ELECTROFORESIS

La electroforesis es un mtodo de laboratorio en el que se utiliza una corriente elctrica controlada con la finalidad de separar biomoleculas segn su tamao y carga elctrica a travs de una matriz gelatinosa.

La gran mayora de macromolculas estn cargadas elctricamente y, al igual que los electrolitos, se pueden clasificar en fuertes y dbiles dependiendo de la constante de ionizacin de grupos cidos y |bsicos. Por ejemplo los cidos nucleicos son policidos fuertes.

[ ] La separacin puede realizarse sobre la superficie hidratada de un soporte slido ejemplo:

Electroforesis a travs de una matriz porosa (electroforesis en gel),

Electroforesis en acetato de celulosa, (en papel)

Electroforesis en disolucin (electroforesis libre).

Dependiendo de la tcnica que se use, la separacin obedece en distinta medida a la carga elctrica de las molculas y a su masa.

1.- ELECTROFORESIS DE GEL.

La electroforesis en gel es un grupo de tcnicas empleadas por los cientficos para separar molculas basndose en propiedades como el tamao, la forma o el punto isoelctrico. La electroforesis en gel se utiliza generalmente con propsitos analticos, pero puede ser una tcnica preparativa para purificar molculas parcialmente antes de aplicar espectrometra de masas, PCR, clonacin o secuenciacin de ADN.

La primera parte del nombre, electroforesis, se refiere a la fuerza electromotriz que es empleada para desplazar las molculas a travs del gel. Al situar las molculas en el gel y aplicar una diferencia de potencial elctrico, las molculas se mueven a diferentes velocidades, hacia el ctodo, si estn cargadas positivamente, y hacia el nodo, si estn cargadas negativamente (en una electroforesis, los electrodos se comportan igual que en una cubeta electroltica).

La segunda parte del nombre, gel se refiere a la matriz usada para separar las molculas. En muchos casos un gel es un polmero entrelazado de porosidad controlable.

PROCESO DE ELECTROFORESIS EN GEL EN ESTE CASO GEL AGAROSA EN EL ANALISIS DEL ADN

La agarosa es un polisacrido (originalmente obtenido de algas, como el agar-agar, pero de composicin homognea), cuyas disoluciones (tpicamente de 0.5 a 2 %) poseen la propiedad de permanecer liquidas por encima de 50 grados C y formar un gel, semislido al enfriarse. Este gel esta constituido por una matriz o trama tridimensional de fibras polimricas embebida en gran cantidad de medio lquido, que retarda el paso de las molculas, se usa usualmente para separar molculas grandes de alrededor 20.000 nucletidos

1) Fabricacin del gel: -Agregar la agarosa solida a un frasco. -Agregar el buffer para disolver la agarosa. -Colocar el fresco en el microondas por un tiempo. -Agregar la solucin a la cuba. -Colocar el peine para hacer las calles. -Dejar solidificar y luego quitar el peine con cuidado. 2) Configuracin de la caja de electroforesis: -Poner solucin buffer en la caja de electroforesis. -Colocamos la cuba en la solucin anterior.

3) Visualizacin de la muestra de ADN en el gel: -Tomar buffer descarga con una micro pipeta. -Mezclar con la muestra de ADN en un eppendorf. -Tomar esta mezcla con la micropipeta y volcar en una calle de la cuba. -Tomar con la micropipeta(con otro tip) los Standard de tamao. -Colocar esta solucin en la 2da calle. 4) Conexin de la corriente elctrica y corrida del gel: -Enchufar los cables de la caja de electroforesis. -Encender el aparato (se aplica una diferencia de potencial). 5) Tincin del gel y anlisis de los resultados: -Se quita el gel de la cuba. -Se introduce el gel en un recipiente lleno de bromuro de etidio. - Luego de un tiempo se retira el gel y expone a radiacin UV. -Se analizan los resultados.

Revelado y visualizacin

Cuando se ha completado la electroforesis, las molculas ms pequeas han llegado al nodo. Entonces se pueden 'revelar' mediante la adicin de un colorante especfico para hacerlas visibles. Se emplean compuestos como el bromuro de etidio, para los cidos nucleicos, o tincin fluorescente, para las protenas. Asimismo se emplean otros mtodos para visualizar la separacin de la mezcla en el gel. Si el reactivo es fluorescente bajo la luz UV, se puede simplemente hacer una fotografa de la placa bajo dicha luz. Tambin, si las molculas contienen tomos radiactivos se puede efectuar una autorradiografa.

Las bandas en diferentes calles que se encuentran a la misma altura contienen molculas que han atravesado el gel a la misma velocidad. Existen marcadores especiales que contienen una mezcla de molculas de tamao conocido. Si se hace una electroforesis de una mezcla desconocida y se agrega una calle con un determinado marcador, las bandas observadas en el marcador pueden ser comparadas con las obtenidas en la mezcla desconocida para determinar su tamao o punto isoelctrico. Sabiendo que el desplazamiento de las molculas es proporcional al logartmo de la masa, se puede estimar el peso molecular de una molcula de inters comparandola con el patrn de migracin de los marcadores.

PROBABILIDADES DE ERROR

La electroforesis es una tcnica muy sensible y puede ser afectada por muchos errores experimentales, como la temperatura durante la polimerizacin y la corrida del gel, velocidad de la polimerizacin, niveles de catalizador, pureza del reactivo, tiempo de corrida y preparacin de las muestras.

2.- ELECTROFORESIS EN PAPEL

Es la tcnica en la que se emplea el papel como medio de difusin. Esta tcnica est limitada casi totalmente a separaciones de pequeas molculas como los aminocidos, pptidos y nucletidos, y casi siempre se usan voltajes relativamente altos.

Es muy til en los laboratorios clnicos por su fcil manipulacin y su fcil desarrollo. Pueden hacerse en tiras de acetato o celulosa, que son qumicamente ms homogneas y ms transparentes.

El Acetato de Celulosa se utiliza tambin para separar lipoprotenas.

PROCESO CON ELECTROLISIS DE PAPEL.

La muestra se aplica sobre una tira de papel de filtro. Humedecido con unas dos soluciones tampn, bien en el centro o en cualquiera de los extremos del papel, dependiendo de las sustancias a separar y del PH del tampn. Los extremos de las tiras se sumergen en dos recipientes separados que contienen la disolucin tampn y en los cuales se conectan los electrodos. Los iones migran al electrodo de carga opuesta.

Esta tecnica puede ser combinada con la cromatografa en papel, separndolos de acuerdo a su carga y a su polaridad. Tambin se puede realizar una electroforesis en dos dimensiones en la cual se usan buffer con diferente pH para cada dimensin.

NOTA:

Un tampn, buffer, solucin amortiguadora o solucin reguladora es la mezcla en concentraciones relativamente elevadas de un cido dbil y su base conjugada, es decir, sales hidrolticamente activas. Tienen la propiedad de mantener estable el pH de una disolucin frente a la adicin de cantidades relativamente pequeas de cidos o bases fuertes. Cada sistema buffer tiene su propio rango efectivo de pH, el cual depender de la constante de equilibrio del cido o base empleado. Son importantes en el laboratorio y en la industria, y tambin en la qumica de la vida

Se conecta los electrodos a una fuente de tensin continua y se aplica una diferencia potencial durante el tiempo adecuado. Al aplicar una corriente directa, las molculas cargadas de la mezcla emigran hacia los electrodos de polaridad opuestas formando bandas de papel. La velocidad de emigracin de una molcula, depende preferentemente de su carga.

Desventajas:

Si el papel es fino se puede desgarrar con facilidad.

Si el papel es grueso las bandas se distrorsionan.

Se producen interaccion entre las proteinasy los grupos hidroxilos de la celulosa de papel, por lo tanto la migraccion se frena.

ELECTROFORESIS LIBRE

Sin lugar a dudas, la forma ms sencilla de realizar una electroforesis consiste en un tubo en forma de U donde se introduce un electrolito y la muestra adems por supuesto, de los dos electrodos. Al conectar el sistema las macromolculas comenzarn a migrar por el tubo hacia el polo opuesto y as irn diferencindose segn su carga. Uno de los inconvenientes que presenta esta tcnica es la fluidez del medio, o sea, la facilidad con la que las partculas difunden, de modo que al cortar la corriente nos encontraramos con la tendencia natural al equilibrio, con lo que no habramos logrado nada