M.T.E. BIOLOGÍA CELULARProliferación celular en meristemos radiculares de
Allium sativumC. Gallardo, D. López, J. Almagro, R. Gómez y N. Perea
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Introducción
De acuerdo con la teoría celular establecida por el biólogo alemán Rudolf Virchoff en el
siglo XIX, “las células sólo provienen de células”. Las células se reproducen mediante
un proceso conocido como división celular en el cual su material genético –el DNA– se
reparte entre dos nuevas células hijas.
En los organismos unicelulares, por este mecanismo aumenta el número de
individuos en la población. En las plantas y animales multicelulares, la división celular
es el procedimiento por el cual el organismo crece, partiendo de una sola célula, y los
tejidos dañados son remplazados y reparados. Una célula individual crece asimilando
sustancias de su ambiente y transformándolas en nuevas moléculas estructurales y
funcionales. Cuando una célula alcanza cierto tamaño crítico y cierto estado
metabólico, se divide. Las dos células hijas comienzan entonces a crecer.
Las células eucarióticas pasan a través de una secuencia regular de
crecimiento y división llamada ciclo celular. El ciclo celular se divide en tres fases
principales: interfase, mitosis, y citocinesis. Para completarse, puede requerir desde
pocas horas hasta varios días, dependiendo del tipo de célula y de factores externos
como la temperatura o los nutrimentos disponibles. Cuando la célula está en los
estadios interfásicos del ciclo, los cromosomas son visibles dentro del núcleo sólo
como delgadas hebras de material filamentoso llamado cromatina.
Antes de que una célula eucariótica pueda comenzar la mitosis y dividirse
efectivamente, debe duplicar su DNA, sintetizar histonas y otras proteínas asociadas
con el DNA de los cromosomas, producir una reserva adecuada de organelas para las
dos células hijas y ensamblar las estructuras necesarias para que se lleven a cabo la
mitosis y la citocinesis. Estos procesos preparatorios ocurren durante la interfase, en la
cual, a su vez, se distinguen tres etapas: las fases Gl, S y G2 (Figura 1).
La fase G1 es la etapa más larga y más variable, y en ella se produce
crecimiento celular hasta alcanzar el tamaño óptimo, sintetizándose proteínas y ARN.
La dotación genética de esta fase es de 2n y 2c y suele durar entre 6 y 12 horas. La
fase S (síntesis), comienza cuando la célula adquiere el tamaño suficiente y el ATP
necesario. Dado que el ADN lleva la información genética de la célula, antes de la
mitosis deben generarse dos moléculas idénticas para ser repartidas entre las dos
células hijas. Con esta duplicación el núcleo contiene el doble de proteínas nucleares y
de ADN que al principio de la fase (2n y 4c). La duración aproximada de la fase es de 6
a 8 horas. La última etapa de la interfase es la G2, más breve que la G1, en la cual se
acumulan los productos necesarios para la siguiente etapa, la fase M, en la que se
producirá la división celular. Durante esta etapa también tiene lugar síntesis de DNA
asociada a la reparación de posibles imperfecciones en el material genético.
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Se considera terminada cuando la cromatina empieza a condensarse,
lo que marca el inicio de la mitosis. La carga genética en esta fase es de 2n y
4c, y la duración de la misma va, aproximadamente, de 3 a 4 h.
La mitosis (o fase M) cumple la función de distribuir los cromosomas
duplicados de modo tal que cada nueva célula obtenga una dotación completa de
cromosomas. En dicho proceso es posible identificar cuatro etapas: profase, metafase,
anafase y telofase. La profase es el primer estadio de la mitosis. La cromatina se
condensa (recordar que el ADN de la cromatina se replica en la interfase), por lo que
en este punto existen dos cromátidas unidas. La membrana nuclear se disuelve y se
forma el huso mitótico. Los centrómeros (o constricciones primarias) se vuelven
claramente visibles, debido a que se le han asociados placas proteicas a ambos lados:
el cinetocoro. En el citoplasma el retículo endoplasmático y el complejo de Golgi se
fragmentan en vesículas, se desorganiza el citoesqueleto por lo que la célula pierde su
forma original y se hace esférica. La metafase sigue a la profase. Los cromosomas
(que a este punto consisten en dos cromátidas mantenidas juntas por el centrómero)
alcanzan su máxima condensación y migran al ecuador de la célula donde las fibras del
huso se "pegan" a las fibras del cinetocoro. La anafase comienza con la separación de
los centrómeros y el arrastre de las cromátidas (los llamamos cromosomas luego de la
separación de los centrómeros) a los polos opuestos. En la telofase los cromosomas
llegan a los polos de sus respectivos husos, la membrana nuclear se reconstituye, los
cromosomas se desenrollan y pasan a formar la cromatina y el nucleolo, que
desapareció en la profase se vuelve a constituir. Donde antes había una célula ahora
existen dos pequeñas con exactamente la misma información genética y número
cromosómico.
Figura 1. Ciclo celular de una célula eucariota. En él es posible identificar diferentes etapas, destacando la
interfase, la cual ocupa la mayor parte del ciclo.
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La citocinesis es el proceso de separación de las células formadas. En tanto
la mitosis es la división del núcleo en la citocinesis ocurre la división y la relocalización
de los plástidos, Golgi y citoplasma en cada nueva célula, además de restablecerse el
citoesqueleto. En las células vegetales, una serie de vesículas divide al citoplasma en
la línea media. Estas vesículas, son producidas por los complejos de Golgi y contienen
polisacáridos. Las vesículas migran hacia el plano ecuatorial, transportadas por los
microtúbulos remanentes del huso mitótico; finalmente se fusionan y forman una
estructura plana limitada por membrana, la placa celular. A medida que se agregan
más vesículas, los bordes de la placa en crecimiento se fusionan con la membrana de
la célula y se forma una capa de polisacáridos entre las dos células hijas,
completándose su separación. Esta capa se impregna con pectinas y forma finalmente
la lamina media. Cada nueva célula construye, así, su propia pared celular,
depositando celulosa y otros polisacáridos sobre la superficie externa de su membrana
celular.
Cuando se completa la división celular, se han producido dos células hijas,
más pequeñas que la célula materna, pero indistinguibles de ésta en cualquier otro
aspecto (Figura 2).
Metodología experimental general
Los procedimientos experimentales desarrollaron en torno al estudio del ciclo celular de
meristemos radiculares de Allium sativum, una hortaliza cuyo bulbo se emplea
corrientemente en la cocina mediterránea. En todos los experimentos el procedimiento
experimental se inició con la preparación de los ajos, los cuales se pelaron, se les
insertaron fragmentos de dientes transversalmente al eje principal, los cuales actuarían
como soportes, y se introdujeron en recipientes de vidrio llenos de agua mineral,
procurando que el agua permanezca en contacto con los bulbos.
Figura 2. Etapas de la mitosis. (1) Profase: la cromatina se esta condensando y el nucleo está esmpezando a
desaparecer. (2) Prometafase: los cromosomas comienzan a ser visibles, cada uno de los cuales está constituido
por dos cromátidas hermanas. En un estado más avananzado de esta etapa se desorganiza la membrana nuclear.
(3) Metafase: el uso mitótico es claramente visible y los cromosomas, asociados a los microtúbulos, se encuetran
dispuestos sobre la placa metafásica. (4) Anafase: las cromátidas de cada cromosoma se han separado y migran
hacia los polos opuestos de la célula. (5) Telofase: los núcleos hijos comenzan a formarse, mientras se inicia la
formación del fragmoplasto.
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Tras ello los bulbos fueron introducidos en la cámara de cultivo (Figura 3) ,
en la que los eran mantenidos en condiciones constantes de 25ºC de temperatura,
oscuridad y burbujeo constante (o ausencia del mismo, según dicte el diseño
experimental). El objetivo de mantener las condiciones constantes durante la
incubación es conseguir que el material biológico alcance un equilibrio dinámico
proliferativo, el cua le caracteriza porque la duración de todas las fases del ciclo celular
tienen una duración constante.
Una vez transcurrido el tiempo de incubación establecido para cada caso,
se procedió a la preparación de los meristemos radiculares para su observación al
microscopio (Figura 4) , para lo cual se cortaban las raíces con mejor aspecto y se
introducían en solución de fijación Carnoy (constituida por una mezcla de alcohol y
ácido acético en proporciones 3:1) para de este modo fijar las raíces. Una vez fijadas
las raíces podrían ser teñidas, para lo cual se empleó la orceína acética, un colorante
que se asocia a las histonas, permitiendo poner de manifiesto la estructura de la
cromatina.
Figura 3. Cámara de cultivo de los bulbos. En la imagen puede verse detalladamente el sistema empleado para
llevara a cabo las incubaciones de los bulbos de A. sativum. En la imagen de la derecha aparecen bulbos con tres
días de incubación, en los cuales es posible apreciar claramente las raíces.
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Para llevar a cabo la tinción se era necesario verter en cada caso 500 µL de
orceína en un tubo Eppendorf, en el cual se introducían entre 4 y 5 raíces, dejándolas
incubar durante 8 minutos a 60ºC al baño maría. Tras ello, las raíces debían dejarse
incubar al menos durante 1 hora a temperatura ambiente. Hay que apuntar que la
tinción con orceína se llevó a cabo en todos los casos excepto en el caso del
experimento de impregnación argéntica nucleolar. Tras la incubación de una hora a
temperatura ambiente, podía pasarse al montaje de la muestra, para lo cual las raíces
eran extraídas, colocadas de forma individual sobre un portaobjetos y mediante el
empleo de una lanceta se les seccionaba aproximadamente 3 milímetros de tejido del
extremo distal, que se corresponde con las células meristemáticas del ápice radicular.
Una vez realizado el corte se desechaba el resto de la raíz, se añadía una gota de
orceína sobre la muestra y se cubría con un cubreobjetos. Finalmente para la extensión
de la muestra, empleando la punta de un lápiz de grafito, se presionaba la muestra
mediante golpes suaves hasta conseguir que la muestra se extendiera sobre el
cubreobjetos. Tras ello se procedió a la eliminación de los restos de la orceína acética
con papel de filtro.
Figura 4. Detalles de la preparación de las muestras. En las fotografías se describe el proceso de montaje de las
muestras, las cuales, una vez fijadas eran extraídas de la solución de Carnoy (izq. Sup.), se depositaban sobre un
porta y se le seccionaba el extremo (Dcha. Sup.), se les añadía una gota de orceína (Izq. Inf.) y se procedía al
proceso de aplastamiento (Dcha. Inf.).
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Una vez montadas las preparaciones, estas eran almacenadas en una placa
de petri que contenía un fragmento de papel de filtro empapado en ácido acético. Hay
que apuntar que en todos los experimentos a la hora de llevar a cabo el conteo no hay
que tener en cuenta a las células diferenciadas o en diferenciación (G0). Podemos
considerar que una célula está en ciclo cuando visto su núcleo no cabe otro igual que él
en el espacio restante. Así mismo, para realizar el conteo en primer lugar
seleccionaremos el objetivo de x10 para buscar campos buenos.
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Primer experimento:
Estimación de los parámetros del ciclo proliferativo
Introducción
El índice mitótico de una población celular, definido por Champy como la proporción de
células de una población que se encuentra en cualquier etapa de la mitosis, ha sido
considerado como un criterio muy importante para la caracterización del crecimiento y
multiplicación de tejidos. A partir del índice mitótico es posible inferir el índice
interfásico, que es la proporción de células que se encuentran en dicha etapa del ciclo
celular. Así mismo, dadas las diferencias morfologías que caracterizan a las distintas
etapas de la mitosis en lo referente al grado de empaquetamiento y la distribución de
los cromosomas, mediante la observación a microscopía es también posible estimar los
índices profásico, metafásico, anafásico y telofásico (Figura 5).
Figura 5. Morfología células en las distintas etapas del ciclo celular. (A) Célula en interfase, en la cual es posible
identificar claramente en núcleo, así como una zona mas clara en su interior, lo cual corresponde al nucleolo. (B)
Profase, en la cual se aprecia que el núcleo se ha desorganizado y la cromatina comienza a condensarse. (C)
Célula en metafase, en la cual se identifican nítidamente los cromosomas alineados en la placa metafásica.
(D) Anafase, en la cual se aprecia el efecto sobre los cromosomas de la despolimerización de los microtúbulos
cinetocóricos, lo que provoca la migración de los mismos. (E) Célula en telofase, en la cual los cromosomas,
constituidos ya por una única cromátida, han alcanzado sus respectivos extremos. (F) Célula diferenciada.
A B C
D E F
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Procedimientos experimentales
Para la estimación de los índices, las cabezas de ajo fueron incubadas en agua mineral
durante 72 horas en el incubador, a una temperatura de 25ºC, oscuridad y burbujeo
constante, tras lo cual las muestras fueron preparadas de acuerdo con la metodología
descrita en el apartado introductorio.
Cada uno de los integrantes del grupo contó dos preparados, mil células por
preparado, diferenciando en cada caso la etapa del ciclo en que se encontraban las
células (Figura 5). A partir de ello fue posible estimar los índices mitótico, interfásico,
profásico, metafásico anafásico y telofásico mediante la aplicación de las siguientes
fórmula:
Índice de fase = (Células en fase /células totales) ·100
Por otor lado, para la estimación de los índices de G1, S y G2 se llevo
haciendo uso de la morfometría, a través del análisis de imágenes mediante una
herramienta informática denominada Visilog. Para ello se contó con la colaboración del
Servicio Central de Informática de la Universidad de Málaga (Figura 6).
Figura 6. Captura de pantalla del software Visilog.
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Para llevar a cabo el análisis de
imagen, se emplearon algunos de los
preparados empleados para la estimación
de los índices en el laboratorio, de los
cuales se tomaron una serie de imágenes
mediante el empleo de un microscopio
con una cámara acoplada. Las imágenes
fueron analizadas mediante el software
Visilog, intentando seleccionar únicamente
aquellas células que se encontraban en
interfase, lo cual permitió estimar diversas
variables, como el área celular.
De este modo tras el análisis 2000 células por parte de nuestro grupo de
prácticas, obtuvimos una colección de valores, los cuales fueron agrupados en
intervalos de 10 µm y representados de menor a mayor, lo que permitió la estimación
las proporciones de G1, S y G2, partiendo de la idea de que el tamaño de las células
en fase G1 (2C) debe ser aproximadamente el doble que el de las células en G2 (4C)
(Figura 7).
Resultados y discusión
Los resultados obtenidos por el grupo A a partir del contaje de las células en las
distintas etapas del ciclo aparecen recogidos en la tabla 1. A partir de los valores
medios de los distintos índices obtenidos es posible afirmar que los resultados
obtenidos se ajustaron bastante a lo esperado (Figura 8), dado que, por ejemplo, en el
caso del índice mitótico, el valor medio estimado por los miembros del grupo fue del
13%, siendo el valor esperado entorno al 10%. En el caso de los índices
correspondientes a las distintas etapas de la mitosis, los valores obtenidos también
mostraron un patrón similar a lo esperado de acuerdo con los estudios previos,
obteniéndose valores de 7,2% para la profase (el valor esperado era entorno al 5%), un
1,4% para la metafase (el valor esperado era de un 1%) un 1,5% para la anafase (en al
cual el valor esperado era de un 2%), y un valor de índice telofásico medio de 2,9%
(siendo el valor esperado de un 3%).
Es por ello por lo que es posible considerar que la aproximación de los
índices de fases mediante conteo celular es bastante adecuada, dado que los valores
obtenidos fueron bastante aceptables, a pesar de que los integrantes del grupo de
prácticas carecían experiencia.
Figura 7. Cantidad de ADN a lo largo del ciclo
celular de una célula eucariota.
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En el caso de los valores obtenidos por el grupo A a partir del análisis de
imagen, los valores obtenidos agrupados en intervalos de 10 aparecen en la figura 8.
Hay que apuntar que los valores extremos, resultado de estimaciones erróneas, fueron
eliminados, con lo que el valor total de datos que fue considerado finalmente fue de
2003. A partir del gráfico fue posible inferir que los tamaño de las células cuya carga de
ADN es 2C oscilaban entre 80 y 120, mientras que los tamaños de las células carga es
4C oscilaban entre 190 y 310. Así pues, la proporción de células cuya carga era
2C y por tanto se encuentran en fase G1 fue 251/2003 (12,5%), la proporción
de células cuya carga de ADN es 4C, es decir, que es encuentran en la fase G2 es
678/2003 (33,85 %), y finalmente la proporción de células que se encuentran en fase S
(el resto) fue 1074/2003 (53,65 %). Los valores obtenidos al recalcular los índices,
considerando que el índice interfásico medio obtenido fue de 86,7 %, son 10,9% el
índice de G1, 46,5% el índice de S, y 23,9 el índice de G2.
La principal dificultad que plantea esta estrategia es que no se tienen valores
de referencia de tamaños correspondientes a células 2c y 4c, dado que, aunque en
ocasiones se ha intentado emplear las células diferenciadas (en estado G0 y por tanto
con dotación 2c) como referente, esta aproximación se reveló como poco adecuada,
dado que es muy dependiente del grado de condensación del DNA, de forma que en
aquellas células que se expresan mas genes el volumen nuclear tiende a ser mayor.
Tabla 1. Valores de índices interfásico, mitótico, profásico, metafásico, anafásico y telofásico obtenidos por los
miembros el grupo A.
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Es por esta razón por la que los valores obtenidos tanto para la fase G1
como para la fase G2 se alejaron bastante de lo esperado (Figura 8), dado que en una
población celular sincrónica a 25 ºC los índices para las distintas etapas de la interfase
deberían rondar en torno 26,1% para G1, 43,35 para S y 17,34 para G2. Esto es debido
en gran parte a que la asignación de los límites entre las fases G1, S y G2 se llevo a
cabo de acuerdo con el criterio inexperto de los miembros del grupo.
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
G1 S G2
Observado
Esperado
Figura 8. Distribución de los tamaños celulares agrupados en intervalos de 10 µm2. Los datos fueron obtenidos
mediante el análisis morfométrico realizado con el software Visilog.
Área celular (µm2)
Frecuencia absoluta
Figura 9. Comparación entre los valores obtenidos por el grupo 1 y los valores esperados para los
índices de G1, S y G2.
Índice de fase
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En la figura 10 aparecen representadas las frecuencias de las superficies
celulares correspondientes a los tres grupos. Como es posible observar, incluso en
este caso, en el que las estimaciones fueron llevadas mediante una aplicación
informática, aparecen desviaciones en las frecuencias, lo que refleja que el empleo de
la morfometría para la estimación de los índices de G1, S y G2 es muy dependiente del
criterio del observador, por lo que sería conveniente recurrir a otras estrategias como el
la tinción de Fulgen para el estudio de los índices interfásicos.
Finalmente en la figura 11 aparecen representado en diagramas de sectores
los resultados obtenidos para los índices de fase de las distintas etapas del ciclo celular
de los tres grupos. En ellos es posible observar que mientras que en el caso de los
índices profásico, metafásico, anafásico y telofásico los valores obtenidos en todos los
casos son bastante similares, los índices de G1, S y G2 muestran grandes
divergencias, lo cual vuelve a poner de manifiesto que el empleo de la morfometría
requiere para su aplicación de personal con experiencia, ya que de lo contrario los
resultados que rinde son de escasa fiabilidad.
Figura 10. Representación de la distribución de las superficies celulares llevada a cabo mediante el uso de la
herramienta informática Visilog.
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Figura 11. Distribución de los índices de fase correspondientes a las distintas etapas del ciclo celular estimados por
cada uno de los grupos de prácticas.
Grupo A Grupo B
Grupo C
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Segundo experimento:
Estimación del flujo celular y duración de las fases
Introducción
El flujo celular es el porcentaje de células que pasan por un determinado punto del ciclo
celular por unidad de tiempo, lo cual es posible estimarlo mediante el uso de
poblaciones celulares marcadas, cuantificando el tiempo necesario para que las células
completen una vuelta completa del ciclo. Para llevar a cabo el marcaje en el presente
estudio se emplearon dos sustancias diferentes, la cafeína y la colchicina.
La colchicina es un alcaloide extraído de Colchicum autumnale, el cual
actúa como antimitótico inhibiendo la polimerización de moléculas de tubulina,
impidiendo la formación de los microtúbulos, con lo que no se forma el huso mitótico.
Ello evita la separación de las cromátidas hermanas y su migración a los polos de la
célula, provocando que los cromosomas queden dispersos por la célula, dando lugar a
tetraploides. Se tata de un marcador que genera poblaciones celulares por inducción ya
que actúa bloqueando el paso de las células a la siguiente fase.
Figura 12. Fotografía de Colchicum autumnale.
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La cafeína es un alcaloide del grupo de las xantinas, sólido cristalino, blanco y
de sabor amargo, presente en algunas semillas vegetales. La administración de cafeína
a tejidos vegetales inhibe la formación del fragmoplasto o tabique de separación
celular impidiendo la formación de la nueva pared celular durante las divisiones
citoplásmicas en la telofase, no dejando que la citocinesis se lleve a cabo y por lo tanto
y los dos núcleos permanecen separados pero dentro del mismo citoplasma, dando
como resultado células binucleadas. La diana de actuación de la cafeína es de muy
corta duración (aproximadamente el 1% del ciclo total), por lo que se trata de un
marcador muy fino. Así mismo, dado que esta sustancia no actúa bloqueando las
células en una etapa específica del ciclo, se considera como un generador de
poblaciones sincrónicas por selección, dado que las células afectadas en telofase
pasarán a interfase como binucleadas.
Procedimientos experimentales
El experimento se inició con la incubación de los bulbos en la cámara de cultivo durante
tres días a 25ºC, oscuridad y burbujeo continuo. Una vez las raíces se encontraban en
el estado adecuado y como paso previo al inicio de los tratamientos, se procedió a la
preparación de las soluciones de colchicina 0,05% y la cafeína 5 Mm (300 mL de cada
una de ellas). En el caso de la cafeína, para poder disolverla es necesario calentar el
agua, siempre procurando que se mantenga por debajo de 60ºC (dado que a esta
temperatura esta molécula se degrada).
Una vez preparadas las soluciones se procedió a llevar a cabo los
tratamientos específicos de este experimento. Para ello, se tomaron por un lado 4
bulbos y se incubaron durante 2 horas en la cámara de cultivo en cafeína 5 mM, y por
otro, se tomaron otros cinco bulbos y se incubaron también durante 2 horas en la
cámara de cultivo en colchicina 0,05 %. Tras las incubaciones, las raíces sometidas a
los tratamientos de colchicina se cortaron y se fijaron en solución de Carnoy, mientras
que los bulbos expuestos a las soluciones de cafeína se mantuvieron en agua mineral
en las condiciones iníciales durante una hora, con el objetivo de que las células
binucleadas generadas pasasen a G1 y poder distinguirlas de este modo de las células
mononucleadas en telofase no afectadas por el tratamiento, tras lo cual también se
cortaron las raíces y se fijaron. En el caso de las células tratadas con cafeína es
necesario fijarlas tras el tratamiento, ya que de lo contrario darían lugar a células
poliploides con un único núcleo, y por tanto prácticamente indistinguibles. Una vez
fijadas las raíces fueron montadas de acuerdo con el procedimiento experimental
descrito en el apartado inicial. Por último se procedió a la estimación de los porcentajes
celulares afectados por cada marcaje, lo cual fue posible gracias a la distinta
morfología que presentaban las poblaciones celulares e cada caso (binucleadas en el
caso de la cafeína y con los cromosomas condensados y dispersos por el citoplasma,
en el caso de los meristemos tratados con colchicina) (Figura 13).
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Para ello cada uno de los integrantes del grupo empleó cuatro preparados,
contando 1000 células en cada uno de ellos.
A
B
Figura 13. (A) Fotografía de un preparado correspondiente al tratamiento con cafeina; las células binucleadas
aparecen marcadas con asteriscos. (B) Preparado de una muestra tratada con colchicina; las células afectadas
aparecen marcadas con un asterisco.
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Resultados y discusión
Los resultados obtenidos por el grupo A aparecen en la tabla 2. Como era de esperar,
los valores obtenidos para la colchicina fuero ligeramente superiores a los obtenidos
para la cafeína, lo cual es debido a que la diana sobre la que actúa la colchicina es
mucho más amplia, lo que introduce mayor error (afecta a las etapas de la mitosis
dependientes de microtúbulos, es decir desde profase a telofase), debido a lo cual se
procedió a realizar una corrección de los datos, restando un 1% a los valores obtenidos
para la colchicina para de este modo poder normalizar los resultados (dado que al
tratar con colchicina, además de verse afectadas las células que pasan de profase a
metafase, se ven afectadas todas las células que se encuentran en metafase y
anafase).
Flujo celular (% de células / hora) Alumno Cafeina Colchicina Corrección colchiclina
Diego 6,3 7,07 6,07 4,9 6,8 5,8
Nicolas 4,4 7,11 6,11 5,81 7,86 6,86
Cristóbal 5,55 6,8 5,8 6,1 7,7 6,7
Javier 5,3 6,8 5,6 5,7 7,2 6,2
Rafael 5,7 6,9 5,9 5,1 7,4 6,4
Media 5,49 6,144
Media total 5,817
Los porcentajes obtenidos se corresponden con el doble del flujo celular
(dado que las muestras fueron expuestas durante dos horas a los tratamientos), por lo
que para la estimación de los flujos (φ) únicamente habría que dividir entre dos los
valores obtenidos. De este modo fue posible estimar que el flujo celular obtenido a
partir del tratamiento con cafeína fue de 2,74 % de células / hora, para el tratamiento
con colchicina normalizado 3,072 % de células / hora, mientras que el valor obtenido a
partir del promedio de los resultados obtenidos para ambos tratamientos fue de 2,91 %
de células / hora. Si comparamos los resultados obtenidos en nuestro grupo con los de
los otros dos grupos (Tabla 3) podemos observar que en todos ellos se conserva la
tendencia de valores de flujos celulares mayores en la estimación llevada a cabo
mediante el marcaje mediante colchicina, resultado de la mayor diana de acción de
este marcaje.
Tabla 2. Resultados de los índices de fase obtenidos por los miembros del grupo A, así como la media total.
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Sin embargo a pesar de ello llama la atención a que las mayores diferencias
aparecen en las estimaciones llevadas a cabo mediante el marcaje con cafeína (desde
2,74 a 3,3), lo cual se debe probablemente a que la morfología resultado de las
alteraciones provocadas por la exposición a cafeína (células binucleadas) son más
difíciles de identificar en los preparados, lo cual resulta en que muchas de las células
marcadas no sean consideradas como tal , con lo cual es posible que mediante esta
técnica se subestime el número de células marcadas.
Flujo celular (células/hora)
Cafeína Colchicina * Media
Grupo A 2,74 3,08 2,91
Grupo B 2,7 3,78 3,24
Grupo C 3,3 3,48 3,39
Total 2,91 3,44 3,18
A partir de la estimación del flujo celular es posible también realizar una
estimación de la duración total del ciclo (Tabla 4):
Tiempo total grupo A (h) = 100/φ
Duración del ciclo (horas)
Cafeína Colchicina* Media
Grupo A 36,5 32,5 34,4
Grupo B 37,0 26,5 30,9
Grupo C 30,3 28,7 29,5
Total 34,4 29,1 31,4
Dado que la duración esperada del ciclo celular a 25ºC es de una 30 horas,
es posible aceptar que la metodología basada en el marcaje celular para la estimación
de la duración permite obtener resultados bastante aceptables, y todo ello a pesar de
los errores experimentales introducidos por los componentes del grupo a la hora de
llevar a cabo el contaje de las muestras.
Tabla 3. Comparación de los valores de flujos celulares obtenidos por los tres grupos de prácticas.
* El valor de la colchicina se corresponde con los valores corregidos al restarles el 1%
Tabla 4. Comparación de las duraciones de ciclo celular obtenidos por los tres grupos de prácticas.
* El valor de la colchicina se corresponde con los valores corregidos al restarles el 1%
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Con todo ello hay que apuntar que, dada a la inexperiencia de los alumnos a
la hora de identificar a las células marcadas, mediante el marcaje con cafeína se tiende
a sobrevalorar la duración del ciclo, con lo que en el caso de personal inexperto, el
marcado mediante cafeína parece una alternativa más adecuada, a pesar de que su
marcaje es menos específico.
A partir de los índices de fase obtenidos en el primer experimento y el flujo
celular fue posible estimar la duración en horas de cada una de las etapas del ciclo
celular (Tabla 5). Como es posible observar en los resultados obtenidos, tanto en el
caso de los valores obtenidos a partir de los datos del grupo A como en el conjunto de
los datos de todos los grupos, la interfase es con diferencia la etapa de mayor duración,
y dentro de ésta, la fase S, lo cual concuerda con los resultados esperados. Sin
embargo, de acuerdo con los resultados obtenidos el periodo G1 tendría una duración
inferior al periodo G2, lo cual no se ajusta a la realidad dado la duración del periodo G1
es superior a la de G2 (en un ciclo de 30 horas la etapa G1 tendría una duración
aproximada de 8 horas, frente a las 6 horas de la etapa G2 y las 14 horas de la fase S).
Duración (h)
Etapa Grupo A Total
Interfase
29 h 48 min 27 h 28 min
G1 3 h 42 min 5 h
S 16 h 15 h 10 min
G2 10 h 6 min 7 h 18 min
Metafase
4 h 30 min 3 h 36 min
Profase 2 h 30 min 1 h 42 min
Metafase 30 min 33 h 6 min
Anafase 30 min 36 min
Telofase 1 h 48 min
Tabla 5. Comparación de los resultados sobre la duración de cada una de las etapas de ciclo celular obtenido por
los tres grupos de prácticas.
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Tercer experimento:
Efecto de la tensión de O2 sobre la sincronía de una
población celular
Introducción
Diversas condiciones ambientales pueden afectar a la cinética del ciclo celular, de
modo que una de las estrategias empleadas para su estudio es la generación de
poblaciones celulares sincrónicas, lo cual es posible, como se puso de manifiesto en el
experimento anterior, mediante la exposición de los meristemos radiculares a cafeína
5 mM durante 1 hora. Uno de los factores que provoca alteraciones en la cinética del
proceso es la disponibilidad de oxígeno dado que las condiciones de hipoxia provocan
un incremento de estrés en la célula, lo cual se ve potenciando en las raíces del ajo, las
cuales presentan un metabolismo heterotrófico.
Procedimientos experimentales
Del mismo modo que en los experimentos anteriores, el procedimiento se inició con la
preparación de los ajos, y su incubación en la cámara de cultivo durante 48 horas en
condiciones constantes de oscuridad, 25 ºC y oxigenación proporcionada mediante
burbujeo, con el objetivo de que el material biológico alcanzase el equilibrio dinámico
proliferativo.
El siguiente objetivo fue el marcaje de poblaciones sincrónicas, para lo cual
se incubaron todos los bulbos en soluciones de cafeína 5 mM durante una hora, tras lo
cual los bulbos se lavaron para eliminar los restos de cafeína y se reintrodujeron en los
recipientes de vidrio con agua, tomando este momento como tiempo 0. A partir de aquí,
la mitad de los bulbos se incubaron en burbujeo constante, y la otra mitad sin burbujeo,
y a una temperatura de 20-21 ºC, para de este modo alargar de duración del ciclo
celular, lo cual era un requisito necesario para poder tomar las muestras en horarios
adecuados para los alumnos. Así pues, se tomaron muestras a las 12 horas, 13 horas,
17 horas, 19 horas y 21 horas tras el inicio de la incubación. Las muestras se fijaron, se
tiñeron y se prepararon de acuerdo con los procedimientos presentados con
anterioridad, llevando a cabo el conteo de células mediante la discriminación de las
binucleadas, diferenciando aquellas que se encontraban en interfase de las que se
encontraban en mitosis.
21
Resultados y discusión
En este experimento el número de células binucleadas por campo fue menor que en el
experimento anterior debido a que las los bulbos únicamente fueron expuestos a
cafeína durante 1 hora. En la figura 14 aparecen representados los índices bimitóticos
obtenidos a lo largo del experimento tanto para el tratamiento de los bulbos incubados
en presencia de burbujeo como en ausencia del mismo. Así, podemos ver que hasta
las 13 horas no comenzaron a aparecer células binucleadas en mitosis. La proximidad
al 50% obtenida por el pico que aparece a las 19 horas en los meristemos incubados
en presencia de oxígenos nos indica que el tratamiento mediante cafeína resultó muy
eficiente para conseguir una población sincrónica, dado que el 50 % es el límite teórico
superior que podría alcanzar una población sincrónica, ya que el 50% de las células
binucleadas abandonarán el ciclo y pasarán a un estado diferenciado, y el otro 50% se
mantendrá en el ciclo celular.
A partir e la gráfica es también posible observar como, a pesar de mantener
una tendencia similar, en la población celular incubada en ausencia de oxigeno
aparece un desplazamiento hacia la derecha, lo cual es indicativo de un alargamiento
del ciclo celular, de forma que el grueso de la población alcanzará la mitosis con 2 o 3
horas de retraso. Finalmente, en el caso de la población celular incubada sin burbujeo,
teóricamente la sincronía debería ser menor, de acuerdo con García-Herdugo et al., lo
cual se traduciría en un pico más bajo que en el caso de las raíces incubadas en
ausencia de burbujeo, aunque únicamente con los resultados del presente experimento
esto no puede ser inferido, dado que sería necesario haber seguido tomando muestras
más allá de la hora 21. Así mismo, las enormes desviaciones típicas obtenidas para
t = 21 dificultan aún más la posibilidad de extraer alguna conclusión, con lo que sería
necesario volverá realizar el experimento para confirmar los resultados.
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
12 h 13 h 15 h 17 h 19 h 21 h
O2 +
O2 -
Figura 14. Evolución del índice de bimitosis en poblaciones celulares sincrónicas. La línea azul se
corresponde con las células incubadas en presencia de burbujeo, mientras que las rojas se corresponden con
las muestras incubadas en ausencia de burbujeo.
Índice de bimitosis
Tiempo tras tratamiento con colchicina
22
Cuarto experimento:
Efecto del 5-aminouracilo sobre la población proliferante de
Allium sativum
Introducción
El 5-aminouracilo (5-AU) es una molécula estructuralmente análoga al nucleótido
timina (Figura 15), y que se ha visto que puede tener efectos notables sobre el ciclo
celular. Esta molécula es capaz de inhibir la síntesis de DNA, concretamente inhibe a
una enzima conocida como timidilato sintasa. Dicha molécula también presenta la
característica de inhibir a la RNA-polimerasa de manera competitiva.
Se engloba dentro de lo que se conocen
como marcadores sincrónicos por inducción, ya que va
a bloquear el transito de las células a través del ciclo,
en una parte del ciclo conocida como “región 5-
aminouracilo”, de tal manera que tras la aplicación de
esta droga vamos a crear una población de células
sincrónicas. La zona de acción de esta sustancia, se
encuentra en el transito desde la fase S a la fase G2
gracias a que bloquea la síntesis tardía de DNA así
como la reparación.
En este experimento observaremos como dicha molécula induce la formación de una
población sincrónica, lo cual será apreciable ya que observaremos primero un
descenso en el numero de células en mitosis, y posteriormente tras la retirada de la
droga un aumento en el número de células en dicha fase, lo que nos indica que las
células se fueron acumulando en una parte del ciclo, y que en el momento que se retira
dicha droga, estas reanudan el ciclo celular.
Material y métodos
Las raíces fueron cultivadas a 25ºC, oscuridad, y aireación constante durante 48 horas,
cambiando el agua de cultivo cada 24 horas, como en los experimentos anteriores.
Para este experimento se llevo a cabo la preparación de la solución que contenía el
5-aminouracilo, concretamente se preparo una solución a 0,5 mM de 5-aminouracilo en
agua destilada. Se retiraron las raíces de los bulbos que presentaban un aspecto
desfavorable, y estos fueron sumergidos en la solución con 5-AU e incubados durante
17 horas, tras lo cual se paso a realizar un lavado de raíces y su posterior inmersión en
agua por otras 12 horas, estableciéndose así un periodo de recuperación.
Figura 15. Estructura del
5-aminouracilo
23
Durante estas horas de cultivo se fueron tomando muestras a diferentes
tiempos, concretamente durante las 17 horas de cultivo con 5-AU se tomaron muestras
a las horas 0, 2, 5, y 17. Por otro lado durante las 12 horas de recuperación también se
tomaron muestras, a las horas +5, +7, +8, y +12. Tras ello las muestras tomadas fueron
fijadas (fijador Carnoy), y posteriormente teñidas con orceína, para a continuación ser
visualizadas al microscopio diferenciando las células en interfase frente a las células en
mitosis. El recuento celular fue llevado a cabo mediante el conteo de 1000 células por
preparado, obviando las células diferenciadas, es decir solo teniendo en cuenta
aquellas que se encontraban en ciclo.
Resultados y discusión
Los resultados obtenidos por los tres grupos de prácticas aparecen recogidos en la
tabla 6 y representados en la figura 15.
Como podemos apreciar en la grafica, en la hora 0 de tratamiento, es decir
células pertenecientes a los meristemos de la raíz que no han sido tratadas,
observamos un índice mitótico de 8,3% cosa que es totalmente lógica puesto que el IM
generalmente ronda un 10% del ciclo celular, y teniendo en cuenta la poca experiencia
de conteo celular de los alumnos dicho resultado es satisfactorio. Posteriormente
podemos observar un descenso continuo y progresivo en los índices mitóticos en las
muestras tomadas a diferentes horas del tratamiento con 5-aminouracilo,
concretamente vemos como el IM se va reduciendo hasta alcanzar el valor mas bajo,
de 4,4% en la hora 17 de tratamiento, lo que es debido a la parada del ciclo en alguna
etapa anterior a la mitosis como consecuencia de la droga, lo que implica que lleguen
menos células a mitosis. Generalmente este índice mitótico debería tender a 0, pero su
valor un poco mas elevado puede deberse a no haber usado una concentración muy
alta de 5-AU (0,5 mM).
Finalmente tras la retirada de la droga vemos un aumento del IM el cual llega
incluso a hacerse mas elevado de lo normal, en torno al 12,4% en la hora +7, lo que es
debido a la llegada de una oleada de células que se encontraban retenidas en una fase
del ciclo celular previa a mitosis, y que tras la retirada de la droga han continuado su
curso por el ciclo celular, lo que nos indica también la obtención de una población
sincrónica. Por ultimo en la hora +12 vemos como el IM vuelve a tomar valores
normales (9,1%).
Estos resultados nos corroboran lo observado en la bibliografía, es decir que
5-aminouracilo bloquea el ciclo creando una población sincrónica, y que además lo
hace en una fase previa a mitosis, concretamente en el paso desde la fase S a G2
(Díez et al. 1976). Tenemos que resaltar que la fase G2 suele tener una duración
aproximada de unas 3-4 horas, pero el valor mas alto de IM lo obtenemos a la hora 7
tras retirar el tratamiento, y esto puede ser debido a que la droga produzca algún tipo
de retardo en el ciclo (intoxicación celular).
24
Tratamientos
5-Aminouracilo 0,5 mM Agua mineral 0h 2h 5h 17h +5h +7h +8h +12h
Índices
Mitóticos (%)
8,1 5,1 4,3 1,3 8,1 14,5 12 10,3 8,6 10,47 4,7 1,6 10,6 10,8 11,3 6,8 7,1 4,7 4,8 5,9 9,8 8,7 9,6 9,7 9,4 8,7 9,2 15,4 7,6 9,4
11,1
Media 8,3 6,7 4,6 4,4 8,2 12,4 10,3 9,1
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
0h 2h 5h 17h +5h +7h +8h +12h
Figura 15. Evolución de los índices mitóticos a lo largo del tratamiento con 5-AU. El intervalo que va desde 0
horas hasta 15 horas se corresponde con el tiempo en el que los bulbos estuvieron expuestos a la droga.
Tiempos de tratamiento
Índice mitótico
Tabla 6. Valores de los índices mitóticos obtenidos por los tres grupos de prácticas en conjunto a lo largo del
experimento de exposición a 5-aminouracilo.
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Quinto experimento: Estudio del ciclo nucleolar
Introducción
El nucléolo es la manifestación morfológica de un conjunto de procesos bioquímicos
que tienen lugar en el interior del núcleo, y que culminan con el ensamblaje de las
subunidades ribosomales. Este se organiza entorno a unas regiones del genoma
conocidas como organizadores nucleolares (o NOR, del inglés: nucleolar organizer
region) que es el sitio cromosómico donde se localizan los clusters de genes
ribosómicos que codifican para el ARN ribosómico y que está asociado a una
constricción secundaria. Estas regiones NOR no aparecen en todos los cromosomas,
ya que, por ejemplo en humanos solo aparece en los cromosomas 13, 14, 15 21 y 22.
El nucleolo suele tener una forma más o menos redondeada aunque puede
adquirir formas muy irregulares, y en el los componentes principales a destacar son:
proteínas, ADNr (es decir el ADN que codifica a los ARNr que formarán los ribosomas)
y los propios ARNr. Hay que destacar que todos los ARN presentes en el nucléolo
provienen de un ARN 45s que será procesado, excepto un ARNr 5s que no tiene origen
nucleolar (transcrito por la ARN polimerasa III, a diferencia del ARNr 45s, que es
transcrito por la ARN polimerasa I).
El número de nucléolos es variable, de forma que generalmente las células
suelen tener uno o más nucléolos, aunque hay ciertos tipos celulares que pueden
carecer de este. El tamaño del nucléolo también puede ser variable siendo lo normal
1 µm, y su posición generalmente es centrada con respecto al núcleo. Así mismo, el
nucléolo puede ser dividido en dos partes diferentes :
• Parte amorfa o nucleoloplasma, que es una parte poco densa y que contiene gránulos
de ADN.
• Parte densa o nucleolonema, en la que se distinguen:
* Parte granular que contiene las ribonucleoproteinas.
* Parte fibrilar formada por fibrillas, también esta constituida por proteínas.
* Centro fibrilar, menos densa que las dos anteriores y abunda en ARN y ADN.
La técnica que emplearemos para la visualización de los nucléolos es
conocida como tinción argéntica nucleolar, fue desarrollada en 1975 y pone de
manifiesto la presencia de nucléolos puesto que va a reaccionar con las proteínas
acidas presentes de tal manera que los nucléolos van a quedar impregnados de una
gran cantidad de plata lo que les proporciona una tonalidad pardo-oscura, mientras que
el núcleo toma un color ocre débil y una tonalidad aun más leve el citoplasma.
26
El nucléolo también esta sometido a un ciclo (Figura 16), de forma que éste
no está presente durante todas las fases del ciclo celular. En el ciclo nucleolar
podemos destacar tres fases principales (Figura 17):
- Desorganización nucleolar: Esta fase se da durante la profase, en ella el nucléolo
disminuye de tamaño, y se hace irregular. Dejan de poder expresarse las regiones
codificantes para los componentes nucleolares debido a la compactación cromosómica.
- Transporte metafásico y anafásico: El nucléolo pierde su individualidad al diluirse y no
es observable.
- Organización nucleolar: Durante la telofase comienza la descondensación de los
cromosomas, se forman los cuerpos prenucleolares, y finalmente aparecen de nuevo
los nucléolos, siendo en G1 cuando el nucléolo vuelve a ser funcional. Destacar que la
inhibición de la síntesis de ARN no impide la formación de los cuerpos prenucleolares
pero si la nucleologénesis.
Procedimientos experimentales
Como ya se ha mencionado la técnica empleada nos servirá para diferenciar el
nucléolo del resto del núcleo así como del citoplasma y demás componentes celulares.
Figura 16. Morfología de los nucléolos a lo largo del ciclo nucleolar. (A) Nucleolo ausente. (B) Aparición de los
cuerpos prenucleolares. (C) Nucleolos claramente visibles. (D) Desaparición progresiva de los nucléolos.
A B C D
Figura 17. Correspondencias entre los ciclos nucleolar y celular.
27
Para la realización de esta técnica se procedió de la misma forma que para
las anteriores en cuanto a la obtención de raíces se refiere. Una vez tubimos las raíces
se preparó una solución 1:1 de formol al 10% e hidroquinona al 1% y se introdujeron
dichas raíces durante 2 horas para su fijación a temperatura ambiente. Posteriormente
se realizaron tres lavados de 10 minutos cada uno en agua destilada. A continuación se
llevó a cabo la tinción del material mediante su introducción en una solución de nitrato
de plata al 2%. El nitrato de plata es fotosensible por lo cual el bote que contiene la
solución y las raíces fue cubierto con papel de aluminio e introducido en la estufa a
70ºC durante toda la noche. A la mañana siguiente se realizaron tres lavados de 10
minutos cada uno de ellos con agua destilada y se precedió a la reducción de las
muestras, para lo cual fue necesario volver a introducir dichas muestras en la solución
formo-hidroquinona (1:1) durante 2 horas a temperatura ambiente.
Finalmente se llevó a cabo el montaje en el portaobjetos, para lo cual
empleamos una gota de ácido acético al 50% en lugar de orceína. En este experimento
el aplastamiento final se llevó a cabo con la uña del dedo en lugar de con la yema, y
hay que tener bastante cuidado puesto que del aplastamiento puede depender mucho
la calidad final de la tinción. Tras el conteo de los nucleolos en las distintas etapas de
los preparados se calcularon los índices de células en cada una de las fases del ciclo
nucleolar. De este modo se obtuvieron los porcentajes de cada una de las fases: Con
nucléolo, desorganización nucleolar, sin nucléolo y reorganización nucleolar.
Resultados y discusión
Dicha técnica resulta ser bastante dificultosa para su realización, es por ello por lo que
no obtuvimos buenos preparados, por lo que fue necesario que el profesor
proporcionase preparados para poder realizar los conteos. Por lo general los nucléolos
eran fáciles de identificar pudiendo tener un nucleolo de tamaño grande o dos-tres
nucléolos de tamaño un poco menor.
Las células con nucléolo son fácilmente identificables por presentar su
nucléolo bien teñido de color pardo oscuro. Las células que presentan el nucléolo en
desorganización son apreciables por que su nucléolo presenta un estado ligeramente
fibrilar mientras que las células con el nucléolo en reorganización presentan un estado
más granuloso. Finalmente las células sin nucléolo se identifican por no presentar la
zona pardo-oscura correspondiente al nucléolo. Los resultados obtenidos acerca de los
índices en cada fase nucleolar aparecen recogidos en la figura 18.
De acuerdo con los resultados, la fase con nucléolo presente es la más
larga del ciclo celular y prácticamente se corresponde a toda la interfase, y es por ello
por lo que hemos obtenido un 92 % de células con nucléolo, lo que se asemeja mucho
al 90 % de la población que generalmente se encontrara en interfase.
28
Por otro lado tenemos un índice de desorganización nucleolar de en torno al
2 % esta fase comienza una vez a comenzado la profase, y cabría de esperar un
resultado un poco mayor de esta fase pero puede ser debido a su difícil observación ya
que puede ser confundida con la fase de reorganización. El porcentaje de células sin
nucléolo se aproximó al 3 % y este dato también debería ser un poco más elevado
puesto que esta fase se corresponde con la metafase, anafase y el comienzo de la
telofase. Finalmente para la reorganización nucleolar obtuvimos un 2,5 % y de nuevo
cabria de esperar para esta fase un porcentaje un tanto mayor debido a que se
corresponde con buena parte de la telofase y parte de G1. El descenso en esta última
fase puede ser debido de nuevo a que se confundieran células con la desorganización
nucleolar. A su vez los porcentajes bajos tanto en reorganización como
desorganización pueden ser debidos a que sean confundidos con situaciones en las
que presumimos que el nucléolo se encuentra intacto y por tanto encuadremos a
dichas células en el índice de fases de células con nucléolo.
Inhibición de la nucleologénesis
Introducción
La nucleologénesis es el proceso por el cual el nucléolo vuelve a formarse y se
convierte en un nucléolo funcional, fase del ciclo nucleolar que se corresponde con el
final de la telofase y el comienzo de G1. Ocurre en esta etapa pues es cuando los
cromosomas tras la mitosis comienzan de nuevo a descondensarse pudiendo
expresarse las regiones NOR, lo que desencadenara la formación del nucléolo.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Con nucleolo Sin nucleolo Desorganizandose Reorganizandose
Célu
las (
%)
Figura 18. Representación en tanto por ciento de cada una de las fases del ciclo nucleolar. Los tantos
porcientos obtenidos fueron los siguientes: Con nucléolo: 92%; Sin nucléolo: 3,5%; Desorganización
nucleolar: 2%; Reorganización nucleolar: 2,5%.
29
Procedimientos experimentales
En este experimento puesto que vamos a estudiar el nucléolo será necesario emplear
la tinción argéntica nucleolar, realizada del mismo modo que en el experimento
anterior. Además para el estudio de la nucleologénesis empleamos una sustancia
conocida como cordicepín, la cual es capaz de inhibir la síntesis de ARNr llevado a
cabo por la ARN polimerasa I. Para ello se seleccionaron dos lotes de raíces también
obtenidas del mismo modo que en los experimentos anteriores, de forma que uno de
los lotes se sometió a una concentración de 5 mM de cafeína durante una hora tras lo
cual se depositaron en agua, mientras que el otro lote de raíces fue sometido tanto a
cafeína 5mM como a cordicepín 0,1mM, durante una hora.
En ambos casos se tomaron muestras a diferentes tiempos, y se tiñeron con
la tinción de plata ya empleada en el experimento anterior, para finalmente contabilizar
en las distintas muestras las proporciones de células con nucléolo formado y células
con el nucléolo desorganizado.
Resultados y discusión
Como ya hemos dicho la nucleologénesis es el proceso por el cual se forma el nuevo
nucléolo tras la mitosis. Este proceso comienza en telofase con la descondensación de
los cromosomas, y la formación de los cuerpos prenucleolares. Mediante el marcaje
con cafeína conseguimos marcar a una serie de células que pasan por telofase
quedando como binucleadas.
En el caso de los bulbos tratados solo con cafeína se pudo observar que el
proceso de nucleologénesis transcurrió de forma normal, mientras que en el caso de
los bulbos tratados con cordicepín no tubo lugar la formación de nucleolos maduros,
quedando los cuerpos nucleolares dispersos por todo el núcleo. El cordicepín es una
molécula capaz de inhibir a la RNA polimerasa I. De este modo, a partir de los
resultados obtenidos es posible inferir que la formación de los cuerpos prenucleolares
es independiente de ARN. Así mismo, a partir de los resultados obtenidos es posible
afirmar que la formación de los nucleolos funcionales es dependiente de la actividad de
la RNA polimerasa I.
30
Bibliografía
Giménez-Abián J.F. , G. Giménez Martín, J.A. Suja and J.S. Rufas. Nucleolar organizer regions are associated with silver-stained chromatid cores in meiotic chromosomes of grasshoppers. Genome, 32: 829-833, 1989.
Giménez-Martín G., J.F. Giménez-Abián and M.I. Giménez-Abián (2003). Bases celulares del ciclo proliferativo. Cancer. pg.: 23-69
Goodpasture C. & S.E. Bloom (1975). Visualization of nuclear organizer regions in mammalia
chromosomes using silver staining. Chromosoma 53: 37-50.
Molecular Cell Biology (4th edition). Harvey Lodish, Arnold Berk, S. Lawrence Zipursky, Paul Matsudaira, David Baltimore and James Darnell; Freeman & Co., New York, NY, 2000.ISBN 0-7167-3136-3
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