Seminario: Bacillus thuringiensis (Bth)
y sus aplicaciones...
Alejandro Crosa & Juan Pablo Oliver
Agroquímicos I
Noviembre 2006
Bacilo Gram +Esporulador
Aerobio FacultativoDistribuido en el AmbientePatógeno natural de InsectosICP (inclusiones cristalinas paraesporales)
Cry I => LepidópterosCry II => Lepidópteros, DípterosCry III => ColeópterosCry IV => Dípteros Cry V => Lepidópteros, ColeópterosCyt => Mosquitocidal y Citolítica
Receptores de membrana:
Caderinas
Aminopeptidasa N (APN)
Fosfatasa alcalina
entre otras...
1 a 2 nm
Productos a base de toxinas BthInsectecidas a base Bth:
1era Generación: esporas y cristales
2da Generación : esporas y toxinas expresadas con otras bacterias
3era Generación : bacterias recombinantes muertas
4ra Generación : quimeras proteicas de toxinas
Forma de Aplicación de toxinas de BthDispersión superficial de la pro-toxina y se deja secar
Microgoteo de pro-toxina más una atrayente (como sacarosa)
Aspersión, barnizado o inmersión de la pro-toxina (hoja, tubérculos, tallos)
Toxicidad:
Nula => Animales superiores
Nula => Insectos no blanco (artropodos, abejas y abejorros)
Advertencias y precauciones :
Aplicación estados tempranos de Lepidópteros
No mezclar con sust. de pH básico
Persistencia: Baja
Los cristales de Pro-toxina son solubles en agua
Captafol, captan, Demeton S-etil, Difolatan, Dimetoato, Dinocap, Fentoato, Fosalon,
Isoprocarb, Leptofos, Propargita, Propoxur y
Tetraclorvinfos.
Acefato, Azinfos metil, Carbofurano, Clordimeform,
Diazinon, Dicofol, Diflubenzuron, Endosulfan,
Fenitrotion, Hidrácida maléica, Malatión, Maneb,
Metomilo, Mevinfos, Monocrotofos, Paration (etil
paration), Paration metil, Permetrin y Triclorfon,
Verticillium lecanii y Zineb.
Bacillus thuringiensisvariedad kurstaki
No CompatibleCompatible
IPM: Compatibilidad con otros Agroquímicos
Productos a base de toxinas Bth
2Ab1LepidópteroskurstakiBioprotec
10Aa1, 11Aa1 , CytAaDípteros israelensisTeknar
TransconjuganteLepidópterosaizawaiGC91 (T)Agree
DesconocidoLepidópteroskurstaki SA12Coestar
DesconocidoLepidópteroskurstakiAble
Termo Trilogy Cop.
β-exotoxinaDesconocidodesconocidoDibeta
1Aa1, 1Ab1 , 1Ba1 , 1Ca1 , 1Da1LepidópterosaizawaiThuricide
1Aa1, 1Ab1 , 1Ba1 , 1Ca1 , 1Da1LepidópterostenebrionisNovodor
4Aa1, 4Ba1 , 10Aa1 , 11Aa1 , CytAa, 3Aa3
Coleóptero DípteroisraelensisGnatrol
1Aa1, 1Ab1 , 1A c1, 2Aa1 , 2Ab1
LepidópteroskurstakiDipel, Biobit
Abbott Labs.
ProteinasBlancoVariedadNombre ComercialCompañía
Productos a base de toxinas Bth
Métodos de Transformación
• Naturales: Agrobacterium tumefaciens
Vectores Virales.
• No Naturales: BioBalística (fuerzabruta).Protoplastos.
• Mixtos: Agrolística.
Etapas en el desarrollo de Plantas Transgénicas
1) Clonado: · Identificación.· Clonado· Secuenciación
2) Diseño de la · Promotor.construcción: · Targeting.
· Selección.
3) Transformación: · Selección del método de transformación.
4) Selección: · Sistema de selección.· Eliminación del gen de selección.
Agrobacterium tumefaciens
Ciclo Natural de Infección
Sistema Binario
Procedimiento1) Incubación de A. tumefaciens
con explantes (cocultivo).2) Regeneración de explantes
infectados con hormonas (auxinas y citoquininas). Eliminación de A. tumefaciens, incubación en medio selectivo. Producción de callos.
3) Producción de brotes.4) Transferencia de brotes a
medio de cultivo.5) Crecimiento en tierra.
Limitaciones
• Poco eficiente en monocotiledóneas.
• Los genes se incorporan únicamente en el genoma nuclear, no sirven para transformar cloroplastos.
Biolística• Permite transformar prácticamente todas las plantas
y también permite transformar los genomas de mitocondrias y cloroplastos (los cuales son generalmente de herencia “materna”).
• Se utilizan proyectiles de oro o tungsteno de aproximadamente 1 µm de diámetro.
• Las partículas son aceleradas por el uso de gas Helio o Nitrógeno de alta presión. Alcanzan velocidades de más de 440 m/s (necesarias para la penetración).
• En general la primera línea de células muere por el impacto, pero las células enseguida por debajo sobreviven.
Biolística
Limitaciones
• Alto grado de daño al tejido.
• Relativamente bajo grado de transformantes estables (1 – 5 % de las células).
• Grandes variaciones entre cada experimento, los niveles de expresión génica son totalmente diferentes entre cada experimento.
• Limitaciones en el tamaño de las construcciones.
Agrolística• Combina la transformación de por Biolística con la mediada
por A. tumefaciens.
• Se incorporan a la construcción los genes virD1 y virD2, bajo la regulación del promotor p35S CaMV. Esto permite la correcta escisión de la hebra-T in planta. Aumenta mucho la frecuencia de transformación.
• Las construcciones se cotransforman por bombardeo de partículas.
Transformación de Protoplastos
• Métodos: · Electroporación.· Shock osmótico.· Otros.
• Limitaciones: Bajo · 1 – 2 % de transformantes.rendimiento
· 0,1 % de regeneración.
Consideraciones finales• Efecto de la posición:
· Existe una gran variación en los niveles de expresión de los transgénicos.
· Baja correlación entre el número de copias del transgen y el nivel de expresión.
• Patrones de integración:
· Los transgenes se pueden integrar en varias copias con una correlación directa o invertida.
· La presencia de repetidos, especialmente de orientación inversa, se correlaciona con el fenómeno de silenciamineto génico (cosupresión).
EL PODER CONTROLAR EL PATRÓN DE INTEGRACIÓN Y
ELIMINAR EL NÚMERO DE COPIAS EXTRA DE UN
TRANSGEN ES UN OBJETIVO PRIORITARIO DE LA
INVESTIGACIÓN EN EL CAMPO DE LA BIOLÓGÍA
MOLECULAR VEGETAL
Preguntas?
y el futuro?
Muchas gracias
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