REACCION EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)
Dr. Dante Flores
PCR
La reacción en cadena de la polimerasa es una técnica de biología molecular que permite la amplificación in vitro de una secuencia de DNA, al ser delimitada por un par de cebadores que la flanquean
PCR
Desarrollada pro el investigador Dr. Kary Mullis en 1983.
Permite el copiado in vitro de ADN y ADNc
RequerimientosMuestra, molde de DNA o cDNACebadores, iniciadores, primersDNApol termoestableIones metálicos cloruro de magnesio Desoxinucleotidos trifosfatoTampón y cloruro de potasio
Agua (grado biología molecular)
Agua libre de RNAsas y DNAsas
Provee el medio en el cual se llevaran a cabo las reacciones para la replicación del material genético
CATION DIVALENTE
Los iones de magnesio estimulas a la enzima , para incorporara los dNTPs ( actúa como un coofactor).
Desoxinucleotidos
Provee de nucleotidos a la reacción para la sintesis del DNA
Se incorpora a un DNA molde de manera complementaria.
Deben ser usados en concentraciones equivalentes para minimizar los errores
Tampón y Sales
Deberá tener un pH óptimo para que la enzima actúe. Tris HCl pH 8 .8,8
Las sales proporcionan la fuerza iónica adecuada para la actividad de la enzima . KCl menor a 50mM(Inhibición )
Deberá considerarse la Tm de hibridación.
Oligonucleotidos Iniciadores son secuencias cortas de 18 a 25
bases.Moléculas lineales con un grupo hidroxilo con
un extremo 3´Son secuencias complementarias al DNA
Enzima La Taq polimerasa fue aislada de la bacteria
Thermus aquaticus en 1976Es termoestable y actúa en la presencia de
iones de magnesio a temperaturas elevadas.Concentración recomendada de 1 a 2,5
unidades por 100 ul.
TERMOCICLADOR DE DNA
Equipo que controla en forma cíclica la temperatura para la amplificación del DNA es programable.
Etapas de la PCR
DESNATURALIZACIÓN
HIBRIDACIÓN
REPLICACIÓN
Desnaturalización
Las cadenas del DNA son separadas por calentamiento.
Consiste en llevar la reacción hasta temperaturas de 94 a 96 °C.
ALINEACIÓN
Se lleva a cabo por enfriamiento de la mezcla de reacción, después de la desnaturalización
Solo se establecen emparejamiento cuando la cadena concuerda con el complemento.
Extensión o elongación La Taq polimerasa se une al templado de
DNA y comienza la polimerización, a la temperatura optima de la enzima.
PCR
CRECIMIENTO EXPONENCIAL DE LA PCR
ANALISIS DE LA PCREl DNA clonado es colocado en un gel de
agarosa, para realizar el corrimiento electroforético y observar con luz ultravioleta.
Tinción El bromuro de etidio es un colorante
fluorescente que tiene la capacidad de intercalarse entre las bases nitrogenadas. Es un agente muta génico.
PCR
Diagnóstico de Enfermedades Hereditarias y
Cáncer Diagnóstico de Infecciones
Aislamiento de Genes
Investigación Forense
Aplicaciones de la PCR
Estudios de Evolución
Estudios de Identidad y Filiación
VENTAJAS
Rapidez en la obtención de resultados
Alta especificidadAlta sensibilidadAmplio rango de muestras
biológicas
DESVENTAJAS
Contaminación por arrastre de secuencias inespecíficas –falsos positivos
Inhibidores de la muestra – falsos negativos.
Electroforesis en gel de agarosa
100bp
200bp
300bp
MPM C-C+
MPM C-C+
LSSP - PCR
elevada cc de taq, 1 solo primer y baja Tº de annealing
RT- PCR
RNA Una sola hebra Sensible al calor
Transcripción Reversa antes de la PCR
a partir de una copia de la hebra de RNA
cDNA (DNA complementario) estable al calor resistir PCR
PCR MULTIPLEX
Muchas gracias Hasta pronto
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