicos.
Se analizó todo el hot dog puesto que en este tipo de alimentos no se asegura una
homogeneidad de microorganismos por la variedad de sus componentes.
En los resultados se puede observar que el 100% de las muestras indican presencia de
bacterias aerobias sin especificación de su tipo, sin embargo existe un cumplimiento del
95% de este microorganismo según los límites permitidos en las Normas DIGESA
N°10.11 y 15.1, con una gran variabilidad del 70% (porcentaje de coeficiente de
variación) pudiendo deberse a que los alimentos no han sido manipulados ni
conservados correctamente, que cada manipulador presenta su forma de preparación y
que el alimento posee varios ingredientes.
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En este estudio se estableció un 25% de muestras positivas para coliformes totales, del
cual el 10% incumplen la Norma DIGESA N°15.1. También se determinó un 5% de
muestras positivas para el indicador de contaminación fecal y patogenicidad,
Escherichia coli, esta bacteria es una de las principales en causar diarreas agudas en
niños menores de 5 años (Gómez, 2014). La determinación de Escherichia coli, permite
identificar una contaminación fuerte y/o reciente por desechos animales o humanos, en
cambio sí se detectan coliformes totales pero no Escherichia coli, señala que la
contaminación es reciente pero de origen no fecal o contaminación fecal lejana, sin
supervivencia de coliformes intestinales. (Blanco & Casadiego, Calidad microbiológica
de alimentos remitidos a un laboratorio de salud pública, 2016) (Díaz & Rodríguez,
2013)
C perfringens y S. aureus cumplieron con la norma, el recuento del primero indica
presencia del mismo en valores por debajo del límite inferior establecidos en la norma.
El análisis de Salmonella fue uno de los más importantes por su grado de patogenicidad
y por su alta incidencia en las muestras de los hot dogs, 45% de incumplimiento. Esto
podría deberse a varios factores principalmente por la manipulación, transporte y
almacenamiento de aderezos inadecuados. Además durante el muestreo se indagó la
forma de preparación de la mayonesa, pudiendo ser el foco principal de contaminación
pues esta es elaborada de forma casera. Se recomienda un análisis con mayor
frecuencia y número de muestras de cada vendedor enfocadas a este microorganismo.
(Bayona, 2016). En estudios de alimentos preparados a base de huevos, se determinó
que no se deberían utilizar huevos sin pasteurizar, menos en alimentos frescos como la
mayonesa. (Rincón, Ramírez Rueda, & Vargas, 2015)
En el análisis de Listeria monocytogenes los hot dogs analizados dieron un 10% de
incumplimiento, este tiene un alto índice de mortalidad (20%) vs otros microorganismo
patógenos como E. coli y Salmonella. (Flor, 2017) No se establece una vía de
contaminación específica a este microorganismo pues presenta gran ubicuidad en el
medio ambiente. (Fernández, 2016)
La contaminación de hot dogs puede darse por deficiencias sanitarias de la materia
prima y/o del manipulador, así como todas las acciones incorrectas que lleve a cabo,
transformándose en el principal vehículo de microorganismos patógenos o indicadores
de calidad. ANEXO 13 (Blanco, Casadiego, & Pacheco, 2015)
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Es muy probable que la contaminación sea por tres vías existentes, la utilización del
mismo utensilio en el proceso de preparación del alimento, los aderezos no se
encuentren almacenados en recipientes adecuados (sin tapa, frascos reutilizables y/o
sucios) y que el área de preparación del alimento presente poca higiene esto podría
llevar a causar una contaminación cruzada. Si los vendedores no usan material de
protección, ofrecen el alimento con la mano (pudiendo estar sucia y/o con uñas largas)
estarían propiciando una contaminación por manipulación o de origen si la materia prima
usada está contaminada (embutidos).
Otro problema que incrementa la contaminación podría ser cuando la materia prima se
mantiene a temperaturas inadecuadas, centrándonos al hot dog de tipo perrito caliente,
según el modo de preparación se mantienen el embutido y el refrito (cebolla y tomate)
a temperaturas menores a ebullición o a temperaturas intermitentes propiciando el
medio idóneo para la proliferación bacteriana.
4 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
4.1 Conclusiones
Mediante los resultados obtenidos en los análisis microbiológicos de hot dog vendidos
de forma ambulante en la ciudad de Cuenca, Ecuador se determina que el 60% de
muestras analizadas incumplen con los parámetros establecidos en la Norma DIGESA
N° 10.11 de aerobios mesófilos 5%, Escherichia coli 5%, Salmonella spp 45% y Listeria
monocytogenes 10%. El incumplimiento de la Norma DIGESA N° 15.1 para coliformes
totales es de 10%, los demás parámetros posen los mismos porcentajes de
incumplimiento que la Norma N°10.11. Indica que este producto por su complejidad de
componentes presenta facilidad de contaminación es por ello que se debería llevar un
control sanitario más riguroso ya que es poco apto para el consumo
La variación de temperaturas durante la cocción del refrito y embutido debe ser
controlada para evitar tener el alimento en la zona de peligro (5 a 60°c) por tiempos
prolongados.
A través de una capacitación a los vendedores de este tipo de alimentos se pretende
mejorar la calidad del producto y mantener un control de buenas prácticas de
manufactura.
4.2 Recomendación
Actualizar el registro del GAD municipal de los vendedores ambulantes de hot dogs, de
esta forma se tendrá una mayor vigilancia y control de estos productos.
Universidad de Cuenca
38 Jhoselyn Mishell Vivanco Gallardo Oscar Martin Yauri Calle
Elaborar planes de capacitación constantes en cuanto a la manipulación correcta de los
alimentos y así mejorar la calidad de los mismos
Para una evaluación de la inocuidad de los alimentos se debe sumar el análisis de
superficies de contacto con el alimento desde la materia prima hasta que llega al
consumidor así también como un control sanitario de los manipuladores de hot dogs.
Universidad de Cuenca
39 Jhoselyn Mishell Vivanco Gallardo Oscar Martin Yauri Calle
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6 ANEXOS
ANEXO 1 Vendedores ambulantes de la ciudad de cuenca
Tabla 5 Dirección de los vendedores participantes y fecha del análisis.
Identificación de muestras
Fecha de análisis Dirección
Universidad de Cuenca
42 Jhoselyn Mishell Vivanco Gallardo Oscar Martin Yauri Calle
M1
19 Junio 2018 / 25 Junio 2018
Hurtado de Mendoza y Av. de los Andes
M2 Hurtado de Mendoza y Antisana
M3 Gil Ramírez Dávalos y Chapetones
M4 Calle Vieja y Silban
M5 Camino a Cajamarca y Cojimíes
M6
02 Julio 2018 / 09 Julio 2018
Calle Antonio Vega Muñoz y Padre Aguirre
M7 General Escandón y Roberto Crespo Ordóñez
M8 Av. de las Américas y Juan Pio Montufar
M9 Camino Viejo a Baños
M10 Pío Bravo y Tomás Ordoñez
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43 Jhoselyn Mishell Vivanco Gallardo Oscar Martin Yauri Calle
ANEXO 2 Mapeo
Figura 3 Mapa del muestreo de hot dogs de la Ciudad de Cuenca
Universidad de Cuenca
44 Jhoselyn Mishell Vivanco Gallardo Oscar Martin Yauri Calle
ANEXO 3 Metodología de la preparación de diluciones
Flujograma 1 Forma de preparación de diluciones usadas en el análisis
Universidad de Cuenca
45 Jhoselyn Mishell Vivanco Gallardo Oscar Martin Yauri Calle
ANEXO 4 Descripción del procedimiento e interpretación para aerobios mesófilos en placas compact Dry
INTERPRETACIÒN:
Negativo: no se observa ningún crecimiento de
colonias, se debe incubar 35-37 ºC por 24-48
horas.
Positivo: Se observan colonias color rojo, las
colonias deben ser redondas e uniformes.
Flujograma 2 Descripción del procedimiento e interpretación para aerobios mesófilos en placas compact Dry
Universidad de Cuenca
46 Jhoselyn Mishell Vivanco Gallardo Oscar Martin Yauri Calle
ANEXO 5 Descripción del procedimiento e interpretación para Escherichia coli en placas compact Dry
INTERPRETACIÒN
Negativo: no se observa ningún crecimiento de
colonias, se debe incubar 35-37 ºC.
Positivo: Se observan colonias de color rojo
característico de las coliformes; se observan colonias
azules características de E. coli, las colonias deben
ser redondas e uniformes.
Flujograma 3 Descripción del procedimiento e interpretación para Escherichia coli en placas compact Dry
Universidad de Cuenca
47 Jhoselyn Mishell Vivanco Gallardo Oscar Martin Yauri Calle
ANEXO 6 Descripción del procedimiento e interpretación para Estafilococo aureus en placas compact Dry
INTERPRETACIÒN:
Negativo: no se observa ningún crecimiento de
colonias, se debe incubar 35-37 ºC por 24 horas.
Positivo: Se observan colonias diferenciadas
redondeadas de color verde azuladas.
Flujograma 4 Procedimiento e interpretación para Estafilococo aureus en placas compact Dry
Universidad de Cuenca
48 Jhoselyn Mishell Vivanco Gallardo Oscar Martin Yauri Calle
ANEXO 7 Descripción del procedimiento e interpretación para Clostridium perfringens
Flujograma 5 Procedimiento e interpretación para Clostridium perfringens
Universidad de Cuenca
49 Jhoselyn Mishell Vivanco Gallardo Oscar Martin Yauri Calle
ANEXO 8 Informe técnico de los resultados de Clostridium perfringens del laboratorio externo
Figura 4 Modelo de los resultados de Clostridium perfringens emitidos por el laboratorio externo.
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50 Jhoselyn Mishell Vivanco Gallardo Oscar Martin Yauri Calle
ANEXO 9 Resultados del análisis microbiológico
Tabla 6 Resultados de los análisis microbiológicos
Muestras TC 1/100 TC 1/1000 E. coli 1/10 XSA 1/10 C.
perfringens Salmonella
spp Listeria
Coliformes 1/10
1A 1,00E+03 9,09E+02 0 0 < 10 - - 0
2A 2,06E+04 2,64E+04 0 0 < 10 - - 0
3A 9,09E+01 0 0 0 < 10 - - 0
4A 1,00E+05 1,23E+05 5,45E+03 0 < 10 + - 5,45E+03
5A 1,00E+04 2,27E+04 0 0 < 10 - - 0
6A 2,18E+03 3,64E+03 0 0 AUSENCIA - - 0
7A 8,00E+03 6,36E+03 0 0 AUSENCIA - - 2,73E+02
8A MNPC 3,55E+04 0 0 AUSENCIA - - 1,27E+02
9A 5,45E+02 0 0 0 AUSENCIA + - 0
10A 2,73E+02 0 0 0 AUSENCIA + - 0
1B 5,00E+03 4,55E+03 0 0 < 10 - - 0
2B 9,27E+03 8,91E+04 0 0 < 10 + - 0
3B 1,15E+05 9,09E+03 0 0 < 10 - - 0
4B 9,27E+03 1,24E+05 0 0 < 10 + - MNPC
5B 8,45E+03 9,09E+02 0 0 < 10 + - 2,82E+03
6B 9,09E+03 0 0 0 < 10 - - 0,00E+00
7B 1,36E+03 1,82E+03 0 0 < 10 + - 2,73E+01
8B 6,91E+03 6,91E+04 0 0 < 10 + + 0
9B 1,82E+02 1.82E+03 0 0 < 10 + - 0
10B 1,10E+03 9,09E+01 0 0 < 10 - + 0
Indica incumplimiento de la Normas DIGESA
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51 Jhoselyn Mishell Vivanco Gallardo Oscar Martin Yauri Calle
ANEXO 10 Procedimiento para determinación de reveal 2.0 para Salmonella
Interpretación:
Resultado positivo: Presenta dos líneas cromogènicas en el dispositivo reveal
Resultado negativo: genera una línea cromogénica en la zona de control
Prueba inválida: no se manifiesta la línea control y se debe repetir el proceso.
La lectura se debe realizar antes de los 20 min
Flujograma 6 Procedimiento e interpretación para determinación de reveal 2.0 para Salmonella
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52 Jhoselyn Mishell Vivanco Gallardo Oscar Martin Yauri Calle
ANEXO 11 Procedimiento para determinación de reveal 2.0 para Listeria
Interpretación:
Resultado positivo: Presenta dos líneas cromogénicas en el dispositivo reveal
Resultado negativo: genera una línea cromogénica en la zona de control
Prueba inválida: no se manifiesta la línea control y se debe repetir el proceso.
La lectura se debe realizar a los 20 min
Flujograma 7 Procedimiento para determinación de reveal 2.0 para Listeria
Universidad de Cuenca
53 Jhoselyn Mishell Vivanco Gallardo Oscar Martin Yauri Calle
ANEXO 12 Capacitación
Figura 5 Diapositivas de apoyo para la capacitación
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54 Jhoselyn Mishell Vivanco Gallardo Oscar Martin Yauri Calle
Figura 6 Tríptico de capacitación sobre medidas de control para evitar las enfermedades transmitidas por alimentos
Universidad de Cuenca
55 Jhoselyn Mishell Vivanco Gallardo Oscar Martin Yauri Calle
Figura 7 Certificado de asistencia a la capacitación sobre medidas de control para evitar las enfermedades transmitidas por alimentos
Figura 8 Foto de los asistentes a la capacitación con sus certificados
Universidad de Cuenca
56 Jhoselyn Mishell Vivanco Gallardo Oscar Martin Yauri Calle
ANEXO 13 Fotos de carritos de hot dogs
Figura 9 Fotos de carritos de hot dogs
Universidad de Cuenca
57 Jhoselyn Mishell Vivanco Gallardo Oscar Martin Yauri Calle
Convenio de cooperación institucional entre la Universidad de Cuenca y el GAD Municipal del Cantón Cuenca
Universidad de Cuenca
58 Jhoselyn Mishell Vivanco Gallardo Oscar Martin Yauri Calle
Universidad de Cuenca
59 Jhoselyn Mishell Vivanco Gallardo Oscar Martin Yauri Calle
Universidad de Cuenca
60 Jhoselyn Mishell Vivanco Gallardo Oscar Martin Yauri Calle
Universidad de Cuenca
61 Jhoselyn Mishell Vivanco Gallardo Oscar Martin Yauri Calle
Figura 10 Convenio entre la Universidad de Cuenca y el Municipio de Cuenca