Centro De Bachillerato Tecnológico Industrial Y De Servicios No. 134

Identifica Microrganismos Con Base En Técnicas Bacteriológicas

Q.B.P. Teresita Alicia Vélez Carbajal

Escherichia Coli

Resumen

3º “C”

Noviembre del 2015

Luis Andrés Torreblanca Godínez

ESCHERICHIA COLICaracterísticas generales

Es el miembro más frecuente e importante del género Escherichia la cual incluye siete especies (E. adecarboxylata, E. alberti, E. blattae, E. fergusonii, E. hermannii, E. vulneris y E. coli).

Este microorganismo se asocia a múltiples enfermedades, incluida la gastroenteritis e infecciones extraintestinales, como las urinarias (ITU); se presenta como un comensal del intestino humano pocas horas después del nacimiento. Escherichia coli y otras bacterias son necesarias para el funcionamiento correcto del proceso digestivo, además de ser responsables de producir vitaminas B y K.

Son bacilos Pertenece al grupo de las enterobacterias. El tamaño promedio de los bacilos es de 0.5 µ de ancho por 3 µ de largo En la tinción de Gram se tiñen de rojo (Gramnegativas). Algunas especies son móviles (por flagelos perítricos) No esporuladas Fermenta la glucosa y la lactosa Son catalasa positiva Oxidasa negativos y reduce nitratos a nitritos. Aerobios o anaerobios facultativos Posee fimbrias Existen cepas oportunistas y cepas patógenas.

Transmisión

En el tubo digestivo existen grandes cantidades de E. Coli. Aunque estos microorganismo pueden comportarse como patógenos oportunistas cuando los intestinos se perforan y las bacterias acceden a la cavidad peritoneal, la mayor parte de E. Coli que causan enfermedad digestiva y extraintestinal lo hacen porque han adquirido factores de virulencia secundarios codificados en plásmidos, isoltes de patogenicidad o en ADN de bacteriófagos. La eficacia de E. Coli como patógeno se caracteriza por el hecho de que estas bacterias son: bacilos gramnegativos que con más frecuencia se aíslan de pacientes con sepsis y

responsables de más del 80% de las ITU adquiridas en la comunidad y del mismo número de las infecciones hospitalarias. La mayor parte de las infecciones son endógenas, de forma que E. Coli de la propia flora microbiana normal del paciente consigue ocasionar infección cuando sus defensas se alteran. También hay tipos de E. Coli que se pueden transmitir por persona a persona o por el consumo de alimentos y/o agua contaminada.

Patogenia

E. Coli posee una amplia variedad de factores de virulencia. Además de los factores generales que comparten todos los miembros de la familia Enterobacteriaceae, las cepas de Escherichia Coli poseen unos factores de virulencia especializados que se pueden clasificar en dos categorías: adhesivas y exotoxinas

Las cepas de Escherichia coli causantes de diarrea se han agrupado en cinco tipos patógenos, cada uno definido por sus propiedades de virulencia: E. coli enteropatógena (ECEP), enterotoxigénica (ECET), enterohemorrágica (ECEH), enteroinvasiva (ECEI) y enteroagregativa (ECEA). Cada uno de los grupos patógenos de E. coli presenta características distintivas relacionadas con su epidemiología, patogénesis, manifestaciones clínicas y tratamiento.

Enfermedades Por Eschericiha Coli

E. Coli enteropatógena (ECEP)

Las cepas enteropatogeneas de E. Coli fueron las primeras en asociarse a la enfermedad diarreica y continua siendo la principal causa de diarrea infantil en los países pobres. La enfermedad es infrecuente en los países desarrollados, salvo por la aparición de brotes pero frecuentes en

Síndromes clínicos Escherichia coli patógenas

Enteritis/ enfermedad diarreica

E. coli enteropatogénica - ECEPE. coli enterohemorrágica - ECEHE. coli enterotoxigénica, ECETE. coli enteroagregativa - ECEAE. coli enteroinvasiva - ECEI

Infecciones del tracto urinario E. coli uropatogénica - UPECSepsis/meningitis MNEC

guarderías y la enfermedad es poco frecuente en niños mayores y adultos, porque se han desarrollado una inmunidad protectora. Estas presentan la capacidad de adherirse a células HEp-2 (línea celular de carcinoma faríngeo humana) formando microcolonias. Este patrón fue denominado posteriormente como adherencia localizada. Una vez formadas las microcolonias comienza una segunda fase de adherencia, con la destrucción de las microvellosidades intestinales, proceso al que se ha denominado como esfacelamiento. La falta de microvellosidades permite a las bacterias adherirse en forma íntima a receptores de la membrana presentes en la célula epitelial.

Factores de virulencia

La infección se caracteriza por la adhesión bacteriana a las células epiteliales del intestino delgado con la destrucción posterior de las microvellosidades (histopatología por unión/borrado [U/B]). La agregación inicial de las bacterias que determina la formación de microcolonias en la superficie de las células epiteliales viene mediada por los Pili formadores de haces (BFP) codificados por plásmidos. Los estudios posteriores del anclaje vienen regulados por los genes codificados por plásmidos. Los estadios posteriores vienen regulados por los genes codificados en el islote de patogenicidad. Este islote de más de 40 genes es responsable de la unión a la superficie de la célula anfitriona y su destrucción. Tras la unión laxa mediada por los BFP, se produce una secreción activa de proteínas hacia el interior de la célula anfitriona epitelial por el sistema de secreción de tipo III. Una proteína, el receptor de la intimina translocada (Tir), se inserta en la membrana epitelial y actúa como receptor de una adhesina bacteriana de la membrana externa, la intimina. La unión de la intimia con Tir determina la polimerizaron de la actina y la acumulación de elementos del citoesqueleto por debajo de las bacterias ancladas, con pérdida de la integridad de la superficie celular y muerte de la célula

Cuadro clínico

Es caracterizada por la lesión histopatológica de la superficie apical de los enterocitos, conocida como "Adherencia y y Esfascelamiento" (A/E).

Afecta la mucosa intestinal al conducir a la disolución del borde en cepillo por vesiculación de las microvellosidades, con pérdida de disacaridasas, lo que a su vez altera la absorción y conduce a la producción de una diarrea secretora, que puede estar asociada a fiebre.

Una vez que se inician los trastornos intestinales, las manifestaciones de la enfermedad incluyen:

Diarrea Anorexia Desgaste rápido, que puede causar la muerte en el transcurso de días si no

se maneja adecuadamente.

Aunque la diarrea ECEP se auto limita, esto depende de la respuesta inmune del hospedero, y puede dar lugar a diarrea secretora persistente, deshidratación y muerte.

E. Coli enteroinvasiva (ECEI)

Las cepas de E. Coli enterovasiva son infrecuentes, las cepas patogénicas se asocian fundamentalmente a un número limitado de serotipos O: O124, O143 y O164. Las cepas presentan una estrecha relación con las propiedades fenotípicas y patógenas de Shigella. Las bacterias son capaces de invadir y destruir el epitelio colonico para producir una enfermedad que se caracteriza inicialmente por diarrea acuosa.

Factores de virulencia

Las cepas ECEI se internalizan y reproducen dentro del citoplasma de las células epiteliales, a las que destruyen. También penetran a los macrófagos. Diversos estudios han concluido que además de genes cromosómicos involucrados en la virulencia, ECEI porta un plásmido de 140 megadaltones (mDa) indispensable para conferir el fenotipo invasivo a estos microorganismos.

Cuadro clínico

Estas afectan la mucosa del colon y producen un cuadro disentérico similar, aunque menos severo, al que produce Shigella dysenteriae tipo 1. Las manifestaciones clínicas asociadas con ésta infección son:

Evacuaciones de escasas acompañadas de moco y sangre Dolor abdominal tipo cólico Fiebre. Presencia de sangre y leucocitos en heces

E. Coli enterohemorrágica (ECEH)

Las cepas de E. Coli enterohemorragica son las cepas que causan con mayor frecuencia enfermedad en los países desarrollados. La enfermedad por ECEH es más frecuente en los meses templados y la incidencia máxima se describe en niños menores de 5 años. La mayor parte de las infecciones se explican por el consumo de ternera u otros derivados cárnicos poco cocidos, agua, leche no pasteurizada o zumos de fruta, verduras crudas como espinacas o frutas. La transmisión se describe de persona a persona.

Factores de virulencia

La cepa más frecuente de ECEH es el serotipo O157:H7. Esta cepa es un clon evolucionado a partir de ECEP y expresa actividad de anclaje y borramiento. Además estas cepas han adquiridos la toxina Shiga (es decir Stx-1, Stx-2 o amabas). Stx-1 es básicamente idéntica que la toxina Shiga producida por Shigella disenteriae; Stx-2 muestra una homología del 60%. Ambas toxinas se adquieren a partir de bacteriófagos lisogenicos. Ambas poseen una subunidad A y cinco subunidades B, y estas últimas se unen a un glucolipido especifico de la célula del organismo anfitrión (globo triaosilceramida, GB3).

Cuadro clínico

En esta se presenta:

Colitis hemorrágica que es un padecimiento autolimitado, caracterizado por diarrea de inicio brusco con dolor abdominal.

Las evacuaciones líquidas se acompañan de una descarga hemorrágica. El síndrome urémico hemolítico (SHU) es una de las principales causas de

daño renal en niños, se define por la presencia de anemia hemolítica microangiopática, insuficiencia renal aguda y trombocitopenia.

E. Coli enteroagregativa (ECEA)

Las cepas de E. Coli enteroagretativa se ha visto implicada en una diarrea acuosa, persistente y con deshidratación en niños de los países en vías de desarrollo y en personas que han viajado a estos países. Se han notificado brotes de gastroenteritis pos ECEA en EE.UU., Europa y Japón y es posible que este microorganismo sea una causa importante de diarreas infantiles en los países desarrollados. Esta es una de las pocas bacterias asociadas a diarrea crónica y retraso del crecimiento en niños

Factores de virulencia

Estas producen autoaglutinacion en una disposición en pilas de ladrillos. Este proceso viene mediado por las fimbrias de adherencia agregantes (AAF1), unas adhesinas parecidas a los BFP responsables de la formación de microlonias en ECEP. Se han descrito otras fimbrias de adherencia agregantes (AAF/11, AAF/111). Tras la adherencia de ECEA sobre la superficie del intestino se estimula la secreción de moco, lo que condiciona la formación de una biopelicula gruesa. Esta película protege a las bacterias agregadas frente a los antibióticos y las células fagociticas. Además, dos grupos de toxinas se asocian a ECEA: la toxina termoestable enteroagregante (EAST) y la toxina codificada por plásmidos (PET). EAST incluye sobre la secreción de líquido y guarda relación antígena con la toxina termoestable de ECET. PET induce también la secreción de líquido.

Cuadro clínico

Las características clínicas de la infección intestinal por EAEC son:

Diarrea secretora acuosa con moco y sangre, y febrícula. Un gran porcentaje de pacientes presentan lactoferrina fecal detectable (un

indicador sensitivo de leucocitos fecales) y niveles elevados de IL-8 en las heces.

PET tiene efecto estimulante sobre macrófagos e induce en estos, la expresión de interleucinas proinflamatorias. Esto sugiere que la infección por EAEC puede estar acompañada de una forma sutil de inflamación de la mucosa.

E. Coli enterotoxigena (ECET)

La enfermedad causada por E. Coli enteroxigena se produce principalmente en los países en vías de desarrollo. Las infecciones son más frecuentes en niños pequeños en estos países o en viajeros a estas regiones. El inoculo de la enfermedad es alto, de forma que las infecciones se adquieren fundamentalmente por el consumo de aguas o alimento contaminados por heces. La transmisión persona a persona es imposible.

Factores de virulencia

Sintetiza dos clases de enterotoxinas: toxinas termolábiles (LT-1, LT-11) y toxinas termoestables (STa y STb). Mientras que la LT.11 no se asocia a enfermedad en el ser humano, LT-1 es funcional y estructuralmente semejante a la toxina del cólera y se asocia a enfermedad en el ser humano. Esta toxina está formada por una subunidad A y por cinco subunidades B idénticas. Las subunidades B se unen al mismo receptor que la toxina del cólera (gangliosido GM1). Así como a otras glucoproteínas de superficie en las células epiteliales del intestino delgado. STa, pero no STb, se asocia a la enfermedad en el ser humano STa es una toxina pequeña y monomerica que se une al receptor transmebrana de la guanilato ciclasa, lo que provoca un aumento de las concentraciones de guanosina monofosfato cíclico (GMPc) y la posterior hipersecreción de líquidos. Los genes de LT-1 y STa se encuentran en plasmido tranferible, que puede portar también los genes de las adhesinas (CFA/1, CFA/11, CFA/111). Los factores de colonización son fimbrias que reconocen unos receptores glucoproteicos específicos de la célula anfitriona (definen la especificidad de anfitrión). La aparición de enfermedad requiere la actuación de la toxina y los factores de colonización. La enfermedad causada por la toxina termoestable es indistinguible de la asociada a la toxina termolábil

Cuadro clínico

El cuadro clínico que inducen estas bacterias es similar al que se observa en el caso del cólera:

Presentándose de ocho a 12 evacuaciones al día por un periodo de cuatro a cinco días.

Las cepas ETEC son una causa importante de diarrea en niños menores de cinco años de edad y una de las causas más frecuentes de diarrea del viajero.

Patotipos de E. coli diarrogénica para el humano

E. coli uropatogénica (ECUP)La mayoría de los bacilos gramnegatios que producen IAU se originan en el colon, contaminan la uretra, asciende hasta la vejiga y pueden migrar hasta el riñón o la próstata. Aunque la mayoría de las cepas de E. Coli puede producir IAU, la enfermedad se relaciona con mayor frecuencia a ciertos serogrupos específicos.

Factores de virulenciaEstas bacterias son especialmente virulentas por su capacidad para producir adhesinas (principalmente pili P, AAF/11 y Dr), las cuales se unen a las células que recubren la vejiga y el aparato urinario superior (evitando la eliminación de las bacterias durante la micción) y hemolisisna H1Ya, que lisa los eritrocitos y otros tipos celulares (llevando a la liberación de citosinas y la estimulación de la respuesta inflamatoria).

Cuadro clínico Asintomático Su principal enfermedad son las infecciones urinarias

E. Coli (ECMN)Meningitis

E. Coli y los estreptococos del grupo B causan la mayoría de las infecciones del SNC en los niños menores de 1 mes. Alrededor del 75% de las cepas de E. Coli poseen antígeno capsular K1. Este serogrupo esta habitualmente presente en el aparato digestivo de las mujeres embarazadas y de los recién nacidos. Son embrago, no se conoce cuál es el mecanismo que gobierna la predilección de este serogrupo por la enfermedad en los neonatos.

SepticemiaDe forma característica, la septicemia producida por los bacilos gramnegativos como E. Coli proviene de infecciones del aparato urinario o digestivo. La mortalidad que se asocia a la septicemia por E. coli es elevada en paciente cuya inmunidad esta alterada, o en los que la infección primaria se localiza en el abdomen o en sistema nervioso ventral (SNC)

Diagnóstico de laboratorio

Toma de muestra

La toma de muestras se lleva a cabo de materiales generalmente estériles, como el líquido cefalorraquídeo o un tejido que se obtiene durante una cirugía. Las muestras de se pueden inocular en medios de cultivos selectivos que se usan para el cultivo de muestras que suelen estar contaminadas por otros microorganismos (p. ej., esputo, heces) también los diferenciales que permite separar las enterobacterias que fermentan la lactosa de las cepas que no la fermentan, el uso de estos medios selectivos y diferenciales proporcionan información que puede ser valiosa para iniciar el tratamiento antimicrobiano empírico. El diagnóstico de las cepas de E. coli responsables de la gastroenteritis se suele realizar en laboratorios de referencia.

IdentificaciónSe han empleado dos abordajes: cultivo y detección de toxinas. A diferencia de la mayor parte de E. coli, muchas cepas de ECEH no fermentan el sorbitol. Por eso, el agar de MacConkey con sorbitol (S-MAC) se ha empleado para la detección selectiva en las heces de bacterias gramnegativas negativas para sorbitol (colonias incoloras), que posteriormente se analizan mediante pruebas de serogrupo y bioquímicas como E. colí 0157, el serotipo más frecuente de ECEH. La limitación de este abordaje es que algunas cepas de 0157 y muchos otros

serotipos de ECEH fermentan el sorbitol y podrían pasar desapercibidos con este tipo de detección selectiva. El método preferido para la detección de ECEH es cultivar las muestras de heces en agar de MacConkey no selectivo y después valorar las colonias aisladas para detectar la producción de toxina con las pruebas comerzialiadas.

Otro mecanismo es el análisis serológico que es muy útil para determinar la significación clínica de una cepa y para clasificar las cepas con fines epidemiológicos. Sin embargo, la utilidad de este procedimiento está limitada por las reacciones cruzadas con enterobacterias antigénicamente relacionadas y con microorganismos de otras familias bacterianas.

Debido a la presencia normal de este agente en el organismo, el diagnóstico debe estructurarse conjuntamente con las manifestaciones clínicas y la respuesta al tratamiento. El cultivo, por sí solo, únicamente nos informa de la existencia de levaduras, pero no diferencia la colonización de la infección. Por tanto, la observación de levaduras en el examen directo es imprescindible para establecer el diagnóstico de certeza.

Medios de Cultivo

En el laboratorio esta bacteria crece en:

Agar MacConkey

Este separa las bacterias fermentadoras de la lactosa. Escherichia coli produce colonias rosadas, circulares y de 2 – 3 mm.

Agar EMB

Permite la diferenciación de especies fermentadoras de la lactosa. Klebsiella pneumoniae y Escherichia coli presentan colonias que varían del púrpura a verde metálico estas forman colonias circulares que presentan un centro grande y oscuro, Su tamaña varía entre los 1 – 2 mm.

Agar SS

Este se utiliza para aislar bacterias lactosa negativa como Salmonella y Shigella. Especies de la familia Enterobacteriaceae lactosa – positivas, como Escherichia coli, presentan colonias rosadas, ovaladas y lisas aproximadamente de 1 - 3 mm. en este tipo de medio

Pruebas bioquímicas

Las pruebas Bioquímicas son la forma más convincente del diagnóstico de las enfermedades infecciosas, mediante este proceso se determinan el género y las especies bacterianas de interés. Cada tipo bacteriano tiene un cuadro de reacciones específicas donde se comprueba el resultado de las reacciones y son la base de la identificación de los diferentes agentes bacterianos. En general para la identificación de enterobacterias se sugiere realizar las siguientes pruebas:

Agar TSIEs un medio de cultivo diferencial basado en la capacidad de los bacilos gram negativos de fermentar carbohidratos, de producir H2S y producir gas.Se observa en el tubo el pico y el fondo ácido

Hay 1% de positividad para la producción de H2S en cepas de E. coli.

Prueba de Rojo de metilo (RM)

Identifica especies de bacterias que producen ácidos a partir de glucosa.

99% de positividad para cepas de E. coli.

Voges – Proskauer (VP):En esta prueba se detecta la producción de acetil-metilcarbinol (acetoína), el cual se convierte a diacetilo en presencia de KOH y O2 atmosférico. El diacetilo es convertido posteriormente en un complejo rojo en presencia de α-naftol y creatinina. La producción de acetoína es una vía alternativa del metabolismo del ácido pirúvico, donde se producen cantidades pequeñas de ácidos mixtos que pueden ser insuficientes para dar una prueba RM positiva. Por este motivo, la mayoría de las especies de la familia Enterobacteriaceae son VP positivo y RM negativo y viceversa.

Esta prueba es negativa para cepas de E. coli.

Prueba de UreasaLos microorganismos que hidrolizan la urea a través de la enzima ureasa, liberan amoníaco lo cual produce un cambio de color rojo en el medio. El agar urea de Christensen permite la detección de menores cantidades de amoníaco para aquellos microorganismos que producen menores cantidades de ureasa se evalúan con este método.

1% de positividad para esta prueba en E. coli.

Producción de IndolEl indol es uno de los productos de la degradación del aminoácido triptofano. Para su detección la bacteria es cultivada en caldo triptona y posteriormente se utiliza el reactivo de Ehrlich, el cual es más sensible que el reactivo de Kovacs cuando se estudian bacilos no fermentadores o anaerobios cuya producción de indol es mínima.

98% de positividad para esta prueba en E. coli.

Simmos Citrato Agar Esta prueba determina la capacidad de un microorganismo de utilizar el citrato de sodio como única fuente de carbono para el metabolismo y crecimiento.

1% de positividad para cepas de E. coli.

Lisina Hierro AgarDecarboxilación de la lisina:-Prueba Positiva: Pico violeta/fondo violeta.-Prueba Negativa: Pico violeta/fondo amarillo

Kligler Hierro Agar

El medio contiene una cantidad limitante de glucosa y concentración 10 veces mayor de lactosa. Las enterobacterias y los fermentadores de glucosa comienzan metabolizando este azúcar. Una vez que se ha reducido toda la glucosa piruvato, este se metaboliza por el ciclo de Krebs formando productos finales ácidos.

K/A: fermentación de glucosa solamente (Pico de flauta alcalino/profundidad ácida). Característico de bacterias no fermentadores de lactosa como Shigella.

A/A: fermentación de glucosa y lactosa (Pico de flauta ácido/ profundidad ácida). Característicos de E. coli y grupo Klebsiella-Enterobacter.

K/K: No fermentación de glucosa y lactosa (pico de flauta alcalino/profundidad alcalina). Característico de bacterias no fermentadoras como Pseudomas aeruginosa

La presencia de burbujas, o ruptura del medio de cultivo, indica que el microorganismo produce gas.

El ennegrecimiento del medio indica que el microorganismo produce ácido sulfhídrico.

Caldo rojo fenol y manitol

Determinar la capacidad de un organismo de fermentar un carbohidrato incorporado a un medio, produciendo ácido y/o gas en una campana de Durham; el medio es lsolido y como indicador contiene rojo de fenol

Caldo rojo fenol y sacarosaEl caldo rojo de fenol utilizado para la diferenciación de cultivos puros, en base a su capacidad para fermentar la sacarosa y el manitol. La Capacidad de las baterías de fermentar carbohidratos es utilizada como un criterio para su identificación. La peptona probé la fuente de nitrógeno para el buen desarrollo de los microorganismos, sólo mantiene el balance osmótico del medio y el rojo de fenol actúa como indicador, virando de color rojo y un naranja amarillo en presencia del ácido producido por la fermentación del azúcar.

BIBLIOGRAFIA:

https://www.nlm.nih.gov/medlineplus/spanish/ecoliinfections.html http://www.facmed.unam.mx/deptos/microbiologia/bacteriologia/escherichia-

coli.html https://biotaetscientia.wordpress.com/tag/medio-de-cultivo/ Microbiologia Medica, Sexta edición

Patrick R. Murray, Ken S. Rosenthal, Michael A. Pfaller Edit. Elsevier. Helsevier España - 2009