TESIS CON CARACTER ABIERTO
PROGRAMA: MAESTRÍA EN TECNOLOGÍA DE POLÍMEROS
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TITULO: Preparación y caracterización de membranas poliméricas permeables obtenidas por deposiclón altern*da de pollelectrolitos sobre células de Sacchapomvces cereviiee.
ASESOR:Dr Sergio Moya FIRMA
M.C. Antonio S. Ledezma Pérez
El Centro de Investigación en Química Aplicada clasifica el presente documento de tesis como ABIERTO.
Un documento clasificado como Abierto se expone en los estantes del Centro de Infonnaclón para su consulta. Dicho documento no puede ser copiado en ninguna modalidad sin autorización por escrito del Titular del Centro de Información o del Director General del CIQA.
Saltillo, Coahuila, a 26 de Febrero de 2007
p.CON 4,ç
4,. 3
Sello de Ja Institución Dr. Juan M'bdez NoneH Firma del Director General del CIQA
- - -
Centro de Investigación en Química Aplicada
TESIS
Preparación y caracterización de membranas _ . polimericas permeables obtenidas por deposici o,n
alternada de polielectrolitos sobre células de Saccharomyces cerevisiae
CtNTR0 DE INFORMACIÓN
Presentada por: 16 ABR 2008
MÓNICA AIMEÉ CENICEROS RR E C IBID <?
Para obtener el grado de:
MAESTRO EN TECNOLOGÍA DE POLÍMEROS
Asesores
Dr. Sergio Moya M. C. Antonio S. Ledezma Pérez
Saltillo, Coahuila Febrero 2007
CENTRO DE INVESTIGACION EN QUIMICA APLICADA Programa de Maestría en Tecnología de Polímeros
TESIS Preparación y caracterización de membranas poliméricas permeables obtenidas por
deposición alternada de polielectrolitos sobre células de Saccharomyces cerevisiae
Presentada por:
MÓNICA AIMEÉ CENICEROS REYES
Para obtener el grado de:
Maestro en Tecnología de Pofimeros
Asesorada por:
Dr. Sergio Moya M.C. Antonio S. Ledezma Pérez
CENTRO DE INFORMACIÓN
16 ABR 2OO
RECIBID9
SINODALES
___
Dr Jor e ero García Dr. Dámaso Navarro Rodríguez 14C.
dente Secretario
Dr. Luis Alfón90 García Cerda Vocal
Saltillo, Coahuila Febrero, 2007
DECLARACIÓN
Declaro que la información contenida en la Parte Experimental así como
en la Parte de Resultados y Discusiones de este documento y que forman
parte de las actividades de investigación y desarrollo realizadas durante el
período que se me asignó para llevar a cabo mi trabajo de tesis, será
propiedad del Centro de Investigación en Química Aplicada.
Saltillo, Coahuila a 26 de Febrero de 2006
MÓNICA AIMEÉ CENICEROS REYES Nombre y Firma
Dedico este trabajo con mucho cariño
a mis padres Beto y Martha
y a mis hermanitas Melissa y Daniela,
así como también a mis abuelos
Ramiro y Olga
Agradecimientos
A Dios por permitirme llegar hasta aquí.....
A mis papás Humberto y Martha por todo su apoyo y a mis hermanas
Melissa y Daniela por su cariño. 1
Al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología por el apoyo financiero en el
proyecto 47350 para la realización de este proyecto de maestría.
Al Centro de Investigación en Química Aplicada por haberme permitido
realizar este trabajo de maestría en sus instalaciones.
Al Profesor Edwin Donath del Instituto de Biofísica y Física Médica de la
Universidad de Leipzig en Alemania por haberme permitido trabajar con su
equipo de investigación.
A mis asesores, el Doctor Sergio Moya y al M. C. Antonio Ledezma (Sr.
Tony) por el apoyo y dedicación para la realización de este trabajo.
A mis evaluadores Dr. Luis Alfonso García Cerda, Dr. Dámaso Navarro
Rodríguez y Dr. Jorge Romero García por su valiosa aportación y tiempo dedicado
en la revisión de este trabajo.
A Esmeralda Saucedo, Miriam Lozano, M. C. Silvia Solís por su apoyo para
la caracterización de los materiales y a la L. C. Q. Gabriela Padrón por el apoyo
- técnico otorgado en la manipulación de material biológico.
- Especialmente a Ramiro Guedea y Layza Arizmendi por esos días y noches
de estudio compartido (ja), así también a Edgar Vergara, Maria Concepción García,
Migdaliz Garza, Araceli G., Selene Guzmán, Sofía Vazquez y Maricela García,
además con mucho cariño a Miguel Ángel M. y Deifilia Sánchez por el tiempo
compartido en el cubículo (se les extraña!). Esas fiestas estuvieron geniales!!!!
ÍNDICE
Página
Resumen 1
1. Introducción 1
1.1. Nanofabricación 1
1.2. Polielectrolitos 2
1.3. Técnica capa a capa 4
1.4. Células utilizadas como plantillas 8
1.4.1. Características principales de Saccharomyces cerevisiae 9
1.5. Fabricación de Cápsulas 13
1.5.1. Influencia del núcleo sobre las propiedades de la cápsula 14
1.5.1.1. Núcleos orgánicos compuestos de polímeros
degradables 15
1.5.1.2. Núcleos que pueden ser disueltos a nivel de moléculas
de bajo peso molecular y iones 17
1.5.1.3. Núcleos que se disuelven por una oxidación fuerte 17
1.5.2. Determinación de la permeabilidad de las cápsulas 19
2. Hipótesis 21
3. Objetivo general 21
3.1. Objetivos particulares 21
4. Parte Experimental 22
4.1. Material y reactivos 22
4.1.1. Microorganismo 22
4.1.2. Reactivos 22
4.2. Preparación de soluciones 23
4.2.1. NaC1 O.5M 23
4.2.2. iss 23
4.2.3. PAH 23
4.2.4. PDADMAC 23
4.3. Preparación de polielectrolitos marcados con Rodamina 23
4.4. Propagación de células de levadura Saccharomyces cerevisiae 24
4.4.1. Medio de cultivo 24
4.4.2. Preparación del preinóculo 25
4.4.3. Cinética de crecimiento de S. cerevisiae 25
4.4.4. Recuperación de la biomasa 26
4.5. Recubrimiento de células de levadura Saccharomyces cerevisiae 26
4.6. Crecimiento de células de Sacc/zarornyces cerevisiae cubiertas con
diferente número de capas de polielectrolito 27
4.7. Preparación de cápsulas usando como plantilla células de la
levadura Saccharomyces cerevisiae 28
4.8. Instrumental 28
S. Resultados y Discusiones 32
5.1. Obtención de células de levadura Saccharomyces cerevisiae 32
5.1.1. Propagación de células de Saccharomyces cerevisiae 32
5.1.2. Recubrimiento polimérico de células de S. cerevisiae 33
5.1.3. Efecto del recubrimiento polimérico preparado con diferente
número de capas sobre el crecimiento de S. cerevisiae 37
5.1.4. Fabricación de cápsulas 41
6. Conclusiones 51
7. Trabajo a futuro 52
Referencias 53
ÍNDICE DE FIGURAS
Página
Figura 1. Algunas estructuras químicas de polielectrolitos. 2
Figura 2. Procedimiento de ensamblaje de multicapas en superficies
planas. 5
Figura 3. Procedimiento de ensamblaje de polielectrolitos por LBL sobre
partículas coloidales. 7
Figura 4. Ejemplo de una medición de potencial zeta de una deposición
de varios polielectrolitos: LII PDADMAC-PSS, • BSA-
PDADMAC, O PSS-PAH, A DNA- PDADMAC. 7
Figura S. Mecanismo de reproducción de la levadura por gemación. 10
Figura 6. Modelo de la estructura de una célula de levadura. 11
Figura 7. Micrografía obtenida por SEM de un cultivo de Saccharoniyces
cerevisiae. 12
Figura 8. Micrografia obtenida por microscopia confocal de la disolución
• de un núcleo de melamina. 16
Figura 9. Esquema de posibles reacciones de PAH y PSS durante el
• tratamiento con NaOC1. 18
Figura 10. a) Microscopia confocal (transmisión) de cápsulas fabricadas a
partir de discositos; b) Imagen TEM de cápsulas fabricadas con
• equinocitos. 19
* Figura 11. Cinética de crecimiento de S. cerevisiae en medio YM. 33
Figura 12. Micrografías de microscopia laser confocal de células de S.
cerevisiae recubiertas con 15 capas de PSS/PAH con una
penultima capa de PAH-rodamina: a) micrografía en modo de
fluorescencia y b) micrografía en modo de reflexión. 34
Figura 13. Micrografía de microscopia laser confocal en el modo de
fluorescencia de una sola célula de S. cerevisiae cubierta con 15
capas de PSS/PAH con una penúltima capa de PAH-
rodamina. 35
Figura 14. Micrografía TEM del recubrimiento de una célula de levadura
con 15 capas de polielectrolito PSS/PDADMAC. 36
Figura 15. Cinética de crecimiento para levaduras cubiertas con 10 capas
de polielectrolito: a) células sin recubrimiento, b) células
recubiertas con el sistema PSS/PAH y c) células recubiertas
con el sistema PSS/PDADMAC. 38
Figura 16. Cinética de crecimiento para levaduras cubiertas con 15 capas
de polielectrolito: a) células sin recubrimiento, b) células
recubiertas con el sistema PSS/PAH y c) células recubiertas
con el sistema PSS/PDADMAC. 39
Figura 17. Micrografía TEM de una cápsula recubierta con 15 capas de
polielectrolito utilizando como plantilla una célula de
levadura. 42
Figura 18. Micrografías SEM de la superficie de una cápsula de 5 capas de
polielectrolitos. a) 35 740 aumentos y b) 176 600 aumentos. 44
Figura 19. Espectro de FTIR de: a) PSS sin tratar y b) PSS tratado con
agente oxidante. 46
Figura 20. Espectro de FTIR de: a) PAH sin tratar y b) PAH tratado con
agente oxidante. 48
Figura 21. Espectro de FTIR de: a) PDADMAC sin tratar y b) tratado con
agente oxidante. 50
ÍNDICE DE TABLAS
Página
Tabla 1. Características de algunos polielectrolitos utilizados para
encapsulación celular. 3
Tabla 2. Componentes del medio de cultivo YM y sus cantidades en
g/L. 25
Tabla 3. Condiciones de fabricación de los sistemas PSS/PAH y
PSS/PDADMAC. 26
Resumen
En esta tésis se ha procedido a recubrir levaduras del género Saccharoniyces
cerevisiae con multicapas de polielectrolitos del tipo "capa a capa", fabricadas por
deposición alternada de polielectrolitos de carga positiva y polielectrolitos de carga
negativa. Como policationes se utilizaron PAH (Poli(hidrocloruro de (alil amina))
y PDADMAC (Poli(cloruro de dialil, dimetil amonio)) mientras que el P55 (Poli 4-
estireno sulfonado de sodio) fue utilizado como polianión.
El recubrimiento de polielectrolitos sobre las células se fabricó con espesor
variable utilizando 5, 10 y 15 capas de carga alternada. Se caracterizó la integridad
del recubrimiento de la pared celular por medio de microscopia electrónica y de
microscopia confocal utilizando polímeros marcados. Para comprobar que las
levaduras mantenían sus funciones fisiológicas a pesar de haber sido modificada
con la multicapa de polielectrolitos, se realizaron experimentos de cinética de
crecimiento en medio de cultivo YM. El crecimiento celular se registró por medio
de medidas de turbidimetría. Este tipo de experimentos se realizó tanto para
células recubiertas de PSS/PAH como para recubiertas con PSS/PDADMAC para
los espesores de 10 y 15 capas. Se observó que en el caso de PSS/PAH el
crecimiento mostraba un retrazo mayor (4 horas) que en el caso de
PSS/PDADMAC y que en ambos casos al pasar de 10 a 15 capas se incrementan
los tiempos de crecimiento pero no se observaron mayores diferencias al aumentar
de 10 a 15 capas.
Las células recubiertas fueron utilizadas como plantilla para la fabricación
de cápsulas. Después de proceder al recubrimiento con la película de
polielectrolitos se oxidó a las células con NaOC1. Se estudió también la integridad
de las cápsulas fabricadas y su morfología por medio de TEM y SEM. Así como, el
efecto del NaOCl en la estructura química de los polielectrolitos que forman la
película a través de experimentos de IR.
u
Mónica Aimeé Ceniceros Reyes Antecedentes
1. Introducción
1.1. Nanofabricación
La combinación de elementos de materia blanda (soft matter) como
polímeros, surfactantes, cristales líquidos, etc. y moléculas de origen biológico en
la nano y micro fabricación es sin duda una de las direcciones más prometedoras
en la moderna ciencia de materiales, dirección que aún no ha sido explorada en
profundidad. La combinación de macromoléculas sintéticas con proteínas, lípidos
y ácido desoxirribonucleico (ADN) abre muchas posibilidades en la fabricación de
nuevos materiales y dispositivos inteligentes, los cuales se beneficiarían de la
especificidad y selectividad de las biomoléculas y de las propiedades físicas de los
polímeros sintéticos, como por ejemplo la conductividad, la resistencia mecánica
[1], elasticidad y las propiedades eléctricas y ópticas [2].
En los últimos años se han desarrollado diferentes técnicas de nano
fabricación empleando polímeros. Estas técnicas han permitido la fabricación de
superficies poliméricas con estructura a nivel nanométrico, buscando de esta
manera lograr topologías superficiales definidas, o adquirir la capacidad de
responder a estímulos externos tales como el pH, la concentración iónica, la
temperatura, o de cambiar el carácter hidrofóbico o hidrofílico, etc.
Una aplicación muy interesante de la nanofabricación es el diseño de
dispositivos para la liberación controlada de fármacos [3, 4, 51 que pueden reducir
la toxicidad sistémica, así como también para proteger a las moléculas que son
vulnerables a la degradación en el tracto digestivo entre otras [6].
En este trabajo se consideró la aplicación de la técnica de deposición de
polielectrolitos "capa a capa" para el recubrimiento de células de levadura para su
aplicación potencial como sistemas de liberación controlada.
1
Mónica Aimeé Ceniceros Reyes Antecedentes
1.2. Polielectrolitos
Los polielectrolitos (FE) son polímeros formados por monómeros
ionizables, que en solución acuosa se disocian resultando en una cadena
polimérica con múltiples cargas y sus respectivos contraiones. Algunos ejemplos
de polielectrolitos se esquematizan en la figura 1.
cI.1-clI2-
S O3N a
CF L
iI2 C
COOH
Ácido Desoxirribonucleico (ADN
Poli 4-estireno sulfonado de sodio (PSS) Poli (ácido metacrilico)
(PMA)
Figura 1. Algunas estructuras químicas de polielectrolitos.
Cuando las soluciones de dos polf meros de carga opuesta se mezclan, éstas
se unen por medio de interacciones electrostáticas, dando lugar a un sólido, al
compensarse las cargas, que muchas veces precipita ante la falta de estabilidad
coloidal.
Los polielectrolitos se clasifican en débiles (PED) y fuertes (PEF) [7]. Un
polielectrolito fuerte es aquel que disocia completamente en una solución acuosa y
presenta constantes de disociación cercanas a 1 y a su vez ésta no se ve afectada
por el pH de la solución. Un polielectrolito débil, por el contrario, es aquel que
tiene una constante de disociación en el intervalo de 2 a 10. Estos polielectrolitos
no están completamente cargados en solución pero su carga puede ser modificada
2
Mónica Aimeé Ceniceros Reyes Antecedentes
variando el pH de la solución. La tabla 1 muestra algunos polielectrolitos y su
clasificación, como PED o PEF [8].
Tabla 1. Características de algunos polielectrolitos utilizados para encapsulación celular.
Sistema Características
Alginato Poli anión fuerte
- Carragenina Poli anión fuerte
PSS (Poli(estireno sulfonado)) Polielectrolito fuerte
Carboxymetil celulosa Poli anión
Sulfato celulosa Poli anión
Heparina Poli anión
Poli(metilen-co-guanidina) Poli anión PDADMAC(Poli(cloruro de dialil * . Po catión fuerte Poli -
dimetil amionio)) Quitosan Poli catión débil
PLL (Poli(L-Lisina)) pKa de amina primaria 6.3-6.8
• poli catión débil PAH (Hidrocloruro de Poli(alil pKa de amina primaria -40.5
amina)) poli catión débil * Hidrocloruro de poli(vinil amina) pKa grupo amina -8.5
Los PE tienen diversas y variadas aplicaciones tecnológicas. Se han utilizado
- para estabilizar suspensiones coloidales o iniciar la floculación (precipitación),
también para otorgar carga a la superficie de partículas neutras, en tratamientos
de aguas y recuperación de aceites, y en otros casos se han incorporado en la
preparación de jabones, shampoo y cosméticos [7].
Entre algunos ejemplos de PEs utilizados en productos alimenticios
podemos citar la pectina, la carragenina, los alginatos, la polivinil pirrolidona y la
carboximetil celulosa.
3
Mónica Aimeé Ceniceros Reyes Antecedentes
Con el avance de las nuevas técnicas en nanotecnología los PE se han estado
utilizando en la fabricación de diferentes nanoestructuras y una de ellas es el
autoensamblaje mediante la técnica de "capa a capa".
1.3. Técnica capa a capa
Recientemente se ha desarrollado un nuevo concepto de nanofabricación a
partir del ensamblado de multicapas de polielectrolitos [9], utilizando la llamada
técnica "capa a capa" del ingles Layer by Layer (LbL).
La técnica LbL fue introducida por Decher y col. [10] para ser utilizada en
superficies planas. Esta técnica consiste en la deposición alternada de
polielectrolitos de carga opuesta sobre una superficie cargada y desde el punto de
vista experimental es extremadamente sencilla. La técnica consiste en sumergir
alternadamente un sustrato cargado en soluciones de polielectrolitos con carga
opuesta. El proceso se inicia con una solución de carga diferente a la de la
superficie cargada que interactúa por atracción electrostática a su vez favorecida
por el proceso entrópico ocasionado por la liberación de contraiones. Durante el
proceso, la superficie del substrato adquiere la carga del polímero que se ha
depositado. Para eliminar el polímero en exceso, la superficie se lava con agua
después de cada deposición. Posteriormente el sustrato se vuelve a sumergir en
otra solución de polielectrolito pero ahora con carga opuesta al depositado sobre la
superficie. Este proceso se repite las veces necesarias hasta obtener una película de
espesor requerido (Figura 2).
Mónica Aimeé Ceniceros Reyes Antecedentes
Ni Figura. 2. Procedimiento de ensamblaje de multicapas en superficies planas.
Por lo general, el espesor de una capa de polielectrolito en una película LBL
varía de uno a dos nanómetros y depende de las condiciones experimentales al
hacer la deposición, especialmente de la concentración salina de la solución de
polielectrolito, la cual va a definir la conformación con la que el polímero se
depositará en la superficie. Cuanto más baja sea la concentración de sal el
polímero estará más extendido y más delgada resultará la película. En general el
espesor de las películas fabricadas no sobrepasa los 15-20 nm aunque en principio
no hay un límite definido en el número de capas que se pueden depositar.
Además de los polielectrolitos es posible depositar otras especies cargadas tales
como nanopartículas, pellets de arcilla, células, lípidos, etc., incrementándose de
esta manera la complejidad y funcionalidad de la multicapa [10].
La composición de la multicapa puede ser variada con precisión a nivel
nanométrico y la composición en el interior de la multicapa no depende de la
composición en la capa más externa.
5
Mónica Aimeé Ceniceros Reyes Antecedentes
El par de polielectrolitos (policatión/polianión) más utilizado en la
fabricación de multicapas es sin duda el formado por poliestireno sulfonado de
sodio (PSS) que es un polianión fuerte y de alta estabilidad, y por poli(hidrocloruro
de alilamina) (PAH) [11, 12], un policatión relativamente débil. Es importante
mencionar que este polielectrolito esta completamente cargado en un rango de pH
de 2.5 a 4.5 [13]. Este par de polielectrolitos ha sido utilizado tanto en superficies
planas como coloidales [10]. Además forman multicapas muy estables en diversos
entornos químicos.
El poli(cloruro de dialil, dimetilamonio) (PDADMAC), constituye el
segundo polielectrolito más usado en multicapas LBL. A diferencia del PAH, éste
es un polielectrolito fuerte, completamente disociado y se puede depositar como
estructuras globulares [14].
La técnica de capa a capa ha sido extendida al plano coloidal por Donath y
Sukhorukov [1] donde ha servido para funcionalizar partículas coloidales
otorgándoles propiedades ópticas, magnéticas o una actividad biológica definida
[15, 161. El principio para el recubrimiento de partículas coloidales es el mismo
que para las superficies planas. La interacción electrostática entre los
polielectrolitos y en este caso la superficie del coloide debe estar totalmente
cubierto con un mismo tipo de carga, ya que si esto no ocurre algunas partículas
podrían tener cargas diferentes y el sistema floculará. En general este problema se
evita utilizando un exceso de polielectrolito en cada deposición. También se debe
mencionar que a diferencia de las superficies planas el lavado del polielectrolito en
exceso se realiza a través de centrifugación o diálisis [1] (Fig. 3).
no
Mónica Airneé Ceniceros Reyes Antecedentes
Figura 3. Procedimiento de ensamblado de polielectrolitos por LBL sobre partículas coloidales.
La deposición de polielectrolitos sobre coloides puede ser estudiada a través
de la determinación del cambio en el potencial zeta. Cada vez que se deposite una
capa de polielectrolito se va a inducir el cambio de la carga de los coloides, la cual
podrá ser apreciada por los cambios en el signo del potencial zeta (Figura 4).
También es posible cuantificar la deposición de polielectrolitos a través de la
técnica de dispersión de luz ya que a medida que aumenta el número de capas de
polielectrolitos, aumenta el tamaño del coloide y con ello la cantidad de luz
dispersada.
u pe
o
0 2 4 6 8 Número de capas
Figura 4. Ejemplo de una medición de potencial zeta de una deposición de varios polielectrolitos: PDADMACPSS. BSA-PDADMAC, PSS-PAH, DNA- PDADMAC.
7
Mónica Aimeé Ceniceros Reyes Antecedentes
Otra técnica para estudiar el proceso de ensamblaje de polielectrolitos es a
través de citometría de flujo. Con esta técnica se determina en paralelo la
dispersión de luz y la intensidad de fluorescencia a nivel de cada partícula
individual en una dispersión coloidal o de células. El ensamblaje de
polielectrolitos sobre coloides se ha cuantificado empleando polímeros marcados
con fluoróforos. La intensidad de la fluorescencia aumentará proporcionalmente al
número de capas marcadas que se depositen. Las mediciones de dispersión de luz
- en paralelo permiten discriminar entre coloides individuales y agregados.
De entre las partículas coloidales que han sido cubiertas con polielectrolitos
empleando la técnica LbL se pueden citar: eritrocitos [4, 11, 171, plaquetas, látex de
melamina [18], levaduras [5], virus, cristales orgánicos e inorgánicos [19]. El
desarrollo y fabricación de partículas coloidales cuyas superficies presenten
funcionalidades definidas con control en escala nanométrica ha ganado notable
interés en diferentes áreas del conocimiento tales como la biotecnología, la
medicina y ecología, entre otras [20].
1.4. Células utilizadas como plantillas
El uso de células como soporte para el ensamblado de multicapas LbL se
debe fundamentalmente al interés en fabricar cápsulas a partir de ellas, como se
explicará en la próxima sección. Recientemente se ha demostrado que es posible
- recubrir células de levadura [4, 5, 21] con filmes LbL sin destruir la pared celular,
es decir, la membrana ensamblada es biocompatible y carece de toxicidad respecto
a la actividad celular [5]. La célula en un medio de condiciones adecuadas es capaz
de reproducirse aún estando cubierta por la membrana polimérica [5].
Este descubrimiento sugiere una nueva manera de funcionalizar la
superficie celular ofreciendo así mismo la posibilidad de controlar el intercambio
Mónica Aimeé Ceniceros Reyes Antecedentes
de las células con su medio a través de una pared artificial. Una membrana
polimérica a través de la cual se pudiera controlar la permeabilidad celular sería de
gran utilidad en el diseño de dispositivos para la liberación controlada [5]. El
diseño de una membrana polimérica con estas características representa un
verdadero reto ya que la estabilidad y propiedades ajustables de la cubierta celular
tienen que preservarse así como la difusión de nutrientes a través de la pared de la
cápsula.
- Otra de las ventajas que ofrece el uso de levaduras y bacterias como
soportes para multicapas es que, también podrían ser utilizadas para fabricar
cápsulas tal como se ha hecho con eritrocitos, sin embargo en el caso del uso de
levaduras no se requiere una funcionalización previa tal como ocurre con
eritrocitos, dada la resistencia de la pared celular de las levaduras. Además, las
levaduras constituyen una fuente económica de partículas coloidales en relación
con los eritrocitos o las partículas de látex.
1.4.1. Características principales de Saccharomyces cerevisiae
Levadura es un nombre genérico que agrupa a una gran variedad de hongos
unicelulares, incluyendo tanto a especies patógenas para plantas y animales, como
a especies no solamente inocuas sino de gran utilidad [22].
Dentro del género Saccharoniyces, la especie cerevisiae es el microorganismo
más estudiado. Se le conoce también como levadura de panificación. Este
microorganismo es ideal para estudios biológicos y genómicos, además ha
resultado ser una herramienta poderosa para la comprensión de los genes de
organismos eucariotes superiores, como el humano [23].
Mónica Aimcé Ceniceros Reyes Antecedentes
Las células de levadura pueden tener forma esférica, elíptica y/o cilíndrica.
El diámetro de Saccliaromyce cerevisine oscila de 2 a 8 micras, con una longitud entre
3 a 15 micras.
- Las levaduras se multiplican en forma característica por gemación. En este
proceso aparece en la pared celular una pequeña prominencia que poco a poco
aumenta de tamaño (Figura 5) resultando luego en una célula hija. Los
citoplasmas de las células madre e hija continúan unidos durante cierto tiempo, al
cerrarse la conexión entre las dos células se forma una pared transversal doble, en
ese momento las dos células son fisiológicamente independientes y pueden
separarse. En el sitio de separación aparece una cicatriz.
Figura 5. Mecanismo de reproducción de la levadura por gemación.
La pared celular es una estructura rígida, la cual provee a la célula de
protección, define la forma de la célula y modula la entrada selectiva de
macromoléculas; sin esta barrera la célula estaría desprotegida ante cambios en el
medio y ocurriría lisis celular debido a las diferencias osmóticas con el medio que
la rodea [24].
La pared celular de Sacc/iaroiuyces cerevisiae, así corno la de otras levaduras
(por ejemplo Candida alhicans) constituye aproximadamente el 30% de peso seco de
10
Mónica Airneé Ceniceros Reyes Antecedentes
la célula. Consiste básicamente de 3 elementos: -glucano, quitina y mananos, los
cuales están interconectados. En la figura 6 se describe su distribución.
El 1,3-13-glucano, el principal y más abundante polisacárido estructural, es
responsable de la forma y rigidez de la envoltura celular. Además forma la red
donde las manoproteínas (mananos) están ancladas. Esta proteína constituye uno
de los principales componentes celulares.
La quitina se presenta en pequeñas cantidades en células vegetativas y está
restringida casi enteramente al anillo que encierra la barrera en células germinando
o en la cicatriz en la célula madre [24].
MnTnos 0-0
-glucano
Quitina -glucano
Membrana Plasmática
Quitina
Figura. 6. Modelo de la estructura de una célula de levadura.
Las levaduras necesitan los mismos elementos químicos que otras formas de
vida: carbono, hidrógeno, oxígeno, nitrógeno, fósforo, potasio, azufre, magnesio,
11
Mónica Airneé Ceniceros Reyes Antecedentes
hierro, zinc, manganeso, cobre y molibdeno. Crecen en límites amplios de pH,
muchas especies se multiplican en soluciones cuyo pH va desde 3 hasta 7.5.
En cuanto a la temperatura, las levaduras no presentan crecimiento celular a
temperaturas cercanas a la de congelamiento, ni tampoco a temperaturas
superiores a 470 C.
Saccitaromyces cerevisiae es una especie modelo, este organismo ha sido parte
de la biotecnología desde los comienzos de la historia ya que es el microorganismo
utilizado en la elaboración del pan, el vino y la cerveza entre otros [23]. De hecho,
las levaduras constituyen el grupo de microorganismos más íntimamente asociado
al progreso y bienestar de la humanidad (Figura 7).
Figura 7. Micrografía obtenida por SEM de un cultivo de SaccIiaroínices ceret'isiüe.
12
Mónica Aimeé Ceniceros Reyes Antecedentes
1.5. Fabricación de cápsulas
Por una cápsula entendemos a una película delgada de polímero cerrada en
si misma y hueca. Es posible fabricar cápsulas de polielectrolitos a partir de
coloides modificados con multicapas LbL, si el coloide utilizado como soporte es
destruido después de la deposición de la multicapa [11, 251. No todo coloide
puede ser utilizado para la fabricación de cápsulas; como se mencionó debe ser
posible destruirlo química o físicamente, como la melamina y los eritrocitos [4, 16,
17, 261. Además la multicapa polimérica aunque resulte químicamente modificada
después de la disolución del coloide su base debe preservarse. Las partículas de
melamina y los eritrocitos constituyen los coloides más utilizados en la fabricación
- de cápsulas aunque pueden utilizarse otras partículas (ejemplo; oxido de silicio,
carbonato de calcio). Cuando se utiliza células biológicas es necesario destruir
- toda la célula para formar la cápsula y para ello se requiere de un tratamiento de
oxidación fuerte con una solución de hipoclorito de sodio que va a oxidar los
componentes celulares [17, 271. Los productos de bajo peso molecular resultantes
de la descomposición celular difunden fuera de la cápsula [28]. Por otro lado al
utilizar partículas de melamina-formaldehído (MF) estas pueden ser eliminadas
del interior de la cápsula a pH <1.6. La degradación del coloide de melamina se
lleva a cabo por hidrólisis, originando los respectivos oligómeros que se liberan a
través de las paredes de la membrana[11].
El tamaño de una cápsula de polielectrolito fabricada de la manera antes
descrita varía entre 0.1 y 10 ptm, y está definido por el tamaño de la plantilla. El
espesor de la cápsula por otra parte dependerá del número de capas de
polielectrolito ensambladas [18].
Una característica muy importante de las cápsulas, es la posibilidad de
controlar a nivel nanométrico propiedades de la pared polimérica tales como el
13
Mónica Aimeé Ceniceros Reyes Antecedentes
espesor, la compatibilidad, la elasticidad y la estabilidad [29]. La aplicación más
probable de este tipo de sistemas se encuentra en la liberación controlada de
medicamentos para la cual es deseable que el sistema sea altamente biocompatible
[9].
Las propiedades físicas y químicas de las cápsulas pueden ser manipuladas
variando los polímeros usados e incorporando otros materiales en la estructura de
la capa incluyendo nanopartículas, lípidos y otras moléculas biológicas [6]. Una de
las propiedades más importantes de estas microcapsulas es la permeabilidad
selectiva que presentan para moléculas de diferente tamaño. La permeabilidad de
una cápsula va a depender de varios parámetros como el espesor de la capa,
porosidad, la estructura y composición química de las multicapas, así como del pH
[2].
La posibilidad de modificar y controlar la permeabilidad de una cápsula es
de gran importancia para muchas aplicaciones por ejemplo en medicina [8];
biotecnología, cosméticos, nutrición, donde la encapsulación selectiva y liberación
de sustancias sea requerida [30].
1.5.1. Influencia del núcleo sobre las propiedades de la cápsula
Muchas de las propiedades de la pared (espesor, permeabilidad,
homogeneidad, etc.) dependen del mecanismo de degradación empleado para
destruir el coloide base y en definitiva del coloide que se ha usado como plantilla.
Por ejemplo, las cápsulas construidas sobre partículas de látex melamina-
formaldehído (MF) entrecruzadas parcialmente pueden contener residuos de MF
(oligómeros) que se adhieren a las paredes de la cápsula durante la disolución (la
melamina tiene carga positiva y se pega a una capa negativa). El proceso de
disolución de la melamina genera una fuerte presión osmótica desde el interior de
la cápsula que se está formando, el cual en muchos casos conduce a la ruptura de
14
Mónica Aimeé Ceniceros Reyes Antecedentes
la misma y va a determinar la presencia de poros en el material [31]. En el caso de
las cápsulas templadas a partir de eritrocitos se producirá una notable
modificación química como consecuencia del uso del agente oxidante que se utiliza
en la destrucción de la célula [17].
De acuerdo al mecanismo de disolución se dividen en: núcleos orgánicos
compuestos de polímeros degradables, núcleos que pueden ser disueltos a nivel de
moléculas de bajo peso molecular y iones, y núcleos que se disuelven por una
oxidación fuerte. A continuación se describen cada una de estas principales clases.
1.5.1.1. Núcleos orgánicos compuestos de polímeros degradables
A esta clase corresponden los núcleos ampliamente estudiados de
melamina-formaldehído (MF) que se disuelven a bajo pH y en algunos solventes
orgánicos; los núcleos de poliestireno (PS) solubles en tetrahidrofurano (THF) y
ácido poliláctico/ácido poliláctico-co-glicólico (PLA/PLGA) soluble en una mezcla
de acetona/ N-metil-2-pirrolidinona.
Los núcleos de polímeros degradables poseen en general una buena
monodispersidad (con excepción de PLA/PLGA) y resultan de procesos de síntesis
bien establecidos. La desventaja de este tipo de sistemas es la adherencia del
material del núcleo a la pared de la cápsula durante la disolución ya que estos
núcleos están cargados. Los oligómeros cargados formados durante la
degradación pueden unirse fácilmente con la multicapa de polielectrolito, siendo
su eliminación en muchos casos imposible. El núcleo más estudiado de esta clase
son los coloides de melamina-formaldehído ligeramente polimerizado.
Los monómeros de melamina se encuentran unidos por grupos metileno y
éter. El grupo éter es hidrolizable a bajo pH, propiedad que se utiliza para
15
Mónica Aimeé Ceniceros Reyes Antecedentes
degradar estos coloides, normalmente dispersándolos en una solución de HCI a
pH 1 (Figura 8) [311.
Los oligórneros de melamina que se generan durante la disolución difunden
progresivamente fuera de la cápsula. Sin embargo, la eliminación de los
oligómeros del interior de la cápsula ocurre a una velocidad diferente,
normalmente menor, que la del proceso de disolución en sí. Esto genera una
tensión osmótica desde el interior de la cápsula, la cual puede causar la ruptura de
la membrana polimérica. Se ha observado por esta razón que es conveniente
fabricar cápsulas cuyo espesor varíe entre 8 y 10 capas de polielectrolitos [31, 321.
Cápsulas de menor espesor se rompen fácilmente ante la presión ejercida por los
oligómeros de melamina durante la disolución, mientras que en el caso de cápsulas
con paredes de espesor superior a las 10 capas, la liberación de los residuos de
melamina procede tan lentamente que se genera una alta presión dentro de la
cápsula por acumulación de oligómeros, que resulta finalmente en la destrucción
de la pared.
Figura S. Micrografía obtenida por microscopia confocal de la disolución de UJi núcleo de
melamina.
16
Mónica Aimeé Ceniceros Reyes Antecedentes
1.5.1.2. Núcleos que pueden ser disueltos a nivel de moléculas de bajo peso
molecular y iones
Estos pueden ser tanto cristales iónicos o moleculares solubles en
condiciones ácidas o básicas o en un solvente orgánico. Como ejemplos de este
tipo de plantillas podemos citar, diferentes partículas inorgánicas de carbonato
(CaCO3, CdCO3 y MnCO3) [31, 331 y partículas de silicio (Si02) [34]. Para destruir
las partículas de MnCO3 se ha utilizado una solución de ácido cítrico 0.2M en O.1M
de HC1; las partículas de CaCO3 pueden ser disueltas usando una solución de
EDTA a pH 7 [35].
La ventaja principal de tales partículas es la ausencia de tensión osmótica
después de la dilución y completa eliminación del núcleo.
1.5.1.3. Núcleos que se disuelven por una oxidación fuerte
*
Una célula es un ejemplo típico de este tipo de núcleos. El ensamblaje de
polielectrolitos puede ser llevado a cabo usando como plantillas células de
eritrocitos previamente fijadas [4, 18, 271. Para fijar las células se utiliza
glutaraldehído que actúa como agente entrecruzante en las proteínas del
citoplasma. Se busca de esta manera evitar que los polielectrolitos que se
depositan causen la ruptura de la membrana celular. La eliminación de estos
núcleos se lleva a cabo mediante oxidación con una solución de hipoclorito de
sodio, NaOC1 (lejía).
El interior de los eritrocitos, compuesto fundamentalmente por
hemoglobina, es oxidado y degradado a oligopéptidos y aminoácidos, las cuales
son liberadas a través de la membrana polimérica resultando así una cápsula
hueca. La oxidación con NaOC1 cambia además dramáticamente la composición
química de la cápsula [4]. Las cargas positivas de los grupos amino en el PAH se
17
PAH
Mónica Aimeé Ceniceros Reyes Antecedentes
pierden durante la oxidación dando lugar a grupos carboxilatos, nitrilos, aldehídos
y ciano. El PSS es parcialmente liberado o depolimerizado. El resultado final de
estas reacciones es una estructura polimérica con cargas negativas [17]. Se asume
que las capas, después de la disolución del núcleo se estabilizan mediante
entrecruzamiento y no a través de interacciones electrostáticas como en las
multicapas LbL iniciales [11, 41. La figura 9 esquematiza las posibles reacciones del
PAH y el PSS durante el tratamiento con hipoclorito de sodio. Los eritrocitos como
coloides de base representan un sistema altamente monodisperso y muy
económico para la producción de cápsulas.
NH2
Entrecruzamiento o Aldehído
Azometino
It-, n OH
Ac. Carboxílico
Ion
NH
NO Entrecruzamiento N —N omp. Nitroso
Azo compuesto
NH2
It-,
n
-~n I>
2 Entrecruzamient_N
Nitro-compuesto O Comp. Azoxy
CN Nitrilo
Yn
-lt,
t, l~~
S03 Na SO3 Na
PSS Ruptura, cadenas más pequeñas de PSS
Figura 9. Esquema de posibles reacciones de PAH y PSS durante el tratamiento con NaOC1.
Mónica Aimeé Ceniceros Reyes Antecedentes
Las cápsulas fabricadas a partir de eritrocitos se caracterizan por una alta
estabilidad química y mecánica, y la ausencia de cargas positivas podría ser
utilizada para una adsorción selectiva de cationes [4] (Figura 10).
a) b)
j.. / -J
1
. . . -,,
-.
•• • -•
O/iç •
Fig. 10. a) Microscopia confocal (transmisión) de cápsulas fabricadas a partir de discocitos; b)
Imagen TEM de cápsulas fabricadas cori equinocitos.
1.5.2 Determinación de la permeabilidad de las cápsulas
-
La permeabilidad de los distintos tipos de cápsulas ha sido estudiada en
extenso con microscopia confocal. La microscopia confocal permite hacer estudios
-
de permeabilidad a nivel de una cápsula individual. En un experimento típico, se
suspenden cápsulas en una solución de un fluoróforo o una macromolécula
marcada con un fluoróforo. Posteriormente se dejan incubar y finalmente se
observan en el microscopio confocal. Si las moléculas fluorescentes no difunden
hacia su interior a través de las paredes de la membrana, el interior de la cápsula se
observa oscuro, en tanto que la solución exterior fluoresce. Si la molécula
fluorescente logra atravesar la pared de la membrana, el interior fluorescerá
también. En este caso es posible realizar un experimento de "bleaching"
Mónica Aimeé Ceniceros Reyes Antecedentes
(blanqueo), en el que por aplicación de un pulso intenso del láser durante algunos
segundos en el interior de la cápsula provoca la oxidación de las moléculas
fluorescentes perdiendo su capacidad de fluorecer. Posteriormente estas
moléculas del interior de la cápsula se intercambian con las moléculas marcadas
que están en el exterior, restableciéndose la fluorescencia en el interior de la
cápsula. Se ha encontrado que las paredes de las cápsulas muestran permeabilidad
para pequeñas moléculas. La permeabilidad de las cápsulas para las
macromoléculas puede aumentar considerablemente en presencia de NaC1 [18, 361.
También se ha encontrado que las corazas multicapas de polielectrolito pueden
pasar de un estado abierto (permeable) a otro cerrado (impermeable) ajustando el
pH. Esto se atribuye a la variación de la carga superficial en la multicapa, que
modifica los defectos locales. Así por ejemplo a pH bajo las moléculas difundirán
con mayor facilidad hacia el interior de la cápsula y por el contrario a pH alto serán
excluidas.
En este trabajo se realizó un estudio del recubrimiento de la levadura
Saccharomyces cerevisiae utilizando la técnica de ensamblaje molecular "capa a
capa" con polielectrolitos. Además de la posterior fabricación de cápsulas
mediante la oxidación de la célula.
20
Mónica Aimeé Ceniceros Reyes Hipótesis y Objetivos
Hipótesis
Saccharomyces cerevisiae es un microorganismo que posee una pared celular
resistente que puede ser utilizada como plantilla para el recubrimiento con
polielectrolitos mediante la técnica "capa a capa" y para la obtención de cápsulas a
partir de estas estructuras sin que haya pérdida de la viabilidad celular.
Objetivo general
Utilizar células de Saccharoi'nyces cerevisiae como plantillas para el
recubrimiento y obtención de cápsulas con polielectrlitos mediante la técnica "capa
a capa".
3.1 Objetivos particulares
- a) Estudiar el efecto del número de capas de polielectrolito utilizadas en
el recubrimiento sobre el crecimiento de S. cerevisiae.
b) Realizar un estudio preliminar para caracterizar la morfología de las
cápsulas obtenidas mediante el recubrimiento de células de S.
cerevisiae con diferentes pares de polielectrolitos (PSS/PAH y
- PSS/PDADMAC).
c) Estudiar el efecto del agente oxidante sobre la química de los
polielectrolitos utilizados en la formación de cápsulas.
21
Mónica Aimeé Ceniceros Reyes Parte Experimental
4. Parte Experimental
4.1. Material y reactivos
4.1.1 Microorganismo
El microorganismo utilizado en el estudio fue la cepa de S. cerevisiae
comercial de la marca Dr. Oetker.
4.1.2. Reactivos
PSS (Poli 4-estireno sulfonado de sodio). FW= 206.2, Mw = 70 000, d =
0.801. ALDRICH
.- PAH (Poli(hidrocloruro de (alil amina)). Mw = —70 000. ALDRICH
PDADMAC (Poli(cloruro de dialil, dimetil amonio)), 20% peso en agua,
FW = 161.7, bp = ioo °C, mp = -2.8-0 °C, d = 1.04, Mw = lOO 000 - 200
000. ALDRICH.
Rodamina B Isotiocianato, mezcla de isómeros. Mw = 536.08 SIGMA
Extracto de Levadura. Extracto de células de levadura autolizada. REF
* 212750, LOT 3260842. Becton Dickinson.
Bacto Peptona. LOT 59673JB. DIFCO Laboratorios.
- Extracto de Malta. REF 218630, LOT 4026813. Becton Dickinson.
D-(+)-Glucosa. Pureza 99.5%, FW 180.2. SIGMA
)- Agar Nutritivo. REF 213400, LOT 4027499. SIGMA
> NaOC1 0.4% en agua. FW = 74.4, d = 1.097. SIGMA-ALDRICH
* > NaCl 99.0%, FW = 58.44, bp = 1.413 °C, mp =801 °C, d = 2.165. SIGMA
NaclO.5M
NaclO.1M
Solución Fisiológica (Naci 0.85% pH 3.5)
» Solución Fisiológica (NaCl 0.85%)
» PAH marcado con Rodamina
22
Mónica Aimeé Ceniceros Reyes Parte Experimental
4.2. Preparación de soluciones
4.2.1. NaC1 0.5M. Con un peso molecular de 58.5g/gmol
4.2.2. PSS. Peso molecular del PSS es de 206.2 g/mol.
CH-CH2
0 SO3Na
4.2.3. PAH. El peso molecular corresponde a 107.8 g/mol.
HC1 CH2NH2
CH2CH
4.2.4. PDADMAC. PDADMAC es de 161.7 g/mol
CI-
H3C CH3
4.3. Preparación de polielectrolitos marcados con rodamina
Para marcar PAH con rodamina se utilizó isotiocianato de rodamina [37]. El
isocianato forma con los grupos amina un enlace tiourea. Para que la mayoría de
las aminas del PAH se deprotonen (la reacción no procede si la amina está
cargada) se disolvió el polímero en una solución de NaOH de pH alto, por encima
de 11. La rodamina por su parte fue disuelta en DMSO; también puede usarse
DMF. En esta reacción es importante que la solución de rodamina se adicione
23
Mónica Aimeé Ceniceros Reyes Parte Experimental
lentamente para evitar que se precipite con el polímero diluido. La reacción se
lleva a cabo en un matraz bola envuelto con aluminio para que la luz no oxide la
rodamina. La rodamina que no reaccionó con el polímero fue separada de la
solución del polímero mezclando ésta con pentanol, butanol u octanol en un
embudo de separación. La rodamina es soluble en agua pero su solubilidad es
mucho mayor en cualquiera de los solventes orgánicos mencionados. Se
recomienda hacer esto porque la rodamina puede quedar unida al polímero por
atracción electrostática, y no se le puede eliminar completamente en los lavados.
El polielectrolito no es soluble en pentanol de manera que la fase orgánica
arrastrará las moléculas pequeñas.
Posteriormente la solución de polielectrolitos se sometió a un tratamiento de
diálisis durante 36 h renovando los volúmenes de agua cada 12 h. Transcurrido
este tiempo se volvió a lavar la solución de polímero con octanol en un embudo de
separación. El lavado se realizó dos veces y se esperó cada vez 24 h para que la
fase agua y octanol se separaran. La solución de polímero se congeló con
nitrógeno líquido y se liofilizó.
- 4.4. Propagación de células de levadura Saccharomyces cerevisiae
4.4.1. Medio de cultivo
Para la propagación de S. cerevisiae así como para el desarrollo de estudios
- de crecimiento con células cubiertas con polielectrolito, se utilizó como medio de
cultivo Caldo de levadura y extracto de malta (Medio YM). La composición base
en g/L se muestra en la tabla 2.
24
Mónica Aimeé Ceniceros Reyes Parte Experimental
Tabla 2. Componentes del medio de cultivo YM y sus cantidades en g/L.
Componente Cantidad g/L
Extracto de Levadura 3.0
Extracto de Malta 3.0
Peptona 5.0
Dextrosa 10.0
Agar nutritivo 20.0
4.4.2. Preparación del preinóculo
Para preparar el preinoculo, se suspendieron 10 mg de levadura panadera
(Saccharoniyces cerevisiae) en 10 mL de solución fisiológica. La suspensión celular se
vertió a un matraz erlenmeyer de 300 mL conteniendo 10 mL de caldo YM
previamente esterilizado. El preinoculo se incubó a 37 °C por espacio de 7 horas
en un agitador mecánico New Brunswick Scientific a 200 rpm. Al término de este
tiempo se hizo un conteo celular en una cámara de Neubauer para conocer la
concentración celular por mililitro de medio de cultivo.
4.4.3. Cinética de crecimiento de S. cerevisiae
Para el desarrollo del estudio cinético, se prepararon matraces erlenmeyer
de 500 mL, conteniendo 200 mL de caldo YM. Cada uno de los matraces
previamente esterilizados, se inocularon con la suspensión celular del preinóculo.
Se utilizó el volumen requerido de esta suspensión para inocular cada matraz con
2.4x106 células. Los matraces se colocaron en el incubador/ agitador mecánico y se
incubaron a 37° C con una velocidad de agitación de 200 rpm. La cinética de
crecimiento se monitoreo por espacio de 18-20 h, efectuando un muestreo cada
hora. Para cada una de las muestras se determinó el crecimiento microbiano por
medición de la turbidez en un espectrofotómetro de luz UV-vis. A partir del
25
Mónica Aimeé Ceniceros Reyes Parte Experimental
estudio cinético y de la obtención de la curva de crecimiento, se determinó la fase
de crecimiento y el tiempo requerido para la recuperación de las células y su
posterior tratamiento para recubrirlas con el polielectrolito aplicando la técnica de
"capa sobre capa".
4.4.4. Recuperación de la biomasa
Al término de la cinética, se recuperó la biomasa o paquete celular mediante
centrifugación. El contenido del cultivo de células en el matraz se yació en tubos
de 50 mL y se centrifugó a 18° C/10 mm /4000 rpm con el fin de separar las células
del caldo de cultivo, El paquete celular recibió un tratamiento de lavado (3 veces)
con una solución fisiológica de NaC1 al 0.85% p/v.
4.5. Recubrimiento de células de Saccharomyces cerevisiae
Una vez obtenidas las células fueron recubiertas con polielectrolitos
siguiendo la técnica "capa sobre capa". Se utilizaron dos partes de polication y
polianión para el recubrimiento como se muestra en la tabla 3.
Tabla 3. Condiciones de fabricación de los sistemas PSS/PAH y PSS/PDADMAC.
Susp. Muestra celular PE (-) PE (+) Solvente pH de la
solucion (mL)
A 0.5 PSS PAH Solucion 35
Fisiologica
B 0.5 PSS PDADMAC Solucion Neutro Fisiologica
El recubrimiento de las células se realizó en base al siguiente protocolo; 0.5
mL de una suspensión celular de levadura se transfirieron a tubos eppendorff de 2
mL. Esta suspensión celular se lavó con agua bidestilada. El paquete celular se
recuperó por centrifugación a 2000 rpm durante 10 min y a 4 oc utilizando una
centrifuga BECKMAN COULTER. El tratamiento de lavado se repitió varias veces
Mónica Aimeé Ceniceros Reyes Parte Experimental
a fin de retirar las sales de la solución fisiológica. Al paquete celular se le agregó 1
mL de la solución correspondiente de polielectrolito con carga negativa, P55,
manteniendo la suspensión en agitación constante durante 15 minutos. Al término
de este periodo de tiempo, se retiró el exceso de polielectrolito mediante
centrifugado. El sobrenadante se retiró decantado o usando una micropipeta. Las
células recubiertas con el polielectrolito se lavaron con solución fisiológica para
eliminar PSS libre en solución. En seguida se adicionó 1 mL de la solución de
polielectrolito positivo correspondiente (PAH o PDADMAC, continuando con el
proceso de recubrimiento "capa a capa"). Este procedimiento se repitió hasta
completar el número de capas requerido.
4.6. Estudio cinético de células de Saccharomjces cerevisiae cubiertas con
diferente número de capas de polielectrolito.
A partir de una suspensión de células previamente cubiertas con el
polielctrolito, utilizando los sistemas PSS/PAH y PSS/PDADMAC se realizó un
conteo del número de células en una cámara de recuento u hematocitómetro. En
base a este conteo, se tomó el volumen requerido para inocular 2.4x106 células en
matraces erlenmeyer conteniendo 200 mL de caldo de Extracto de Levadura-
Extracto de Malta (YM). Los estudios cinéticos se desarrollaron con células de
levadura sin recubrimiento y cubiertas con 5, 10 y 15 capas de polielectrolito. El
monitoreo del crecimiento celular se determinó mediante el registro del cambio de
la densidad óptica del cultivo a diferentes intervalos de tiempo durante el
transcurso del ciclo de incubación. Las mediciones de densidad óptica se
efectuaron tomando una alícuota de 3.5 mL del cultivo desde el inicio del cultivo y
posteriormente a intervalos de 1 hora. Las lecturas de absorbancia se registraron a
una longitud de onda de 575 nm utilizando un espectrofotómetro UV-visible,
Shimazdu UV2401PC.
27
Mónica Aimeé Ceniceros Reyes Parte Experimental
4.7. Preparación de cápsulas usando como plantilla células de la levadura
Saccharomyces cerevisiae.
Para la fabricación de las cápsulas se procedió a destruir las células de
levadura recubiertas con los polielectrolitos mediante el tratamiento con agente
oxidante (Hipoclorito de sodio al 4%). Para efectuar el tratamiento, se agregó en
un tipo eppendorff 0.2 mL de una suspensión de levaduras recubiertas, enseguida
se adicionó un volumen de hipoclorito de sodio y se mezcló. Posteriormente se
dejó que la reacción transcurriera por 20 minutos y en seguida se recuperaron las
células por centrifugación y se lavaron 3 veces con una solución de NaC1 0.1M y
finalmente con agua destilada para retirar totalmente el material celular oxidado.
4.8. Instrumental
-
Para caracterizar tanto células cubiertas como las cápsulas preparadas se
utilizaron las siguientes técnicas:
Microscopía Láser Confocal (CLSM)
Primeramente para entender el funcionamiento del microscopio láser
confocal es necesario mencionar que la fluorescencia es la propiedad de una
sustancia de emitir luz cuando son expuestas a radiaciones de tipo UV, rayos
catódicos o rayos X. Las moléculas absorben luz de alta energía (azul por ejemplo)
y son transformadas en luz visible, luz de diferente color (verde para este ejemplo)
[38, 391.
Mediante esta técnica se pueden estudiar diferentes tipos de material
(células, coloides, etc.) marcados con un agente fluorescentes y obteniendo
secciones ópticas de los mismos. En principio, la muestra se excita punto a punto
por medio de un láser. La longitud de onda de emisión de esa muestra es mayor a
Mónica Aimeé Ceniceros Reyes Parte Experimental
la de excitación, y es esta última la que al pasar por un pequeño diafragma
(pinhole) permite la detección de un sólo plano focal.
Para obtener las micrografías se utilizó un microscopio Leica Microsystems
Heidelberg GMBH equipado con un objetivo de aceite de inmersión 100x. El
tratamiento del material para su observación en el microscopio consistió en la
deposición de una gota de la suspensión de células cubiertas sobre un portaobjetos
y se fijó por secado. Las observaciones del material se efectuaron utilizando la
configuración para rodamina con una longitud de onda de excitación de 525 nm.
Microsco pía Electrónica de Transmisión (TEM)
La microscopía TEM es una técnica para la obtención de imágenes por
medio de la cual un haz de electrones es enfocado a un espécimen provocando
una versión incrementada a aparecer en una película fotográfica [40]. El TEM es
utilizado en ciencias de los materiales/metalurgia y ciencias biológicas. En ambos
casos los especimenes deben ser muy delgados y capaces de soportar el alto vacío
presente dentro del instrumento. Para especimenes biológicos, el máximo grosor
es aproximadamente 1 Itm. Mediante esta técnica se puede conocer la
ultraestructura de células y tejidos, tanto animales como vegetales. Cuando
además se aplican técnicas inmunocitoquímicas, es posible obtener información
acerca de la localización estructural de determinadas moléculas. Con materiales
inorgánicos se puede estudiar su morfología y realizar patrones de difracción de
rayos X. En este estudio, se utilizó un microscopio TEM JEOL 1200-EXII y para la
preparación del material se puso una gota de la suspensión celular recubierta con
polielectrolitos y una gota de la suspensión con cápsulas en una rejilla de Cu
metálico cubierta con una película de carbono.
29
Mónica Aimeé Ceniceros Reyes Parte Experimental
Espectroscopía Ultravioleta visible
Se utilizó también espectroscopía UV-vis para determinar el cambio en la
densidad óptica celular (turbidez en el medio de cultivo) donde las longitudes de
onda que se utilizan van de 750-200 nm. La concentración del analito en solución
puede ser determinada midiendo la absorbancia en alguna longitud de onda y
aplicando la Ley de Lambert-Beer. Esta ley solo sirve para variaciones
monocromáticas [41, 421. Para la realización de esta prueba se utilizó un
espectrofotómetro UV-vis marca SHIMAZDU a una longitud de onda de 575 nm.
Microsco pía Electrónica de Barrido (SEM)
La microscopía electrónica de barrido (SEM) es un tipo de microscopia
electrónica capaz de producir imágenes de alta resolución de la superficie de una
muestra, donde una muestra es barrida con un haz electrónico de sección
transversal pequeño y de alta energía, generando una imagen punto a punto.
Debido a la manera en la que la imagen es creada, las imágenes SEM tienen la
característica de apariencia tridimensional y son útiles para describir la superficie
de la muestra [43]. En este caso la muestra requiere un recubrimiento previo con
oro-paladio para una mejor conducción del haz electrónico y al mismo tiempo
evitar su degradación. El microscopio utilizado en este estudio fue un microscopio
TOPCON SM 510.
Espectroscopía de Infrarrojo (ETIR)
La espectroscopía de infrarrojo permite el estudio de la interacción de la
radiación electromagnética en el rango de 4000 hasta 400 cm 1 con la materia
(infrarrojo medio) [44]. Dependiendo de la región del espectro en la que se trabaje
y, por tanto de la energía de la radiación utilizada (caracterizada por su longitud o
número de onda), esta interacción será de diferente naturaleza. El infrarrojo medio
puede ser usado para estudiar las vibraciones fundamentales y la estructura
30
Mónica Aimeé Ceniceros Reyes Parte Experimental
rotacional y vibracional ya que, la molécula, al absorber la radiación infrarroja,
cambiará su estado de energía vibracional y rotacional. En el caso del estudio de
muestras sólidas y líquidas sólo se tienen en cuenta los cambios entre estados de
energía vibracional, lo que hace posible la caracterización de los principales grupos
funcionales de la estructura molecular de un compuesto. Para llevar a cabo este
análisis se utilizó un equipo Nicolet modelo GEMINI MAGNA 550C, se utilizó KBr
para hacer las pastillas con los polímeros PSS y PAH (puros y oxidados) y para el
PDADMAC se utilizó una pastilla de Fluoruro de Bario.
31
Mónica Aimeé Ceniceros Reyes Resultados y discusión
S. Resultados y Discusión
En este capitulo se presentan los resultados obtenidos en el estudio del
efecto del número de capas de los diferentes polielectrolitos utilizados en el
recubrimiento sobre el crecimiento de células de S. cerevisiae. También se describen
- los estudios que se realizaron sobre el tipo de morfología de las cápsulas obtenidas
mediante el recubrimiento y oxidación de las células de S. cerevisiae. Finalmente se
- muestran los resultados de la modificación de los polielectrolitos por efecto del
agente oxidante utilizado para la eliminación de la célula utilizada como plantilla.
El recubrimiento consistió de 0, 10 y 15 capas de polielectrolito con los
sistemas PSS/PAH y PSS/PDADMAC.
5.1. Obtención de células de levadura Saccharomyces cerevisiae
5.1.1. Propagación de células de Saccharomyces cerevisiae
La propagación celular de la levadura S. cerevisiae, se llevó a cabo a partir de
levadura comercial de la marca Dr. Oetker, en medio de cultivo de YM por un
espacio de 7 horas. Al término de este tiempo se tomó una muestra con una
concentración 2, 400 000 cel/mL, misma que se inoculó en 200 mL de medio de
cultivo. A partir de esta muestra se estudió la cinética de crecimiento de la
levadura en el medio YM utilizando glucosa como fuente de carbono y como
fuente de nitrógeno extracto de levadura y extracto de malta. El medio YM no
requiere de suplemento de sales minerales. La cinética de crecimiento se
monitoreo midiendo la turbidez de la solución celular en función del tiempo con
un equipo UV. Las medidas de turbidez se realizaron siempre a la misma longitud
de onda, de 575 nm. La curva de crecimiento se muestra en la figura 8, donde se
pueden apreciar las 3 fases de crecimiento: una primera fase de adaptación,
seguida por un crecimiento exponencial y finalmente la fase estacionaria. El valor
de crecimiento celular, en este caso densidad óptica, se incrementa paulatinamente
32
Mónica Aimeé Ceniceros Reyes Resultados y discusión
iniciando en cero. Este experimento sirve de base para estudiar el comportamiento
de las levaduras después de ser recubiertas con polielectrolitos.
Para la modificación superficial de las células con los polielectrolitos
mencionados previamente, se decidió utilizar las células en la mitad de la fase
exponencial, es decir, entre las 10 y 11 horas. En esta fase de crecimiento se
asegura que la población de células se encuentra en su máxima actividad
fisiológica y reproductiva.
3-
2.5 -
2
Ln
1.5-
£ 1
0.5
0. t 1
0 5 10 15 20 25
Tiempo (h)
Figura 11. Cmética de crecimiento de S. cerevisiae en medio YM.
5.1.2. Recubrimiento polimérico de células de S. cerevisiae.
En el recubrimiento de las células de S. cerevisiae se utilizaron los siguientes
pares de polielectrolitos: PSS (Poli 4-estireno sulfonado de sodio)/PAH
(poli(hidrocloruro de alilamina)) y PSS/PDADMAC (Poli(cloruro de dialil
dimetilamonio)). El recubrimiento se llevó a cabo mediante la técnica LBL descrita
33
Mónica Aimeé Ceniceros Reyes Resultados y discusión
dimetilamonio)). El recubrimiento se llevó a cabo mediante la técnica LBL descrita
en la sección 4.5 de la parte experimental. Una vez obtenido el recubrimiento de
las células, éstas se observaron utilizando microscopía confocal. Para determinar
la continuidad de la membrana polimérica sobre la superficie celular se utilizó el
polielectrolito PAH previamente marcado con rodamina.
En la figura 12a se muestra un estudio comparativo de las observaciones al
microscopio láser confocal donde se puede apreciar las imágenes obtenidas
- utilizando el modo de fluorescencia y reflexión de un grupo de células recubiertas
con 15 capas del par polielectrolito (PSS/PAH)I en donde la penúltima capa
ensamblada esta formada por PAH-rodamina. La figura 12a es la imagen
correspondiente al modo de fluorescencia en donde se muestra la continuidad del
perímetro de cada una de las células, indicando con esto que todas las paredes de
las células están uniformemente recubiertas con la membrana de los
polielectrolitos utilizados. Esta imagen fue obtenida realizando un barrido en un
sólo plano focal. En contraste en la figura 12b se muestra la imagen de las mismas
células en el modo de reflexión donde se aprecian las células completas (Fig. 12b).
a) b)
c
c tr.\
Figura 12. Micrografías de microscopia láser confocal de células de S. cL'rL'vIsI(iL' recubiertas con 15
capas de PSS/PAH con una penúltima capa de PAH-rodamina: a) micrografía en modo
de fluorescencia y b) micrografía en modo de reflexión.
34
Mónica Airneé Ceniceros Reyes Resultados y discusión
En la figura 13 se puede apreciar una micrografía de láser confocal de un
acercamiento de una célula de levadura. En esta imagen se muestra que la célula
se encuentra totalmente cubierta con la membrana polimérica ya que no se
aprecian zonas en donde la capa de polielectrolito PAH marcado con rodamina no
este presente. En la imagen de esta figura se aprecia una zona con mayor
intensidad de fluorescencia, la mayor intensidad de esta zona podría ser atribuida
a una cicatriz del proceso de gemación o al inicio de un ciclo de división por
gemación.
Figura 13 Micrografía de microscopia láser confocal en el modo de fluorescencia de una sola celLi la
de S. cL'rL'v,slac cubierta con 15 capas de r'5/PAH con una penúltima capa de FAI-[-
rodamina.
Debido a que la microscopía láser confocal tiene una resolución limitada que
no va más allá de los 200 nm se utilizó la microscopía de transmisión electrónica
(TEM) para estudiar la organización con mayor detalle de las multicapas utilizadas
en el recubrimiento de las células de S. ct'rcvisiae.
35
Mónica Aimeé Ceniceros Reyes Resultados y discusión
La figura 14 muestra una micrografía donde se aprecia el detalle del
recubrimiento de las células de levadura con 15 capas de polielectrolito utilizando
el sistema FSS/PDADMAC. En esta micrografía se observa una morfología
granular en la superficie de la membrana polimérica que recubre la pared de la
células. Esta morfología es característica de uso del polielectrolito PDADMAC
utilizado en el recubrimiento corno ha sido observada en otros sistemas [141. Bajo
las condiciones de recubrimiento que se utilizaron (lmg/mL de PDADMAC en
una solución salina 0.1M NaC1), las moléculas de polielectrolito presentan una
conformación característica de ovillo. Estas estructuras en forma de gránulos
tienen un diámetro que va de los 20 a los 30nm, consistente con determinaciones
realizadas mediante microscopia AFM [18], las imágenes TEM confirman la
observación efectuada con microscopia confocal. La membrana polirnérica
presenta continuidad en toda la superficie de la célula, no se distinguen zonas
libres de polímero.
Figura 14. Micrografía de una imagen TEM del recubrimiento de una c1ula de levadura con 15
capas de polielectrolito PSS/ PDADMAC.
36
Mónica Aimeé Ceniceros Reyes Resultados y discusión
5.1.3. Efecto del recubrimiento polimérico preparado con diferente número de
capas sobre el crecimiento de S. cerevisiae.
Un primer aspecto a estudiar en relación a las propiedades de las levaduras
recubiertas con una membrana de polielectrolitos es determinar como esta
membrana afecta el crecimiento del microorganismo. La viabilidad celular se
estudió mediante el seguimiento de la cinética de crecimiento de células cubiertas
con diferente número de capas de polielectrolito. El análisis se siguió mediante el
cambio en la densidad óptica a 575 nm en función del tiempo. Las cinéticas se
desarrollaron por periodos de 18 a 24 horas. Como microorganismo referencia se
utilizaron células de levadura sin cubrir.
En la figura 15 se muestran las cinéticas de crecimiento para levaduras
cubiertas con O y 10 capas de polielectrolitos a base de PSS/PAH y
PSS/PDADMAC. En la figura se presentan las curvas para cada par de
polielectrolitos y el blanco correspondiente.
Como puede observarse, las células sin ningún recubrimiento muestran una
cinética con las fases típicas para este microorganismo en donde el crecimiento se
inicia alrededor de las 2 horas posterior a la incubación, seguida de la fase de
crecimiento exponencial que se prolonga hasta aproximadamente las 4 horas del
periodo de incubación, seguida de la fase de crecimiento desacelerado y termina
con el inicio de la fase estacionaria alrededor de las 9 horas de incubación (Figura
15a). Cuando las células de S. cerevisiae fueron recubiertas con 10 capas de
PSS/PDADMAC se observó un cambio notable en la cinética de crecimiento del
microorganismo. Por principio de cuentas se aprecia un retraso de 2 horas en el
inicio de la fase exponencial y la fase estacionaria se alcanza aproximadamente a
las 10 horas de haber iniciado el periodo de incubación (Figura 15b). Para el caso
de células cubiertas con 10 capas de PSS/PAH el cambio en la cinética de
37
Mónica Aimeé Ceniceros Reyes Resultados y discusión
crecimiento es aún más drástico, en la curva se aprecia un retraso en el inicio de la
fase exponencial de más de 5 horas, la fase estacionaria se alcanza alrededor de 18
horas. En ambos sistemas de células recubiertas el crecimiento fue ligeramente
menor respecto al control.
2.5
2
E
Ir 1.5
Ln
-i __•__ Sin recubrimiento
—a--- PSS/PAH
05 —Á--- PSS/PDADMAC
0
0 5 10 15 20 25
Tiempo (h)
Figura 15. Cinética de crecimiento para levaduras cubiertas con 10 capas de polielectrolito: -.--células sin recubrimiento, -- células recubiertas con el sistema PSS/PAH y —Á—células recubiertas con el sistema PSS/PDADMAC.
En la figura 16 se muestran lo resultados de las cinéticas de crecimiento para
levaduras cubiertas con O y 15 capas de polielectrolito con los sistemas PSS/PAH y
PSS/PDADMAC. La imagen muestra una gráfica para células sin recubrimiento
en donde el crecimiento inicia cerca de las 2 horas posterior a la incubación,
seguida de la fase de crecimiento exponencial que se extiende hasta las 6 horas del
periodo de incubación e inicio de la fase de crecimiento desacelerado terminando
con el inicio de la fase estacionaria alrededor de las 11 horas de incubación (Figura
16a). Una vez que las células de S. cerevisine fueron recubiertas con 15 capas de
38
Mónica Aimeé Ceniceros Reyes Resultados y discusión
PSS/PAH observó que no hubo crecimiento celular, al menos en el periodo de
tiempo evaluado (Figura 16b). Para el caso de células cubiertas con 15 capas de
PSS/PDADMAC se observó un retraso de 5 h en el inicio de la fase de crecimiento
del microorganismo. Además bajo estas condiciones el crecimiento celular es
mucho menor con respecto al observado con células sin ningún recubrimiento.
2.5
2
tr 1.5 __ Sin recubrimiento
Ln --- PSS/PAH
1 -- PSS/PDADMAC
0.5
o IF -
0 5 10 15 20
Tiempo (h)
Figura 16. Cinética de crecimiento para levaduras cubiertas con 15 capas de polielectrolito: células sin recubrimiento, --- células recubiertas con el sistema PSS/PAH y células
3 recubiertas con el sistema PSS/PDADMAC.
El comportamiento observado en las células de levadura recubiertas con los
polielectrolitos evaluados respecto a lo observado con células sin recubrimiento es
notablemente diferente. Estas diferencias parecen estar determinadas básicamente
por dos parámetros: 1) Las propiedades mecánicas del recubrimiento ensamblado
y 2) la permeabilidad de la membrana. Estos factores no se excluyen mutuamente
y probablemente el comportamiento de las células recubiertas sea el resultado de la
combinación de ambos. Primeramente, la presencia de una membrana polimérica
39
Mónica Aimeé Ceniceros Reyes Resultados y discusión
densa puede mostrar una influencia notable en la permeabilidad y difusión de los
nutrientes hacia el interior de la célula. Este comportamiento se visualiza para los
recubrimientos efectuados con los sistemas PSS/PAH y PSS/PDADMAC y con
respecto al número de capas ensambladas. Indudablemente una disminución de la
permeabilidad debida al incremento en el número de capas puede limitar también
-
el crecimiento celular tal como se observa para las células cubiertas con 10 capas y
con 15 capas. Este comportamiento puede explicarse debido a que al aumentar el
número de capas ensambladas se reduce la velocidad de difusión de nutrientes
hacia el interior de la célula.
Las diferencias encontradas de los sistemas PSS/PAH y PSS/PDADMAC en
-
cuanto al comportamiento en el crecimiento celular que muestra diferencias
notables en las fases de crecimiento exponencial respecto a las células sin
recubrimiento como se menciona anteriormente no sólo puede atribuirse a una
disminución en la permeabilidad sino también puede estar influenciada por el
número de capas ensambladas y la resistencia de este recubrimiento ya que para el
caso de células cubiertas con 10 capas la presencia de una fase exponencial indica
que las células fueron capaces de romper la membrana y continuar
-
reproduciéndose mientras que en el caso de células cubiertas con 15 capas no
permite que esto ocurra.
- Los polielectrolitos PAH y PDADMAC difieren en el empaquetamiento de
sus moléculas en la multicapa. El polielectrolito PDADMAC puede adquirir una
conformación de cadena en forma de ovillo por efecto de concentraciones bajas de
solución salina. Esta característica hace que las moléculas de PDADMAC se
ensamblen formando granos característicos durante el ensamblado {14]. El PAH
por su parte tiene mucha mayor capacidad de cambiar conformación y puede
unirse más íntimamente a PSS, dando lugar a una mayor interacción entre las
capas. Las propiedades elásticas del recubrimiento LbL pueden depender de la
EN
Mónica Aimeé Ceniceros Reyes Resultados y discusión
composición. La interacción entre los diferentes polieltrolitos explica las
diferencias en el comportamiento encontradas en las células recubiertas con uno u
otro sistema (Figura 15 y 16).
La interpretación a las diferencias encontradas entre el sistema PAH/ PSS
respecto al sistema PSS/PDADMAC en cuanto al rompimiento de la membrana
observado se puede explicar debido a que el PAH es capaz de interaccionar más
íntimamente con el PSS resultando en una membrana más rígida y por lo tanto con
más resistencia al rompimiento de la membrana mientras que en el caso del
sistema PSS/PDADMAC no interactúan más íntimamente y por lo tanto su
resistencia es menor.
El módulo elástico de cápsulas fabricadas con PAH y PDADMAC ha sido
medido mediante experimentos de ósmosis [32, 45], encontrando que en el caso de
membranas PSS/PAH registra un módulo elástico entre 500 y 750 MPa mientras
que para membranas de PSS/ PDADMAC el valor obtenido fue de 140 MPa.
Los valores de elasticidad mencionados implican que las membranas de
PSS/PDADMAC son más fáciles de romper que las compuestas de PSS/PAH y
por lo tanto durante el crecimiento de las células de levadura oponen menos
resistencia al crecimiento y por ende se rompen más fácilmente tal como se observa
en las figuras 15 y 16.
5.1.4. Fabricación de cápsulas
Otro de los aspectos a estudiar fue la fabricación de cápsulas de
polielectrolitos a partir de células de levadura. Para su preparación se siguió una
metodología similar a la reportada para la fabricación de cápsulas a partir de
eritrocitos [4, 11, 17, 181. Una vez efectuado el recubrimiento de las células con los
sistemas de polielectrolitos evaluados se procedió a la oxidación de las células
41
Mónica Almeé Ceniceros Reyes Resultados y discusión
utilizando una solución de hipoclorito de sodio al 4 %. Posterior a la oxidación se
efectuaron una serie de lavados con una solución salina y luego agua.
Las cápsulas obtenidas mediante el procedimiento descrito se caracterizaron
aplicando técnicas de microscopía electrónica de barrido y microscopía electrónica
de transmisión.
En la figura 17 se observa una cápsula formada a partir de 15 capas de
-
polielectrolito utilizando el sistema PSS/PDADMAC. En esta imagen se puede
apreciar que la estructura está vacía, después de haber removido del interior el
material celular. También es posible observar un recubrimiento uniforme de la
cápsula. Las partes oscuras pueden ser atribuidas a posibles diferencias en
profundidad de campo o a una acumulación del material polimérico.
Figura. 17. Micrografía TEM de una cápsula recubierta con 15 capas de polielectrolito utilizando como plantilla una célula de levadura.
42
Mónica Aimeé Ceniceros Reyes Resultados y discusión
Utilizando SEM se puede caracterizar la topografía de las cápsulas. A
manera de ejemplo en la figura 18 se muestra las micrografías obtenidas para
cápsulas preparadas con 5 capas de polielectrolito utilizando el sistema PSS/PAH.
Como se puede observar en la figura 18a, la estructura de la cápsula parece
completamente plana, y al igual que lo observado en la micrografía de TEM es
posible asumir que ha perdido su volumen debido a que el interior esta yació.
También es posible observar que la cápsula mantiene la forma de la célula
utilizada como plantilla. Sobre la superficie de la capsula se detectan dobleces o
"arrugas" generados por el tratamiento de secado durante la preparación del
material para su observación bajo el microscopio.
En la figura 18b se muestra la capsula a mayores aumentos. En esta
micrografía se aprecia que algunos de los poros de la membrana presentan un
máximo de 70 nm, sin embargo la mayoría de estos se encuentra entre los 20 y 40
nm. El tamaño de los poros tendrá muy probablemente influencia en la
permeabilidad de la cápsula y definirá el peso molecular de las moléculas que
pueden penetrar a través de las paredes. Además de los poros se pueden observar
cristales inorgánicos en la pared, los cuales se pueden atribuir a restos de cloruro
de sodio provenientes del tratamiento con hipoclorito de sodio y de los lavados
con solución salina.
43
S!900IA. 1oL Onoto N. 1530
Mónica Aimeé Ceniceros Reyes Resultados y discusión
a)
b)
Figura 18. Micrografías SEM de cápsulas de 5 capas de polielectrolitos del sistema PSS/PAH. a) 35
740 aumentos y b) 176 600 aumentos.
A fin de explicar los cambios químicos que se pueden presentar en la
cápsula después de efectuar un tratamiento con el agente oxidante (NaOC1) se
trató a los polielectrolitos por separado y se efectuó su caracterización antes y
después del tratamiento mediante espectroscopia infrarroja (FTIR). Para realizar
este estudio, se prepararon soluciones de PSS, PAH y PDADMAC por separado y
posteriormente cada una de ellas se mezció con hipoclorito de sodio. Las
soluciones de los polielectrolitos puros y de los polielectrolitos oxidados se
congelaron con nitrógeno líquido y posteriormente se secaron mediante liofilizado.
En la figura 19a se muestra el espectro obtenido del PSS antes del
tratamiento con el agente oxidante. En el espectro se muestran bandas alrededor
de 2800 y 2900 cm-1, asignados a estiramientos de los enlaces C-H de metilos y
metilenos. Las banda de absorción en 1639 cm' se puede atribuir a estiramientos
del enlace C=C. Las bandas de absorción en 1189, 1129 y 1040 cm se asignan a las
vibraciones del enlace S-O. Las transiciones registradas 777 y 832 cm' pueden ser
asignadas a un anillo fenilo sustituido. Para el espectro del PSS tratado con el
Mi
Mónica Aimeé Ceniceros Reyes
Resultados y discusión
agente oxidante (Figura 19b) se observaron las siguientes bandas de absorción,
aparece una banda en la región de 1731 cm1 atribuida a estiramientos del grupo
carbonilo (C=O). En la región de 1641 cm-1 se muestra una banda correspondiente
al estiramiento del enlace C=C del anillo aromático. A 965 cm1 se registra una
banda que puede ser atribuida al enlace C-Cl y que no esta presente en el espectro
correspondiente al material sin tratar. La presencia de esta banda en el espectro
del polielectrolito tratado puede ser un indicativo de una oxidación sobre el
polielectrolito con lo cual podemos inferir que con este tratamiento utilizado para
formar la cápsula mediante la destrucción del material celular también se ve
afectada la química del polielectrolito.
MA
Mónica Aimeé Ceniceros Reyes
Resultados y discusión
C=c
a)
} C'4
CO a C-H N
s-o
b)
1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 a 1
3500 3000 2500 2000 1500 1000 500
Número de onda (cm)
Figura 19. Espectro de FTIR de: a) PSS sin tratar y b) PSS tratado con agente oxidante
Mónica Aimeé Ceniceros Reyes
Resultados y discusión
En la figura 20 se presentan los espectros de infrarrojo del polielectrolito
PAH sin tratar y tratado con el agente oxidante. En el espectro de la figura 20a se
observan bandas de absorción a 1608 y 1508 cm 1 correspondientes a vibraciones en
estiramientos del grupo —NH2, mientras que a 1000 cm1 aparece una banda
correspondiente a estiramientos del enlace C-N. La presencia de estas bandas son
características de la presencia de grupos amina en el PAH. En la figura 20b se
muestra el espectro de infrarrojo correspondiente al polielectrolito tratado con el
agente oxidante. En este espectro se observa una banda alrededor de 3500 cm1
correspondiente al estiramiento del enlace O-H. La presencia de esta banda en el
polielectrolito tratado es un indicativo de la formación de ácidos carboxílicos,
mientras que alrededor de 2720 cm1 aparece otra banda que se atribuye a
estiramientos del enlace C-H correspondientes a la formación de grupos aldehído y
finalmente se detecta la presencia de una banda a 1730 correspondiente al
estiramiento del enlace C=O propio de los grupos funcionales aldehído y ácido
carboxílico. En este caso es posible inferir que este tratamiento puede tener un
efecto sobre la cápsula.
47
Mónica Aimeé Ceniceros Reyes Resultados y discusión
-NH2
CD
CH
O CO
H
en
3500 3000 2500 2000 1500 1000 500
Número de onda (cm)
a)
Figura 20. Espectro de FTIR de a) PAH sin tratar y b) PAH tratado con el agente oxidante.
Mónica Aimeé Ceniceros Reyes Resultados y discusión
El espectro de infrarrojo del polielctrolito PDADMAC sin tratar y tratado
con el agente oxidante se muestra en la figura 21. En el espectro de la figura 21a se
observa una banda amplia de absorción alrededor de 3300 cm1 correspondiente al
estiramiento del enlace N-H, la cual se confirma con la banda registrada alrededor
de 2000 cm-1. Las bandas registradas a 2900 cm1 corresponden a vibraciones de los
grupos metilos y metilenos, mientras las bandas registradas a 1637, 1475 y 1415
cm-1 corresponden a las vibraciones de las flexiones del tipo N-H [46]. En el
espectro de la figura 21b correspondiente al polielectrolito tratado con el agente
oxidante se aprecia una banda de absorción a 1381 cm1 correspondiente a
estiramientos del enlace N-O la presencia de esta banda puede ser atribuida a la
formación de grupos nitro durante el tratamiento. Finalmente se aprecia una
banda de absorción en 971 cm-1 la cual puede ser atribuida a la formación del
grupo C-Cl una vez que el material fue tratado con el agente oxidante.
Mónica Airneé Ceniceros Reyes Resultados y discusión
N-H a)
U-H b)
CIO
3500 3000 2500 2000 1500 1000 500
Número de onda (cm)
Figura 21. Espectro de FTIR del polielectrolito PDADMAC a) sin tratar y b) tratado con el agente
oxidante.
50
Mónica Aimeé Ceniceros Reyes Conclusiones
6. Conclusiones
Mediante el uso de la técnica de "capa a capa" fue posible recubrir células
de levadura con diferente número de capas utilizando los sistemas de
polielectrolitos PSS/PAH y PSS/PDADMAC.
> La caracterización de los recubrimientos por microscopía láser confocal y
microscopía electrónica de barrido indica que el recubrimiento efectuado
utilizando los sistemas de polielectrolitos PSS/PAH y PSS/PDADMAC
confirma un recubrimiento homogéneo de la superficie celular.
El incremento en el número de capas ensambladas con los sistemas
PSS/PAH y PSS/PDADMAC tiene un efecto sobre el crecimiento celular,
debido a una reducción en la velocidad de difusión de los nutrientes.
La presencia de una fase exponencial en las células recubiertas con 10 capas
de polielectrolito indica que las células fueron capaces de romper la
membrana y continuar creciendo mientras que con un recubrimiento con 15
capas no permitieron que esto ocurriera.
Mediante el uso de la metodología de oxidación aplicada con eritrocitos fue
posible fabricar cápsulas con los sistemas PSS/PAH y PSS/PDADMAC
utilizando células de levadura (S. cerevisiae).
La caracterización por TEM y SEM de las cápsulas obtenidas con los
sistemas PSS/PAH y PSS/PDADMAC permite establecer una estructura
continua y vacía con poros con un diámetro de 20 a 40 nm.
La caracterización mediante espectroscopía infrarroja (FTIR) de los
polielectrolitos sin tratar y tratados con el agente oxidante indica que el
proceso de oxidación de la célula afecta la química de los polielectrolitos.
51
Mónica Aimeé Ceniceros Reyes Trabajo a futuro
7. Trabajo a Futuro
'7 Establecer las características diferenciales entre los sistemas PSS/PAH y
PSS/PDADMAC en base a estudios de permeabilidad, morfología y
elasticidad utilizando técnicas de blanqueado en el microscopio confocal
para estudios de permeabilidad de las cápsulas así como el uso de técnicas
de microscopia para los estudios morfológicos y de AFM para estudios de
elasticidad y topología de las cápsulas.
'7 Utilizar estudios de caracterización de las cápsulas después del tratamiento
con el agente oxidante utilizando técnicas como XPS, espectroscopia de
masas y resonancia magnética nuclear para poder determinar los cambios
estructurales de la cápsula.
52
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