Anticuerpos antifosfolípidos
Anticuerpos dirigidos contra epitopos que contienen fosfolípidos
Surgen de las técnicas para el diagnóstico de la sífilis, muy antiguas (de las primeros inmunoensayos)
VDRL y RPR técnicas para el diagnóstico serológico de la sífilis (1906).
El antígeno de estas técnicas lo constituye una mezcla de:
• cardiolipina (DIFOSFATIDIL GLICEROL)
• lecitina (FOSFATIDIL COLINA)
• colesterol.
En estas técnicas se observó un 8% de falsos positivos (para sífilis), denominados falsos positivos biológicos.
Dentro de estos falsos positivos se distinguen 2 grupos:
• Reacción aguda: los Ac son transitorios y está asociada con infecciones virales, varicela y escarlatina.
• Reacción crónica: (persiste + de 6 meses) asociada a desórdenes autoimmunes (LES, Sjogren, anemia hemolítica, Tiroiditis de Hashimoto y AR.
Los individuos con niveles significativos de anticuerpos anti fosfolípidos
presentan frecuentemente alteraciones de la coagulación
Síndrome anti fosfolípido
Criterios de laboratorio• Anticuerpos anticardiolipina presentes en títulos medios o elevados. De isotipo IgM ó IgG presentes en más de dos ocasiones separadas seis semanas, determinados por ELISA para cardiolipina dependiente del cofactor 2 glicoproteína I.
• Anticoagulante lúpico presente. En más de dos ocasiones separadas al menos seis semanas.
Síndrome anti fosfolípido
• Primario
• Asociado a otra enfermedad
especialmente lupus
infecciones (sífilis)
Los anticuerpos anti fosfolípidos modifican las pruebas para la determinación de la funcionalidad de la cascada de la coagulación, aumentan los tiempos de coagulación
Anticoagulante lúpico
In vitro tiene una actividad anticoagulante contradictoria con lo que sucede in vivo que es pro coagulante
Los anticuerpos antifosfolípidos no sólo involucran al fosfolípido sino también a otra proteína, de la cascada de la coagulación, a la que se le denomina cofactor.
cofactorfosfolípido
Anticuerpos dirigidos sólo al cofactor
Anticuerpos dirigidos al fosfolípido + cofactor
Anticuerpos dirigidos sólo al fosfolípido
• cardiolipina (difosfatidil glicerol)
• fosfatidilserina
• fosfatidilcolina
• fosfatidil inositol
• fosfatidil etanolamina.
Los antígenos fosfolípidicos más comunes
• 2 glicoproteína I (apolipoproteína H). El más estudiado, tiene actividad anticoagulante natural in vitro.
• protrombina
• anexina V
• proteína C
• proteína S
Cofactores
Técnicas empleadas para detectar anticuerpos antifosofolípidos
VDRL y RPR
Técnica de aglutinación en que el fosfolípido (mezcla de lecitina y cardiolipina) se encuentra sobre cristales de colesterol, el anticuerpo aglutina las partículas
SIFILIS
Anticoagulante lúpico(se asoció rápidamente al lupus)
Complejo protrombinasa (factor Xa + factor Va + membranas de plaquetas activadas + Ca ++)
Técnicas empleadas para detectar anticuerpos antifosofolípidos
In vivo:
En la prueba in vitro se sustituyen las plaquetas por fosfolípidos, losAc. anti pL inhiben la reacción
protrombina trombina
Anticoagulante lúpico
• prueba de detección (tiempo de tromboplastina parcial activado, tiempo de tromboolastina tisular diluida o prueba del veneno de víbora de Russell).
El diagnóstico se efectúa en tres pasos consecutivos:
Técnicas empleadas para detectar anticuerpos antifosofolípidos
• identificación del inhibidor (se repite la prueba que da mal mezclando el plasma del paciente con plasma normal 1:1)
• prueba confirmatoria. Se repite la prueba coagulométrica agregando un exceso de fosfolípidos. Esto debe anular el efecto del inhibidor
Si alguna de estás pruebas está alargada
Si no se corrige existe inhibidor plasmático
La técnica que das más información es el ELISA, puede diferenciar contra qué fosfolípido y contra cuál cofactor están dirigidos. Es la técnica actual de referencia para anticuerpos antifosfolípdos
También da información del isotipo involucrado y título de los mismos.
Técnicas empleadas para detectar anticuerpos antifosofolípidos
YY
YYYY
Conjugado anti isotipo inmunoglobulina
Complejo
fosfolípido / cofactor
Técnicas empleadas para detectar anticuerpos antifosofolípidos
Tipo de anticuerpo antifosfolípido antígeno Falso positivo biólogico (serología luética +) Cardiolipina
Anticuerpos anticardiolipina
Tipo A con actividad anticoagulante
Tipo B sin actividad anticoagulante
Cardiolipina / 2 glicoproteína I
Anticoagulante lúpico Fosfolípido / protrombina
Anti fosfolípidos verdaderos Fosfolípido sin cofactor
Anticuerpos anti cofactor: Anti 2 – glicoproteína I
Anti protrombina Anti proteína C Anti proteína S Anti anexina V Anti trombomodiluna
2 glicoproteína I
Protrombina
Proteína CProteína SAnexina VTrombomodulina
Anticuerpos anticardiolipina (AAC).
Se detectan por ELISA.
• Los que sólo son contra el fosfolípido sólo aparecen en ciertas infecciones (sífilis). No están vinculados al síndrome
• Los dirigidos al neo epítopo con el cofactor se asocian a manifestaciones clínicas del síndrome.
Valor diagnóstico de los anticuerpos antifosfolípidos y cofactores
Los anticuerpos dirigidos contra otros fosfolípidos, pueden detectarse por ELISA, pero no aportan más información que los AAC.
Anticuerpos contra 2 glicoproteína
Se detectan por ELISA, al inmovilizar la proteína aparece el neoepitopo como si estuviera unido al fosfolípido.
• Tienen gran valor para identificar un grupo de pacientes con el síndrome que tiene riesgo aumentado de trombosis.
• Existen pacientes con las manifestaciones clínicas del síndrome, con anticoagulante lúpico y anticuerpos AAC negativo, que son positivos para esta proteína.
•En conclusión: son de gran valor para la toma de decisiones terapéuticas
La prevalencia en pacientes con lupus oscila entre el 31 al 27 %
Valor diagnóstico de los anticuerpos antifosfolípidos y cofactores
Anticuerpos antiprotrombina
Se determinan por técnica de ELISA
Prevalencia global en paciente positivos al anticoagulante lúpico: 55%Prevalencia en pacientes con síndrome primario antifosfolípidos o lupus, positivos al anticoagulante lúpico: 70%
Aunque estos anticuerpos se han asociado a manifestaciones trombóticas, los resultados son contradictorios. Su utilidad clínica está aún por definirse
Valor diagnóstico de los anticuerpos antifosfolípidos y cofactores
Anticuerpos anti anexina V
Esta molécula (proteína anticoagulante placentaria) es una anticoagulante natural por desplazamiento de los factores de coagulación de las superficies de fosfolípidos. Se encuentra en placenta y endotelios.
• Crea un estado de hiper coagulabilidad en la placenta.
• se detectan en el 19% de los paciente con lupus
Valor diagnóstico de los anticuerpos antifosfolípidos y cofactores
Anticuerpos anticitoplasma del neutrófilo
ANCA
VASCULITISGrupo heterogéneo de enfermedades por lesión inflamatoria de vasos sanguíneos.
Isquemia y/o hemorragia de órganos. La severidad de la enfermedad depende de cuáles vasos están afectados y órganos que irrigan.
Anticuerpos anticitoplasma del neutrófilo anticuerpos anti células endoteliales
VASCULITIS• granulomatosis de Wegener
• síndrome de Churg-Strauss
• poliarteritis nodosa
• poliangitis microscópica
• enfermedad de Kawasaki
DE VASOS PEQUEÑOS
VASCULITIS• arteritis de la temporal
• enfermedad e Takayasu
DE GRANDES VASOS
Las vasculitis pueden ser primarias, no asociadas o consecuencia de otra patología y secundarias, con asociación a otras entidades como infecciones o enfermedades autoinmunes (ARTRITIS REUMATOIDEA Y LUPUS ERITEMATOSO SISTEMCO).
Los anticuerpos anti citoplasma de neutrófilo (ANCA), están dirigidos contra enzimas presentes en los gránulos azurófilos de los neutrófilos
Están asociados a la granulomatosis de Wegener, la poliangitis microscópica y glomerulonefritis idioptática
Vasculitis de pequeños vasos asociadas a ANCAVasculitis de pequeños vasos asociadas a ANCA
VASCULITIS DEFINICIÓN (Conf de Chapel Hill)
Granulomatosis de Wegener
Inflamación granulomatosa del tracto respiratorio y vasculitis necrotizante afectando a vasos de pequeño a mediano calibre (capilares, vénulas, arteriolas y arterias). La glomerulonefritis necrotizante es común
Sindrome deChurg-Strauss
Inflamación granulomatosa rica en eosinófilos afectando al tracto respiratorio, y vasculitis necrotizante de vasos de pequeño a mediano tamaño, y asociada con asma y eosinofilia.
Poliangeítis microscópica (PANm)
Vasculitis necrotizante con escasos o ausentes depósitos inmunes, afectando a los pequeños vasos (capilares, vénulas o arteriolas. Puede haber arteritis necrotizante de arterias de tamaño pequeño y mediano. La glomerulonefritis necrotizante es muy común. A menudo hay capilaritis pulmonar.
GN extracapilar paucinmune
No definida en Consenso de Chappel Hill. Glomerulonefritis necrotizante y con formación de semi lunas, sin evidencias clínicas ni histológicas de vasculitis sistémicas.
ANCA
Inmunoflurescencia indirecta (IFI)
c-ANCA p-ANCA atípicoTinción granular del
citoplasmaTinción del núcleo Tinción diferente
a las anteriores.
Patrones
Patrón cANCA.Patrón cANCA.
• Patrón granular fino con acentuación central en el citoplasma del neutrófilo.
• La especificidad antigénica de c ANCA se identificó como Proteinasa 3 (PR3)
• La PR3 es una enzima localizada en los lisosomas (gránulos azurófilos) de los neutrófilos.
• PR3 degrada elastina, proteína presente en la pared de los vasos sanguíneos.
• PR3 también se denomina antígeno de Wegener.
cANCA 10
Patrón pANCA.Patrón pANCA.
• Fluorescencia perinuclear del citoplasma de los neutrófilos.
• Uno de los Ag responsable del patrón (el más importante) es la mieloperoxidasa, una enzima presente en los lisosomas del neutrófilo.
Fijación con alcohol Fijación con formol
Atención:Atención:
• Otras proteínas lisosomales pueden producir un patrón de fluorescencia pANCA:– Elastasa– Lactoferrina – Catepsina G – Lisozima
c ANCA Patrón citoplasmático IFI
p ANCA Patrón perinuclear IFI
PR3 ANCA ELISA con especificidad por proteinasa 3.
MPO ANCA ELISA con especificidad por mieloperoxidasa
Terminología aceptada
c ANCA+/ PR3 ANCA+ Patrón citoplasmático por IFI, confirmado antígeno por ELISA
pANCA+/MPO ANCA+ Patrón perinuclear por IFI, confirmado antígeno por ELISA
ANCA por ELISAANCA por ELISA
Técnica desarrollada con los objetivos de:
– Conocer la especificidad de los anticuerpos.
– Soslayar problemas de interpretación del patrón de IFI.
ALGORITMO de la paraclínica en las VASCULITIS
1
ANCA +
(60%)
Ac anti MBG +
(10%)
ICC +
(30%)
VASCULITIS CON TOQUE RENALGlomérulonefritis rápidamente progresiva
• ANCA – anticuerpos contra citoplasma del neutrófilo
• MBG - membrna basal
• ICC - inmunocomplejos circulantes
2
Sin manifestaciones
extrarrenales
ANCA +
Con granuloma pulmonar
necrotizante
Arteritis necrotizante
sistémica
Granulomatosis de Wegener
Poliarteritis microscópica
(poliarteririts nodosa)
Glomérulonefritis idiópatica en
semilunas
Ac anti MBG +
3
Con hemorragia pulmonar
Sin hemorragia pulmonar
Nefritis anti membrana basal
glomerular
Síndrome de Goodpasture
Glomérulonefritis lúpica
Ac. Anti DNA + AELO +
Anticuerpos anti estreptolisina
OTROS
ICC +4
Glomérulonefritis post infección por
estreptococos
Crioglobulinas
Glomérulonefritis crioglobulinémica
Glomerulonefritis por inunocomplejos
(otros)
El laboratorio en
Lupus eritematoso sistémico
AUTOANTICUERPOS EN LUPUS ERITEMATOSO SISTEMICO
ANTICUERPOS anti -
Prevalencia en lupus, asociación con otras enfermedades
ADN nativo 40 – 70 %, nefropatía. Anticuerpo marcador
ADN desnaturalizado
70% en enfermedad activa, artritis reumatoidea, lupus inducido por fármacos, hepatitis crónica, infecciones.
Histonas Lupus inducido por drogas (>95%); 50 – 70% en lupus, artritis reumatoidea
Sm 30% criterio diagnóstico (ARA, 1982)
U1-RNP 30 – 40%; fenómeno de Reynaud, enfermedad mixta del tejido conectivo
Ro/SS-A 25-60%; lupus cutáneo (70-90%), lupus neonatal (>90%)
La/SS-B 10-35%;lupus neonatal (75%)
Ribosoma (anti P) 10-20%; sicosis lúpica (56-90%)
Ku 15-40%; síndrome de solapamiento en población oriental
PCNA (antígeno nuclear de proliferación celular)
3%
lupus
La mayor cohorte estudiada confirma que la mayoría de los casos presentan anti ADN de doble cadena, está ligado estrechamente a la frecuencia y severidad de enfermedad renal.
La presencia de ac. anti cadena única de ADN se describe como más frecuente, pero de menor jerarquia diagnóstica.
Anticuerpos anti ADN
Su presencia es virtualmente diagnóstica por su gran especificidad, pero su frecuencia en los pacientes es baja y no se asocia con características particulares de la enfermedad
Anticuerpos anti Sm
Anticuerpos anti proteína ribosomal P
Asociación con la forma neuropsiquiátrica de la enfermedad.
• Los anticuerpos anti Ro / SSA se asocian con patología renal (especialmente si se encuentra ausente La) y sarpullidos con fotosensibilidad.
• Los anticuerpos anti LA / SSB están particularmente asociados con lupus que presenta además síndrome de Sjögren.
Ambos están presentes en el llamado LUPUS NEONATAL (sarpullido y bloqueo cardiaco)
Anticuerpos anti Ro y La
Presente en el 25% de los pacientes, generalmente a título bajo. No tiene un rol patogénico conocido ni relevancia en el pronóstico
Factor reumatoideo
Prueba% de los casos de lupus
positivos
Anticuerpos anti plaquetas 65
Anticuerpos antifosfolípidos 30 - 40
Factor reumatoideo (bajo título) 30
Depósitos de IgG, C3 y C4 en biopsia de piel 75
Niveles bajos de C3 / C4 60
Velocidad de eritrosedimentación elevada 60
Proteína C reactiva Normal, a menos que haya infección
Crioglobulinemia 60
Nivel de IgG sérica elevada 65
Proteinuria 30
Otras pruebas en lupus eritematoso sistémico
Resultado
Anticuerpos anti ADN doble cadena
C3 C4 Interpretación
Aumento de la actividad. Prestar atención a cambios en el estado clínico
Sospechar toque renal
/ Sospechar una infección. Realizar determinación de proteína C reactiva.
Interpretación de cambios serológicos en muestras seriadas de lupus eritematoso sistémico
El laboratorio en
Artritis reumatoidea
EXÁMENES PARA EL DIAGNOSTICO
• Factor reumatoideo
• Anticuerpos anti péptidos citrulinados cíclicos
Diagnóstico serológico
FACTOR REUMATOIDEO Análisis de su utilidad clínica
Posee significativas limitaciones de sensibilidad,especificidad y valor predictivo. Reconocerlas mejora la utilidad del test alentando a ser mas
selectivos en su solicitud y mas cuidadosos en su interpretación.
A primera vista parece ser particularmente útil
· Esta presente en un 70-90% de los pacientes con AR
· Es el único criterio de laboratorio incluido por la ACR para el diagnostico
de AR.
Sin embargo, las características de los test utilizados y las circunstancias en las cuales son pedidos afectan su utilidad.
La probabilidad de poseer la enfermedad que el clínico estima respecto a ese paciente (PROBABILIDAD PRE-TEST) determina en gran parte la capacidad del FR de ayudar en el diagnostico como vemos en la siguiente tabla:
TABLA 1
Probabilidad de tener AR basada en la ‘probabilidad pre test’ y el resultado del FR, asumiendo una sensibilidad de 80% y especificidad de 95%
Probabilidad RF positivo RF negativo
Pre test
1% 16% 0,2%
15 74 4
75 98 39
90 99 65
De ‘Clinical utility of RF’ Shmerling and Delbanco The American Journal of Medicine, vol91,nov 1991
ENFERMEDADES REUMÁTICAS ASOCIADAS A FR +
AR...........................................................75-90%
SLE.........................................................15-35%
S DE SJOGREN....................................75-95%
ESCLEROSIS SIST..............................20-30%
PM/DM..................................................5-10%
CRIOGLOBULINEMIA..........................40-100%
MCTD....................................................50-60%
VALOR PRONÓSTICO DEL FACTOR REUMATOIDEO
Se ha comprobado estadísticamente que los pacientes con título elevado tienen enfermedad más severa y los pacientes seropositivos para el FR a cualquier titulo se verán mas afectados que los seronegativos.
AR Lupus
FR Positivo en un 70% positivo en un 30% . Título alto bajoANA . Isotipo IgM IgG . Título Bajo Alto . porcentaje de pacientes + 40 % 95 %Unión a ADN <10 % 70 – 85 %Niveles de (C3 + C4) Normal o o normalProteína C reactiva usualmente normalBiopsia de piel - +Nivels séricos de IgG normal a menudo
Serología comparativa de lupus y artritis reumatoidea
En la actualidad se han descrito auto anticuerpos de valor diagnóstico en artritis reumatoidea (2000).
Anti péptidos citrulinados cíclicos (CCP)
Es una modificación post traducción en que se trasforma el entorno arginina de las proteína en citrulina por deiminación
N
H
NH
O
H2N+ NH2
Ca2+
NH2
O
NH
H
N
O
peptidilarginina deiminasa (PAD)
Modificación enzimática de la arginina a citrulina.
Los anticuerpos generados contra proteínas modificadas son generalmente promiscuos en cuanto a su reconocimiento.
• Reconocen tanto a la proteína modificada como la no modificada.
• Por contraste las células T sólo reconocen la proteína modificada.
Una de las proteínas modificas por citrulinización en la artritis reumatoidea es la fibrina.
Los anticuerpos anti filagrina
Pro filagrina filagrina
Deiminación de argininas
Las regiones de la filagrina citrulinadas son los epitopos de los autoanticuerpos.
Péptidos cíclicos citrulinados
Diferenciación celular
Filagrina: es producida durante los últimos estadios de la diferenciación terminal de las células epiteliales en los mamíferos y es sintetizada como una proteína precursora fosforilada (profilagrina)
Grupo AR
positividad
Anti - CCP FR (EIA)
AR temprana (< 3 meses) 385 / 455 344 / 455
Artritis reumatoidea confirmada 189 / 227 72 / 80
Total para el grupo AR% de sensibilidad clínica
547 / 662
80416 / 535
78Grupo control / enfermedad
Donantes sanos 0/323 37/240
Lupus 22/199 69/147
Síndrome de Sjögren 1/86 39/53
Polimiositis y dermatomiositis 0/55 418
osteoartritis 7/66 11/39
Síndrome antifosfolípido 0/10 neg
Esclerodemia 6/96 40/59
Total para el grupo control% especificidad clínica
41/1189
97263/695
62
Ensayo multicétrico de anticuerpos anti CCP
El laboratorio enSíndrome de Sjögren
Anticuerpos en el síndrome de Sjögren
Recordar que puede ser primario o secundario. En este caso aparece asociado a artritis reumatoidea, lupus eritematoso o esclerodermia.
Aparecen anticuerpos anti Ro y anti La.
Anticuerpos específicos de órgano contra
• conductos salivares
• anti-células parietales gástricas
• anti-tiroideos.
Sjögren
Anticuerpos de enfermedades no específicas de órgano
• Factor reumatoideo
• Anticuerpos antinucleares. Se observa en general un patrón moteado como resultado de la presencia de anti SSA-Ro,anti SSB-La o ambos.
No son específicos de la enfermedad, pero son mas frecuentes en estos pacientes.
El ensayo diagnóstico más simple es el test de Shirmer: se coloca una tira de papel de filtro debajo del párpado. La imposibilidad de producir en 5 minutos suficiente cantidad de lágrimas para mojar un área de 10 mm demuestra defectos en al producción de la lágrimas .
En el contexto de otros hallazgos clínicos de enfermedades sistémicas sugiere fuertemente el síndrome de Sjögren.
Sjögren
El laboratorio en
Esclerodermia
AUTOANTICUERPOS EN ESCLERODERMIA
Anticuerpo Antígeno Patrón en la IFI Asociación clínica
Anti SCL70 Topoisomerasa I Nuclear moteado 30% de Difusa
Enz. del nucleolo fino cutánea
Anti-Centrómero Proteínas del ki- Centrómero (en 80% de limita-
netocore metafase) da cutánea
Antinucleolar RNA polimerasa I Nucleolar 25% de difusa
II y III.Fibrilarina cutánea
Anti-PM SCL Complejo de 11 prot. Nucleolar Superposición esclerodermia/miositis
AD
N + ADN sc
ADN dc
AN
A +
La
Sm
RNP
Jo - 1
Perf
il EN
AArtritis reumatoidea
Lupus inducido por drogas
Lupus eritematoso sistémico
Síndrome de Sjögren
Enfermedad mixta del tejido conectivo
Polimiositis / dermatomiositis
Esclerodermia
Ro
Resumen
Scl-70