LABORATORIO DE BIOQUIMICACUANTIFICACION DE PROTEINAS POR METODO BIURET
ESTEFANIA MEZA BUCHELY Cód. 215076457YESICA HERRERA MONTENEGRO Cód.
UNIVERSIDAD DE NARIÑOFACULTAD CIENCIAS DE LA SALUD
PROGRAMA DE MEDICINA2015
INTRODUCCIÓN
Las proteínas son principios inmediatos orgánicos constituidos por largas cadenas de aminoácidos, los cuales se unen entre sí mediante enlaces peptídico. La existencia del enlace peptídico, de aminoácidos azufrados, puede ponerse de manifiesto en el laboratorio mediante una serie de reacciones coloreadas específicas, que sirve para la identificación de proteínas.
Se pretende reconocer la presencia de proteínas por medio del método Biuret,en cuatro muestras diferentes (leche, gelatina, Yema y clara de huevo), el cual se fundamenta en la formación de un complejo coordinado entre los iones cúpricos del reactivo y el enlace peptídico de la proteína, reacción que transcurre en medio alcalino.
OBJETIVOS
GENERAL
El objetivo de este laboratorio es poder aplicar un método colorimétrico para determinar la concentración de proteína en una muestra problema, reconocer su utilidad y poder deducir propiedades propias de las muestras utilizadas.
Específicos
Aprender el manejo del espectrofotómetro y su aplicación en los métodos colorimétricos.
Aprender el empleo de una curva patrón para la determinación de la cantidad de moléculas presentes en una muestra, en este caso de proteínas.
Determinar la concentración de proteínas en una muestra x, utilizando el método de Biuret.
MARCO TEÓRICO
Las proteínas son macromoléculas compuestas por unidades de alfa –aminoácidos que se unen entre sí mediante enlaces peptídicos y que alcanzan un peso molecular igual o superior a 5000 D.El enlace peptídico, característico de estos compuestos, resulta de la reacción del grupo carboxilo de un aminoácido con el grupo amino del otro aminoácido, lo cual da lugar a un enlace covalente de tipo carbamida.
REACCION DE BIURET
El nombre de la reacción procede del compuesto coloreado formado por la condensación de dos moléculas de urea con eliminación de amoníaco. Si una solución fuertemente alcalina de sulfato cúprico (CuSO4) se añade a una solución de proteína se forma una complejo entre el ion cúprico y los enlaces peptídicos, con aparición de una coloración violeta-púrpura, que presenta un máximo de absorción a 540 nm. Las características más importantes de la reacción son: La reacción del Biuret se aplica, a partir de los tetrapéptidos, a todos los péptidos y proteínas. · Su rango de determinación es de 1 a 6 mg/ml, y no depende de la composición de aminoácidos.
MATERIALES Y MÉTODOS
Muestras
Clara y yema de huevo
Leche descremada
Gelatina
Materiales de vidrio
Tubos de ensayo
Gradilla
Vasos de precipitados
Pipetas
Reactivos
Reactivo de Biuret
Método
Usamos el método experimental, el cual implica la observación, manipulación, registro de las variables (dependiente, independiente e intervinientes) que afectan un objeto de estudio. A continuación con este método es indispensable usar el método analítico en el cual se fundamenta en la aplicación del método científico, sus características son la exactitud, precisión, sensibilidad, límite de detección, intervalo dinámico, selectividad, seguridad
Procedimiento
Se usa normalmente en el ensayo de Biuret, un método colorimétrico que permite determinar la concentración de proteínas de una muestra mediante espectroscopia ultravioleta-visible a una longitud de onda de 540 nm (para detectar el ión Cu2+).
En total se utilizó 16 tubos de ensayo, 4 por cada proteína /leche, huevo, y gelatina) a cada uno se le adiciono 3ml de reacción de Biuret, posteriormente Se toma la gradilla con los tubos de ensayo y se introduce en el baño de agua termostatizado a 37 ºC, dejándose que se desarrolle el color durante 15 min, al final se enfrían los tubos de ensayo, introduciendo la gradilla en el agua a temperatura ambiente ,a continuación se procede a medir en el espectrofotómetro.
Cálculos
Tubo(Nº) Patrón de proteínaLeche (ml)
Agua Destilada (ml)
Valor reportado de absorbancia
Total Solución
1 0 2,0 0 2 ml2 0,4 1,6 0,523 2 ml3 0,8 1,2 0,817 2 ml4 1,2 0,8 1,028 2 ml
Tubo(Nº) Patrón de proteínaClara de huevo
Agua Destilada (ml)
Valor reportado de absorbancia
1 0 2,0 02 0,4 1,6 0,7693 0,8 1,2 0,8694 1,2 0,8 1,067
Tubo(Nº) Patrón de proteínaYema de huevo
Agua Destilada (ml)
Valor reportado de absorbancia
1 0 2,0 02 0,4 1,6 0,8373 0,8 1,2 0,915
4 1,2 0,8 1,002
Tubo(Nº) Patrón de proteínagelatina
Agua Destilada (ml)
Valor reportado de absorbancia
1 0 2,0 02 0,4 1,6 0,2613 0,8 1,2 0,4694 1,2 0,8 0,567
Curvas de Calibración
Se trata de una curva de referencia construida con cantidades conocidas de una sustancia, que se utiliza para determinar la cantidad de esta sustancia (proteínas) presente en una muestra.
Esta técnica analítica instrumental se relaciona con la absorción de fotones de luz, por parte de los enlaces peptídicos de los polipéptidos que están presentes en la materia orgánica de la muestra, de tal forma que al incrementarse la presencia de tales enlaces, entonces se produce mayor Absorbancia de la solución y por ende mayor concentración de proteína en las muestras estudiadas.
La concentración de una muestra es directamente proporcional a la cantidad de energía radiante absorbida por la sustancia, o inversamente proporcional al logaritmo de energía radiante trasmitido por la sustancia.
Concentración de proteínas de leche tubo 2, 3, 4.
Tubo # 2 C= 0.4 x 0.5 g/dl / 2ml x (10 dl/l) = 1 g/l
Tubo # 3 C= 0.8 x 0.5 g/dl / 2ml x (10 dl/l) = 2 g/l
Tubo # 4 C=1.2 x 0.5 g/dl / 2ml x (10 dl/l) = 3 g/l
Concentración de proteínas de la clara del huevo tubo 2, 3, 4.
Tubo # 2 C= 0.4 x 0.5 g/dl / 2ml x (10 dl/l) = 1 g/l
Tubo # 3 C= 0.8 x 0.5 g/dl / 2ml x (10 dl/l) = 2 g/l
Tubo # 4 C=1.2 x 0.5 g/dl / 2ml x (10 dl/l) = 3 g/l
Concentración de proteínas de la yema del huevo tubo 2, 3, 4.
Tubo # 2 C= 0.4 x 0.5 g/dl / 2ml x (10 dl/l) = 1 g/l
Tubo # 3 C= 0.8 x 0.5 g/dl / 2ml x (10 dl/l) = 2 g/l
Tubo # 4 C=1.2 x 0.5 g/dl / 2ml x (10 dl/l) = 3 g/l
Concentración de proteínas de la gelatina tubo 2, 3, 4.
Tubo # 2 C= 0.4 x 0.5 g/dl / 2ml x (10 dl/l) = 1 g/l
Tubo # 3 C= 0.8 x 0.5 g/dl / 2ml x (10 dl/l) = 2 g/l
Tubo # 4 C=1.2 x 0.5 g/dl / 2ml x (10 dl/l) = 3 g/l
1 gr/l x 1 l/1000ml x 1000 mg/1gr = 1mg/ml2 gr/l x 1 l/1000ml x 1000 mg/1gr = 2mg/ml3 gr/l x 1 l/1000ml x 1000 mg/1gr = 3mg/ml
Tubo No.leche
Solución Concentración de la solución mg/ml
Absorbancia a 540
1 2.0 ml agua destilada 0 blanco2 1.6 ml agua destilada 100mg/ml 0,5233 1.2 ml agua destilada 200mg/ml 0,8174 0.8 ml agua destilada 300mg/ml 1,002
Tubo No.Clara de huevo
Solución Concentración de la solución mg/ml
Absorbancia a 540
1 2.0 ml agua destilada 0 blanco
2 1.6 ml agua destilada 100 mg/ml 0,8693 1.2 ml agua destilada 200 mg/ml 0,7694 0.8 ml agua destilada 300 mg/ml 1,067
Tubo No.yema de huevo
Solución Concentración de la solución mg/ml
Absorbancia a 540
1 2.0 ml agua destilada 0 blanco2 1.6 ml agua destilada 100 mg/ml 0,8373 1.2 ml agua destilada 200mg/ml 0,9154 0.8 ml agua destilada 300 mg/ml 1,002
Tubo No.Gelatina
Solución Concentración de la solución mg/ml
Absorbancia a 540
1 2.0 ml agua destilada 0 blanco2 1.6 ml agua destilada 100 mg/ml 0,2613 1.2 ml agua destilada 200 mg/ml 0,4794 0.8 ml agua destilada 300 mg/ml 0,967
Trasmitancia (0-100%)
Inversamente proporcional a la cantidad de concentración de la proteína
Tubo No.leche
Solución Transmitancia
1 2.0 ml agua destilada blanco2 1.6 ml agua destilada 52.33 1.2 ml agua destilada 81.74 0.8 ml agua destilada 100.2
Tubo No.Clara de
Solución Transmitancia
huevo1 2.0 ml agua destilada blanco2 1.6 ml agua destilada 86.93 1.2 ml agua destilada 76.94 0.8 ml agua destilada 100.6
Tubo No.yema de huevo
Solución Transmitancia
1 2.0 ml agua destilada blanco2 1.6 ml agua destilada 83.73 1.2 ml agua destilada 91.54 0.8 ml agua destilada 100
Tubo No.Gelatina
Solución Transmitancia
1 2.0 ml agua destilada blanco2 1.6 ml agua destilada 26.13 1.2 ml agua destilada 47.94 0.8 ml agua destilada 96.7
LEY DE BUOGUER-LAMBERT
Abs
orba
ncia
0 0.4 0.8 1.20
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
4
GelatinaHuevo (clara)Huevo (yema)Leche
TRANSMITANCIA
paso optico0
20
40
60
80
100
120
GelatinaHuevo(clara)Huevo (yema)Leche
CONCLUSIÓN
Concentración
Abs
orba
ncia
Tr
ansm
itanc
ia
(%)
Efectivamente, aplicando el método Biuret se puede determinar la concentración de proteína en una o varias muestras problema, que resultan al interpolar los valores de absorbancia en una curva patrón originada a partir de concentración de proteína conocida.
Por medio de las expresiones gráficas, en donde se recaudan los datos por medio de las fórmulas de concentración y de los datos del espectrofotómetro, se puede observar que respecto a absorbancia se puede definir que es directamente proporcional a la concentración de la solución, y la transmitancia es inversamente proporcional a ella.
El método de Biuret, nos arroja en corto tiempo la definición de presencia de proteína, en el caso experimental observamos que la yema de huevo no arroja una coloración violeta, por ende no refiere la presencia de proteína
BIBLIOGRAFÍA
Berg, J.M.; John, L.T.; Lubert, S. (2008) Bioquímica. 2ª ed. Reverté, Barcelona.
Segal, C. (2005) Manual de prácticas de biología molecular de la célula. Editorial publidisia.
Cambell, P.N.; Smith, A.d.; Peters, T.J. (2006) Bioquímica ilustrada: bioquímica y biología molecular en la era posgenómica. Masson, España.
Harris, D.C. (2003). Quantitative chemical analysis. San Francisco: W.H. Freeman
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