INTRODUCCION

Las bacterias u otros microorganismos que se desarrollan en medios de laboratorio, se

llaman cultivos. Las diferentes especies de bacterias que se desarrollan en la misma clase

de medios de cultivo pueden tener aspectos muy diferentes, y por lo tanto el conocimiento

de la apariencia, o de las características del cultivo de las especies es útil para reconocer

ciertos tipos de bacterias; asimismo, nos puede servir como un medio que haga posible

identificar las especies. Las bacterias pueden ser obtenidas en cultivo puro para

determinar las características del cultivo o cualquier otra propiedad de la especie.

Cultivos puros.

El cultivo puro presenta las condiciones artificiales para el desarrollo de las bacterias y otros microorganismos y las condiciones impuestas a los microorganismos mediante el manejo del laboratorio.

Métodos para aislar cultivos puros.

Técnica de siembra por estrías en placa y técnica de siembra por difusión en placa.

Con un asa bacteriológica, se pasa una porción de la muestra ala superficie de un medio de cultivo hecho a base de agar y se siembra en el medio ya sea por estrías o por difusión.Para sembrar por difusión en placa, por lo común se usa una varilla de cristal estéril para esparcir la muestra. Esta operación hace posible adelgazar la muestra de tal manera que en la superficie del agar quedan las bacterias separadas unas de otras. Cabe suponer que cada colonia aislada es descendencia de una sola célula y por lo tanto un cultivo puro. En las especies donde las colonias se agrupan de manera característica, las colonias se desarrollan a partir de un mismo tipo de células e igualmente provienen de un cultivo puro. Una porción de una colonia que se pase a un medio de cultivo en tubo viene a ser un cultivo puro. Después de una incubación adecuada, el desarrollo se observa al microscopio o mediante cultivo para verificar si es puro.La técnica de siembra en placa con estrías y por difusión se puede hacer convincentemente y con equipo mínimo; estos son procedimientos de rutina que se efectúan para aislar bacteria en cultivos puros. Aunque sus limitaciones son que solo pequeñas cantidades de la muestra pueden ser esparcidas en la superficie del medio de cultivo.

Técnica de la placa invertida.

Su principio es la dilución de la muestra en tubos de agar fundido y enfriado. Se necesita hacer diluciones en mas de un tubo para obtener colonias bien aisladas, si es que no se conoce la magnitud de la población bacteriana de la muestra antes de manejarla. El medio se mantiene al estado liquido a una temperatura de 45°C para permitir que el inoculo se distribuya adecuadamente en el medio. Una vez sembrado el medio se pone en cajas de petri, se deja solidificar y después se incuba. Como algunos microorganismos quedan atrapados en el agar, se observaran colonias tanto en la superficie como en el medio cuando este solidifica. Esta técnica se hace de forma cualitativa o cuantitativa. Cuando se hace de forma cuantitativa podremos determinar el numero de bacterias(de un tipo en particular)en la muestra así como aislarlas en cultivo puro.Las técnicas de siembras por estrías y la de placa invertida para aislar cierta clase de bacterias, pueden mejorarse con medios de cultivos selectivos o diferenciales.

También es posible tratar el medio para eliminar otro tipo de bacterias diferentes de las que se desean aislar, antes de sembrar en las placas.

Técnica de enriquecimiento de cultivo.

Para mejorar las posibilidades de aislamiento de algunos tipos fisiológicos poco frecuentes de bacterias, los procedimientos de la siembra en placa deberán estar precedidos del desarrollo de las bacterias en un cultivo de enriquecimiento. El principio de esto, es procurar un ambiente de cultivo diseñado que pueda favorecer el desarrollo de cierto tipo concreto de bacterias que necesitaremos pero que no sea adecuada para los demás. Los medios de enriquecimiento se usan generalmente cuando un tipo de bacteria que queremos aislar se encuentra en muy pequeñas cantidades y se desarrolla con mayor lentitud que muchas de las otras especies presentes en el inoculo.

Mantenimiento y preservación de cultivos puros.

La mayoría de los laboratorios de bacteriología cuentan con una gran variedad de este tipo de cultivos, que frecuentemente se denominan colección de cultivos tipo. Es muy importante tener identificadas las bacterias del cultivo puros listas para usarse. La mayoría de las compañías industriales de productos biológicos, mantienen colecciones de cultivos bacterianos en cantidades importantes. Estos cultivos se emplean para probar la efectividad de agentes químicos míoterapéuticos y potencialmente efectivos, así como cultivos de referencia para estudios taxonómicos., como agentes de ensayo para antibióticos y vitaminas, y como cultivos de referencia que citan en las patentes de las compañías.

Métodos de preservación.

A fin de desarrollar condiciones propias para la preservación de bacterias se ha realizado un considerable número de investigaciones. Es esencial que el método de preservación y mantenimiento conserve todas las características de las especies como fueron en el momento de la preservación. Algunas técnicas en uso son las siguientes:

Resiembra periódica a medios frescos.- los cultivos de bacterias se pueden mantener en tubos de medio en los que han sido cultivados mediante pasos periódicos a medios frescos. Cuando se va a utilizar este procedimiento para mantener una colección de cultivos se deben determinar 3 cosas antes de manejarlo: el medio de cultivo apropiado para usarlo con cada cultivo, la temperatura y el tiempo que se necesita para hacer las resiembras.

Preservación de cultivos con una capa de aceite mineral.- muchas bacterias se preservan bien cubriendo el agar en el que van creciendo con aceite mineral estéril. Para cultivos de agar inclinado el aceite deberá cubrir mas o menos 1.5 cm pico del agar inclinado. El mantenimiento de la vialidad bajo este tratamiento varia

según la especie de bacteria pero generalmente en cuestión de años. Este método tiene la ventaja de que se pueden tomar muestras del desarrollo bacteriano que esta debajo del aceite con un asa de siembra, inocular medios frescos y aun preservar el cultivo inicial. La facilidad de este método lo hace muy atractivo.

Preservación de cultivos por secado rápido en congelación (liofilización).- este procedimiento es el mas eficaz muchas especies preservadas por esta técnica han permanecido viables e invariables por mas de 20 años. En este procedimiento las células se secan rápidamente, mientras son congeladas, mediante las siguientes etapas: la suspensión de células se pone en pequeños frascos que se sumergen en una mezcla de hielo seco y alcohol (-78°C) los frascos se conectan inmediatamente a una línea de alto vació y una vez que termino el secado cada frasco se sella bajo condiciones de vació.

Características del cultivo

Una de las características principales de las bacterias es su apariencia (características de desarrollo) seguida del crecimiento de diferentes medios de cultivo. Estas características generales como el color, abundancia de crecimiento y aun el olor del cultivo nos pueden servir de guias para la identificación. Para determinar las características de desarrollo de un cultivo puro es costumbre observar los siguientes aspectos del cultivo:

1.-tipos de colonias en agar( cultivo en placas).2.-desarrollo en agar inclinado. 3.-desarrollo en caldo.4.-Desarrollo en gelatina por picadura

Los cultivos en agar inclinado se preparan haciendo la inoculación por estrías con un asa de siembra más o menos de la zona para arriba de la zona inclinada del agar. Para efectuar los cultivos por picadura, se debe usar la aguja de siembras rectas que se introduce a la gelatina en línea recta desde la superficie al fondo del tubo y retirarlo por el mismo lugar que se introdujo. Los tubos de caldo se pueden sembrar con el asa o con agujas de siembras; en Gral. Se usa el asa cuando el medio de cultivo es líquido.Después de la siembra del medio de cultivo y después de la incubación, se puede determinar las características de cultivo del microorganismo. Los aspectos más peculiares del desarrollo en cada uno de los medio y se resumen de la siguiente manera:

Colonias en placas de agar.

Tamaño.-los limites de las colonias varían desde muy pequeñas, que miden solamente unas fracciones de milímetros de diámetro, hasta colonias muy grandes que miden 5 o 10mm de diámetro. La mayoría de las bacterias forman colonias de tamaño limitado de acuerdo con el periodo de incubación.

Margen o Bordes.- los bordes de las colonias bacterianas son de diferentes tipos según la especie de la que se trate. Pueden formar un círculo perfecto, como las orillas de una gota o mostrar una gran variedad de irregularidades como salientes redondas, hendiduras irregulares, proyecciones filiformes o en forma de raíz.Elevación.-las colonias pueden ser muy finas (aplanadas) o gruesas (elevadas). Las colonias elevadas muestran diferentes grados de convexidad.Cromogenesis o pigmentación.-las colonias pueden estar coloreadas o sin color. Algunas especies se caracterizan por los matices que presentan de rojo, amarillo, café y violeta.Características ópticas.-las hay opacas, transparentes u opalescentes.

Desarrollo en agar(inclinado) por estrías.

Cantidad.- escaso, moderado o abundante.Margen o borde del desarrollo.-uniforme o incluso presentando varias irregularidades en cierta manera similares a las irregularidades descritas para las colonias.Consistencia de la masa desarrollada.-consistencia mantecosa fácilmente removibles con una aguja de siembras, viscosas o filamentosas, secas y brillantes.Cromogenesis.

Desarrollo en caldo nutritivo.

Cantidad del desarrollo.- escaso, moderado y abundante.Distribución del desarrollo en el caldo. Uniformemente distribuido(turbiedad uniforme), desarrollo confinado a la superficie del caldo como nata o pelusa, o desarrollo que se acumula como sedimento, que es granular o viscoso.Olor.- pútrido, a frutas, aromático o imperceptible.

Desarrollo de gelatina por picadura.

Desarrollo (sin licuefacción) a lo largo de la línea de inoculación.-El desarrollo puede estar limitado a la zona de la picadura o puede haberse expandido mas allá de la picadura.

Licuefacción de la gelatina.- se puede presentar desde arriba suavemente o adquirir aspectos variados de embudos al licuar la gelatina.

BIBLIOGRAFÍA

Enciclopedia Microsoft encarta 2004

Microbiología, Pelczar/Reid/Chan, cuarta edición, editorial MC.GRAW-HILL, Capitulo 8, Pág. 117.

UNIVERSIDAD DE SONORA

DEPARTAMENTO DE CIENCIAS QUÍMICO BIOLÓGICAS

LABORATORIO DE ANÁLISIS MICROBIOLOGICOS

*OBTENCIÓN DE UN CULTIVO PURO*

ALUMNO:

GRIJALVA MATUS JESÚS ADAN

LUNES 23 DE ENERO DEL 2005