MANEJAR EL POTENCIAL DE LA BIODIVERSIDAD

GRACIAS A LA BIOTECNOLOGÍA

JOSE TEJEDOR

¿QUÉ ES LA BIODIVERSIDAD?

ÍNDICE

¿QUÉ ES LA BIOTECNOLOGÍA?

SELECCIÓN DE MICROORGANISMOS

MEJORA DE MICROORGANISMOS

CONTROL DE MICROORGANISMOS

¿QUÉ ES LA BIODIVERSIDAD?

• Diversidad Ecosistémica, la diversidad de las

comunidades biológicas (biocenosis) cuya suma

integrada constituye la biosfera.

R.A.E. “Variedad de especies animales y vegetales

en su medio ambiente”

Diversidad de especies de plantas, animales, hongos y microorganismos

que viven en un espacio determinado.

Su variabilidad genética.

Los ecosistemas de los cuales forman parte estas especies.

Los paisajes o regiones en donde se ubican los ecosistemas.

• Diversidad interespecífica, que consiste en la

pluralidad de los sistemas genéticos o genomas

que distinguen a las especies.

• Genética o diversidad intraespecífica: diversidad de

los genes (alelos) y de su distribución, base de las

variaciones interindividuales (la variedad de los

genotipos).

Y si hablamos de BIODIVERSIDAD en ENOLOGÍA…

Mohos : Vendimias tardías, vinos botritizados

No – Saccharomyces:

Brettanomyces, Candida, Torulaspora,

Hansenula, Hanseniaspora, Klockera,

Kluyveromyces, Pichia, Rhodatorula ,

Zygosaccharomyces,

Bacterias : Fermentación maloláctica

Levaduras: Función primaria/ Función Secundaria

Penicillium Botrytis Aspergillus

¿QUÉ ES LA BIOTECNOLOGIA?

Productos, bienes y

servicios mediante

el empleo de

sistemas biológicos

Microorganismos, células

animales y vegetales, animales

y plantas, o partes de ellos

Ciencias de la

ingeniería

• Medicamentos y tratamientos personalizados. Sistemas

de diagnósticos más rápidos, eficaces y seguros.

Diseño de vacunas biotecnológicas.

• Biocombustibles y productos renovables como

bioplásticos. Uso de biodetergentes. Tratamiento

de residuos y depuración.

• Mejoras en la eficiencia de los procesos

biotecnológicos clásicos (vino, cerveza,

pan, productos lácteos). SELECCIÓN ,

MEJORA Y CONTROL de microrganismos

Ciencias de

la vida

HISTORIA DE LA BIOTECNOLOGÍA Sociedades orientales descubren

la fermentación gracias a la

fabricación de la cerveza

7000 A.C

Yogur y quesos realizados gracias a la

fermentación con bacterias lácticas.

6000 A.C.

Los egipcios fabrican pan

gracias a levaduras 4000 A.C.

Los griegos practican la rotación de

cultivos en para una máxima

optimización de los suelos

250 A.C.

Los chinos utilizan el Crisantemo

como un insecticida natural

100 A.C.

LA BIOTECNOLOGÍA MODERNA Louis Pasteur

descubre el origen

de la fermentación

1862

Creación de

LAFFORT

1895

Gregor Mendel descubre las

leyes de la herencia genética.

1863

Primeras cepas de levaduras

seleccionadas en Enología

1930

Primera LSA en Enología 1960

James D. Watson y Francis Crick

escriben la estructura del ADN.

1953

Alexander Fleming

descubre la penicilina 1928

Aparece la técnica de la Polymerase

Chain Reaction (PCR).

1983

ZYMAFLORE® VL1, F10

1989

1993 Identificación y revelación de

aromas de Sauvignon:

ZYMAFLORE® VL3

1994

Purificación de enzimas frente a la

actividad cinamol esterasa :

LAFASE HE GRAND CRU

1996

Tecnica de cruzamiento

(breeding) para levaduras:

ZYMAFLORE ® X5

2004

Ecoselección de levaduras

no-Saccharomyces :

ZYMAFLORE ® ALPHA TD

2011

SELECCIONAR MICROORGANISMOS

SELECCIÓN, MEJORA Y CONTROL GÉNETICO DE LEVADURAS

- Para aislar y caracterizar nuevas cepas

- Para obtener FA seguras, óptimas y con una calidad reproducible

¿Cómo ?

- Mediante screening a partir

¿Por qué seleccionar?

de la flora autóctona

o una LSA

La selección clonal - masal de individuos

LAS TÉCNICAS UTILIZADAS

Aislamiento de clones

de Saccharomyces y

de no-Saccharomyces

Análisis, degustación y posterior

selección de clones de interés

1) A partir de la flora autoctona

Microvinificación

a partir de un

cultivo puro

(single cell origin)

Selección en

el viñedo Selección en mosto

de FA espontaneas

2) A partir de cepas comercializadas (LSA)

Evidencia de mutantes (espontáneos) a partir de una cepa haploide con el fin de

visualizar mutaciones regresivas Pueden utilizarse agentes mutágenos externos:

UV, rayos X, …

Identificación, Caracterización

- PCR, QPCR y PCR inter

- PCR RFLP de ADN mitocondrial

- PCR asociada a µ-satélites

¿CÓMO IDENTIFICAR?

MUESTRA

ANÁLISIS DIRECTOS

(sin cultivo)

ANÁLISIS INDIRECTOS

(con cultivo)

PCR

Determinación

de especies

Determinación de la

cantidad de células

viables.

Determinación de

especies de

poblaciones y

morfología;

EPIFLUORESCENCIA AISLAMIENTO

DE COLONIAS

CULTIVABLES

BIOMASA

CULTIVABLE

Determinación de

cantidad de especies

de poblaciones

según el medio de

cultivo;

PCR / Q-PCR / Inter

Determinación de la

especie y de la

cantidad de la especie

(Q-PCR).

Diversidad interespecifica de la

POBLACION VIABLE

Diversidad interespecifica de la

POBLACION VIABLE Y CULTIVABLE

¿Por qué mejorar ?

- Porque la levadura enológica perfecta no existe….todavía

CONTROL, SELECCION Y MEJORA GENETICA DE LEVADURAS

- Para aislar y caracterizar nuevas cepas

- Para obtener FA seguras, optimas y con una calidad reproducible

¿Cómo ?

¿Por qué seleccionar?

- Mediante screening a partir de la flora autóctona una LSA

MEJORA DE

MICROORGANISMOS

CARACTEREISTICAS NO DESEABLES

Azúcares

Alcohol

Ácido

Acético

H2S y

exceso

de SO2

Urea,

Carbamato de etilo

NH4+

Amino ácidos

Producción de espuma

Etanal y

compuestos que

combinan el SO2 Azucares

Reductores

CARACTEREISTICAS DESEABLES

Glicerol Autólisis

Resistencia al

choque osmótico

Killer

POF -

Azúcares

Alcohol

NH4+

Amino ácidos

Tolerancia a ≠

Temperaturas Tolerancia

al SO2

Esteres y Alcoholes

Superiores

Tioles y Terpenos

Hsp12

- Mediante dos enfoques complementarios:

• la tecnología del ADN recombinante (electroporación, biolistica)

• la genética clásica (hibridación, retrocruzamiento, rare-mating)

¿Cómo ?

- Enfocada a características complejas,

- Falta de especificidad

- No necesita conocer el genoma.

- Busca características simples, bien definidas genéticamente

- Permite intervenciones precisas

- Necesita conocer la secuencia del gen codificador

¿Por qué mejorar ?

- Porque la levadura enológica perfecta no existe….todavía

CONTROL, SELECCION Y MEJORA GENETICA DE LEVADURAS

- Para aislar y caracterizar nuevas cepas

- Para obtener FA seguras, optimas y con una calidad reproducible

¿Cómo ?

¿Por qué seleccionar?

- Mediante screening a partir de la flora autóctona o una LSA

LA GENÉTICA CLÁSICA

Ventajas:

• Mejora de una característica compleja, genéticamente si esta

codificada por un gen o un número pequeño de genes.

• De la misma manera que las levaduras mutantes, los híbridos no

son OGM, (es decir no contienen ADN extranjero).

Limites:

• Características bajo control poligénico: por ejemplo la utilización

de azúcares, floculación,…

• En determinados casos mejora de una característica en detrimento

de una otra, por la falta de particularidad.

• Control mitocondrial parcial de ciertas características: utilización de

sacarosa, floculación.

≠ TÉCNICAS:

Chr A Chr B

Chr C

Chr E

Chr F

Chr G

(POF-)

Chr H Chr I

Fructofilo/

velocidad

de FA

Resistancia

temperatura

AV- POF- Fase de

latencia

corta

+++

4MMP

HIBRIDACIÓN Y RETROCRUZAMIENTOS

¿Para qué sirve la hibridación?

• Cruce de dos esporas de dos cepas

• Introgresión en una cepa el carácter de una otra

LA condición: conocer a nivel genético donde se encuentra

el carácter a introducir - QTL = Quantitative Trait Loci

P.Marullo,

Cruzamiento

Cepa B :

Debil produccion de SO2 y compuestos

que combinan el SO2

Cepa AB (50 % A + 50 % B)

Cepa A : capacidades fermentativas

Pureza aromatica y gustativa

Cruzamiento

Cepa A+ (75 % A + 25 % B)

Cepa A2+ (87,5 % A + 12,5 % B)

Cepa A3+ (93,75 % A + 6,25 % B)

Cepa C :

Pureza aromatica y volumen gustativo.

Perdida de alguna

capacidad fermentativa Capacidad fermentativa

CEPA A3+C (50 % A3+ + 50 % C) : ZYMAFLORE® XPURE

Debil SO2 y

compuestos que lo

combinan.

Cruzamiento

Cruzamiento

Cruzamiento

Debil produccion SO2 y compuestos que lo combinan

Mini-

fermentadores

para experimentar

los cruzamientos

HERRAMIENTAS

Micro-

manipulador

para realizar los

cruzamientos

BREEDING Y RETROCRUZAMIENTOS DIRIGIDOS

CONTROL DE

MICROORGANISMOS

CONTROL DE LA FLORA DE LOS MOSTOS

Existen alrededor de 50 especies diferentes de microorganismos en los racimos

de uvas. Las principales especies contabilizadas son:

Saccharomyces cerevisiae : menos de 5%

No - Saccharomyces: Kloeckera/Hanseniaspora (50 - 75%)

Candida, Pichia, Kluyveromyces, Hansenula ,Torulaspora…

Mohos, Bacterias

Factores que afectas dichas poblaciones :

Climáticos

Estado de madurez de la uva

Presencia de pesticidas

Bayas dañadas

S. cerevisiae no es dominante a la entrada de la uva, en la recepción del mosto. Su

población aumenta durante la FA gracias a la contaminación con el material de bodega.

o S cerevisiae

● Kloeckera/Hanseniaspora

■ Candida

(Fleet, 1990) Tiempo de Fermentacion (dias)

Co

nta

je d

e L

eva

du

ras L

og

10

ce

l/m

L)

Species Ethanol (%) Propanol (mg/L)

Isobutanol (mg/L) Isoamylalcohol (mg/L) 2-Phenylethanol (mg/L)

S. cerevisiae 6-23 9-170 5-78 17-330 5-83 K. apiculata 5-6.5 16-32 4-38 4-17 21-27 C. stellata 4.5-6.5 4-8 13-21 - 6-11 H. anomala 0.2-4.5 3-15 18-29 11-25 27

(Fleet, 1993)

ATENCIÓN A LOS RESULTADOS…ANALITICOS DE LA FLORA AUTÓCTONA

Species Acetic acid (g/L) Ethyl acetate (mg/L) Isoamylacetate (mg/L) Acetaldehyde (mg/L)

S. cerevisiae 0.3-0.8 10-100 0.1-16 50-120 K. apiculata 1-2.5 25-375 0.4-5 6-40 C. stellata 1-1.3 7-25 0.1-0.4 - H. anomala 1-2 137-2150 1-11 -

Una levadura no-

Saccharomyces

sin defectos

organolepticos y

compatible con

S. cerevisiae

(neutra vis-à-vis de

la toxina killer K2)

PERO TAMBIEN…. EXPLORACIÓN DE LA BIODIVERSIDAD

(P. Renault, 2010)

Especies utilizadas Objetivo Proceso Referencias

S. cerevisiae

T. delbrueckii

S. cerevisiae Cultivos secuenciales

S. pombe Células inmovilizadas

S. cerevisiae

C. cantarellii

S. cerevisiae

H. uvarum (K. apiculata)

S. cerevisiaeReduce la producción

de

K. thermotoleransAumento de la acidez

titulable

S. cerevisiae

Issatchenkia orientalis

S. cerevisiae

Pichia fermentans

S. cerevisiae

Pichia kluyveri

S. cerevisiae

Candida pulcherrima

S. cerevisiae

Debaryomyces vanriji

Aumento de la

concentración de

geraniol

Fermentación

mixtaGarcía et al. (2002)

Incremento del

volumen y

complejidad

aromática

Cultivos

secuencialesClemente-Jiménez et al. (2005)

Mejorar el perfil

aromático

del vino

Fermentación

mixta

Zohre & Erten (2002); Jolly et al.

(2003)

Aumento tiol varietalFermentación

mixtaAnfang et al. (2009)

Herraiz et al. (1990); Zironi et al.

(1993); Moreira (2005); Ciani et al.

(2006); Moreira et al. (2008);

Mendoza et al. (2007)

Mezcla o cultivo

secuencial

La simulación de la

fermentación natural

Cultivos

secuenciales

Mora et al. (1990); Ciani et al.

(2006); Kapsopoulou et al. (2007)

Reducción del

contenido de

ácido málico

Fermentación

mixtaKim et al. (2008)

Reducción de la

producción

de ácido acético

Castelli (1969); Herraiz et al.

(1990); Ciani et al. (2006); Salmon

et al. (2007); Bely et al. (2008)

Cultivos Secuenciales

Degradación de ácido

málico

Snow & Gallender (1979); Magyar

& Panyik (1989); Yokotsuka et al.

(1993); Ciani (1995)

Aumento del

contenido de

glicerol

Pretratamiento o

cultivos

secuenciales

Ciani & Ferraro (1996); Ciani &

Ferraro (1998); Ferraro et al.

(2000)

Gran variedad fenotípica : consideración importante para una buena selección de cepa

Fe

no

les v

olá

tile

s (

mg

/L)

0

5

10

15

20

25

30

35

POF+ POF- V C D E F W L M N O X B A R G H I J K S T Y U

Ph

én

ols

vo

lati

ls (

mg

/L)

Renault et al.,2009

(Medio sintetico)

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

1,6

1,8

2,0

SB C D E F N H J K O P R G I

Acid

ez V

olá

til (g

/L á

cid

o a

cé

tico

)

240 g/L 350 g/L

Renault et al.,2009 S. cerevisiae T. delbrueckii

S. cerevisiae T. delbrueckii

VENTAJAS NATURALES Y SELECCIÓN :

PRODUCCIÓN DÉBIL DE AV - FENOLES VOLÁTILES

Distribución de cepas de T. delbrueckii strains en función del vigor fermentativo a 17 °C

(n=11) y 24 °C (n=16) en medio sintético 240 g/L.

Renault et al.,2009

UNA GRAN VARIEDAD FENOTIPICA

1. Buena capacidad fermentativa para una no-Saccharomyces

2. Tasa de crecimiento y cinética fermentativa mas lenta que S.

cerevisiae.

3. Rendimiento alcohol equivalente al de S. cerevisiae

4. Producción etanol débil por lo que no es una

solución fermentativa completa

5. Desarrrollo de una levadura no- Saccharomyces

IMPACTO DE AlphaTD SOBRE LOS

AROMAS EN BLANCOS Y TINTOS

❷ Rol de AlphaTD sobre el aspecto afrutado

❶ Rol de AlphaTD sobre la revelación de tioles

Ensayos en laboratorio y en bodega

Precisión del protocolo de inoculación

Objetivo:

❶ Rol de AlphaTD sobre la revelacion de tioles

Una perspectiva original : el seguimiento de precursores

Pgsh-3SH +++AlphaTD

Pcys-3SH 3SH +++S.c.

• Vinificaciones en laboratorio

• Inoculación secuencial / inoculación simultanea / cepas puras

• Medición de tioles varietales

❷ Rol de AlphaTD sobre el aspecto afrutado

• Vinificaciones en laboratorio

• Inoculación secuencial / inoculación simultanea / cepas puras

• Medición de esteres fermentativos

Compounds

Main esters

Butyrate d’éthyle 29.15 ± 3.88 219.59 ± 13.53 343.01 ± 15.75 286.38 ± 20.14

Hexanoate d’éthyle 119.83 ± 9.82 671.19 ± 27.35 1195.13 ± 59.87 1300.69 ± 95.82

Octanoate d’éthyle 186.95 ± 12.78 580.44 ± 41.33 1364.16 ± 90.75 1407.30 ± 130.36

Decanoate d’éthyle 457.74 ± 69.36 532.73 ± 17.09 878.01 ± 38.26 613.79 ± 40.85

Acétate d’isoamyle 63.90 ± 1.38 3834.19 ± 101.47 4956.73 ± 83.85 1828.01 ± 62.74

Acétate d’hexyle 3.89 ± 0.98 178.80 ± 16.95 219.20 ± 16.32 235.94 ± 15.59

Phényléthyle d’acétate 53.15 ± 10.02 454.61 ± 68.87 539.70 ± 31.46 435.16 ± 3.50

Sum 914.62 ± 104.37 6471.56 ± 286.63 9495.95 ± 336.30 6107.29 ± 369.02

Minor esters

Proponoate d’éthyle 195.23 ± 31.69 233.22 ± 8.13 110.15 ± 13.99 37.05 ± 10.05

Isobutyrate d’éthyle 24.05 ± 1.94 41.24 ± 2.60 24.49 ± 2.04 8.84 ± 1.07

Acétate de propyle 11.14 ± 1.98 56.15 ± 10.53 53.37 ± 3.42 35.81 ± 3.87

Acétate d’isobutyle 11.58 ± 0.94 98.59 ± 8.75 102.60 ± 5.34 50.69 ± 2.67

2-méthylbutyrate d'éthyle 0.49 ± 0.08 1.38 ± 0.22 0.87 ± 0.04 0.87 ± 0.08

Isovalerate d’éthyle 0.34 ± 0.05 1.28 ± 0.07 1.11 ± 0.09 2.04 ± 0.13

Acétate de butyle 0.12 ± 0.01 2.74 ± 0.23 5.14 ± 0.63 2.75 ± 0,00

Ethyl trans 2-hexanoate 0.25 ± 0.04 1.73 ± 0.11 1.24 ± 0.06 0.71 ± 0.02

Acétate d’octyle 0.05 ± 0.04 0.21 ± 0.03 0.71 ± 0.06 0.81 ± 0.16

Dodecanoate d’éthyle 9.26 ± 0.85 15.00 ± 3.30 40.74 ± 2.76 43.22 ± 3.19

Phénylacétate d’éthyle 0.10 ± 0.00 0.27 ± 0.05 0.20 ± 0.00 0.43 ± 0.06

Dihydrocinnamate d'éthyle 14.00 ± 1.35 1.26 ± 0.19 0.336 ± 0.04 0.20 ± 0.01

Cinnamate d’éthyle 1.12 ± 0.00 1.08 ± 0.03 1.04 ± 0.01 1.08 ± 0.01

Sum 268 ± 2.94 454 ± 35.56 342 ± 29.97 185 ± 22.49

Total sum 1182 ± 107.32 6925 ± 322.20 9837 ± 366.27 6291 ± 391.52

T. delbrueckii pure

culture

Sequential mixed

culture

Simultaneous

mixed culture

S. cerevisiae pure

culture

(µg/L)

(µg/L)

Proporción mas

importante

de esteres menores

Carácter Frutal Complejidad Carácter Vegetal

AlphaTD

S.c. S.c.+

Adiciones

S.c AlphaTD

S.c. S.c.+

Adiciones

S.c

AlphaTD

S.c. S.c.+

Adiciones

S.c

¿Que incidencia AROMÁTICA? • Ensayos en Bodega sobre Merlot

• Inoculación secuencial / inoculación S. cerevisiae pura

• Ajuste del ensayo « S. cerevisiae pura » al nivel de 3 esteres menores de la

modalidad secuencial

AlphaTD

+

S.c.

S.c.

La inoculación secuencial AlphaTD y S. cerevisiae, vía la

producción de esteres específicos, contribuye a :

Aumentar la fruta y la complejidad de los vinos

Pulir las notas vegétales

S.c.

₊ Propanoate

d’éthyle

₊ Isobutyrate

d’éthyle

₊ Hydrocinnamate

d’éthyle

--

Zymaflore® Alpha TD y Zymaflore ® RX60

Introducción de S. cerevisiae 36 horas después de la inoculación de T.

delbrueckii.

1. 30 g/hL Zymaflore Alpha TD n.sacch.

Importante : rehidratación en agua a 25 -30 °C sin Superstart.

2. 36h después introducción de Zymaflore ® Alpha TD

Adicion de 20 g/hL de Zymaflore ® RX60 y Superstart Rouge.

Ensayo en bodega : Inoculación secuencial

TEMPRANILLO BAIGORRI RIOJA ESPAÑA

RX60 + Superstart Zymaflore Alpha

+RX60 avec Superstart (+36)

AT (g/L ac tartrique) 4,9 4,6

AV (g/L H2S04) 0,19 0,21

Ac tatrique (g/L) 2,81 2,72

Ac lactique (g/L) 2,02 2,03

Ac malique (g/L) 0,59 0,52

Sucres réducteurs (g/L) <1,5 <1,5

Fructose + glucose (g/L) <1,2 <1,2

Glycérol (g/L) 6,96 9,41

TAV (% vol) 12,4 12,6

pH 3,8 3,9

990

1010

1030

1050

1070

1090

1110

23

-9-1

0

24

-9-1

0

25

-9-1

0

26

-9-1

0

27

-9-1

0

28

-9-1

0

29

-9-1

0

30

-9-1

0

1-1

0-1

0

2-1

0-1

0

3-1

0-1

0

4-1

0-1

0

5-1

0-1

0

De

nsi

dad

RX60

Alpha + RX60 (36h)

1 bazuqueo/dia

durante la FA

Trasiego

05 Oct

Inoculación con

450 PreAc (1 g/hL) Fin FML

01 Nov 12.5% vol, ph 3.7, , AM 2.9 g/L

AT 5.7 g/L A.Tartrique

RESULTADOS DE DEGUSTACIÓN

TEST DE PREFERENCIA

13 degustadores /16 han preferido la modalidad Alpha+RX60 +36 horas

0,0

1,0

2,0

3,0

4,0

5,0Fruits rouges

Fruits noirs

Fraîcheur aromatiqueBoisé

Végétal

RX60

Alpha + RX60

0,0

1,0

2,0

3,0

4,0

5,0

Persistancearomatique

Volume

AstringenceAcidité

Amertume

Degustación asociación de enólogos de Bordeaux, 16 meses después de FA

Persistencia

Aromática

Volumen

Astringencia Acidez

Amargor

Frescor Aromático

Frutos negros

Frutos rojos

Vegetal

Roble

Microscopio Electronico, Aumento X 24000 Bordeaux Imaging Center - Pôle d'Imagerie Electronique - Université Bordeaux 2.

Torulaspora delbrueckii Saccharomyces cerevisiae

ZYMAFLORE® ALPHA - UNA CEPA ESPÉCIFICA

Débil producción de acidez volátil.

No produce fenoles volátiles (POF -).

Débil producción de Etanal y de acetato de etilo.

Débil producción de H2S

Perfil organoléptico complejo

Impacto neto y positivo en el volumen y la

duración en boca

Pureza y complejidad aromática importantes

TAKE HOME MESSAGE

BIODIVERSIDAD – Levaduras Saccharomyces y No-

Saccharomyces,

Trabajo exhaustivo de bio-selección :

ZYMAFLORE® ALPHA TD

No -Saccharomyces: Torulaspora

delbrueckii,

TECNOLOGIA de última generación:

CONOCIMIENTO y SAVOIR FAIRE - Expertos en

BIOTECNOLOGÍA

MUITO OBRIGADO!!