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Page 1

Aplicaciones de Q-TOF(Soluciones Analíticas en Identificación con LCMS)

Juan Carlos López Flores, MScMarzo-Abril-Mayo Junio , 2008

ROADSHOW LCMSAMÉRICA LATINA

AGILENT TECHNOLOGIES

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Situación de análisis cualitativo para identificación

• La muestra es desconocida– Puede tenerse alguna idea de la clase de

compuestos, pero no se sabe a ciencia cierta si están o no presentes

•El(Los) compuesto(s) de interés puede estar presente en muy bajas concentraciones

– Se requiere alta sensibilidad•Dado que en LC-MS no existen bibliotecas de espectros (como en GCMS usando EI) se requieren herramientas adicionales a solo MS

– MS de alta exactitud y resolución– Varios pasos de MS (MS/MS, MS3 o MSn)– Combinación de ambos (MS/MS con alta exactitud

en las masas)

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SIMPOSIUM 2006Agilent Restricted

Page 3

Complejidad de muestras, ¿cuantos y cuáles compuestoshay en una muestra?

6x10

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

1.4

1.6

1.8

2

2.2

2.4

2.6

2.8

Cpd 279:+ ECC Scan CoffeeSpiked12.d

Counts vs. Acquisition Time (min)0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5 5 5.5 6 6.5 7 7.5 8 8.5 9

Más de 280 compuestos en café con pesticidas añadidos

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SIMPOSIUM 2006Agilent Restricted

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9 compuestos coeluyendo en 6 segundos5x10

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

1.4

1.6

1.8

2

2.2

2.4

2.6

2.8

3

3.2

3.4

Cpd 105:+ ECC Scan CoffeeSpiked12.d

Counts vs. Acquisition Time (min).31 1.315 1.32 1.325 1.33 1.335 1.34 1.345 1.35 1.355 1.36 1.365 1.37 1.375 1.38 1.385 1.39 1.395 1.4 1.405 1.41 1.415 1.42 1.425 1.43 1.435 1.44 1.445

6 segundos

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Extracto de orina realmente complejo > 1000 compuestosAmplio intervalo dinámico – ¿Como se analiza?

6x10

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

1.4

1.6

1.8

2

2.2

2.4

2.6

2.8

3

3.2

3.4

3.6

3.8

4

4.2

4.4

4.6

4.8

5

5.2

Cpd 932:+ ECC Scan DQC3.d

1417

Counts vs. Acquisition Time (scans)250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 900 950 1000 1050 1100 1150 1200 1250 1300 1350 1400

5x10

-0.2-0.1

00.1

0.20.3

0.40.5

0.60.7

0.80.9

11.1

1.21.3

1.41.5

1.61.7

1.81.9

22.12.2

2.32.4

2.5

Cpd 932:+ ECC Scan DQC3.d

Counts vs. Acquisition Time (min)3.08 3.1 3.12 3.14 3.16 3.18 3.2 3.22 3.24 3.26 3.28 3.3 3.32 3.34 3.36 3.38 3.4 3.42 3.44 3.46 3.48 3.5

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El mayor reto en Proteomics: Encontrar biomarcadores en fluídoshumanos como suero, plasma o Líquido cefalo raquídeo

En el suero humano, las concentraciones de proteínas se estiman están en un intervalo de doce órdenes de magnitud

Number of Proteins

(Órdenes de magnitud)

Aún no resueltas

2D gelesLC-MS

Nivel

121110987654321

Biomarcadoresen tejidos

(mg/ml)

(ug/ml)

(ng/ml)

(pg/ml)

(fg/ml)

- Alta abundancia

- Abundancia moderada

- Baja abundancia

- Muy baja abundanciaCitoquinas

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Retirando las capas de proteínas es el primer paso

Uno de los mayores objetivos es encontrar proteínas útiles desde el punto de vista clínico(biomarcadores). Estas son típicamente proteínas de baja abundancia. Las tecnologías actuales permitenver solo las tres capas superiores.

Level 1

Level 2

Level 3

Level 4

Level 5

Level 6

Ya estudiadas

Las proteínas de interés

Level 7Level 8

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Resultados con instrumento con baja exactitud en masas (MW 609. 2, con solo C, H, O y N)

H25N36O5CH21N40OC33H31N13

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Resultados con instrumento con alta exactitud en masas (MW 609. 28066, con solo C, H, O y N)

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Definiciones

•Una disolución con ácido en concentración 0.0025M

•Una disolución de pH 2.6– pH = -log 0.025

Error en la medición de masas•Error pequeño 200.0 y 200.1• (200.0 – 200.1)/200.0 = 0.0005

•Error en masas exactas(200.0000-200.0016)/200.0000 = 0.000005

•Exactitud en masas = Error x 1,000,0000.00005X1,000,000 = 5 ppm

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Importancia de las mediciones exactas de masas

Reserpina (C33H40N2O9) tiene un ión protonado a m/z 609.28066

Un espectrómetro de masas tipo cuadrupolo reporta masas en +/- 0.1 = 165 ppm

0.1/609.28 x 10e6 = 164.128

Número de fórmulas posibles usando solo C, H, O y N:

• 165 ppm 209• 10 ppm 13• 5 ppm 7• 3 ppm 4• 2 ppm 2

Las masas exactas reducen el riesgo de invertir esfuerzo en la molécula incorrecta

Error en ppm = (error de masa/MW) x 106

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Alta resolución y número posible de fórmulasquímicas

1

10

100

1000

0.1 0.05 0.01 0.005 0.001 0.0005 0.0001

Exactitud de masa (amu)

# de

fórm

ula/

com

pues

tos

posi

bles

176386882134716725687

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Masas Atómicas e isótopos

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Diferencias entre MW promedio, monoisotópico y nominal

Nombre FórmulaMolecular

Masa Promedio(Da)

MasaMonoisotópica

Masa Nominal(Da)

Carbón C 12.1115 12.0000 12Hidrógeno H 1.0080 1.0078 1Nitrógeno N 14.0067 14.0031 14Oxígeno O 15.9994 15.9949 16Azufre S 32.0600 31.9721 32

Un lípido C18H35NO 281.4858 281.2718 281Un azúcar C56H118N4O14 1071.5833 1070.8644 1070Un péptido C101H258N24O24 2193.3288 2191.9704 2190

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Sistemas LC/MS de Agilent, vista por dentro

Rough Pump

Octopole 1

Turbo 1

Turbo 1

Turbo 1

Quad Mass Filter (Q1)

Collision Cell

Lens 1 and 2

Quad Mass Filter (Q3)

10KV Detector

Ion Pulser

Turbo 2

Octopole 1

DC Quad

Rough Pump

Turbo 1

Turbo 1

Turbo 1

Quad Mass Filter (Q1)

Collision CellLens 1 and 2

Octopole 2

Rough Pump

Octopole 1

Turbo 1

Turbo 1

Turbo 1

Quad Mass Filter (Q1)

Lens 1 and 210KV

Detector 6520 Q-TOF6410 QQQ

6100 Series SQ

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Modelo Conceptual de un Espectrómetrode Masas de Tiempo de Vuelo (TOF)

Video TOF

Tubo de vuelo del TOF:Zona libre de campo eléctrico. Opcional: Reflectron (espejo de iones)

0 V

Analizador de Masasde Tiempo de Vuelo (TOF)

Detección Iones

IonizaciónExterna Campo Eléctrico

Pulsante

Resolución Espectral:

“alta”

Técnica “Pulsante”

E = - m v221 v =

m2E

t =length

m2E

2(30000)= 1.0

50200

= 91 μsec

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Posicionamiento de los instrumentos 6210 y 6220 TOF

G6210 Resolución de 4,000 @ 118 m/z (típica)Resolución de 7,000 @ 322 m/z (típica)Resolución de 13,000 @ 2722 m/z (spec)3.5 décadas de intervalo dinámico

G6220 >Cambio 2X – Resolución de 9,000 @ 118 m/z(spec)

Cambio 2X- Resolución de 14,000 @ 322 m/z(spec)

Cambio 1.3X- Resolución de 16,000 @ 2722 m/z(spec)

Cambio 10X- 4.5 décadas de intervalo dinámico

Introducción automática de masas de referenciapara Multimodo, APCI yAPPI

100% MassHunter software

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Posicionamiento de los instrumentos 6510 y 6520 QTOF

G6510Resolución 4,000 @ 118 m/z (típico)

Resolución 7,000 @ 322 m/z (típico)

Resolución 13,000 @ 2722 m/z (spec)

3.5 décadas de intervalo dinámico

Intervalo de masas 4,000 m/z cuad;

12,000 m/z –TOF

G6520>cambio 2X- Resolución de 9,000 @ 118 m/z (spec)

Cambio 2X - Resolución de 14,000 @ 322 m/z (spec)

Cambio de 1.3X – Resolución de 16,000 @ 2722 m/z(spec)

Cambio de 10X - 4.5 décadas de intervalo dinámico

Intervalo de masas 4,000 m/z cuad; 20,000 m/z - TOF -standard

Introducción automática de masas de referencia paraMultimodo, APCI y APPI

8,000 m/z cuad – opción de intervalo de masasextendido (Fase III)

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Diagrama TOF

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Diseño que mejora la transmisión de iones y la resolución

Espejo de iones de dos etapas

Sistema de vacío de 5 etapas

Fuente de ionesortogonal

Detector ópticamenteacoplado con la digitalización ADCAl 25ppm/°C, Acinox 20ppm/oC. Agilent 2ppm/oC

Longitud real del paso de vuelo de 2.0m

Tubo de vuelo con bajo CTE

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Exactitud de masas, extremos ambientales

Inyección cada 15 minutos, desde 11º - 36º C y de 10 a 95 % humedad relativa

Mass Accuracy

-5-4-3-2-1012345

0 50 100 150 200 250 300

Reserpine Injection

Mas

s Er

ror,

ppm

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Fuente dual ElectrosprayDiseño de rociador dual para la muestra y los compuestos de referencia

Rociador de referencia

Rociador analítico

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Universal IRM:

– IRM para fuentes Multimodo(ESI/APCI), APCI y APPI

– Utiliza el sistema de entrega de calibrante para adición de compuestos IRM

– Polaridad positiva y negativa– Disponible para TOF y Q-TOF

• Disponible para sistemas ya existentes

– Disponible en Septiembre 2007

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Page 24

Correción de masas

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Sistema de entrega de calibrante para tuning automático e introducción de masa de referencia

A B

TOFTOF Ref Mass

CDS entrega ya sea la mezcla de Tune o la disolución de masas de referencia

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Facilidad de uso: Corrección con la masa internade referencia

100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000m/z, amu

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

Rel. Int. (%

)

279.091691

579.155974

121.050925 301.073403922.010400

Masas de referencia

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Exactitud de masas para tecnología de tiempo de vuelo

–3

–2

–1

0

1

2

3

5 10 15 20 25 30 35 40 45

Mass error (ppm)

Standards from 0.1 to 5 ng/mL Urine samples spiked from 2 ng/mL to 250 ng/mL

Clenbuterol

Ractopamine

Bambuterol

Mabuterol

Run number

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Mejoras en el Time-of-Flight Nueva tecnología de adquisición incrementa el poder de resolución

FIA, 2 scans/sec (6713 transients/scan)2 IRM averaged over five scans

Butyl paraben[M+H]+ 195.10157

Methyl 5-acetylsalicylate[M+H]+ 195.06519

O

O

OH

O

OH

OO

8 bit – 1 GHzCovertidorAnalógico

Digital

195.088679

Counts vs. Mass-to-Charge (m/z)195 195.02 195.04 195.06 195.08 195.1 195.12 195.14 195.16 195.18 195.2

6,100 Resolving Power (FWHM)

8 bit – 4 GHzConvertidorAnalógico

Digital

195.100392

195.066356

Counts vs. Mass-to-Charge (m/z)195 195.02 195.04 195.06 195.08 195.1 195.12 195.14 195.16 195.18 195.2

Counts vs. Mass-to-Charge (m/z)

8,000 Resolving Power (FWHM)

195.101392

195.065349

195 195.02 195.04 195.06 195.08 195.1 195.12 195.14 195.16 195.18 195.2

0.036 Da+ 0.8 ppm

- 0.9 ppm

14,000 de poder de

Resolución(FWHM)

8 bit – 4 GHzConvertidorAnalógico

Digital Picking de

picostransientes

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Page 29

Uso de alta resolución y alta exactitud

163.063Tyr (Y)Tyrosina156.101Arg (R)Arginina147.068Phe(F)Fenil alanina128.095Lys (K)Lysina128.059Gln (Q)Glutamina113.084Leu (L)Leucina113.084Ile (I)Isoleucina71.037Ala (A)Alanina57.021Gly(G)Glicina

Masa monoisotópica(Da)CódigoAminoácido

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1296.69 seq(c-FH[IL])

Secuenciación por Peptide Ladder

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Saturación espectral y exactitud de masas

XIC of +TOF MS: 409.3 amu Max. 3.7e6 cps.

0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 2.0 2.2Time, min

0.0

8.0e5

1.6e6

2.4e6

3.2e6

Intensity, cps

409.30

m/z, amu408.0 408.5 409.0 409.5 410.0 410.5 411.0 411.5 412.00%

20%

40%

60%

80%

100%409.2837

410.2648

409.2597

410.2630

Masa real 409.2598

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SIMPOSIUM 2006Agilent Restricted

Page 32

Intervalo dinámicoIntevalo estrecho

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SIMPOSIUM 2006Agilent Restricted

Page 33

Intervalo dinámicoIntervalo amplio

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SIMPOSIUM 2006Agilent Restricted

Page 34

Mediciones exactas de masas: Amplio intervalodinámico

m/z 582.319

100,000 Arb.U

nits

250 Arb.U

nits

m/z 922.010

400x

1.6 ppmerror

TheoreticalMass487.73253450.2364

722.81666417.21191512.25457464.25036519.21717653.3617

435.91023501.79513820.47251526.58871674.32258480.60877582.31897710.84248627.97323474.23075507.81333740.40136784.37501

AbundanceArb. Units

13165304661169108978

12534575

21881555

10141842

31001881

23885490273863

1388124508110169671643

Error(ppm)

0.611.590.642.661.660.730.061.38-0.28-0.040.250.35-1.4

-2.521.57-1.160.551.130.68-0.12-3.49

“Problema”Masas Ref.

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SIMPOSIUM 2006Agilent Restricted

Page 35

Poder de resolución mejorado –Alta exactitud de masas para isóbaros en un ampliointervalo dinámico

Methyl 5-acetyl-salicylate (MAS)[M+H]+ 195.065185

Butyl paraben (BP)[M+H]+ 195.101571

Counts (%) vs. Mass-to-Charge (m/z)195.02 195.04 195.06 195.08 195.1 195.12 195.14 195.16 195.18 195.2 195.22

0

0.25

0.5

0.75

1

1.25

1.5

1.75

2

2.25

2.5

2.75

3

3.25

3.5

3.75

4

4.25

4.5

4.75

5

5.25

5.5

5.75

6

6.25

6.5

6.75

7

7.25

7.5

7.75

8

8.25

8.5

8.75

9

9.25

9.5

+ Scan (# 3-7, 5 scans) MAS_BP_1_128.d

Counts (%) vs. Mass-to-Charge (m/ z)195.02 195.04 195.06 195.08 195.1 195.12 195.14 195.16 195.18 195.2 195.22

Zoom view128x dilution

+1.3 ppm

-1.4 ppm

-0.8 ppm

-0.2 ppm

Counts (%) vs. Mass-to-Charge (m/z)194.94 194.96 194.98 195 195.02 195.04 195.06 195.08 195.1 195.12 195.14

-1x10

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

1.4

1.6

1.8

2

2.2

2.4

2.6

2.8

3

3.2

3.4

3.6

3.8

4

4.2

4.4

4.6

4.8

5

5.2

5.4

5.6

5.8

6

6.2

6.4

6.6

6.8

7

+ Scan (# 3-7, 5 scans) BP_MAS_1_128.d

Counts (%) vs. Mass-to-Charge (m/ z)194.94 194.96 194.98 195 195.02 195.04 195.06 195.08 195.1 195.12 195.14

Zoom view128x dilution

+0.5 ppm0.0 ppm

+1.9 ppm

+0.7 ppm

O

OH

OO O

O

OH

Dilute MAS, keep BP constant Keep MAS constant, dilute BP

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SIMPOSIUM 2006Agilent Restricted

Page 36

Nuevo sistema de adquisición de 4GHzhasta 5 décadas de intervalo dinámico en-espectro

6x10

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

1.4

1.6

1.8

2

2.2

2.4

2.6

2.8

3

3.2

3.4

3.6

3.8

4

4.2

4.4

4.6

4.8

5

5.2

5.4

5.6

5.8

6

6.2

6.4

6.6

6.8

7

7.2

7.4

7.6

7.8

8

8.2

8.4

8.6

8.8

9

+ Scan (# 31-35, 5 scans) niacinamide_erythromycin.d

* 123.055394

425.138434207.007866 329.056151 1521.971969922.009798659.287715 759.355249 1221.991581

Counts vs. Mass-to-Charge (m/ z)100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 900 950 1000 1050 1100 1150 1200 1250 1300 1350 1400 1450 1500 1550 1600 1650 1700

2x10

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

1

1.1

1.2

1.3

1.4

1.5

1.6

1.7

1.8

1.9

2

2.1

2.2

2.3

2.4

2.5

+ Scan (# 31-35, 5 scans) niacinamide_erythromycin.d

734.468956

735.416113

736.387755

Counts vs. Mass-to-Charge (m/ z)734 734.5 735 735.5 736 736.5 737 737.5 738 738.5 739 739.5 740 740.5

In-Scan Dynamic Range

Este ejemplo9x106 / 250 = 3.6 × 104

Máximo3x107 / 250 = 1.2x 105

Max Abd3x107

Erythromycin, 500 fg/µL[M+H]+ = 734.468518 m/zError = +0.6 ppmNiacinamide, 10 ng/µL

[M+H]+ = 123.055289 m/zError = +0.8 ppm

250 cts

9x106 cts

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SIMPOSIUM 2006Agilent Restricted

Page 37

Mezcla de compuestos en infusión; TIC

8x10

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

1

1.1

1.2

1.3

1.4

1.5+ TIC Scan mix995.d

1

Counts vs. Acquisition Time (min)0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1 1.1 1.2 1.3 1.4 1.5 1.6 1.7 1.8 1.9 2 2.1 2.2 2.3

Ang: 16 nMCaf: 25 nMRes: 25 uM

Inyección en flujo

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SIMPOSIUM 2006Agilent Restricted

Page 38

Espectro de masas de mezcla. Notar que solo se ve el picode reserpina en esta escala

5x10

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

1

1.1

+ Scan (0.678-0.795 min, 8 scans) mix995.d Subtract (1)

609.27982

84.95922 523.77439 922.01114

Counts vs. Mass-to-Charge (m/ z)100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600

Reserpina:M+H 609.27982, M neutral 608.27254,abundancia 108,725 cuentas,ppm error; + 1.38 ppm

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SIMPOSIUM 2006Agilent Restricted

Page 39

Espectro de masas de angiotensina

1046.5403

2x10

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

3.5

4

4.5

5

5.5

6

6.5

7

+ Scan (0.678-0.795 min, 8 scans) mix995.d Subtract (1)

Counts vs. Mass-to-Charge (m/z)1040 1042 1044 1046 1048 1050 1052 1054 1056 1058 1060 1062 1064 1066 1068 1070 1072

M+H 1046.54032, M neutral 1045.53304,abundancia 651 cuentas,ppm error; + 1.41 ppm

M+Na 1068.52561, M neutral 1045.53639,abundancia 207 cuentas,ppm error; - 1.8 ppm

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SIMPOSIUM 2006Agilent Restricted

Page 40

Espectro de masas de cafeína

3x10

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

1+ Scan (0.678-0.795 min, 8 scans) mix995.d Subtract (1)

Counts vs. Mass-to-Charge (m/z)193 193.5 194 194.5 195 195.5 196 196.5 197 197.5 198

195.0878Cafeina: M+H 195.08792, M neutral 194.08064, abundance 852 cuentas, ppm error; -1.36

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SIMPOSIUM 2006Agilent Restricted

Page 41

Results from Mass Hunter Formula calculator

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SIMPOSIUM 2006Agilent Restricted

Page 42

Reserpina: confirmación

14 equivalentes de enlaces dobles(DBE)

Consistent isotope ratios

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SIMPOSIUM 2006Agilent Restricted

Page 43

Regla de anillos + enlaces dobles

•“Because of the valances of the elements involved, the total number of rings and double bonds in a molecule of the formula CxHyNzOn will be equal to: ”Interpretation of Mass Spectra, 3rd Edition F.W. McLafferty, pag 23, Univerity Science Books,USA, 1980

•Para la fórmula general CxHyNzOn o el caso general IyIInIIIzIVx dondeI=H,F,Cl,Br; II=O,S; III=N,P y IV=C,Si, etc

Total de anilos más enlaces dobles

Para un ión con número par de electrones (el pseudo-ión molecular), el valor real será acompletado por 1/2

121

21

++− zyx

121

21

++− zyx

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Page 44

Regla de anillos + enlaces dobles: ejemplos

•C5H5N anillos más dobles enlaces = 5 - 2.5 + 0.5 + 1 = 4

Piridina+. (# impar de electrones, GC/MS)

•C7H5O anillos más dobles enlaces = 7 - 2.5 + 1 = 5.5

Ion benzoilo, C6H5CO+. (# par de electrones)

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SIMPOSIUM 2006Agilent Restricted

Page 45

Calculadora de Posibles Fórmulas Empíricas

Permite definir los elementos posibles y su nº máximo de átomos

El perfil de relaciones isotópicas indica que la molécula debe contener 2 azufres y 2 cloros (reduciendo así las posiblidades a 2 de los 4 compuestos)

La calculadora de masas incorporada en el software facilita enormemente la identificación de las posibles fórmulas empíricas

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SIMPOSIUM 2006Agilent Restricted

Page 46

Cuantificación con TOF

•Mito: espectrómetros de masas tipo TOF no se pueden utilizar para cuantificar

•Realidad: históricamente, TOF utilizaba digitalización TDC, por lo que presentan problemas de saturación de señal y no podían cuantificar. En la actualidad, solo un proveedor tiene electrónica TDC.

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SIMPOSIUM 2006Agilent Restricted

Page 47

Cuantificación de Acrilamida

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SIMPOSIUM 2006Agilent Restricted

Page 48

Curva de calibración entre 0.25 y 3 µg/L

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SIMPOSIUM 2006Agilent Restricted

Page 49

XIC of +TOF MS: 334.4 to 335.4 amu from Sample 18 (Blank Poultry+0.5ppb) of Nitrodfuransequence1.wiff Max. 2.0e5 cps.

0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5Time, min

0.0

5000.0

1.0e4

1.5e4

2.0e4

2.5e4

3.0e4

3.5e4

4.0e4

4.5e4

5.0e4

5.5e4

6.0e4

6.5e4

6.8e4

Inte

nsity

, cps

123.06

123.05

Nitrofuranos en aves con resolución unitaria335.1352 -0.7+0.3 uma, 334.4352 – 335.4352 (0.5 ppb de NPAMOZ en matriz, recuperación del 50%)

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SIMPOSIUM 2006Agilent Restricted

Page 50

NPAMOZ 335.1352 ± 0.1uma (335.0352 – 335.2352)

XIC of +TOF MS: 335.0 to 335.2 amu from Sample 18 (Blank Poultry+0.5ppb) of Nitrodfuransequence1.wiff Max. 1.7e5 cps.

0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5Time, min

0.0

2000.0

4000.0

6000.0

8000.0

1.0e4

1.2e4

1.4e4

1.6e4

1.8e4

2.0e4

2.2e4

2.4e4

2.6e4

2.8e4

3.0e4

3.2e4

3.4e4

Inte

nsity

, cps

123.06

S/N = 70:1

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SIMPOSIUM 2006Agilent Restricted

Page 51

NPAMOZ 335.1352 ± 20ppm, 0.009 umas (335.1262-335.1396)

XIC of +TOF MS: 335.1 to 335.1 amu from Sample 18 (Blank Poultry+0.5ppb) of Nitrodfuransequence1.wiff Max. 1.0e4 cps.

0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0Time, min

0

100

200

300

400

500

600

700

800

900

1000

1100

1200

1300

1400

1500

1600

1700

1800

1900

2000

2100

2200

2300

2400

2500

2600

2700

2800

2900

3000

3100

3200

Inte

nsity

, cps

123.05

S/N = 214:1

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SIMPOSIUM 2006Agilent Restricted

Page 52

Curva de calibración NPAMOZ en Pollo

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SIMPOSIUM 2006Agilent Restricted

Page 53

Number ofTransitionsper group

QQQ inMRM

TOF Full Scan2 ppm Accuracy20-50 pg

1

10

100

300

Instrument Detection Limit10 pg1 pg 100 pg

Screening de pesticidas:Límite de detección por TOF es X y es el “punto de cruce”

QQQ5 msec100+ transitions

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SIMPOSIUM 2006Agilent Restricted

Page 54

Comparison matrices for Imidacloprid

0.00E+00

1.00E+06

2.00E+06

3.00E+06

4.00E+06

5.00E+06

6.00E+06

7.00E+06

8.00E+06

9.00E+06

1.00E+07

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2

Concentration (ppm)

Inte

nsity

BufferPepperTomatoLettuceCucumber

Sobreposición de las curvas de calibración paraimidacloprid en 5 matrices

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SIMPOSIUM 2006Agilent Restricted

Page 55

Imazalil en alimento de bebés: pera, naranja y plátano

m/z 297.0556Exactitud de 1 ppm25 pg en columna

S/N ≅ 10

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SIMPOSIUM 2006Agilent Restricted

Page 56

6x10

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

1.4

1.6

1.8

2

2.2

Abundance vs. Acquisition Time (min)0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5 5 5.5 6 6.5 7 7.5 8 8.5 9 9.5 10 10.5 11 11.5

+ BPC Scan Bus-contr-MS_0002.d

1 1

6x10

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

1.4

1.6

1.8

2

2.2

2.4

2.6

+ EIC(386.2570) Scan Bus-contr-MS_0002.d

1 1

Buspirona

Cromatograma pico base

Cromatograma iónico extraídom/z 386.2570

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SIMPOSIUM 2006Agilent Restricted

Page 57

Espectro de masas de la Buspirona

5x10

00.10.20.30.40.50.60.70.80.9

11.11.21.31.41.51.61.71.81.9

22.12.2

Abundance vs. Mass-to-Charge (m/z)100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 120

+ Scan (6.647 min) Bus-contr-MS_0002.d

386.2558922.0098

121.0509

783.4963663.4541302.1744 537.5374

Teórico: 386.2551Observado: 386.2558Error: -1.8 ppm

Reference mass

Reference mass

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SIMPOSIUM 2006Agilent Restricted

Page 58

4x10

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

1.4

1.6

1.8

2

2.2

2.4

2.6

2.8

3

Abundance vs. Mass-to-Charge (m/z)60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420

+ Product Ion (399.3 sec) (386.2536 -> **) Bus-contr-MS_0002.d

122.0717

148.0873

222.1499 265.1934168.1026

386.253998.0966

343.2126292.2099

MS/MS de Buspirona

-3.0 ppm

A=168

H=291

E=150

B=219

N11

12

19

21N4

14

13

20

N1

N22

N26

O28

O27

3

5

2

6

10

247

25

23

15

18

9 8

17

16

C=180D=222

F=265

G=122

Pyrimidine (P)Butyl piperazine

(BP)

Azaspirone decane dione

(ADD)

C-chain

G

AE FD

B

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SIMPOSIUM 2006Agilent Restricted

Page 59

Cromatograma iónico total de una muestra de carotenoides

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SIMPOSIUM 2006Agilent Restricted

Page 60

Métodos tradicionales para el análisis de impurezas

Comparación manual de cromatogramas LC/UV y MS de muestras “control” vs “contaminadas”

La La plantaplanta se se parapara…… el el productoproducto fallfallóó.. .. PorPor queque, , cuandocuando, , dondedonde, , comocomo

Fácil.. Contratese una persona con muchaexperiencia y adquiera muchos datos de GCMS y LCMS (de marcas ya con tiempo en el mercado

ArrojarArrojar los los datosdatos a a todostodos los los colaboradorescolaboradores y y quequeencuentrenencuentren laslasdiferenciasdiferencias……

EnfoqueEnfoque manual, susceptible manual, susceptible a a tendenciastendenciasPrimeroPrimero buscarbuscar lo lo queque se se conoceconoceVerVer laslas diferenciasdiferenciasprincipalesprincipales

AunqueAunque pequepequeññaa, , unauna agujaaguja en un en un palarpalar puedepuedecausarcausar mucho dolormucho dolor

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SIMPOSIUM 2006Agilent Restricted

Page 61

Secuencia de trabajo oara screening de impurezas:

• Objetivo: Detección - ID de impurezas de baja concentración eningredientes activos farmacéuticos

Cuantificacióno

Identificación ID de impurezasRRLC Q(TOF)Control/Muestra (3x)RT, MW, Formulas

Análisispor

objetivo

QQQ MRM

ID CompuestosMass Hunter

MFE(Bases de datos)

Análisisdiferencial

Mass ProfilerID RT, MW

Características únicas

Importar lista de MS/MS objetivoRRLC MS/MS

ID estructuras“AutoMSMS”

EFG MS - MSMS

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SIMPOSIUM 2006Agilent Restricted

Page 62

3D Plot Before3D Plot Before

Molecular Feature Extraction (MFE)Software de reducción automática de datos

Original TICProcessed TIC

3D Plot No Background

Suma de datos reducidos con intensidad de isótopos, aductos, clusters e iones con carga múltiple

Encuentra las características en datos TOF/QTOF Coeluting Features

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SIMPOSIUM 2006Agilent Restricted

Page 63

Molecular Feature Extraction (MFE)Genera

FórmulasEmpíricas

Generación de fórmulas moleculares y búsqueda en bases de datos

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SIMPOSIUM 2006Agilent Restricted

Page 64

Productos de degradación de Amoxicillina y AmoxiClavin

C16H19N3SO5

MW 365.10454Fuente• Tableta 875mg Nueva• Tableta 500mg 09/07

Preparación de la muestra• Tabletas disueltas en 40mL metanol

agua con 0.1% ácido fórmico• Sonicación por 20 minutos• Spin 5 minutos 14000 RPM• Diluír 100 y 1000 veces con agua

S

O

OHO

OOH

N

NH

NH2

CH3

CH3

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SIMPOSIUM 2006Agilent Restricted

Page 65

Condiciones Experimentales

Cromatografía• Agilent 1200 RRLC• Eclipse Plus C18 2.1x100mm 1.8µm

temp en 50oC• Fase móvil:

– Agua /metanol 0.1% FA– Agua /metanol 5mM NH4Ac

• Prueba de varios gradientes– 0 to 95% in 16 Minutes– 0 to 95% in 13 Minutes

• Flujo: 400-500 µL/min

Espectrometría de masas• Agilent 6520 QTOF• ESI ion positivo• Intervalo de masas m/z 100-

1000• Velocidad de adquisición: 2

spectra/s• Gas de secado: 250oC• Masas de referencia internas

– m/z 121 y 922• Fragmentador: 165V• Modo de alta resolución

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SIMPOSIUM 2006Agilent Restricted

Page 66

Buffer en la fase móvilAumento de 10X con acetato de NH4

0.1% Ac. fórmico

5mM Acetato de NH4

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SIMPOSIUM 2006Agilent Restricted

Page 67

Efecto del gradiente

0-95% en 13 minutos

0-25% en 13 minutos

10 Productos de degradación separados

14 Productos de degradación separados

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SIMPOSIUM 2006Agilent Restricted

Page 68

Vía de degradación de Amoxicillin(trabajo con TOF/trampa previo)

NH

O

H NH2 NO

SH

CH3

CH3

H COOH

H

OH

NH

O

H NH2 NH

SH

CH3

CH3

H COOH

H

O OH

OH

NH

O

H NH2 NH

SH

CH3

CH3

H COOH

OH

OH

NH

NH

O

O

NH

S

CH3

CH3

H COOH

NH

O

H NH NO

SH

CH3

CH3

H COOH

H

OH

O

OH

NH2 H

1 2 3

5 4

1 Amoxicillin

2 Amoxicillin penicilloic acid

3 Amoxicillin penilloic acid

4 Diketopiperazine amoxicillin

5 4-Hydroxyphenylglyl amoxicillin

E. Naegele, R. Moritt, J. Am. Soc. Mass Spectrom. 2005, 16, 1670-1676

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SIMPOSIUM 2006Agilent Restricted

Page 69

Masas exactas con alta resolución

-0.96-2.84340.13352340.1331C15H22N3O4Samoxicillin penilloic acid I and II 34.57

-0.23-0.58398.13826398.13803C17H23N3SO6Amoxicillin Acid5.954

-1.04

-0.4

-0.36

Exactitud de masa[ppm]

Exactitudde masa

[mDa]

MasaDeterminada

MasaCalculadaFórmulaNombre del compuestoRT [min]

-2.85366.11286366.1124C16H20N3O5Sdiketopiperazine

amoxicillin 56.269

1.09366.11222366.1124C16H20N3O5Samoxicillin 13.84

-0.93384.12274384.1229C16H22N3O6Samoxicillin penicilloic

acid 23.71

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SIMPOSIUM 2006Agilent Restricted

Page 70

Información estructural de MS/MS C16H19N3SO5

NH

O

H NH2 NO

SH

CH3

CH3

H COOH

H

OH

OH

NH

NH

O

O

NH

S

CH3

CH3

H COOH

C6H10NO2S 3.53 ppm Error

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SIMPOSIUM 2006Agilent Restricted

Page 71

Exclusión Activa - MS y MS/MS de CoeluyentesData-dependent MSn: Active Exclusion

379 543

482

MS/MS of 633

m/z

MS (A)569

633

m/z

MS (B)569

633

m/z

Threshold

478

387

MS/MS of 569

m/z

Tiempo

MS (A)

MS (B)Exclusión activa

“repeat” n=2

….. pico

Maximiza la obtención de información MSn útil evitando la redundante

Los iones precursores ya adquiridos n-veces,

desaparecen de la “lista de exclusión activa” cuando ha

transcurrido el “Exclude time”

Ejemplo auto MS2 con 1 ión precursor, y

exclusión activa con un máximo de 2 repeticiones

Se efectuará el MS/MS de 633, puesto que el de 569 ya se ha adquirido 2 veces

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Page 72

Análisis diferencial usando Mass Profiler

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SIMPOSIUM 2006Agilent Restricted

Page 73

Análisis de impurezas: SW Mass Profiling

Processed TICProcessed TICProcessed TICGrupo A (Impuro)

Processed TICProcessed TICProcessed TICGrupo B (Control)

Alinea datosRT, Masas, Abundancia

All Data RT/Mass

¿Que cambió? Masas/RT >2 veces de cambio

Lo que es único Impureza Control

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SIMPOSIUM 2006Agilent Restricted

Page 74

S/N 5:1, Masas 200-600, RT 1-11 minutos 835 Características

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SIMPOSIUM 2006Agilent Restricted

Page 75

36 características después de filtrarlo

Reducción por patrón isotópico, resta de ruido de fonde y número de iones

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SIMPOSIUM 2006Agilent Restricted

Page 76

Detección de 17 productos de degradación

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SIMPOSIUM 2006Agilent Restricted

Page 77

Composición y búsqueda en base de datos

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SIMPOSIUM 2006Agilent Restricted

Page 78

Software MetID para perfil de impurezas

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SIMPOSIUM 2006Agilent Restricted

Page 79

Vista general MetID1. Compuesto padre: MW, Formula y estructura

2. Transformaciones: Lista de productos de degradación propuestos

3. Criterio de identificación: Pruebas con diferente valor

4. Encontrar compuestos con MFE: Molecular Feature Extraction

5. Encontrar compuestos por AutoMSMS: para datos MSMS

6. Comparación de la muestra: Mass Profiler para diferencias

7. Filtros por perfil isotópico: Excelente para especies halogenadas

8. Filtro por defecto de masas: De los compuestos propuestos

9. Generación de EIC: Confirma la presencia de los compuestos

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Page 80

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SIMPOSIUM 2006Agilent Restricted

Page 81

Entrada del método

Compuesto padreProductos de degradación

propuestos

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SIMPOSIUM 2006Agilent Restricted

Page 82

Criterios de identificación de metabolitos

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Page 83

Resultados de metabolitos

La decloronización oxidativa no esta confirmada por la baja relevancia

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SIMPOSIUM 2006Agilent Restricted

Page 84

Cromatograma iónico extraído

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SIMPOSIUM 2006Agilent Restricted

Page 85

Ajuste de isótopos

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SIMPOSIUM 2006Agilent Restricted

Page 86

Ajuste por patrón de isótopos

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SIMPOSIUM 2006Agilent Restricted

Page 87

Ajuste de isótoposEl patrón ajusta la descloronización oxidativa

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SIMPOSIUM 2006Agilent Restricted

Page 88

Resultados de metabolitos

Decloronización oxidativa confirmada al 100%

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SIMPOSIUM 2006Agilent Restricted

Page 89

Predicción de fórmulas elementalesDecloronización oxidativa

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SIMPOSIUM 2006Agilent Restricted

Page 90

Predicción de fórmula elementalHidroxilación

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SIMPOSIUM 2006Agilent Restricted

Page 91

Productos de degradación propuestosCalificados por defecto de masas y patrón isotópico

Determinemos la composición de MW 411

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SIMPOSIUM 2006Agilent Restricted

Page 92

Las masas exactas generan la composición, hidrólisis ácida (H2O+CO2H-OH)

Masa exacta de los iones fragmento

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SIMPOSIUM 2006Agilent Restricted

Page 93

Espectros MSMS sobrepuestos Padre/Producto

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SIMPOSIUM 2006Agilent Restricted

Page 94

MSMS del compuesto MW 380

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SIMPOSIUM 2006Agilent Restricted

Page 95

¿Para interpretar espectros?

•Moléculas pequeñas de interés ambiental o alimentos– Merck, NIST…

•Moléculas pequeñas tipo metabolitos– Metlib (colaboración con el Scripps Institute

•Proteínas– Spectrum Mill para comparar datos en bases de datos como SwissProt y

obtener identidad de proteínas

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Page 96

Monograph Number: 5723

Title: MalathionCAS Registry Number: 121-75-5

CAS Name: [(Dimethoxyphosphinothioyl)thio]butanedioic acid diethyl ester

Additional Names: diethyl mercaptosuccinate S-ester with O,O-dimethyl phosphorothioate; S-(1,2-dicarbethoxyethyl) O,O-dimethyldithiophosphate; insecticide no. 4049; carbofos; malathon (obsolete); mercaptothion; phosphothion

Manufacturers' Codes: ENT-17034

Trademarks: Cythion; Derbac-M (International); Malamar 50; Malaspray; Organoderm (Mundipharma); Prioderm (Coates & Cooper); Suleo-M (International)

Molecular Formula: C10H

19O

6PS

2

Molecular Weight: 330.36.Percent Composition: C 36.36%, H 5.80%, O 29.06%, P 9.38%, S 19.41%

Literature References: Cholinesterase inhibitor. Prepn: Johnson et al., J. Econ. Entomol. 45, 279 (1952); Cassaday, US 2578652 (1951 to Am. Cyanamid). Purification: Usui, US 2962521(1960 to Sumitomo). Treatment of Pediculus humanus (head lice) infestation: D. Taplin et al., J. Am. Med. Assoc. 247, 3103 (1982). Toxicity data: T. B. Gaines, Toxicol. Appl. Pharmacol. 14,515 (1969). Review of distribution, transport and fate in the environment: M. S. Mulla et al., Residue Rev. 81, 1-159 (1981); of carcinogenic risk: IARC Monographs 30, 103-129 (1983).

Properties: Deep brown to yellow liq, mp 2.9°. bp0.7

156-157°. Characteristic odor. d425 1.23. n

D25 1.4985. Vapor pressure at 30°: 4 × 10-5 mm Hg. Slightly sol in water (145 ppm).

S

PS

H3COH3CO

O CH3

O

O

O

CH3

Búsqueda en bases de datos

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Búsqueda en bases de datos: Metabolitos

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Búsqueda en bases de datos, Proteínas

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Identificación de proteínas

Traten de leer rápidamente sin detenerse y al final entenderánel mensaje.

“Sgeun un etsduio de una uivenrsdiad ignlsea, no ipmotra el odren en el que las ltears etsan ersciats, la uicna csoaipormtnate es que la pmrirea y la utlima ltera esten ecsritas en la psiocion cocrrtea. El rsteo peuden estar ttaolmntee mal y aunpordas lerelo sin pobrleams. Etso es pquore no lemeos cadaltera por si msima snio la paalbra cmoo un tdoo. Pesornamelnteme preace icrneilbe..."

¡Itresatne vreadd!

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Conclusiones• Para ayuda en la elucidación de identidad, mientras más datos se

tengan, la identificación es más fácil– MS no es suficiente– MS/MS ayuda a construír la molécula como un rompecabezas– MS de alta exactitud brinda mucha ayuda y complementa a MS/MS

• Análisis diferencial: MassProfiler

• Identificación: Personal Metlin Database, Spectrum Mill, etc

• Perfil de impurezas: SW MetID con datos MS/MS

• En suma, Agilent technologies ofrece el portafolio de MS máscompleto

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¿Como funciona un espectrómetro de masas?

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Portafolio LC/MS Agilent 6000 Series

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