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Recomendaciones prácticas para maximizar el uso de columnas
en HPLC y UPLC
Las claves del éxito para análisis por HPLC y/o UPLC: afrontando los problemas cromatográficos
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Recomendaciones prácticas para maximizar el uso de columnas
en HPLC y UPLC
Las claves del éxito para análisis por HPLC y/o UPLC: afrontando los problemas cromatográficos
A través del chat resolveremos las dudas y cuestiones que vayan surgiendo.
Olatz Mitxelena Soporte Técnico Comercial División Columnas
Elena Chiquero Responsable ventas División Columnas área Madrid
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Desafíos en los laboratorios
Realizar análisis cromatográficos y asegurar la exactitud de los resultados cromatográficos a través de un enfoque de garantía de la calidad.
Minimizar el tiempo empleado en el diagnóstico de averías o malfuncionamiento.
Trabajar com métodos robustos que aporten resultados sólidos, fiables y duraderos.
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Botella- Bomba Autoinyector Columna Detector Fase móvil
Tiempo de retención Área
Linearidad
Resolución
”Factor cola” Nº platos
Ruido/deriva
Mapa origen malfuncionamiento
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Agenda
Introducción: la columna Conexiones de columna a sistema cromatográfico Filtros de columna Relleno de columna
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Introducción: la columna
Entrada conector
Salida conector Filtro entrada
Filtro salida
Relleno: partículas sílica funcionalización C18, Fenil,…
- Conexiones al sistema - Filtros: particulado proveniente de fase móvil, muestra o precipitados - Relleno: particulado, condiciones de trabajo (pH fase móvil, temperatura, viscosidad y presión), contaminación química, interacción muestra
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Conexiones: Posición de la férrula fijada de forma incorrecta
N 5sigma = 5025 Factor de cola= 1.31
N 5sigma = 6959 Factor de cola= 1.17
Posición incorrecta de la férrula
Posición correcta de la férrula
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Férrula reutilizable enroscada manualmente con excesiva fuerza
Férrula deformada
Férrula buen estado
Conexión reusable instalada Correctamente
au
0.000
0.010
0.020
0.030
0.040
Conexión reusable enrosque forzado
au
0.000
0.005
0.010
0.015
0.020
0.025
Minutes 1.00 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 2.20 2.40 2.60 2.80 3.00 3.20 3.40
P/N 700003139
P/N PSL613315
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Filtros columnas
- Mantienen relleno - Evitan entrada particulado en relleno
Tamaño partícula relleno (dp) ↔ Porosidad filtro 25, 20, 10 µm ↔ 5 µm 10, 5, 4, 3.5, 3 µm ↔ 2 µm 2.5, 1.8, 1.7, 1.6 µm ↔ 0.2 µm UPLC
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Filtros columnas: particulado
- Partículas insolubles muestras - Precipitados “in-situ” - Particulado fases móviles - Contaminación bacteriana, algas,… - Precipitados sales tampones fosfato - Restos membrana filtración no adecuada
Crecimiento bacteriano filtro entrada
Polisulfona procedente de membrana de filtración en filtro de entrada a columna
Injection 10
Injection 627
AU
0.00
0.02
0.04
0.06
0.08
0.10
0.12
0.14
Minutes 0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50 5.00
Time = 2.17 d
Time = 1 h
Efecto 1: Sobrepresión Efecto 2: Pérdida Resolución
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Particulado: Consejos para la preparación de muestras HPLC/UPLC
Verificar la ausencia de partículas visibles tras la dilución de la muestra Filtración sistemática:
– Filtro 0.2µm/0.45µm compatible con diluyente utilizado ¡Cuidado! Interacciones membrana/muestra
Recomendado el uso de filtros en línea antes de la columna. La centrifugación puede ser necesaria para eliminar las micropartículas.
– Una centrifugación de 4000 a 12000 rpm durante 5 a 30 min permite aislar partículas invisibles.
Tableta Donepezil diluída según la monografía (muy peligroso)
Muestra filtrada con 0.2µm
Partículas muy finas: solución
turbia(peligroso)
Muestra filtrada y centrifugada a 12000 rpm Solución transparente
(OK)
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Particulado muestra: recomendaciones
Preparación muestra: filtración membrana
adecuada/centrifugación http://www.waters.com/app/selector/en/filters.html Preparación muestra: Sirocco (precipitación proteínas), Ostro
(precipitación proteínas+eliminación fosfolípidos), Sep-Pak, Oasis, DisQuE (Quechers)
“Microprecipitaciones”: componentes muestra insolubles en las condiciones del método.
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Vidrio borosilicato, proceso fabricación y certificación calidad: fuente contaminación y picos fantasma
Filtro botella: especial atención, fuente contaminación bacteriana
Particulado: ambiental, sales y crecimiento bacteriano
Particulado: Botellas Fases Móviles
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Contaminación bacteriana: fuente de problemas tanto en UPLC como en HPLC.
La contaminación bacteriana es una fuente de obturación de columna UPLC, y también en menor medida en HPLC
¡Cuidado! Con las líneas 100% acuosas: – Preparar las fases 100% acuosas cada día. o Nota: Los filtros en línea pueden dejar pasar ciertas bacterias.
Limpiar regularmente los filtros
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Utilizar solventes, tampones y aditivos de “alta calidad”
Solventes orgánicos:
— Calidad High Grade LC o LC/MS, filtrar una vez abierta
Agua : — El Agua Milli-Q está filtrada a través de una membrana 0.22 µm, no es necesario
volver a filtrarla. — Los aditivos compatibles LC/MS (ácido fórmico) no requieren ser filtrados en su
preparación. — Cambiar las fases acuosas cada día (UPLC) o cada 2 días (HPLC) — No transferir los nuevos solventes recién preparados a las botellas que están en uso.
Filtración : — Membranas compatibles solventes fase móvil: GHP/PVDF — HPLC 0.45 µm / UPLC 0.22 µm (<3 µm)
Recomendaciones Fases Móviles particulado
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Todas las botellas han de estar cerradas – Nunca utilizar Parafilm® para cubrir las botellas. o Se puede disolver y crear picos fantasma.
Utilizar botellas con una buena calidad de vidrio – El vidrio borosilicato para las fases móviles aporta un alto pH.
Utilizar material de vidrio limpio (para las botellas y la filtración) – No utilizar detergentes
Precauciones a considerar con las Fases Móviles
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Particulado filtro columna: ¿qué hacer?
Prevención Determinar origen, en casos sobrepresión: punto obturación Presiones teóricas: calculadora Acquity/Preparativa
Cambio prefiltro columnas UPLC/UHPLC Cambio filtro columnas UPLC
Tratamiento “solubilización” o descontaminación
Consulta Waters
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Particulado filtro columna aplica al relleno Variabilidad en la fabricación/producción de la columna Contaminación columnas Columna degradada – Hidrólisis ligando y disolución sílica: pH uso – Degradación por Temperatura – Colapso hidrofóbico (efecto reversible)
Tiempos de equilibrado/re-equilibrado insuficiente
Interacciones secundarias: sílica/analitos – Interacciones iónicas – Interacciones metálicas
Relleno columna
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Particulado filtro columna aplica al relleno Variabilidad en la fabricación/producción de la columna Contaminación columnas Columna degradada – Hidrólisis ligando y disolución sílica: pH uso – Degradación por Temperatura – Colapso hidrofóbico (efecto reversible)
Tiempos de equilibrado/re-equilibrado insuficiente Interacciones secundarias: sílica/analitos – Interacciones iónicas – Interacciones metálicas
Relleno columna
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Particulado filtro columna aplica al relleno Variabilidad en la fabricación/producción de la columna Contaminación columnas Columna degradada – Hidrólisis ligando y disolución sílica: pH uso – Degradación por Temperatura – Colapso hidrofóbico (efecto reversible)
Tiempos de equilibrado/re-equilibrado insuficiente
Interacciones secundarias: sílica/analitos – Interacciones iónicas – Interacciones metálicas
Relleno columna
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¿Qué hace que una columna LC sea
reproducible?
A) Sorbentes
0
5
10
15
20
25
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0
1 . 7 µm ACQUITY UPLC® BEH C18
2 . 5 µm XBridge™ BEH C18 XP
2 . 6 µm Core-Shell C18
Linear Velocity, u (cm/sec)
Plat
e He
ight
(H, 4
sig
ma)
Acenaphthene, 2.1 x 50 mm columns
70/30 MeCN/H2O, 30 °C, 254 nm
B) Empaquetado C) Ingeniería
¡Todos ellos son CRITICOS!
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Aseguramiento reproducibilidad
Primary Manufacturer
Particle Creation
Bonding
Column Packing
Sales and Distribution
Bonder
Bonding
Column Packing
Sales and Distribution
Column Packer
Column Packing
Sales and Distribution
Distributor
Sales and Distribution
• Certificación cGMP, ISO 9001 e ISO 13485 • Registrado FDA
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Test Acceptance
Criteria Ziprasidone Zip-Imp
1 Zip-Imp
2 Zip-Imp
3 Zip-Imp
4 Result
Intermediate Precision
Ret Time < 2% RSD 1.1 1.1 1.1 0.9 0.8 Pass
Peak Area < 5% RSD 1.7 2.1 2.6 3.8 4.9
AU
-0.010
0.000
0.010
AU
-0.010
0.000
0.010
AU
-0.010
0.000
0.010
Minutes1.00 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 2.20 2.40 2.60 2.80 3.00 3.20
Lot 101
Lot 103
Lot 109
Tests con kit “Method Validation” ACQUITY UPLC CSH C18 2.1 x 50 mm Method Validation Kit (P/N 186005571)
Testar 3 lotes diferentes de columna para evaluar la calidad y la fiabilidad del método: Robustez.
Recomendaciones Columnas
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Particulado filtro columna aplica al relleno Variabilidad en la fabricación/producción de la columna Contaminación columnas Columna degradada – Hidrólisis ligando y disolución sílica: pH uso – Degradación por Temperatura – Colapso hidrofóbico (efecto reversible)
Tiempos de equilibrado/re-equilibrado insuficiente
Interacciones secundarias: sílica/analitos – Interacciones iónicas – Interacciones metálicas
Relleno columna
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Otras fuentes de contaminación
Preparar y manipular las muestras adecuadamente: – Utilizar viales con certificación según detector y aplicación:
“Vial selector” “Filter Selector” http://www.waters.com/app/selector/en/vials.html http://www.waters.com/app/selector/en/filters.html
-Particulado -Solventes -Muestra (p.e.Proteínas) -Detergentes -Plastificantes -Filtros solvente -Aditivos -Par iónico
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Uso de precolumnas (guarda-columnas) para aumentar la vida de las columnas
Muestra alimentaria con celulosa vegetal, sílice y estearato de magnesio, disuelta en 50/50 Agua/Acetonitrilo
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Precauciones con las precolumnas:
Ratio volumen precolumna/columna (1:25 – 1:10) Imprescindible la misma química que la columna para reducir el
riesgo de cambios de selectividad
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¡NUEVAS! Precolumnas VanGuard
Nuevo formato de precolumnas para HPLC: – Conexión directa a columna para minimizar volúmenes muertos o Disponibles dos formatos según férrula de entrada de columna
– Alto rendimiento de empaquetado para mantener la separación – Disponibles en todos los tamaños de partícula (2.5µm a 5µm) XBridge, XSelect, Atlantis, SunFire, XTerra, Symmetry
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Contaminación relleno columna: ¿qué hacer?
Prevención Determinar origen Cambio prefiltro columnas UPLC/UHPLC Cambio filtro columnas UPLC Uso precolumnas o guardacolumnas Tratamiento “solubilización” o descontaminación: manuales
columnas
Consulta Waters
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Particulado filtro columna aplica al relleno Variabilidad en la fabricación/producción de la columna Contaminación columnas Columna degradada – Hidrólisis ligando y disolución sílica: pH uso – Degradación por Temperatura – Colapso hidrofóbico (efecto reversible)
Tiempos de equilibrado/re-equilibrado insuficiente Interacciones secundarias: sílica/analitos – Interacciones iónicas – Interacciones metálicas
Relleno columna
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Degradación de relleno: pH
Sílica convencional pH>7 se disuelve
Sílica híbrida pH>12 (XBridge)
Grupos funcionales (C18) pH<2 hidrólisis ácida
Funcionalización y End-capping pH<1 (XBridge)
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Degradación de relleno: Temperatura
- Disminuye viscosidad fase móvil - Parámetro crítico: azúcares, aminoácidos… - Herramienta desarrollo métodos (ajuste fino) - Herramienta regeneración columna - Acelera procesos degradación (cuidado pH + T)
ACQUITY TUV ChA - ACQUITY TUV ChA 260nm
AU
0.000
0.010
0.020
0.030
ACQUITY TUV ChA - ACQUITY TUV ChA 260nm
AU
0.000
0.010
0.020
0.030
Minutes1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00
Tmax = 80 ºC Tmax bajo pH= 80 ºC Tmax alto pH= 60 ºC
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Test acelerado estabilidad rellenos
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Minutes0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 1.20
Vo Shift
Colapso Hidrofóbico: ¿De qué se trata?
Al trabajar con una fase móvil altamente acuosa con columnas muy hidrófobas, pueden darse cambios repentinos de V0 así como de tiempo de retención. Esto es indicativo de que los poros expulsan la fase móvil y se secan, perdiendo capacidad de retención. *1 – 10% de reducción en el volumen muerto – 23% de pérdida de retención del analito
ACQUITY UPLC® BEH C18 L = 5 cm F = 0.3 mL/min P = 2,040 T = 90 oC % Dewet = 23.10
*1 T.H. Walter, P. Iraneta and M. Capparella J. Chromatogr. A 1075 (2005) 177-183
1.25
-Atlantis T3 -XSelect HSS T3 -XBridge BEH Shield RP18
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Particulado filtro columna aplica al relleno Variabilidad en la fabricación/producción de la columna Contaminación columnas Columna degradada – Hidrólisis ligando y disolución sílica: pH uso – Degradación por Temperatura – Colapso hidrofóbico (efecto reversible)
Tiempos de equilibrado/re-equilibrado insuficiente
Interacciones secundarias: sílica/analitos – Interacciones iónicas – Interacciones metálicas
Relleno columna
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Tiempos de equilibrado
Nota: Optimización posible experimentalmente. Re-equilibrado gradientes: 5-8 volúmenes columna HILIC, ciertos aditivos requieren mayor tiempo equilibrado/re- equilibrado
ID Length Volume 5X Vol Flow Rate EQUILIBRATION TIMEmm mm mL mL mL/min 2695 2795 ACQUITY
0.60mL 0.35mL 0.15mL
4.6 250 4.15 20.76 1.39 16.2 15.7 15.3
3.9 150 1.79 8.95 1.00 10.8 10.0 9.43.9 50 0.60 2.98 1.00 4.8 4.0 3.43.9 20 0.24 1.19 1.00 3.0 2.2 1.6
2.1 150 0.52 2.60 0.29 15.2 12.6 10.52.1 100 0.35 1.73 0.29 12.2 9.6 7.52.1 50 0.17 0.87 0.29 9.2 6.6 4.52.1 20 0.07 0.35 0.29 7.4 4.8 2.7
1.0 100 0.08 0.39 0.07 32.7 21.5 12.61.0 50 0.04 0.20 0.07 29.8 18.6 9.6
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Particulado filtro columna aplica al relleno Variabilidad en la fabricación/producción de la columna Contaminación columnas Columna degradada – Hidrólisis ligando y disolución sílica: pH uso – Degradación por Temperatura – Colapso hidrofóbico (efecto reversible) Tiempos de equilibrado/re-equilibrado insuficiente
Interacciones secundarias: sílica/analitos – Interacciones iónicas – Interacciones metálicas
Relleno columna
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Interacciones secundarias
Procesos síntesis sílica, funcionalización y End-capping actuales optimizados para minimizar estos efectos
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Recomendación relleno: Viales QCRM
Comprobación rápida rendimiento SISTEMA + COLUMNA: Específicamente formulado para proporcionar una evaluación rápida y fácil del sistema en ciertas condiciones de fase reversa
Componentes del vial con las siguientes características: – Separados adecuadamente por fase reversa – Buena absorbancia a 254nm – Separación para amplia gama de condiciones
Referencia QCRM Neutros: 186006360
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Diagnóstico del sistema a través de los QCRM
720004635EN
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QCRMs disponibles :
Neutrals 186006360 Reversed-Phase 186006363 LCMS 186006963 Quad LCMS 186007362 QDa 186007345 Preparative 186006703 Dye Standard 716000765 HILIC 186007226 SEC125 186006519 SEC200 186006518 SEC450 186006842 IEX Cation 186006870 IEX Anion 186006869
Standard Part Number
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Oferta especial Webinar 30% descuento
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Preguntas
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