ProteasasBioquímica de Proteínas
2018
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Reacción no catalizada
• La reacción no catalizada consiste en un ataque nucleofílico por el
átomo de O del H2O sobre el carbono carbonílico del enlace peptídico
formando un intermediario tetraédrico.
• El carácter parcial de doble enlace del enlace peptídico hace que el
carbono carbonílico sea mucho menos reactivo que los carbonos
carbonílicos en los ésteres.
• La tarea catalítica de las proteasas consiste en transformar al carbono
carbonílico, normalmente no reactivo, en mucho más susceptible al
ataque nucleofílico por el agua.
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FUNCIONES DE LAS PROTEINASAS.
1) Función digestiva.
a) Extracelular.
b) Intracelular.
2) Turnover proteico.
3) Procesamiento post-traduccional de proteínas.
a) Proteasas del péptido señal.
b) Proteasas de procesamiento de pro-Hormonas
y otras proteínas.
c) Dominio pro- en muchas proteinasas.
4) Invasión de tejidos (parásitos, metástasis tumorales).
Proteasas: Endo y exo
•Las endopeptidasas hidrolizan unionespeptídicas internas en una cadenapolipeptídica, tendiendo a actuar lejos del N-terminal o del C-terminal.
•Las exopeptidasas requieren un aminoterminal, un carboxilo terminal, o ambos, libres,e hidrolizan una unión peptídica a no mas detres residuos desde el N terminal o del Cterminal. Según el extremo que cortan, seránaminopeptidasas o carboxipeptidasas.
Clasificación de Proteasas
• Por la reacción catalizada: son pocos los casos enque se conoce exactamente la reacción catalizada,en términos de qué unión es hidrolizada en elsubstrato. Se aplica sobre todo a exopeptidasas.
• Por el mecanismo catalítico: es la más usada,desde su propuesta por Brian Hartley hace más de50 años. Se basa en cuáles son los grupos queintervienen en la catálisis y en cómo actúan.
• Por su secuencia y estructura: es la clasificaciónmás moderna, propuesta por Alan Barrett, ycomplementa a la anterior.
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Exopeptidasas: clasificación por el tipo
de reacción catalizada• Aminopeptidasa: libera un único residuo desde el
N-t no bloqueado de su sustrato.
• Dipeptidil-peptidasa: hidroliza un dipéptido desdeel N-t de su sustrato.
• Tripeptidil-peptidasa: hidroliza un tripéptido desdeel N-t de su sustrato.
• Carboxipeptidasa: libera un único residuo desdeel C-t no bloqueado de su sustrato.
• Peptidil-dipeptidasa: hidroliza un dipéptido desdeel C-t de su sustrato.
• Dipeptidasa: hidroliza un dipéptido, y típicamenterequiere que ambos extremos estén libres.
• Omega-peptidasas: no requieren un N-t o un C-tlibre en el sustrato. Frecuentemente actúan cercade uno u otro extremo del péptido. Algunashidrolizan uniones peptídicas que no son unionesalfa, como las ubiquitin hidrolasas, laspiroglutamil peptidasas y la gama-glutamilhidrolasa.
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Peptidasas específicas para uniones
peptídicas con Prolina
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Endopeptidasas: clasificación por el tipo
de reacción catalizada
• Pueden ser denominadas en base a la preferencia
por un determinado residuo en P1 o en P1´ (por
ejemplo, glicil-endopeptidasa; peptidil-lisil
endopeptidasa). Si hay varias enzimas con igual
especificidad, hay que distinguirlas (glutamil
endopeptidasas I y II).
• En la gran mayoría de los casos, la especificidad es
demasiado compleja, y se usan nombres triviales
(pepsina, tripsina, quimotripsina, papaína,
termolisina)
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Proteasas: Clases mecanísticas
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Aspartil proteasas
Cisteín proteasasSerín Proteasas
Metaloproteasas
Treonin proteasas
Asn proteasas
Asp/Asn
Glu proteasas
Glu/Gln
Proteasas: Clasificación por
relación evolutiva• Propuesta en 1993 por Alan J. Barrett y N.D. Rawlings (Cambridge, UK).
Comparación de secuencias proteicas y clasificación en:
• Familias, cuyos miembros derivarían de una misma proteína ancestralpor evolución divergente. Tienen homología estadísticamentesignificativa, al menos en el dominio catalítico (es decir, en el que tieneactividad de proteasa).
• Clanes, grupos de familias con una proteína ancestral común. Lahomología de secuencia entre ellas es mucho más baja, pero seconservan el orden lineal de los residuos del sitio activo y lospequeños grupos de residuos que los rodean; además, tienen unaestructura terciaria similar.
• La información, que se mantiene actualizada, está contenida en la basede datos MEROPS (merops.sanger.ac.uk). Se complementa con lanomenclatura de enzimas de la IUBMB (peptidasas, EC 3.4; lacruzipaína es EC 3.4.22.51 y C01.075 en MEROPS).
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Al 4/5/2017: 5 clanes A, 10 C, 2 G, 15 M, 5 N, 5 P y 12 S. 16 familias A, 71 C,
2 G, 72 M, 7 N, 44 P (incluyen 4 familias T), 36 S y desconocidas 10.
DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD PROTEOLÍTICA.
1.SUSTRATOS PROTEICOS.
1) Proteínas naturales como sustratos generales (hemoglobina, caseína)
a) Precipitación de proteína no digerida y determinación de A280 nm
en el sobrenadante.
b) Precipitación y reacción de Folin en el sobrenadante.
2) Derivados cromogénicos de proteínas naturales (azocaseína, azoalbúmina)
Precipitación y lectura de la A440 nm de los azopéptidos.
3) Derivados fluorogénicos de proteínas naturales: Caseína ligada a isotiocianato
de fluoresceína (FITC-caseína). Excitación a 490 nm y emisión a 525 nm.
4) Proteínas específicas.
a)Colágenos para colagenasas.
b) Pre-proteínas radioactivas (sintetizadas por traducción in vitro de
su mRNA), para las proteinasas del péptido señal.
5) Proteínas naturales marcadas con radioisótopos (125I en Tyr).
Precipitación y determinación de radioactividad en el sobrenadante.
6) Separación de fragmentos grandes después de proteólisis limitada.
a) HPLC en fase reversa.
b) SDS-PAGE.
c) Filtración por gel.
7) Determinaciónes en fase sólida (proteinasa, o sustrato, o ambos,
inmovilizados).
a) Electroforesis en gel de poliacrilamida.
Actividad determinada in situ después de la electroforesis.
- Métodos histoquímicos: b-naftilamidas y Fast Garnet.
- Proteína copolimerizada: Gelatina, fibrinógeno. Gel lavado para
eliminar el SDS, incubado al pH adecuado, teñido con Coomassie Blue.
Actividad detectada como zonas incoloras sobre fondo azul.
b) Ensayos de ELISA
Determinación de colagenasa. Ab anti-colágeno, revelado con Ab
contra la IgG usada conteniendo un cromóforo adecuado.
2. SUSTRATOS SINTETICOS:
Péptidos cromogénicos o fluorogénicos.
a) Sustratos de endopeptidasas (sin amino ni
carboxilo libres). Bz-L-Arg-NHNan, 400 nm.
b) Sustratos de aminopeptidasas (sólo el carboxilo
bloqueado). L-Arg-NHNan, 400 nm.
c) Sustratos de carboxipeptidasas (sólo el amino
bloqueado). {N-(3-[2-furyl]acryloyl)}-Ala-Lys (FA-Ala-
Lys), 340 nm.
Grupos bloqueantes del amino:
Benzoil (Bz); Benzoiloxicarbonil (Z); O-Aminobenzoil
(Abz); Acetil (Ac); Succinil (Suc); Furil-acriloil (FA).
Ensayos espectrofotométricos:
a) 4-nitroanilidas (NH-Nan):
Derivados N-acilados de la 4-nitroanilina. La A400 nm difiere en
aprox.10.000 M-1cm-1 entre las 4-nitroanilidas y la 4-nitroanilina
a pH 8.0.
Utilizables en determinaciones espectrofotométricas continuas.
b) 2-naftilamidas (NH-Nap):
La 2-naftilamina tiene su máximo de absorción a 340 nm, y difiere
de las 2-naftilamidas en aprox. 1.700 M-1cm-1. Esto depende del
pH: por debajo de 5.5 no hay diferencia.
Se puede aumentar la sensibilidad por diazotación de la naftilamina
libre con N(1-naftil) etilendiamina diclorhidrato, o por reacción con
una sal de diazonio estable, el Fast Garnet, que da un producto
insoluble (requiere un detergente para mantenerse en solución).
c) Amidas y ésteres:
La hidrólisis de amidas puede seguirse a 230 nm, o siguiendo
la liberación de aminoácidos con ninhidrina. Baja sensibilidad.
Ensayos fluorimétricos:
a) 2-naftilamidas:
3 ordenes de magnitud más sensible que la diazotación.
Sensible al pH. Excitación a 335 nm y emisión de 410 nm.
b) 7-amino-4-metil cumarilamidas (NH-Mec):
Fluoróforo libre, 500 a 700 veces más fluorescente que el
conjugado. Excitación a 380 nm, emisión a 460 nm.
c) Sustratos fluorogénicos “apagados“ intramolecularmente
(“quenching”):
Abz-gly-Phe(NO2)-Pro (sustrato de ACE). La proteólisis
libera Abz-Gly, fluorescente. Excitación a 310 nm, emisión a
410 nm.
Nomenclatura de Schechter y Berger (1967)
ESPECIFICIDAD DE SUSTRATO
Determinación de la especificidad de sustrato
La tríada catalítica
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Serín Proteasas
Estructura de la quimotripsina (D. Blow, 1967)
Mecanismo de reacción
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Uniones que intervienen en la estabilización del intermediario
tetraédrico.
Especificidad de sustrato: el subsitio S1
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Subtilisina:
una proteasa bacteriana
• Sin relación evolutiva aparente con la
familia de la quimotripsina/tripsina de
mamíferos (sin semejanza en su
estructura primaria o terciaria).
• Igual mecanismo catalítico que las
serin proteasas de mamífero: una Ser
catalítica asistida por una His y un Asp
(tríada catalítica), en la misma
orientación, y un agujero del oxianión
para estabilizar intermediarios
oxianión (estados de transición)
• Ejemplo de evolución convergente:
evolución independiente de la misma
estrategia catalítica.
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Activación del tripsinógeno• Varias proteasas digestivas son sintetizadas en el páncreas como proenzimas
inactivas (zimógenos), de modo que no comiencen a atacar a las células que las
producen. Estas proenzimas digestivas se almacenan en las células pancreáticas
como gránulos secretorios, y se vierten en el duodeno por el conducto
pancreático.
• El tripsinógeno es activado por clivaje proteolítico de la unión peptídica entre Lys
6 y la Ile 7. El oligopéptido con los primeros 6 residuos de aminoácidos se pierde y
la Ile 7 pasa a ser el N-terminal. La carga positiva asociada con el N-terminal está
ahora en una nueva posición y permite la correcta organización del sitio catalítico.
• La reaccción que activa al tripsinógeno es catalizada por la proteasa
enteropeptidasa, que es una proteína de membrana expuesta sobre la superficie
externa de las células de la mucosa que tapiza el duodeno. La enteropeptidasa es
específica para la secuencia Lys-Ile presente en el tripsinógeno. La cantidad de
enteropeptidasa presente es muy pequeña, y puede activar sólo una pequeña
fracción del tripsinógeno total.
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La tripsina es el activador común de las
proenzimas pancreáticas
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R I
IK
Inhibidores de emergencia
• El trauma a órganos internos que daña el páncreas puede causar pancreatitis, una
condición dolorosa y muy peligrosa en la cual trazas de tripsina escapan y atacan
células, activando sus granos de zimógeno almacenados. El resultado es una
tendencia acelerada del páncreas para digerirse a sí mismo y a los órganos
próximos.
• Para prevenir la activación prematura del tripsinógeno, el páncreas produce
tambien pequeñas cantidades del inhibidor secretorio pancreático de la tripsina.
Este es una proteína pequeña que expone una región similar a un sustrato, que es
atacada por la tripsina. Sin embargo, el inhibidor está diseñado para unirse a la
tripsina extremadamente fuerte (Ki=10–13 M),de modo que el producto de la
reacción no se libera fácilmente y continúa ocupando el sitio catalítico. Hay
inhibidor suficiente para controlar trazas de tripsina que pudieran desarrollarse
accidentalmente, y es capaz de impedir que se gatille la activación del
tripsinógeno remanente dentro del páncreas. Una vez que el tripsinógeno es
secretado en el duodeno, la enteropeptidasa puede producir tripsina en cantidad
suficiente para neutralizar las trazas de inhibidor, y la autoactivación puede tener
lugar.
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SERPINAS
• SERPINS: Serine proteinase inhibitors.
• Representan la familia de inhibidores más grande y funcionalmentemás diversa (aprox. 1500 secuencias de serpinas se han identificadoen los 5 reinos, 36 genes en humanos, 60 en ratones).
• Proteínas en general monoméricas, MW 40-100 kDa. Incluyenproteínas como: α1-antitripsina, α1-antiquimotripsina, antitrombinaIII, cofactor II de la heparina, inhibidor de C1, α2-antiplasmina,inhibidores I y II del activador del plasminógeno, inhibidor de laproteína C, y proteasa nexina-1.
• Tienen una estructura secundaria conservada con un loop reactivo(RCL) que interacciona con el sitio activo de la proteasa inhibiéndola.
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• En muchos casos se forma un complejo tetraédrico con el
inhibidor, que es clivado por la proteinasa y se forman
complejos covalentes. Las serpinas clivadas tienen
estructuras conformacionalmente mas estables que las
nativas. El clivaje induce un cambio conformacional mayor, y
los dos residuos que formaban la unión reactiva quedan en
sitios opuestos de la molécula. 34
Serpinas asociadas con enfermedades
en humanos
• La Alfa 1-antitripsina protege a los tejidos de las
proteasas presentes principalmente en las células
inflamatorias, en especial la elastasa. La deficiencia
de alfa-1 antitripsina (trastorno hereditario) lleva a
una degradación tisular durante la inflamación. Esto
causa enfisema pulmonar y lleva a la cirrosis
hepática en casos severos.
• La deficiencia de antitrombina es una enfermedad
genética rara que generalmente sale a la luz cuando
el paciente sufre trombosis venosas recurrentes y
embolismo pulmonar
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Ovomucoide:
Inhibidor tipo
Kazal
Inhibidores de serín peptidasas
• Diisopropil fluorofosfato (DIPF).
• Simula el estado de transicióntetraédrico.
• Se combina con el residuo de serina enel sitio activo de la enzimaacetilcolinesterasa, que desactiva alneurotransmisor acetilcolina. Si laenzima es inhibida, la acetilcolina seacumula y los impulsos nerviosos nopueden ser detenidos, causandocontracción muscular prolongada. Estoproduce parálisis que puede llevar a lamuerte, dado que los músculosrespiratorios están afectados.
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Fenil-metil-sulfonil fluoruro
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