Biología Molecular en UCI
Dr. Fernando PérezDr. Stevens Salva
Simplificación tecnológica, automatización del los procesos
Abaratamiento de los costos Entrenamiento del recurso humano en el manejo de la tecnología e interpretación de los resultados
Manejo de problemas o dilemas éticos
Transición tecnológica
DiagnósticoMicrobiológico
Diagnóstico Hemato - oncológiaGenética
Diagnóstico Biología Molecular
DiagnósticoMicrobiológico
Unidad de diagnóstico
Hemato - oncológia
Unidad de Genética
Diagnóstico Biología Molecular
Fundamentos técnicos
Aplicaciones clínicas en UCI
Conclusiones y recomendaciones
Diagnostico microbiológico por Biología Molecular
Identificación de microorganismos
• Virus • Bacterias • Micobacterias• Hongos• Parásitos
Mediante técnicas Moleculares
Reacción de cadena polimerasa (PCR)
En abril de 1983 Kary Mullis da a conocer la técnica de reacción en cadena de la polimerasa, o PCR.
Permite la amplificación un fragmento especifico de ADN in vitro.
Diagnostico microbiológico por Biología Molecular
Desnaturalización
Polimerización Producto final
Hibridación
93-97 ºC 45-72ºC
72ºC
Reacción de cadena polimerasa (PCR)
Diagnostico microbiológico por Biología Molecular
Reacción de cadena polimerasa (PCR)Clásico
UV Translluminator
Identificación del ADN (electroforesis)
Extracción del ADN o ARN
Amplificación ADN (PCR)
Reacción de cadena polimerasa (PCR)Clásico
Identificación del ADN (electroforesis)
Reacción de cadena polimerasa (PCR)Tiempo Real
PCR tiempo real
Diagnostico microbiológico por Biología Molecular
Reacción de cadena polimerasa (PCR)
Diagnostico microbiológico por Biología Molecular
Reacción de cadena polimerasa (PCR)Tiempo Real
DETECCIÓN DEPATÓGENOS POR PCRA TIEMPO REALPCR a tiempo real: análisis de patógenos
Revolución en el diagnóstico molecular.Amplificación de una secuencia específica del ADN.
Uso de un tercer “primer” capaz de emitir fluorescencia.
Detección de la amplificación ciclo a ciclo.Técnica altamente sensible
PCR a tiempo real: análisis de patógenosReal Time PCR
Infeccion
Quemaduras, isquemia, pancreatitis
Sepsis
Bacteremia
Adapted from Crit Care Med 1992;20:864-874.
El tiempo y adecuado diagnostico es vital…la sepsis es una enfermedad progresiva
SRIS
Falla Multiples organos
Sepsis
Sepsis Severa
Shock Septico
6 - 17%
16 %
20 %
46 %
> 60 %
Temperatura > 38 < 36FC > 90 ppmFR > 20 o PCo2 < 32GB > 12000 < 4000
SRIS + Lugar infeccion o fuerte sospecha
SRIS + Disfuncion de organo, hipoperfusion o hipotension
SRIS + hipoperfusion e hipotension
Current Definitions According to the “2001 SCCM/ESICM/ACCP/ATS/SIS International Sepsis Definitions Conference”. Levy et al. (2003) CritCare Med 31: 1250 –1256
Mortalidad
El tratamiento empirico inicial El tratamiento empirico inicial muchas veces es inadecuadomuchas veces es inadecuado
Tratamiento antibiotico inicial
Adecuado
Inadecuado
Ibrahim Harbarth Kolleft
Dias 1 2 3 4 5
50
60
70
80
90
% d
e p
aci
en
tes
reci
bin
ed
o
trata
mie
nto
ad
ecu
ad
o
Inadequate treatment from day 1 to day5 (prospective study); BouzaE. et al, CID 2004/39/1161
Los clinicos necesitan diagnostico rapido!
Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4
Hemocultivo
Septi Fast Especies
Resistencia: mecA
Gram Especies ResistenciaCultivo
PCR
6H
SeptiFast. Roche DiagnosticResistencia: mecA
a. DNA libreb. Patogenos
muertosc. Patogenos
viablesd. Patogenos
fagocitados
a. Patogenos viables
b. Patogenos fagocitados
50%
1. Medir el ácido láctico
2. Obtener cultivos de sangre antes de iniciar los antibióticos
3. Administrar antibióticos de amplio espectro en las primeras 3 horas del ingreso a la emergencia o en 1 hora desde otro servicio
El objetivo es realizar todas las indicaciones el 100% de las veces en las primeras 6 horas de la
identificación de la sepsis
TENDRAN UN LUGAR LAS TECNICAS
DE PCR TR?
Microbiological diagnosis of sepsis: comparison between real-time
polymerase chain reaction and blood culture techniques
Simona Barnini, Carlotta Dodi and Mario CampaDipartimento di Patologia Sperimentale, Biotecnologie Mediche,
Infectivologia ed Epidemiologia, Unità Operativa di Microbiologia, Università di Pisa, Pisa, Italy
Critical Care 2007, 11(Suppl 4):P41doi:10.1186/cc6020
Numero de organismos detectados
Nu
mero
de m
uest
ras
10
20
30
27 30 147 muestras51 pacientes con sepsis
30 hemocultivos positivos 27 positivos por PCR
En el 76 % de los casos mismo resultado. Prueba multiplex fue mas rapida que el cultivo el 97% de los casos
Critical Care 2007, 11(Suppl 4):P41doi:10.1186/cc6020
Reaccion en cadena de la Polimera por Multiplex para la deteccion de bacteremia y fungemia.
Louie, Richard F. PhD; Tang, Zuping MD; Albertson, Timothy E. MD, PhD; Cohen, Stuart MD; Tran, Nam K. BS; Kost, Gerald J. MD, PhD
Crit Care Med. 2008 May;36(5):1487-92.
• 200 pacientes con SRIS de emergencia y UCI
45
37
Deteccion patogenos
25 50 Resistencia Mec A( 3/4 casos verificados x HC)
100%
50%
25%
75%
Reaccion en cadena de la Polimera por Multiplex para la deteccion de bacteremia y fungemia
Louie, Richard F. PhD; Tang, Zuping MD; Albertson, Timothy E. MD, PhD; Cohen, Stuart MD; Tran, Nam K. BS; Kost, Gerald J. MD, PhD
Crit Care Med. 2008 May;36(5):1487-92.Polimicrobiana 9
“PCR es una técnica coadyuvante a los
métodos tradicionalesde cultivo, en facilitarla detección temprana
de microorganismos
en sepsis.”
Utility of a Commercially Available Multiplex Real-Time PCR Assay To Detect Bacterial and Fungal Pathogens in Febrile Neutropenia
J Clin Microbiol. 2009 August; 47(8): 2405–2410.
Marie von Lilienfeld-Toal,1,2†* Lutz E. Lehmann,3† Ansgar D. Raadts,3 Corinna Hahn-Ast,1 Katjana S. Orlopp,1 Günter Marklein,4 Ingvill Purr,4 Gordon Cook,2 Andreas Hoeft,3 Axel Glasmacher,1 and Frank Stüber5
Results of blood cultures and PCR during antimicrobial therapy
PathogenN (%) of positive
Results By No. of FNEs (no. initially positive)
Blood culture PCRNone 113 (97) 565 (84)Staphylococcus aureus 0 32 (4.8) 19 (6)
Staphylococcus species (CoNS)
2(1.8) 13 (1.9) 9 (2)
Enterococcus faecium 0 14 (2.0) 6 (1)
Enterococcus faecalis 0 3 (0.4) 1 (1)
Escherichia coli 0 6 (0.9) 4 (3)Pseudomonas aeruginosa 0 14 (2.0) 3 (1)
Stenotrophomonas maltophilia
1(0.9) 4 (0.6) 3 (2)
Candida krusei 0 1 (0.1) 1 (0)Candida albicans 0 8 (1.2) 2 (0)Aspergillus fumigatus 0 9 (1.3) 5 (1)
Total positive (%) 3% 15%
Utility of a Commercially Available Multiplex Real-Time PCR Assay To Detect Bacterial and Fungal Pathogens in Febrile Neutropenia
J Clin Microbiol. 2009 August; 47(8): 2405–2410.
Marie von Lilienfeld-Toal,1,2†* Lutz E. Lehmann,3† Ansgar D. Raadts,3 Corinna Hahn-Ast,1 Katjana S. Orlopp,1 Günter Marklein,4 Ingvill Purr,4 Gordon Cook,2 Andreas Hoeft,3 Axel Glasmacher,1 and Frank Stüber5
Rapid Detection of Methicillin-Resistant Staphylococci from Blood Culture Bottles by Using a Multiplex PCR Assay
L. Louie,1* J. Goodfellow,1 P. Mathieu,2 A. Glatt,2,3 M. Louie,1,4† and A. E. Simor1,4
Sunnybrook and Women's College Health Sciences Centre,1 University of Toronto, Toronto, Ontario, Canada,4 St. Vincent Catholic Medical Centers, Brooklyn/Queens Region, Jamaica,2 New
York Medical College, Valhalla, New York3
Organism type No. of strains
Expected PCR resultsa (16S/mecA/
nuc)
Direct PCR results, 16S/mecA/nuc (no.
of isolates)CoNS,b methicillin resistant
107 +/+/− +/+/− (100); −/+/− (7)
CoNS, methicillin susceptible
73 +/−/− +/−/− (71); −/−/− (2)
MSSA 36 +/−/+ +/−/+ (34); −/−/+ (2)
Total 223
J Clin Microbiol. 2002 August; 40: 2786–2790.
Rapid Detection of Methicillin-Resistant Staphylococci from Blood Culture Bottles by Using a Multiplex PCR Assay
L. Louie,1* J. Goodfellow,1 P. Mathieu,2 A. Glatt,2,3 M. Louie,1,4† and A. E. Simor1,4
Sunnybrook and Women's College Health Sciences Centre,1 University of Toronto, Toronto, Ontario, Canada,4 St. Vincent Catholic Medical Centers, Brooklyn/Queens Region, Jamaica,2 New
York Medical College, Valhalla, New York3
J Clin Microbiol. 2002 August; 40: 2786–2790.
A multicenter trial to compare blood culture with polymerase chain reaction in severe human sepsis
Frank Bloos, Frank Hinder, Karsten Becker, Svea Sachse, Armand Mekontso Dessap, Eberhard Straube, Vincent Cattoir, Christian Brun-Buisson, Konrad Reinhart, Georg Peters, Michael Bauer
Intensive Care Med.2010 Feb; 36(2):193-5
A multicenter trial to compare blood culture with polymerase chain reaction in severe human sepsis
Frank Bloos, Frank Hinder, Karsten Becker, Svea Sachse, Armand Mekontso Dessap, Eberhard Straube, Vincent Cattoir, Christian Brun-Buisson, Konrad Reinhart, Georg Peters, Michael Bauer
Intensive Care Med.2010 Feb; 36(2):193-5
A multicenter trial to compare blood culture with polymerase chain reaction in severe human sepsis
Frank Bloos, Frank Hinder, Karsten Becker, Svea Sachse, Armand Mekontso Dessap, Eberhard Straube, Vincent Cattoir, Christian Brun-Buisson, Konrad Reinhart, Georg Peters, Michael Bauer
Intensive Care Med.2010 Feb; 36(2):193-5
A multicenter trial to compare blood culture with polymerase chain reaction in severe human sepsis
Frank Bloos, Frank Hinder, Karsten Becker, Svea Sachse, Armand Mekontso Dessap, Eberhard Straube, Vincent Cattoir, Christian Brun-Buisson, Konrad Reinhart, Georg Peters, Michael Bauer
Intensive Care Med.2010 Feb; 36(2):193-5
Indicaciones razonables para requerir estudios de PCR tiempo
real (Septi Fast)
1. Pacientes tratados previamente con antibioticos
2. Aislamiento de germenes de crecimento lento, aislamiento complejo.
3. Pacientes con shock septico o sepsis severa4. Sospecha de germenes resistentes (MRSA- Enterococo-Vanc)
Detección Temprana
Activación del Código
Reanimación Inicial
Traslado a UCI
www.grupogenolab.com