Download - Kinolon Dirençli Escherichia coli ve Klebsiella spp ...

Transcript
Page 1: Kinolon Dirençli Escherichia coli ve Klebsiella spp ...

Oya PAZARLI, Füsun CÖMERT, Elif AKTAŞ, Füruzan KÖKTÜRK1,

Canan KÜLAH

Zonguldak Karaelmas ÜniversitesiTıp Fakültesi

Tıbbi Mikrobiyoloji A.D., 1Biyoistatistik A.D.

Kinolon Dirençli

Escherichia coli ve Klebsiella spp.

Suşlarında Direnç Genlerinin Araştırılması

Page 2: Kinolon Dirençli Escherichia coli ve Klebsiella spp ...

Kinolonların etki mekanizması

• DNA Giraz

• GyrA

• GyrB

• Topoizomeraz IV

• ParC

• ParE

2

Hawkey PM. Mechanisms of quinolone action and microbial response.

J Antimicrob Chemother, 51 Suppl S1: S29–35, 2003

Page 3: Kinolon Dirençli Escherichia coli ve Klebsiella spp ...

Direnç mekanizmaları

İlaç hedefinde değişiklik

Hücrede ilaç birikiminin azalması

Membran permeabilitesinde azalma

Dış membran porin protein değişiklikleri

E.coli OmpF, OmpC

Aktif pompalama ile antibiyotiğin hücre dışına atılması E.coli AcrAB-TolC

Plazmid aracılı direnç aktarımı

3

Hawkey PM. Mechanisms of quinolone action and microbial response. JAC 2003,51 Suppl S1: S29–35,

Jacoby AG. Mechanisms of resistance to quinolones. CID 2005; 41:S120–6

Li XZ. Quinolone resistance in bacteria: emphasis on plasmid-mediated mechanisms. Int J Antimicrob Agents 2005, 25: 453-463

Page 4: Kinolon Dirençli Escherichia coli ve Klebsiella spp ...

Direnç mekanizmaları

İlaç hedefinde değişiklik

Kinolon direnci belirleyici bölge

gyrA Ala67-Gln106

gyrB Asp426-Lys447

parC

parE

4

Hawkey PM. Mechanisms of quinolone action and microbial response. JAC 2003,51 Suppl S1: S29–35,

Jacoby AG. Mechanisms of resistance to quinolones. CID 2005; 41:S120–6

Page 5: Kinolon Dirençli Escherichia coli ve Klebsiella spp ...

Direnç mekanizmaları

Plazmid aracılı direnç aktarımı

İlacın enzimatik inaktivasyonu

Aminoglikozid asetil transferaz

aac(6’)-Ib

aac(6’)-Ib-cr

İlacın letal etkisinden koruyan genler

qnrA

qnrS

qnrB

qnrC

qnrD

Aktif pompa sistemi

qepA Poirel L,Cattoir V and P. Nordmann.

Is plasmid-mediated quinolone resistance a clinically significant problem?

CMI 2008; 14: 295–297

Page 6: Kinolon Dirençli Escherichia coli ve Klebsiella spp ...

Çalışmanın amacı

Escherichia coli ve Klebsiella spp. izolatlarında;

Kinolon direnç oranlarının belirlenmesi

GSBL üretiminin araştırılması

En sık görülen kinolon direnç mekanizmalarından

gyrA ve parC mutasyonlarının

Plazmid geçişli kinolon direnç genlerinden qnrA, qnrB,

qnrS ve aac(6’)-Ib varlığının araştırılması

Page 7: Kinolon Dirençli Escherichia coli ve Klebsiella spp ...

7

İzolatların Toplanması

Şubat-Ağustos 2009 arasında izole edilen

508 Escherichia coli

120 Klebsiella spp.

Nalidiksik asite dirençli/orta duyarlı 300 izolat ayrıldı

Page 8: Kinolon Dirençli Escherichia coli ve Klebsiella spp ...

Kültür ve bakteri tanımlaması

Biyokimyasal özellikler

BBL Crystal Identification Systems E/NF (Becton Dickinson, ABD)

Murray PR. Manual of Clinical Microbiology. Vol. 1. 2003, 8th ed. ASM Press, Washington, DC

Page 9: Kinolon Dirençli Escherichia coli ve Klebsiella spp ...

Antibiyotik Duyarlılık Testleri

Disk Difüzyon Yöntemi

Agar Dilüsyon Yöntemi

Antibiyotik MİK (µg/ml)

Duyarlı Orta duyarlı Dirençli

Nalidiksik asit ≤16 _ ≥32

Siprofloksasin ≤1 2 ≥4

-CLSI. Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing;

Eightenth Informational Supplement. CLSI document M100-S18. 2009

-CLSI. Methods for dilution antimicrobial susceptibility test for bacteria that grow aerobically;

Approved Standard 7th ed. M7-A7. 2006.

Page 10: Kinolon Dirençli Escherichia coli ve Klebsiella spp ...

GSBL Üretiminin Gösterilmesi

Çift disk sinerji yöntemi

Jarlier V, Nicolas MH, Fournier G, Philippon A: Rev Inf Dis;10: 867. 1988

Page 11: Kinolon Dirençli Escherichia coli ve Klebsiella spp ...

DNA eldesi ve çoğaltılması

Gen bölgesi Forward primer Reverse primer Bant büyüklüğü (bç)

qnrA 5`-atttctcacgccaggatttg-3` 5`-gatcggcaaaggttaggtca-3` 516

qnrB 5`-gatcgtgaaagccagaaagg-3' 5`-acgatgcctggtagttgtcc-3 469

qnrS 5`-acgacattcgtcaactgcaa-3' 5`-taaattggcaccctgtaggc-3 417

aac(6’)-Ib 5'-ttgcgatgctctatgagtggcta-3' 5'-ctcgaatgcctggcgtgttt-3' 482

parE 5'-tacaccggtcaacattgagg-3' 5'-ttaatattgccgccgtcgg-3' 648

parC 5'-aaacctgttcagcgccgcatt-3' 5'-gtggtgccgttaagcaaa-3' 395

Robicsek A, Strahilevitz J, Sahm D.F, Jacoby G.A, Hooper D.C. AAC, 50: 2872–74. 2006

Park C.H, Robicsek A, Jacoby G.A, Sahm D, and Hooper D.C. AAC, 50: 3953-3955, 2006

Saenz Y, Zarazaga M, Brinas L, Ruiz-Larrea F, Torres C.. JAC, 51:1001-1005, 2003

Vila J, Ruiz J, Goni P, Jimenez de Anta MT. AAC, 40: 491-493, 1996

Page 12: Kinolon Dirençli Escherichia coli ve Klebsiella spp ...

Nükleik asit dizileme

gyrA ve parC bölgelerinde QRDR dizilemesi

TÜBİTAK MAM GMBE de yapıldı

İlgili kodonlarda mutasyonların varlığı, standart

dizilerle karşılaştırılmak suretiyle saptandı

Hall TA. BioEdit: a user-friendly biological sequence lignment editor and analysis program

for Windows 95/98/NT. Nucl Acids Symp, 41: 95-98,1999.

BLAST. National Center for Biotechnology Information. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST

Page 13: Kinolon Dirençli Escherichia coli ve Klebsiella spp ...

İstatistiksel Analiz

SPSS (Versiyon 13.0) programı kullanılarak yapıldı

Tanımlayıcı istatistikler sayı ve yüzde olarak ifade edildi

Kategorik yapıdaki değişkenler bakımından gruplar arası

farklılıklar Ki-kare testi ile incelendi

Sonuçlar %95 güven aralığında değerlendirildi

p<0.05 değeri anlamlı kabul edildi.

Page 14: Kinolon Dirençli Escherichia coli ve Klebsiella spp ...

BULGULAR

Nalidiksik asit direnci;

E. coli % 52

Klebsiella spp. % 27.5

GSBL üretimi;

İzolatların tümünde % 36.1

E. coli %37.4

Klebsiella spp % 30.8

Nalidiksik aside dirençli izolatlarda % 83.3

Nalidiksik aside duyarlı izolatlarda % 16.7

Page 15: Kinolon Dirençli Escherichia coli ve Klebsiella spp ...

BULGULAR

Yatan hasta izolatlarında nalidiksik asit direnci

anlamlı olarak yüksek bulundu (p=0.049)

Nalidiksik aside dirençli/orta duyarlı olan izolatlar, ampisilin

amoksisilin/klavulonik asit

sefalotin

sefepim

sefotaksim

anlamlı olarak daha dirençli bulundu (p<0.001).

sefuroksim

sefoksitin

gentamisin

tobramisin

amikasin

trimetoprim-

sülfometoksazol’e

Page 16: Kinolon Dirençli Escherichia coli ve Klebsiella spp ...

BULGULAR

gyrA; Ala67-Gly106 arasında

Ser83Leu ile birlikte Asp87Asn veya Asp87Tyr

16

İzolat BakteriCIP MIK

µg/ml

QRDR

gyrA ParC

1 E. coli >32 Ser83Leu, Asp87Asn Ser80Ile

3 E. coli >32 Ser83Leu, Asp87Asn Ser80Ile

9 E. coli >32 Ser83Leu, Asp87Asn Ser80Ile

14 E. coli >32 Ser83Leu, Asp87Asn Ser80Ile,Glu84Val

20 E. coli >32 Ser83Leu, Asp87Asn Ser80Ile,Glu84Ala

24 E. coli >32 Ser83Leu, Asp87Asn Ser80Ile,Glu84Val

37 E. coli >32 Ser83Leu, Asp87Asn Ser80Ile,Glu84Val

40 E. coli >32 Ser83Leu, Asp87Asn Ser80Ile,Glu84Val

47 E. coli >32 Ser83Leu, Asp87Asn Ser80Ile,Glu84Val

48 E. coli >32 Ser83Leu, Asp87Asn Ser80Ile,GluE84Gly

50 E. coli >32 Ser83Leu, Asp87Asn Ser80Ile,Glu84Val

Page 17: Kinolon Dirençli Escherichia coli ve Klebsiella spp ...

BULGULAR

parC; ….

Ser80Ile

İlave bir mutasyon olarak;

Glu84Val, Glu84Gly, Glu84Ala

İzolat No Bakteri CIP MIK

µg/ml

QRDR

GyrA ParC

55 E. coli >32 Ser83Leu, Asp87Asn Ser80Ile

56 K. oxytoca >32 Ser83Leu, Asp87Asn Ser80Ile

57 E. coli >32 Ser83Leu, Asp87Asn Ser80Ile

61 E. coli >32 Ser83Leu, Asp87Asn Ser80Ile

63 E. coli >32 Ser83Leu, Asp87Asn Ser80Ile

68 E. coli >32 Ser83Leu, Asp87Asn Ser80Ile

70 E. coli >32 Ser83Leu, Asp87Asn Ser80Ile,GluE84Gly

71 E. coli >32 Ser83Leu, Asp87Tyr Ser80Ile,GluE84Gly

72 E. coli >32 Ser83Leu, Asp87Asn Ser80Ile,Glu84Val

73 E. coli >32 Ser83Leu, Asp87Asn Ser80Ile,Glu84Val

74 E. coli >32 Ser83Leu, Asp87Asn Ser80Ile,Glu84Val

Page 18: Kinolon Dirençli Escherichia coli ve Klebsiella spp ...

BULGULAR

aac(6’)-Ib

E. coli; % 37.4

K. pneumoniae ; % 12.1

K. oxytoca; 0

tobramisin ve gentamisin direnci anlamlı düzeyde

yüksek bulundu

GSBL üretimi anlamlı olarak yüksek bulundu

18

Page 19: Kinolon Dirençli Escherichia coli ve Klebsiella spp ...

BULGULAR

İzolatlarda qnrA, qnrB ve qnrS geni bulunmadı

19

Page 20: Kinolon Dirençli Escherichia coli ve Klebsiella spp ...

TARTIŞMA

2003-2008 yıllarında florokinolon dirençli E.coli izolatları

Page 21: Kinolon Dirençli Escherichia coli ve Klebsiella spp ...

TARTIŞMA

2006-2008 yıllarında florokinolon dirençli K. pneumoniae izolatları

Page 22: Kinolon Dirençli Escherichia coli ve Klebsiella spp ...

TARTIŞMA

Ülkemizde hedef bölge değişimi üzerine çalışmalar

Eraç B, Gill A, Amyes SGB, Gülay Z.

Siprofloksasine dirençli Escherichia coli suşlarında Gyr A

mutasyonlarnın incelenmesi. Mikrobiyoloji Bülteni, 37: 125-130, 2003.

8 izolat; Ser-83-Leu ve Asp-87-Tyr veya Asp-87-Asn

Güven Ö.

Sağlıklı çocuklarda dışkıda kinolon dirençli Escherichia coli

taşıyıcılığının ve direnç mekanizmalarının saptanması.

İstanbul Üniversitesi Sağlık Bilimleri Enstitüsü, Yüksek Lisans Tezi, 2007.

6 izolat; gyrA Ser-83-Leu ve Asp-87-Asn

par C Ser-80-Ile ve Ser-83-Tyr

ve eşlik eden Glu84Gly veya Glu84Val

Page 23: Kinolon Dirençli Escherichia coli ve Klebsiella spp ...

TARTIŞMA

Bu çalışmada;

gyrA QRDR çift mutasyon

Ser83Leu

Asp87Asn veya Asp87Tyr

parC QRDR

İki izolat dışında en az bir mutasyon

Ser80Ile

Ek olarak

23

Glu84Val

Gly

Ala

Page 24: Kinolon Dirençli Escherichia coli ve Klebsiella spp ...

TARTIŞMA

aac(6’)-Ib

Aminoglikozid transferaz

aac(6’)-Ib-cr

Siprofloksasini asetilleme

Siprofloksasine maruziyet ile kromozomal mutasyon

sıklığını arttırıyor

Qnr ile birliktelik

Belirlenen aac(6’)-Ib lerin %58-92’si aac(6’)-Ib-cr

Robicsek A, Strahilevitz J, Jacoby G.A, Macielag M, Abbanat D, Bush K, and Hooper D.C. Fluoroquinolone modifying enzyme: a novel

adaptation of a common aminoglycoside acetyltransferase. Nature Medicine. 12: 83-88, 2006.24

Page 25: Kinolon Dirençli Escherichia coli ve Klebsiella spp ...

TARTIŞMA

Poirel L, Gür D, Minarini L, Arslan U, Nordmann P.

Molecular epidemiology of plasmid mediated quinolone resistance determinants in extended spectrum

beta-lactamase producing E.coli and K.pneumoniae isolates from Turkey,

18th European Congres of Cilinical Microbiology and Infectious Diseases, P1527, Barcelona (2008).

GSBL üreten 50 izolatta 39 aac(6’)-Ib-cr (+)

Bu çalışmada;

E. coli; % 37.4

K. pneumoniae ; % 12.1

25

Page 26: Kinolon Dirençli Escherichia coli ve Klebsiella spp ...

Ülkemizde plazmid aracılı kinolon direnci ile ilgili

çalışmalar Nazik H, Öngen B. ANKEM Derg 2010;24(1):46-54

Page 27: Kinolon Dirençli Escherichia coli ve Klebsiella spp ...

SONUÇ

Bu çalışma ile;

Belirlenen direnç oranları, kinolon grubu antibiyotiklerin

ilimizde E.coli ve Klebsiella spp. kaynaklı infeksiyonların

ampirik tedavisinde güvenilir olmadığı

Dirençli bakteri popülasyonunun mutant seçimine bağlı

olduğu gösterilmiştir

27

Page 28: Kinolon Dirençli Escherichia coli ve Klebsiella spp ...

Teşekkür

Sayın Prof. Dr. Zeynep GÜLAY’a;

qnrA, qnrB, qnrS pozitif kontrol suşlarını temin ettiği için

teşekkür ederiz

Bu çalışma, Z.K.Ü. Bilimsel Araştırma Projeleri Komisyonu

tarafından (Proje No: 2009-20-01-14) desteklenmiştir