Casa m. sbiena al tiempo
n ¡ve rsi dad etropolitana lztapalapa
J MEZA LOEZA LIDIA ITZEL
Matricula Aicenciatura /División
Unidad
Trimestre lectivo Horas a la semana
0 Teléfono
93329196 INGENIERIA BIOQU~MICA INDUSTRIAL CIENCIAS BIOLÓGICAS Y DE LA SALUD IZTAPALAPA 685-61 -95 97-0 20 HORAS
/Título del trabajo METANOGÉNESIS A PARTIR DE ACETAMIDA POR BICULTIVO DE
Baclllus sphaericus y Mefhanosarcina rnarei
JAsesor: M. EN c. FLORINA RAM~REZ VIVES PROFESOR TITULAR DETIEMPO COMPLETO
Fecha de inicio: 9 /Fecha de terminación:
26 de febrero de 1997 26 de agosto de 1997 c 1
Lidia ltzel Meza Geza
I
Casa m sbiena al IiernDo
UNIVERSIDAD AUTONOMA METROPOLITANA
Mexico, D.F. a 28 octubre de 1997
Dr. José Luis Aredondo Figueroa Director División de Ciencias Biológicas y de la Salud.
Presente
Por medio de la presente deseo hacer constar que Lidia ltzel Meza Loeza con matricula 93329196 de la carero de Ingeniería Bioquimica Industrial concluyó satisfactoriamente su Servicio Social con el proyecto titulado:
“Metanogénesis a partir de acetamida por bicultivo de Bacillus sphaericus y Mefhanosarcina maze?’
y realizado en el Laboratorio de Microbiología Ambiental del Departamento de Biotecnología de esta Unidad.
cj
Atentamente
Profesor Titular de Tiempo Completo
UNIDAD IZTAPALAPA AV. Michoadn y La Purisima, Col. Vicentina. 09340 México, D.F. ~e i . : 724-4600 TEEFAX: (5) 612 0885
México, D.F. a 28 octubre de 1997
Dr. Jose Luis Arredondo Figueroa Director División de Ciencias Biológicas y de la Salud.
Presente
Por medio de la presente me permito informarle la terminación de mi Servicio Social, el cual se llevó a cabo en el Laboratorio de Microbiología Ambiental del Departamento de Biotecnología de la Univenidad Autónoma Metropolitana Iztapalapa.
“Metanogénesis a partir de acetamida por bicultivo de Bacillus sphaencus y Methanosarcha mazei”
c El trabajo realizado llevó por título:
Y fue asesorado por la M. en C. Florina Ramírez Vives, profesor titular de tiempo completo en el Departamento de Biotecnología de esta división.
Atentamente
Lidia ltzel Meza Loeza (933291 96)
Mexico, D.F. a 28 de octubre de 1997
Dr. Jose Luis Arredondo Figueroa Director División de Ciencias Biológicas y de la Salud.
Presente
InSIJ1 Me dirijo a usted con el motivo de justificar la entrega del reporte final de
Servicio Social después de la fecha señalada, esto se debió a que mi trabajo de investigación terminó en el periodo vocacional de verano. Dada esta situación debí esperar el comienzo del trimestre en curso para poder concluir los experimentos pendientes y discutir los resultados del trabajo con mi asesor de Servicio Social la M. en C. Flonna RarnÍrez Vives, y asi poder terminar el presente reporte.
Atentamente
Lidia ltzel Meza Loeza (933291 96)
La acetamida es un compuesto que tiene PM de 59.07, p.f. de 82T,
cristalina y sólido incoloro en estado puro.
La acetamida es utilizada como solvente en procesos industriales como en la
industria textil, farmacéutica y de pinturas, por lo cual forma parte de las descargas
residuales de dichas industrias (Guyot y col. 1994).
Se ha observado que la acetamida administrada oralmente a ratas forma
tumores malignos en el higado y debido a la liberación de amonio también es causa
de la desnaturalización de las proteínas (Kirt-Otmer,1978)
La acetamida tiene un3 estructum semejante a la del acetato, el cual es un
intermediario en el proceso de digestión anaerobia, por lo que se han realizado
diversos estudios para degradar anaerobicamente la acetamida (Ramirez, 1992)
Por otro lado se ha estudiado a bacterias anaerobias y aerobias que utilizan la
acetamida, y se ha visto que pueden coexistir para llevar a cabo la degradación de
dicho compuesto.(Raniírez, 1992, 1993 y 1995).
La acetamida puede ser tratada por digestión anaerobia, este es un proceso
microbiono aerobio complejo de conversión de la materia orgánica en acetato.
dióxido de carbono, hidrógeno y metano.
La formación de metano y bióxido de carbono corresponde a la Última etapa
de una serie de reacciones por los cuales los compuestos orgánicos son degradados.
El metano corresponde a la forma más reducida y el bióxido de carbono a la mas
oxidada del carbono.
La biometanización puede ocurrir en ambientes psicrófilos (10 -1 5 "C), mesófilos
(30-40°C) y termófilos (mas de 45°C).
El hombre ha utilizado este fenómeno natural de biometanización para su
propio beneficio, tanto para producción de biogas con fines energéticos como la
descomposición 'y tratamiento de sus desechos sólidos y líquidos.
Las especies bacterianas implicadcs en el proceso de la digestión anaerobia de
la materia orgánica, pueden ser diferentes dependiendo de las condiciones
fiscoquímicas como tempera!ura, pH, presión osmótica y la composición del sustrato.
La producción de meíano en los ecosistemas anaerobias es descrito como un
proceso de trss etapas: la hidrólisis y acidogénesis, acetogenesis y la melanogenesis.
La primera etapa consiste en la hidrólisis y acidogénesis de los compuestos de
alto peso molecular ( proíeínas, lipidos y carbohidraios ) a unidades químicas mas
simples como azúcares, aminojcidcs, alcoholes, iiidrogeno y bióxido de carbono. Esta
etapa se realiza por microorganismos diversos [bacterias y hongos), anaerobios o
facultativos.
La segunda etapa del bioproceso es la occtogenesis que es la transformación
de los productos de la primera etapa en acetoio, hidrógeno y bióxido de carbono. En
esta etapa pueden intervenir tres tipos de microorganismos: bacterias aceloghicas
productoras de hidrógeno, bacterias sulfato-reductoras y bacterias
homoaceiogenicas.
En la tercera etapa que es la metanogénesis se lleva a cabo la producción d e
metano a partir d e acetato, hidrógeno y bióxiodo de carbono.
Diaestión anaerobia
[MATERIA ORGÁNICA I
BACTERIAS FORMADORAS DE ÁCIDO
I (DANOL. PROPIONAIO, BUTIRAIO. ETC.)
SO4 =
I BACTERIAS ACETOG~NICAS BACTERIAS SULFATOREDUCTORAS -
‘1 BACTERIAS HOMOACETOG~NICAS
rl
-$ H2S
H z + CO? I
ACETATO I
I METANdGENAS ACETOCÁSTICAS I e c o ? METANOGEN AS HlDROGENOF¡LlCAS
Metanooénesis
La metanogénesis ocurre en ecosistemas muy diversos lales como pantanos,
sedimentos marinos o lacusires; se requieren tres condiciones básicas para tener un
proceso adecuado: anaerobiosis estrktas. condiciones reductoras rigurosas y ausencia
de aceptores minerales finales que favorezcan otras vías e n competición con la
metünogénesis.
La mayoría de las bacterias metanógenas emplean el COZ como su aceptor
de electrones terminal en la respiración anaerobia, convirtiéndolo en metano: el
donador de electrones utilizado en este proceso es generalmente el hidrógeno, Hz. La
reacción general de la metanogénesis en esta vía es de la manera siguiente:
4H2 + COZ -----+ CHI + 2Hz0 A Go' =-32 kcal
lo que demuestra que la reducción del COZ al metano es un proceso de 8 electrones
(4 moléculas de Hz). Además del COZ, unas pocas sustancias adicionales pueden ser
convertidas en metano, incluyendo el meianol, CH30H; el formiato, HCOO- : el
metilmercaptano, CH3SH: el acetato, CHLOO-: y l as metilaminas.
La formación de metano tiene lugar durante la descomposición de sustratos tan
diversos como celulosa, almidón y carbohidratos, proteínas y aminoácidos, grasas y
ácidos grasos, alcoholes, ácido benzoic0 y numeroscs sustancias de otros tipos.
Aunque en un principio se pensó que las bacterias metanógenas atacaban algunos
de estos sustratos directamente, en la actualidad se sabe bien que la formación de
metano a partir de estos materiales requiere la participación de otras bacterias
anaerobias
Microoraanismos meianóaenos
Los microorganisrnos capaces de llevar a cabo la melanogenesis tienen
divenas formas que van desde cocos en cadenas o scrcinas, hasta bacilos largos
unidos también en cadenas y espirales, algunos son móviles; pueden ser Gram-
positivos o Gram-negativos, miden de 0.5 a 0.8 pm de ancho y 0.8 a 7 pm de largo,
son anaerobios estricfos, crecen en ambientes naturales anóxicos. El pH en el que se
desarrollan es de 6.5 - 7.8 y la temperatura es de 30 - 40 "C en lo mesófilos y de 45 -65
"C en los termófilos.
0
Los meianógenos son 10s rnicroorganismos mas abundantes de las
arqueobacterias, estos se caracterizan por que de la materia orgánica en
descomposición a través de una vía anaeróbica toman sus requerimientos energéticos
y producen biomosa.
Las bacterias melanogenicas se diferencian del reslo de los procarionies por
contener una serie de coenzimas no Presentes en otros rnicroorganismos.
o
Varios tipos morfológicos de bacterias metanogénicas han sido aisladas en años
recientes, y un profundo estudio de su fisiología y secuencia de RNA ribosómico ha
originado la calsificación de este grupo en cuatro familias que tienen un total de doce
géneros.
Las bacterfas denominadas metanogenicas producen CH4 , y pueden
clasificarse en:
a) Bacterias hidrogenofilicas no acetociasicas.
Obtienen su energía de la oxidación del Hz en presencia de COZ como aceptor
de electrones. Estas bacterias no pueden utilizar el acetalo como fuente energía,
pero unas pueden utilizarlo como fuente de carbono. (Methanobacterium forrnicicurn,
Methanobacterium hungatei, Methanobacterium thermoautotrophicurn y
Methanobrevibacter sp.)
b) Bacterias meianogénicas aceioclasticas
Producen metano a partir del grupo metil del acetato, el 73% del metano
producido por los digestores anaerobios viene del acetato.
Este grupo de bacterias pueden dividirse en dos géneros:
i) Las de baja afinidad para el acetato san del generoMethanosarcina ademas de
acetaio estas bacterias pueden utilizar como fuente de energía y de carbono las -
metilaminas, metanol, y algunas el H2 . Las especies más representativas son:
h.lefhanosarcina barker;, Id. maze; y M. :hermophila.
ii) Las bacterias del genero Metanotrix que forman filamentos largos, no utilizan el H2 y
el formido y no son inhibidas por estos. Presentan alta afinidad por el acetato.
Bioauímica de las bacterias metanóaenas
Debido a una muy antigua divergencia evolutiva las arqueobacterias poseen
una bioquímica muy característica que se ha mantenido aislada y que no es
compartida por ningún otro ser vivo: en condiciones anóxicas todos lo metanógenos
usan un grupo metilo como aceptor final de electrones. la reducción de dicho grupo
a CH4 es energéticamente favorable (Go=-112 kJ). tomando de ahí parte de los
requerimientos para su crecimiento. En general lo que hace este tipo de bacteria es
que usando ocho elecfrones reducen el C02 a CH4 para lo cual ponen en marcha
todo un sistema multienzimatico.
La reducción del bióxido de carbono a metano no se lleva a cabo sobre el
compuesto o los intermediarios que se encuentren libres, sino que el primero reacciona
con uno de los cofactores del complejo multienz¡matico(paso de activación del COI
y de ahí en forma de unidad de Ci (un carbono)es transferido de un transportador a
otro sufriendo cambios en su estado de oxidación, interactuando con diversas enzimas
y cofaclores hasta llegar a metano y dejar libre al Último transportador, que activara
otra molécula de COI por estados de oxidación tales como: formaldehído, metenilo,
metileno, metilo y metano.
4
Ciclo Ci para la reducción de C02 a CHI
Formil-metanofurano 4 I
,- Metenil-H4MPT
t+ 2e
Metilen-H4MPT
Metil-H4MPT
::"Jq ,~ p- I,j H2
CH3-S-CoM
Fa0 red F420 OX
hidrogenasa
Los factore: que intervienen en el ciclo son: rnetilfurano,
fetrahidrornetanopterina (H4M,PT), coenzinla M (2-m~rraptoetono sulfónico), factor
F430 y el cofactor F420.
0
~5~~~~~~ QENLML
Estudio de la metanogénesis a partir de acetamida
&DBJErnWO ~~~~~~~~~
Metanogénesis en la hidrólisis de acetamida por bicultivos de Bacillus sphaericus y
Methanosarcina mazei
Metanogénesis en un reactor UASB con acetamida
PRIMERA FASE
En la primera fase del experimento se realizó la propagación tanto de
Methanosarcina mazei, como de Methanosarcina barker;, para lo cual se contó con
dos cepas puras de colección y cuyas características principales las reportan Krieg y
col. (1984), J. L Garcia (1990), estas bacterias fueron seleccionadas porque Ramírez
(1 992) aisló e identificó bacterias del género Meihanosarcina y Methanobacterium
presentes en un reactor anaerobio UASB que trataba acetamida y que eran las
responsables de la producción de metano. rl)i' Para lograr la propagación se emplearon botellas de 500 y de 250 mL, los
cuales contenían 225 y 135 mL de medio anaerobio (Balch y col.,l979. -anexo A-2.)
respectivamente, las botellas fueron inoculadas con 50 y 30 mL de un cultivo en fase
exponencial de Methanosarcina respectivamente. (Se utilizaron das botellas de
diferente volumen para cada especie de bacteria]. La inoculación s e llevó a cabo
purgando las jeringas con nitrógeno y dejando la misma cantidad de este Último en
cada toma de muestra tanto de las soluciones como del inóculo. Después se
mantuvieron en incubación a 35 "C (botellas invertidas para evitar la fuga de metano).
Se tomaron muestras continuas de metano (tres veces por semana) para
observar su producción, y una muestra liquida cada semana para determinar el
consumo de aceiato. Los cultivos se mantuvieron de esta manera durante un mes
hasio obsewar que el acetoio se había consumido, después se realimentoron con
medio anaerotio (anexo A-3). y :e continuó fomarido muestras durante otro mec para
lograr obtener una concentración suficienfe de bacterias para poder realizar el
experimenfo de los bicultivos.
0
SEGUNDA FASE
Se realizó un bicultivo en un reactor batch con 6acillus sphaericus (cepa aislada
de un reactor anaerobio UASB -Ramirez, 1993- cuyas características fueron reportadas
por Ramirez -1995) y Methanosarcina maze;. Se utilizó un frasco serológico de un litro
de capacidad, al cual se le adicionaron 200 mL de medio aerobio (Anexo A-4) y se le
adicionó acetamida hasta tener una concentración de 20 mM en el bicultivo al
tiempo inicial. El inóculo adicionado fue de 50 mL de Bacillus sphaericus. y 50 mL de
Methanosarcina maze; El reactor se mantuvo en incubación a 35 "C, durante un mes,
en el transcurso del cual se tomaron muestras de gas para determinar metano (Anexo
8-3), y muestras líquidas para observar el consumo de acetcto (Anexo 8-2), y dado
que no se preseritó un consumo significante de acetafo ni la producción de metano,
se dio por terminado el experhenlo y se continuó con la siguiente fase para obtener
mayor información y así poder tener las condiciones mas apropiadas para este
reactor. '@#
TERCERA FASE Se realizaron una serie de bicultivos en los cuales se variaba el volumen de
medio aerobio (Anexo A-4) y el medio anaerobio (Anexo A-2) en el cual se
encontraba la bacteria metanog6nica.
En lo serie de bicultivos se mantiene una concentración de acetamida de 25
nM, considerando el volumen total.
Cada bicultivo se llevó a cabo por duplicado.
Se utilizaron boteilas serológicas de 60 rnL, y los diferentes experimentos fueron
como se describe en Ius iablas siguientes.
Tabla 1
Descripcibn de los bicultivos c m 3;ici:lus sphoericiis y Mefhanosoicino rnazei
Bicultivo Medio Medio Inóculo de Solución de Volumen total No. oorobio anaerobic(ml.) B. sphaoncvs acetamida I (mL)
( rn l ) M. ?.laze¡ (ni 1.) 1M (mL) 1 20 O 2 0.55 22.55 2 5 15 2 0.55 3 IO 10 2 0.55 22.55 4 15 5 2 0.55 22.55
22.55 - . -
Tabla 2
Descripción de los bicultivos con Bacillus sphaericus y Methanosarcina barker¡
o Para realizar los experimentos descritos en las tablas anteriores, primero fue
adicionada la acetamida, después el inóculo de Bacillus sphaericus y por ultimo se
adiciona el medio anaerobio dentro del cual se encuentra el inóculo de
Methanosarcina
Después de haber adicionado todo lo anterior, se desplazó la fase gaseosa
contenida en las botellas serológicas con una corrienie de nitrógeno, con lo cual sólo
se tendría oxigeno en forma disuelta en el medio.
Es necesario aclarar que el un cultivo sólo contenía Bacillus sphaericus por lo
que se tomó como control en la hidrólisis de acetamida
Para poder evaluar todos estos bicultivos se determinaron cuatro diferentes
parametros a lo 1a:go del experimento: acetamida, acetato, metano y amonio ( las
técnicas utilizadas para dichas determinaciones están reportadas en el anexo B J . La
duración de eslas cineticas fue de mes y medio. También se evaluaron el pH y el
oxígeno disuelto en el tiempo inicial y el tiempo final. $0 CUARTA FASE
Se trató de poner en marcha el reactor en conlinuo UASB, pero dado que era
un diseno especial con el cual s e permitiría la entrada del electrodo para medir el
oxígeno disuelto en el medio, no fue bien construido del iodo y se presentaron fugas
de la corriente de la chaqueta al reactor.
El diseño del reacior esta siendo mejorado y hasta el momenlo no se ha puesto
en marcha.
El reactor utilizado en esta etapa s e encuntra representado en el esquema
siguiente:
. I
Mediante' el presente estudio se logró llevar a cabo la metanogénesis a partir de
acetamida como sustrato inicial, realizando bicultivos entre microorganismos como
Bacillus sphaericus que es una bacteria aerobia estricta y Methanosarcina (mazei y
barqueri) que son bacterias anaerobias.
o También se demuestra que la metanogénesis es posible a partir de acetamida, y a
que el oxígeno disuelto en el medio es utiljzado por el Bacillus sphaericus para llevar a
cabo la hidrolisis de acetamida para dar como resultado la formación de acetato y
amonio, reduciendo el medio para que Methanosarcina utilice el acetato como
sustrato y lo lleve hosta metano y COZ mediante un proceso anaerobio.
También fue posible observar que a pesar de las condiciones limitadas de oxígeno
dentro de los bicultivos Bacillus sphaericus pudo realizar la hidrólisis de acetamida
0
Los resultados reportados a continuación son los que se obtuvieron en los diferentes bicultivos realizados.
En la tabla 3 se presentan los valores de oxígeno y de pH encontrados en el tiempo inicial en los diferentes bicultivos.
Tabla 3 Condiciones iniciales de oxígeno disuelto y pH
I medio anaerobio (M. barkeri) 1 I I I I
Se puede apreciar que a comparación del cultivo control en donde se tiene sólo medio aerobio se encontró un valor de 6 mg/L de oxígeno disuelto, el cual es relativamente alto comparándolo con el valor que se presenta en los diierentes cultivos mixtos, ya que el máximo valor observado en estos es de 1.22 mg/L de oxígeno en los bicultivos con mayor proporción de medio aerobio.
o
Con respecto al pH no se encontró una diferencia significativa, pero se observa mientras mayor es el volumen de medio anaerobio el pH se incrementa que
ligeramente.
En la tabla 4 se reportan las condiciones de pH y oxígeno disuelto en el tiempo final encontrados en los diversos experimentos.
Tabla 4 Condiciones finales de oxígeno disuelto y pH
. . anaerobio (M. ~mazei) 15 mL de medio aerobio v 5 mL de medio O I 7.855
anaerobio (M. mazei) 5 mL de medio aerobio y 15 mL de medio
anaerobio (M. barkeri)
anaerobio (M. barken) 15 mL de medio aerobio y 5 mL de medio
anaerobio [M. barken)
O 8.035
O 7.87
O 7.785
10 mL de medio aerobio y 1 O mL de medio
Podemos observar en la tabla anterior que el oxígeno se consumió en su
totalidad durante los 45 días del experimento, lo cual resulta de la actividad de Bacillus
sphaencus, ya que éste utiliza el oxígeno existente para degradar acetamida y llevarla
a acetato.
A continuación se presentan los resultados obtenidos en las determinaciones de
acetamida, acetato, metano y amonio en los diferentes cultivos a lo largo del
experimento. Q
Figura 1 Cinbtica de hidrólisis de sceiamida por
Baci//us sphaencus Cultiva conlrol 25 I
*
"1 10 : e x O
X O 1
O 10 20 30 40 50
Te- (dks)
En la figura 1 se presenta el cultivo control, es decir en el cual sólo se tiene
Bacillus sphaericus: en esta cinetica se puede observar que la acetamida es
consumida desde el principio pasando de una concentración de 21.56 mM a 7.5 mM,
dando como resultado la producción de acetato y amonio. En el día 8 se presenta la maxima producción de acetato en una concentración de 3.3 mM, de la cual se
consume aproximadamente 1.6 mM, esto se debe que 6. sphaericus también
aprovecha el acetato como sustrafo.
La producción de amonio aumenta en proporción a la hidrólisis de acetamida,
llegando a su máxima concentración en el día 10, siendo ésta de 10.7 mM Y
decreciendo hasta llegar o 6.4 mM. 0
Figura 2 Cinbtica de hidr6lisis de acetamida por
Bacillus sphaericus y il43ihanosarcina rnazei en un mlumen de 5 rnL de medio aerobio y15 mL de anaerobio
20
15
6 “3.2- 4 < “ E . : 0 2 10
: * - e : S j g :e‘,- 5 u ó P
o <
En la figura 2 se representa un bicultivo de B. sphaericus y M. maze; , en el cual existe 5 mL de medio aerobio y 15 mL de medio anaerobio. En esta cinetica se observa que la mayor producción de amonio está en el día 8 con una concentración de 6.1
mM y de ahi es consumida hasta alcanzar una concentración de 4.2 mM.
El acetato se produce hasta concentraciones de 7.2 mM en el día 8, y se
La producción de metano no es significativa. Con respecto a la acetamida se puede ver que es hidrolizada en
consume de esta producción un aproximadamente 5.8 mM.
aproximadamenle un 85 %.
Figura 3 CinBtica de hidrólisis de aceíamida por
Bacillos sphaencus y hMhanosarcina mazei en un wlumen de 10 mL de medio aerobio y 10 m L de anaerobio
e AcetanMa
m Acetato
x Anunio
En la figura 3 se tiene un bicultivo de B. sphaericus y M. mazei, y e n este caso el volumen de medio anaerobio y aerobio es igual 110 rnL de cada uno], en este experimento podemos ver que la mayor producción de acetato se tienen a los 16 dias con un valor de 5.8 mM consumiendose hasta una concentración de 2.4 mM.
El amonio por su parte llaga a 17.5 rnM y decrece hasta 3.3 mM.
Por otro lado el metano no se produce y, con respecto a la acetarnida, se observa que presenta una hidrólisis del 1 O0 %.
Figura 4 Cinetica de hidrólisis de aceiamida por
Bacillus sphaericus y&üianosarcina mazai en un mlumen de 15 mL de medio aerobio y 5 mL de anaembio
25
Aceiato A Metano x Anunio
X A
A A A M
O 10 20 30 40 50 Tienpo (dkis)
En la figura 4 esta representado el experimento en el que se tenia B. sphaericus
y M. mazei en un medio en donde la proporción de medio aerobio era mayor (15 mL)
que la de medio anaerobio (5 mLJ.
Se puede observar que la producción de metano es alta de hasta de 5.9 mM en
el día 20.
El acetato alcanza una producción maxima en los primeros días del
experimento, siendo esta de 6.9 mM y después se consume aproximadamente 5.4 mM.
Por otro lado el amonio se produjo de forma proporcional a la hidrólisis de acetamida,
presentando una concentración máxima de 8 mM en el día 10.
T)
Figura 5 Cinbtica de hidrólisis de aceiamida por
Bacillus sphaencus y hbthanosarcina barken n un mlumen de 5 m ~ = & ~ U k a e E b j ~ W 3 . l M s & ? b i o
357----- 1 30 t
A . ,A O 4 ..-- I - L 10 20 30 40
-5 Tierrpo (db)
ta Aceiam A Matano
x Anunio
En la figura 5 están los resultados obtenidos en el experimento con B. sphaencus y M. barken en el que se el volumen de medio aerobio es menor que el anaerobio (5
mL de medio aerobio y 15 mL de medio anaerobio]. Primeramente la acetamida se hidroliza aproximadamente 16.5 mM, y se
observa que a partir del dia 8 permanece casi constante hasta los 45 días, esto se debe que el oxígeno se agota rápidamente por que sólo se tienen 5 mL de medio aerobio y por lo tanto el oxígeno disuelto es poco.
Por lo que respecta a el amonio se observa que se produce en una concentración máxima de 9.6 mM y posteriormente es consumida hasta una concentración de 4.2 mM.
El acetato alcanza una concentración máxima de 15.3 mM en el día 8 y de ella T se consume aproximadamente un 12.4 mM.
La producción de metano es baja durante el experimento.
Flgura 6 Cin4tica de hidroiisis de aceiamida por
Bacillus sphaeflcus y Wthanosarcina barken en un valumen de 10 mL de medio aerobio y 10 mL de anaerobio
25 I
10 20 30 40 -5
Tierrpo (dfas)
e Acetamide m Aceiaio
x Amnio
En la figura 6 se presenta la cinética con B. sphaencus y M. barken que se
En esfa figura se muestra que la acetumida se hidroliza en aproximadamente un
Se puede observar que la producción máxima de acetato se alcanza en el día
Por otro lado el metano empieza a producirse en forma significativa a partir del
También se puede ver que el amonio tlene un máximo de 12.2 mM a los 8 días
encuentran en 1 O mL de medio aerobio y 1 O mL de anaerobio.
87 %, ya que de una concentración inicial de 13.4 mM termina con una de 1.6 mM.
10 con una concentración de 7.48 mM y decrece hasta 4.2 mM.
día 6, alcanzando su máximo en el día 24 con 1.9 mM.
de iniciado el experimento.
Flgura 7 Cinética de hidrblisis de acetamida por
Bacillus sphaencus y hMhanosam'na barken en un wlumen de 15 mL de medio aerobio y 5 mL de anaerobio
45 40
O 10 20 30 40 50 Tienpo (dias)
Por último en la figura 7 se presenta la cinetica con 8. sphaencus y M. barked, en la cual se tiene un volumen de 15 mL de medio aerobio y 5 de medio anaerobio.
Se muestra que la acetamida es hidrolizada paulatinamente hasta alcanzar un
El amonio alcanza una concentración de hasta 17.7 mM y después es
El acetaío que es producido llega a concentraciones de 9.5 mM y
El metano producido por la bacteria metanogenica llega hasta una
46 %, ya que de 11.4 mM termina con una concentración de 6 mM
consumida hasta llegar a 4.4 mM.
posteriormente es consumido hasta quedar con 1.7 mM.
concentración de 4 mM.
")
Los resultados observados se resumen en la siguiente tabla:
medio onaerobio IM mazeil I I I I I
10 ml de medio 1.22 O 5.8 3.4 - oerobio y 10 m L de
medio onoerobio IM. maze11 I I I I I
15 rnL de medio 4.22 3.7 6.9 5.4 5.9 oerobio y 5 mL de
medio anaerobio IM. mazeil I I I I I
5 m L de medio 0.92 6.5 15.3 12.4 1.3 oerobio Y 15 mL de
medio anóeiobio IM. barkeiil
aerobioy IOmLde medio anclerobio IM.
10 mL de medio 1.22 1.6 7.48 3.28 1.9 ~~. ~ ~~
barker¡) I I5 mL de medio 4.22 6 9.5 1.7 4
oerobio y 5 mi de medio anaerobio IM.
barked] I I I I I
Con los resultados anteriores podemos ver que el oxígeno disuelto en el tiempo
inicial del cultivo control que sólo tiene medio aerobio es de 6.1 1 mg/L y que éste es
relativamente alto con respecto valor que se presenta en los cultivos mixtos, en éstos
últimos se observa que cuando se tiene un volumen de 15 mL de medio aerobio y 5 mL
de anaerobio se tiene 4.22 mg/L de oxígeno disuelto y éste valor baja conforme
aumenta el volumen de medio anaerobio.
Con respecto al pH presentado se tiene que inicialmente en los cultivos con
mayor volumen de medio anaerobio es ligeramente mayor, lo que se debe a que el
inoculo de Methcinosarcifla (maze; y barker; 1 se encuentra aproximodamente en un
p~ de a. Los valores encontrados de pH inicial y final varían ligeramente siendo mayores
al tiempo final, pero conservando la proporcionalidad entre los divenos cultivos. esto
se debe a la producción de "3
Por otro lado la mejor hidrólisis de acetamida se presenta en los cultivos que
tienen el mismo volumen tanto de medio aerobio como anaerobio, esto sin importar la
bacteria metanogénica de que se trate, puesto que tanto M.mazet’ como M. barken se
comportaron de la misma forma en este caso.
Se puede decir que en general la hidrólisis de acetamida no depende de ni de
Y en el experimento con M. mazei tenemos que la segunda mejor hidrólis de
acetamida cuando el volumen de medio aerobio es mayor. Es conveniente aclarar
que la diferencia de eficiencia de hidrólisis de acetamida cuando se tienen diferentes
volúmenes de medio aerobio y anaerobio (15/5 o 5/15] es muy baja.
la cantidad de inóculo ni de la cantidad de oxígeno disuelto.
Por otro lado podemos ver que con respecto a la producción de amonio es
mayor en los COSOS en los que los volúmenes de medio aerobio y anaerobio son
iguales.
En todos los experimentos se observó que después de alcanzar un valor máximo
el amonio, éste empezaba a decrecer, lo cual se debe a que los microorganismos
presentes en los cultivos lo consumen como fuente de nitrógeno, ya que el medio esta
limitado de éste compuesto.
Con respecto al metano, se tiene que en los cultivos que son con mayor
Por otro lado se esperaba que la concentración de metano aumentara
conforme aumentaba el volumen de medio anaerobio, lo cual no fue así. ya que se
observó que la producción de metano fue mayor cuando se tenia un mayor volumen
de medio aerobio, siendo mayor en el bicultivo en el que se encuentra M. mazei . También se observa que la producción de metano disminuye conforme aumenta el
volumen de medio anaerobio, esto se presentó tanto en los bicultivos con M. mazei y
M. barkeri, pero se presentan valores mayores en el cultivo con M. mazei.
volumen de medio aerobio
En los cultivos en los que se tiene una producción significativa de metano Se
observó que de la producción máxima de acetato es consumido un 70%, y que de lo
que se consume un 79 % se va a la formación de metano , esto es en el caso con M.
barker¡, y con M. rnazei se tiene que de el acetato formado un 77 % es consumido Y
que el 100 % del acetafo que se consume se va a formación de metano. Esto se
presenta en los cultivos con 15 mL de medio aerobio y 5 mL de medio anaerobio.
* Es posible lograr la metanogénesis a partir de bicultivos de bacterias aerobias y
anaerobias estrictas.
* Existe una mayor producción de metano cuando se tiene el bicuitivo con una
relación de inóculo 75/25 (Bacillus /Methanosarcina) ,-'
* La hidrólisis de acetamida es independiente de la cantidad de oxígeno disuelto en
el medio.
Es recomendable que cuando se trabaje con bacterias que crecen en forma de
agregados como Methanosarcina, inocular considerando el peso total de la bacteria.
ya que en volúmenes iguales no se tiene la misma concentración celular.
Brock, T. D., Smith, D. W., y Madigan, M.T. (1987). Microbiología. 4 O edición, Prentice-
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Rev. Lat.-Arnc;r. Microbiol. 35:459-468
Ell Preparación de las soluciones necesarias para el medio de cultivo
Solución mineral 1 :Kz HP04 6g/L
Solución mineral 2: KH2P04 6: (NH4jzS04 6: NaCI 12; MgS04 .7H20 2.6:
CaC1.2H~0 0.1 6 (g/L)
Solución de oligoelementos: Disolver 1.5 g de ácido nitritoacético en 950 mL de agua destilada y ajustar el pH a 6.5 con NaOH al lo%, adicionar MgS04.7HzO 3: MnS04.2H20 0.5 NaCl 1.0 FeSO4 .~HzO 3: MnSO4.2HZ0 0.5: NaCl 1.0
FeS04.7H20 0.1; CoS04.5H~0 0.1: CaC12.2H20 0.1; ZnSO4 0.1; CuS04.5H20 0.01; ric, AIK(S04) 0.01; t i 3 6 0 3 0.01: Na~Mo04.H20 0.1 (g/L]
Solución de vitaminas: biotina 0.02, ácido fólico, piridoxina tiamina 0.05,
riboflavina 0.05: DL ácido pantoténico 0.05; BIZ 0.001; ácido p-aminobenzoico
0.05; ácido lipóico 0.05 g/L
Solución de cloruro de níquel: 0.5 g/L
Solución de sulfato ferroso: 2 g/L
Solución de rezanurina: 0.1 g/100 mL
Sulfur0 de sodio 2.5 %: Na2S.9H20 2.5 g/100 rnL de agua reducida bajo
comente de nitrógeno s Solución patrón de Acetamida 1M: se prepara con agua reducida y bajo
0 corriente de nitrógeno
Solución patrón de Acetato 1M: se prepara con agua reducida y bajo
corriente de nitrógeno
Nota: Todas las soluciones se preparan con agua destilada
Preparación de medio de cultivo anaerobio con reductores
Medio de balch (1 979)
Tabla 1 . Preparación para un litro
Preoaración
1. Mezclar todos los componentes de la tabla 1 excepto la cisteína
2. Marcar hasta el aforo
3. Ajustar el pH a 7 con NaOH al 10% o con HCI diluido
4. Adicionar una tercera parte de agua más, y poner a ebullir hasta la marca de
/-D aforo
5. Enfriar bajo comente de nitrógeno para remover el oxigeno
6. Agregar la cisteína
7. Agregar por cada 50 mL de medio 0.5 mL de sulfur0 de sodio 8. Llenar las botellas serológicas que se vayan a utilizar
9. Desplazar el nitrógeno con una mezcla de nitrógeno y bióxido de corbono (NZ-
80-/C0~-20-)
Esterilizar a 120" C durante 15 min.
A-3
Preparación de medio de cultivo anaerobio de realimentación
Se realiza de forma semejante al descrito en la parte 1 de este anexo, pero
se. hace tres veces concentrado para que al adicionado al medio ya existente se
mantengan las concentraciones iniciales. La Única diferencia es que la
rezanunna y el sulfur0 de sodio no se agrega ,-
r
A 4 Preparación de medio' de cultivo aerobio
. Tabla 1
Preparación para 250 mL ~.
0
Prei3aración
1. Mezclar todos los componentes de la tabla 1
2. Marcar hasta el aforo
3. Ajustar el pH a 7 con NaOH al 10% o con HCI diluido
4. Desplazar el oxígeno con una comente de nitrógeno
5. Llenar las botellas serológicas que se vayan a utilizar (Si son botellas de 60 mL,
poner sólo 20 mL de medio]
6. Esterilizar a 120" C durante 15 min. c
&1
Determinación de Acetamida
1. Tomar un mililitro de muestra líquida en un vial y Centnfugar a 13 O00 rpm.
durante 15 min para eliminar la formación de precipitado.
2. Pasar el sobrenadante a otro vial y acidificarlo con 50 pL de ácido fórmico.
3. Tomar 2 pL con la jeringa, procurando que no haya formación de burbujas.
4. Inyectar la muestra en el cromatógrafo de gases "Varian mod. star 3400"
5. Tomar la lectura del área y hacer la correlación con la C U N ~ estándar de
acetamida [anexo C) para obtener la concentración de acetamida en la
solución problema.
c,
CONDICIONES DEL CROMATÓGRAFO "VARIAN MOD. STAR 3400"
Detector de ionización de flama (FID)
Columna Conitor AT 1 O00
Gas acerreador helio Temperatura del inyector de 200°C
Temperatura de detector de 220°C
Temperatura de la columna de 130-200°C
Rango de temperatura de 1 O"C/min
(C
&a Determinación de Acetato
o
1. Tomar un-mililitro de muestra líquida en un vial y Centrifugar a 13 O00 rpm.
2. Pasar el sobrenadante a otro vial y acidifcarlo con 50 1L de ácido clorhídtico
al 50 % 3. Tomar 0.2 pL con la jeringa, procurando que no haya formación de burbujas.
4. inyectar la muestra en el cromatógrafo de gases "Hewlett Packard mod. 5890"
5. Tomar la lectura del área y hacer la correlación con la curva estándar de
acetato (anexo C) para obtener la concentración de acetato en la solución
problema.
durante 15 min para eliminar la formación de precipitado.
CONDICIONES DEL CROMATÓGRAFO " H E W L ~ PACKARD MOD. 5890"
Detector de ionización de flama (FID)
0 Columna Megaboro AT 1000 en cromosorb W-AW (longitud 10 m).
Gas acarreador nitrógeno
Temperatura del inyector de 200°C
Temperatura de detector de 22OOC
Temperatura de la columna de 130°C
0 Rango de temperatura de 7O0C/min
lntegrador Shimadzu C-R-34 Cromatopac (como factores se utilizaron la pendiente y ordenada obtenidas en la curva estándar de acetato, reportadas en el anexo 2).
i&.3
Determinación de Metano
1. Trabajar en área estéril
2. Flamear la botella serológica de donde se tomara la muestra problema
3. Purgar una jeringa de 1 mL estéril con una corriente de nitrógeno (utilizar una
4. Tomar 0.2 mL de nitrógeno e inyectarlo en la botella serológica (para
compensar el gas que se extraerá para la determinación]
5. Tomar de la botella serológica 0.2 mL de muestra gaseosa
6. Inyectar 0.1 mL de muestra gaseosa en el cromotógrafo de gases “GOW-MAC,
serie 550” 7. Tomar la lectura del área y hacer la correlación con la Cuma estándar de
metano (anexo C) para obtener IC concentración de metano
jeringa de insulina)
CONDICIONES DEL CROMATóGRAFO “GOW-MAC, SERIE 550”
O Detector de conductividad térmica
Columna de acero inoxidable empacada con Carbosphere 80/100
Longitud 0.d. 7/6
O Temperatura de la columna 1 4OoC
Temperatura del detector 190°C
Temperatura del inyector 170°C
La corriente de los filamentos (detector] es de 120 mA.
O Gas acarreador : Helio
O Flujo de helio: 30 mL/min
Presión de 50 psi.
O lntegrador modelo SP4290 Spectra-Physics.
= Determinación de Amonio
1. Tomar 50 mL de muestra líquida y colocarla en un vaso de precipitado del
mismo volumen( en caso de no poder disponer de dicho volumen de muestra,
hacer dilusiones aforando a 50 mL con agua destilada)
2. AI momento de realizar la determinación, acidificar la muestra con 500 pL de
NaOH 10N
3. Realizar la lectura con un electrodo Phoenix para amonio. Cat.No.NH31501,
con un medidor pH/mV.
4. Tomar la lectura en mV después de 3 min.
5. Hacer la correlación con la curva estándar de amonio(anexo C) para obtener
la concentración
Cálculos a realizar
1. Con la pendiente y la ordenada obtenidadas en la CUWQ estándar calcular la
concentración amonio de la siguiente manera:
[NH,] = m * (mV) + 6
2. Obtener el antilogarkno (anti log] de la concentración de amonio obtenida
3. En el caso de que se hayan realizado dilusiones, calcular el ifactor de dilusión
como se indica en seguida:
en el paso anterior
50.d mL.demuesira fd =
4. Por lo tanto la concentración final de amoniaco se obtiene:
(anrilodNH,] * fd) 17
[ NH, ]mM =
CARACTERkTlCAS DEL ELECTRODO PHOENIX PARA AMONIO. CAT.NO.NH31501
o
o
o
o
c
Medidor pH/mV.
Determina amoniaco en rangos de 5x10 -' a 1 M NH3 (0.01 a 17 O00 ppm NH3 o
de 0.01 a 14 O00 ppm en forma de N)
Maneja rangos de pH por ambo de 11
Rango de temperatura de O a 50 "C
Reproductibilidad de 1: 2 %.
i
f
a-1 CURVA ESTANDAR DE ACElAMlDA
1- Preparar una solución patrón de acetarnida 0.1M
2- Preparar una solución de ácido fórrnico
2- Hacer las dilusiones para tener las concentraciones correspondientes a: 1, 1 O y
20 milirnolar de acetarnida como se muestra en la tabla (1 J.
Tabla 1
Dilusiones para realizar la curva estándar de acetato
3- Realizar cada concentración por triplicado en viales de 1 mL
4- Acidificar posteriormente con 50 pL de ácido fórrnico.
6- Realizar la determinación de acetomido crornatograficarnente.
Se inyectan 0.2 pL de la solución problema [procurar que no haya aire en
la jeringa] en un cromatógrafo de gas Vanan modelo star 3400 con detector de
ionización de flama (FID), columna Megaboro AT 1000, utilizando helio como gas
acarreador. La temperatura del inyector de 2OO0C, temperatura de detector de
22OoC, temperatura de la columna de 130-200°C y rango de temperatura de
1 O°C/min
7- Realizar los cálculos necesarios para obtener los parametros estadísticos como:
pendiente, ordenada al origen y coeficiente de correlación
I
Tabla 2
curva estándar de acetamida
para la cwa ertbndar
Pendiente: 441 00.83057
Ordenada: 13651 6.6953 ci Coeficiente de correlación: 0.991 371 1 12
CLe CURVA ESTÁNDAR DE ACElATO
1- Preparar una solución patrón de acetato de sodio 0.1 M
2- Preparar una solución de HCI al 50%
2- Hacer las diluciones para tener las concentraciones correspondientes a: 1, 5,
1 O y 50 milimolar de acetamida como se muestra en la tabla (1).
Tabla 1
Dilusiones para realizar la curva estándar de acetato
3- Realizar cada concentración por triplicado en viales de 1 mL
4- Acidificar posteriormente con 50 pL de HCI al 50 % 5- Centrifugar a 13 O00 rpm. durante 15 min para eliminar la formación de
precipitado.
6- Realizar la determinación de acetato cromatograficamente.
Se inyectan 0.2 pL de la solución problema (procurar que no haya aire en
la jeringa) en un crornatógrafo Hewlett Packard modelo 5890 con detector de
ionización de flarna, columna Megaboro AT 1000 en cromosorb W-AW, utilizando
nitrógeno como gas acarreador (longitud 10 m). La temperatura del inyector de
20O0C, temperatura de detector de 220°C, temperatura de la columna de 130T y
rango de temperatura de 70Vmin
7- Realizar los cálculos necesarios Para obtener los parámetros estadísticos como:
pendiente, ordenada al origen y coeficiente de correlación
Para calcular las concentraciones de las soluciones problema se utilizó un
integrador Shimadzu C-R-34 Cromatopac, al cual se le metieron como factores la
pendiente y la ordenada obtenidas en la curva patrón.
Tabla 2
Curva estandar de acetato
I I 50 I09568 1 05378 I
Pendiente: 2232.41862
Ordenada: 6.384461 7
Coeficiente de correlación: 0.99970875
e
CURVA ESTANDAR DE METANO
1- Pesar 50 botellas serológicas de 60 mL con septo perfectamente lavadas y
secas
2- Llenarlas completamente con agua destilada con jeringa para no tener espacios vacíos.
3- Pesar
4- Calcular el promedio de las botellas llenas y vacías
5- La diferencia en peso de las botellas llenas menos los vacías dará el volumen
total de la botella
6- Colocar 1L de agua destilada en un matraz y ponerlo a ebullir (así se logra
reducir en agua]
7- Enfriar en una palangana con agua fría colocándole corriente de nitrógeno
para desplazar el aire presente
8- En las botellas serológicas poner 25 mL de agua reducida
9- Añadir los mililitros de metano para tener las concentraciones deseadas. Todo
por triplicado.
Las concentraciones se calcularon con la siguiente fbrmula:
una.mol.de. gm. m. la.Cd.de. Merico),
Tabla 1
Diiusiones para realizar la curva estandar de acetato
Las determinaciones se realizaron en un cromatógrafo de gases GOW-
MAC, sene 550 con detector de conductividad térmica, columna de acero
inoxidable empacada con Carbosphere 80/100, longitud 0.d. 7/6. La temperatura
de la columna fue de 140%. detector dee 190°C e inyector de 170°C. La comente
de los filamentos [detector) es de 120 mA. El gas acarreador fué helio con un flujo
de 30 mL/min y una presión de 50 psi. El volumen de inyección fue de 0.1 mL con
Para calcular las areas se utilizó un integrador modelo SP4290 Spectra-
*o jeringa de insulina.
Physics.
Tabla 2
Curva estándar de metano
Pendiente 2841 9671 7
Ordenada 2841 .WI 7
Coeficiente de correlación 0.95082871
c-4 Curva estándar de amonio
1. Preparar una solución patrón de amonio NH4CI al 0.1 M
2. Preparar una solución 10N de NaOH
3. Hacer las dilusiones en 50 mL de agua destilada para tener las concentraciones
conespondientes a: 50,100 y 500 ppm de amonio como se muestra en la tabla.
4. Realizar por triplicado
5. AI momento de realizar la determinación, acidificar la muestra con 500 pL de
NaOH 10 N
6. Realizar la lectura con un electrodo Phoenix para amonio. Cat.No.NH31501,
con un medidor pH/mV.
‘E Las características de el electrodo son: , puede determinar amoniaco en
rangos de 5x10 -7 a 1 M NH3 (0.01 a 17 O00 ppm NH3 o de 0.01 a 14 O00 ppm en
forma de N), maneja rangos de pH por ambo de 11, rango de temperatura de O a 50 OC y tiene una reproductibilidad de f 2 %.
7. Tomar la lectura después de 3 min.
Tabla 1
Lecturas de las diferentes concentraciones de amonio
Nota: por esta ocasión se consideraron 17 detemilnaciones de los puntos de la curva y no solo 3 como se recomienda.
Tabla 2
Curva estandar de arnonio
CONCENTRACIÓN DE AMONIO
Pendiente -0.0198841
Ordenada -0.69752402
Coeficiente de correlación -0.99973689
Cinética de hidrólisisi de acetamida por Bacillus sphaeric us
Cultivo control
iiempo (día) Acetamida O 19.2315 1 3.0589 2 21.5635 3 1.391 6 14.5834 8 12.4775
10 17.1 901 15
20 24 27 31 41 45 7.5643
16.9 7,7985
Acetato 1.9199 1.9779 1.5129
1.27 2.2623 3.3557 2.9703
2.2868
1.7401
Metano Arnonb eficiencia de hidrólisls 3.7079 4.661 a 84.09433
4.4843 92.767322
8.8549 35.1 194919
2.5707 -12.1256561
10.22176 24.169249
10.7026 10.61 52696
59.4492121
6.423 60.6673075
Nota: Las concentraciones de acetamida, ncetato, metano y amonio están en mM
Datos representados en la figura 1
Cinetica de hidrólisisi de acetamida por Bacillus sphaericus y Methanosarcina mazei
, en un volumen 5 mL de medio aerobio y 15 mL de anaerobio
Tiempo (día) Acetamida O 19.3032942 1 12.9637764 2 12.0654259 3 6.11225007 6 3.16686337 8 10.1556433
10 2.74644045 15 16 9.1 1298721 a 24 27 31 41 45 9.28731 499
Acetato Metano Amonlo eficiencia de hidrólisis 2.7539 3.40788561 1.7537 3.70791 32 32.841 637
2.8761 4.25637484 68.33571 5 3.2986 0.1 7481442 5.38673993 83.594181 7 7.2447 0.59431577 6.13921252 47.3890662 ' 7.2822 0.36709733 4.691 57382 85.7721 671
2.4737 0.9997a789 52.7905075
2.8833 -3.9 37.4955081
0.44357037
0.77256946 0.61 2471 24 0.73543327 0.63640344
0.8 1.428 0.71 452697 4.25384693 51.8874089
Nota: Las concentraciones de acetamida, ecetato, metano y arnonio están en mM
Datos reprentados en la figura 2
0
Cinetica de hidrólisisi de acetamida por Bacillus sphaericus y Methanosarcina mazei
en un volumen 10 mL de medio aerobio y 10 mL de anaerobio
Tiempo (día) Acetamida O 17.5095411 1 8.78700695 2 5.27169901 3 0.04610582 6 3.81558131 8 9.32885616
1 O 3.675221 14 15 16 16.1558024
20.4 24 27 31 41 45 -0.1 1865299
..,
Acetoto Metano Amonio eflciencla de hidrólisls 2.4359 7.42023335 3.986 17.5868864 49.81 58923 2.3576 1 6.7998289 69.8924205
4.189 0.2 78.2085591 4.9266 0.1 12.22531 81 46.721 2983 4.6507 0.59871709 3.3854731 79.0101801
5.8688 o. 1 7.73143436
2.9692 6.46792928 99.73668ia
0.2
1.551 60409 -0.0826631 3 -0.13025246 -0.09889302 -0.1761913
2.4257 0.2 13.3623966 100.677648
Nota: Las concentraciones de amtamida. acetato, metano y amonio están en mM
Datos representados en la flgura 3
c
o
Cinetica de hidróliski de acetamida por Bacillus sphaencus y Methanosarcina maze;
en un volumen 15 mL de medio aerobio y 5 mL de anaerobio
Tiempo (día] Acetamida O 12.4326 1 10.6385 2 0.9065 3 10.578 6 3.7059 8 9.236
10 13.0803 15 16 2.9749 20 24 27 31 41 45 1.2357
,-
Acetato 1.9636 6.9587 6.1397 1.3606 3.7301 4.1 191 2.0269
2.0458
1 S963
Metano
0.8347 2.5568 3.3625
4.4 4.4914 5.9551
4.5 3.9528 3.4846 3.3696 2.681 1
Amonio eficiencia de hidróliis
5.1088 14.4310676 24.2314 92.7089031
14.91 74896 6.7279 70.1 92323 3.5667 25.9966771 8.0801 -5.20929366
76.071 5185
18.4108 90.0610309
Nota: Las concentraciones de acetmida, acetato. metano y amonio esten en mM
Datos representados en la figura 4
Cinetica de hidrólisisi de acetamida por Bacillus íphaericus y Mefhanosarcina barqueri
en un volumen 5 mL de medio aerobio y 15mL de anaerobio
Tiempo (día) Acetamida O 23.3528551 1 23.1853526 2 15.7921131 3 2.27907963
8 5.50575356 6 3.97589575
1 o 2.87457862 15 16 10.056963 20 24 27 31 41 45 6.57459964
Acetato Metano 10.5688
12.09 14.91
10.3371 12.02 -0.16243715
15.3737 -0.1 0521 992 9.1 637 0.32693524
5.9258 -0.0821 1296
3.23621 147 -0.14015544 1.30045345
-0.05047843 2.91 32 -0.1 0797075
-0.1 0989633
-0.09476677
Amonio eficiencia d e hidrólisls 3.38346243 9.69830099 0.71 726782
15.329806 32.3760925 7.81 754084 90.240681
33.6271 459 76.4236384 8.76509482 82.974691
4.28455289 87.6906759
56.9346746
14.6437585 71.8466988
Nota: Las concentraciones de acetamida, acetato. metano y amonio están en mM
Datos representados en la flguro 5
f,'C
Cinética de hidrólisisi de acetamida por Bacillus sphaericus y Methanosarcina barken’
en un volumen 10 mL de medio aerobio y 1 O mL de anaerobio
Tiempo (día) Acetarnida O 13.496 1 6.0404 2 1 1.6222 3 7.9642 6 10.4509 8 18.2832
10 1.6684 15 16 O 20 24 27 31 41 45 13.6187
Acetato 4.2952 3.2495 6.1 839 5.5728 6.878
5.6363 7.4896
5.0081
4.2664
Metano
0.3949 2.1 601
-0.0227 -0.0103 0.1 148 0.1424 1.9656 0.0648
-0.0455 -0.01 36 -0.106
Arnonlo eficiencia de hidróllsis 15.4405 6.7239 55.2432994 8.8497 13.8842474 5.421 2 40.9885792
12.2004 22.562721
8.8549 87.6375804 21.9836 -35.471 4739
Nota: Las concentraciones de acetarnida, acetato. metano y amonio están en mM
Datos representados en la figura 6
D-7
I >
.- Ca
Cinética de hidrólisisi de acetamida por Bacillus sphaericus y Methanosarcina barker;
en un volumen 15 mL de medio aerobio y 5 mL de anaerobio
nernpo (día) Acetarnitia O 11.4255967 1 6.3979363 2 4.91855373 3 8.35703773 6 6.3 8 6.08506237
10 15 16 20 24 27 31 41 45 6.3
Acetato Metano Arnonio eficiencia de hidróiisii 1.376 13.3623966
8.5481 43.941 1034 44.0034822
5.63 12.271 1328 26.856881 7 6.0949 0.16161044 17.7138355 19.2494892 3.186 0.40313319 12.7719811 46.7418418
9.545 17.m~a64 56.951 4498
2.7 0.56213107 4.453136 2.1 6366343
3.31 63 1.69932358 2.07948808 3.47800929
3.3 3
4.05320753 1.743 1.60579541 19.2733478 31 .io92973
Nota: Las concentraciones de acetamida, acetato, metano y amonio están en mM
Datos representados en la figura 7
Caraabierta aliiempo
UNIVERSIDAD AUTONOMA METROPOLITANA DIVISION DE CIENCIAS BIOLOGICAS Y DE LA SALUD M EN C. ARlURO PRECIADO LOPEZ SECRETARIO ACADEMIC0
A QUIEN CORRESPONDA:
Por medio Lie la presente se hace constar que el (la) M. en C. FLORINA RAMIREZ VIVES
del Departamento de: Biotecnolugia
T1TULO:”Mclanogenesis a partir de acetamida por bicultivo de Bacillus sphaericus y , iPlutIi«riisrircirrn rnazci”.
A.LUIvlN0: LIDIA ITZEL MEZA LOEZA
dc la División de Ciencias Biológicas y de la Salud, asesoró el siguiente Servicio Social: I
MATRICULA: 93329196
8 , LICENCIATUIU: Iiigciiiería Bioquímica Industrial
PEIUODO: 26 de febrero de ! 997 - 26 de agosto de 1997.
Se extiende la presente para los fines que al interesado convengan, en la Ciudad de México, D.F. a doce de noviembre de inil novecientos noventa y siete.
- (
A t e n t a m e n t e “CASA ABIERTA A TIEII/lPO” t.
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