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UNIVERSIDAD DE GUAYAQUIL
FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA
TESIS
PRESENTADA AL HONORABLE CONSEJO DIRECTIVO
COMO REQUISITO PREVIO A LA OBTENCIÓN DEL TÍTULO
DE MÉDICO VETERINARIO ZOOTECNISTA
TEMA
ESTUDIO DE TOXICIDAD EN LOTES DE VENENOS DE
SERPIENTES Bothrops DE MÁS DE UN AÑO DE
ALMACENAMIENTO
AUTOR
LUIS ALFREDO VERA ARTEAGA
DIRECTOR
DR. SANTIAGO RANGEL BAJAÑA MSc.
GUAYAQUIL-ECUADOR
2011 – 2012
ii
TEMA:
ESTUDIO DE TOXICIDAD EN LOTES DE VENENOS DE SERPIENTES
Bothrops DE MÁS DE UN ANO DE ALMACENAMIENTO
AUTOR
LUIS ALFREDO VERA ARTEAGA
TESIS
PRESENTADA AL H. CONSEJO DIRECTIVO COMO
TULO DE:
DICO VETERINARIO ZOOTECNISTA
N DESIGNADO POR EL
H. CONSEJO DIRECTIVO DE LA FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA
Y ZOOTECNIA, DAMOS
N DE_______ ( ) EQUIVALENTE A ________ ( )
__________________________
Dr. Santiago Rangel Bajaña MSc.
DIRECTOR DE TESIS
_______________________ ___________________
Biolg. Antonio Freire Lascano Dr. Mauro Loor Macías
EXAMINADOR PRINCIPAL EXAMINADOR PRINCIPAL
iii
Los datos escritos en esta investigación son de
Conocimiento y responsabilidad del autor.
LUIS ALFREDO VERA ARTEAGA
iv
DEDICATORIA
A Dios y a Jesús por haberme dado
las fuerzas necesarias para continuar siempre
hacia adelante, por alejarme de todo lo malo
e impulsar mi vida para el bien ofreciéndome
cada día una nueva oportunidad.
A mis padres Tulio Vera Arteaga y
Carlota Arteaga Zambrano por darme el
apoyo, los consejos para mejorar como
persona y procurar mi bienestar en todo
momento, necesarios para llevar a cabo mis
metas. A mi esposa Leovy Viteri Andrade e
Hijos Luis Vera Viteri y Luciana Vera Viteri
por la alegría que siempre transmiten a mi
corazón, y a toda mi familia.
v
AGRADECIMIENTO
Mi más sincero agradecimiento a:
Al Dr. Santiago Rangel Bajaña MSc. Director de tesis, por su
ayuda durante el manejo experimental.
Al Biólg. Antonio Freire y al Dr. Mauro Loor, por su guía y
ayuda constante en el desarrollo te mi tesis.
Al Dr. Raúl Martínez, quien o or en el Instituto Nacional de
Higiene y edi in ropi “ eopo do zquiet érez”
A todos los Docentes de la Facultad de Medicina Veterinaria y
Zootecnia de la Universidad de Guayaquil, por impartir de forma
responsable y paciente sus conocimientos.
A mis amigos y compañeros, muchas gracias.
A todas las personas que de una forma u otra, han colaborado en
la culminación de este trabajo, para ellos mis más sinceros
agradecimientos.
vi
ÍNDICE GENERAL
CAPÍTULOS Pág.
I. OBJETIVOS………………………………………..…………..
3
II. REVISION DE LITERATURA……………………………..……..
4
III. HIP TISIS DE LA INVESTIGA I N………………………… 21
IV. ETODOLOG A……………..…………………………………...
V. RESULTADOS……………..……………………………………....
VI. DIS USI N………………………………………………………
VII. ON LUSIONES………………………………………………
VIII. RE O ENDA IONES………………………………………
IX. RESU EN……………………………………………………….
X. SU ARY…………………………………………………………
XI. I LIOGRAF A…………………………………………………
XII. ANEXOS…………………………………………………………
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CONTENIDO
Portada…………………………………………………………………….. I
Aceptación del Tribunal de Sustentación……………………………….. Ii
DEDI ATORIA…………………………………………………………... Iii
AGRADE I IENTO……………………………………………………. Iv
INTRODU I N………………………………………..……………… 1
I. OBJETIVOS……………………………………………………………
1.1. OBJETIVO GENERAL…………………………………………..
3
3
. . O JETIVOS ESPE FI OS……………………………………..
II. REVISI N DE LITERATURA……………………………..……….
3
4
2.1. OFIDIOS OTHROPS……..……………………………………
2.1.1. GENERALIDADES…………………………………….
2.2. DISTRIBUCIÓN GEOGRÁFI A…………..…………………
2.2.1. Hábitat en Ecuador……….……………………………
2.3. VENENO…………………………………………………..…….
2.3.1. Accidente Bothrópico…………………….…………….
2.3.2. Descripción del veneno…………..…………………….
2.3.3. Suero antiofídico y su producción……………..……..
2.3.4. Fraccionamiento del veneno……………………….….
.3.5. Determinación del peso molecular aparente………...
.3.6. Isoelectroenfoque………………………………………
.3.7. Actividad Hemolítica…………………………………..
.3.8. Actividad de fosfolipasa A ……………………………
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.3.9. itoxicidad………………………………………………
2.4. IN UNIZA I N EN ONEJOS…………..…………………
2.5. APLI A I N DE TRATA IENTO…………………………
2.5.1. Seguimiento del tratamiento…………………………….
2.5.2. Recolección de datos……………………………………
2.5.3. Evaluación de ensayos y de criterios de evaluación...
III. HIP TESIS DE LA INVESTIGA I N…………………………..
IV. ATERIALES Y TODOS……………………………………...
4.1. LOCALIZACIÓN DE LA INVESTIGACIÓN……………
4.2. CONDICIONES METEOROLÓGI AS…………………..
4.3. ATERIALES…………...…………………………….……
4.3. . ateriales biológicos………………………………...
4.3.2. ateriales químicos………………………………….
4.3.3. Instrumental y equipos……………………………….
4.3.4. ateriales de vidrio………………………………….
4.3.5. aterial de oficina……………………………………
4.4. TODOS…..….................................................................
4.4.1. Recolección del veneno………………………………
4.4. . Pesaje del veneno…………………………………….
4.4.3. Pesaje de los ratones…………………………………
4.4.4. Obtención de la DL 50……………………………...
4.5. ANÁLISIS ESTAD STI O…………………………………
V. RESULTADOS……………..……………………………………........
4.1. VARIACIONES DE LA DOSIS LETAL MEDIA (DL 50)
DE ACUERDO AL TIEMPO DE ALMACENAMIENTO
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5.1.1. Desviación estándar de la dosis letal (DL 50)……...
5.2. DOSIS LETAL MEDIA (DL 50) EN LOTES DE
VENENO DE SERPIENTES OTHROPS………………
5.2.1. Incremento porcentual de la dosis letal media (DL
50) prestablecida en lotes de veneno Bothrops por
especie……………………………………………….
VI. DIS USI N…………………………………………………………
VII. CON LUSIONES…………………………………………………
VIII. RE O ENDA IONES…………………………………………
IX. RESU EN…………………………………………………………
X. SU ARY……………………………………………………………
XI. BIBLIOGRAFÍA……………………………………………………
XII. ANEXOS………………………………………………………… 43
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1
INTRODUCCIÓN
Existen una gran familia de serpientes que su veneno tiene un alto grado de
toxicidad y poder de envenenamiento de gran magnitud, éste es el género Bothrops,
de las cuales se derivan muchas especies, la obtención de este es utilizado para la
preparación de los sueros antiofídicos.
Las serpientes venenosas del género Bothrops, son responsables de la
mayoría de los accidentes ofídicos registrados anualmente en toda Latinoamérica y
en Ecuador, los que se caracterizan por presentar hemorragia y necrosis local,
sangrado por coagulopatía de consumo, hipotensión, shock y muerte. Anualmente en
el mundo se presentan alrededor de 5.400.000 envenenamientos ofídicos, donde en
Latinoamérica se estiman 150.000 envenenamientos ofídicos anuales y 5.000
muertes por esta causa.
El accidente ocurre principalmente en áreas rurales donde la cobertura de
salud es deficitaria. Dado que una de las problemáticas más concurridas en los
cuadros clínicos producidos por mordeduras de serpientes es la diversa
sintomatología producida por los venenos, se hace evidente que puedan sufrir
grandes variaciones - aun en individuos de la misma especie - debido a factores
ambientales externos tales como: clima, altitud, humedad, tipo de presas disponibles,
entre otros; así como también otros factores internos: sexo, edad, ciclo hormonal,
nutrición, estado de salud y condiciones de bienestar - animales en cautiverio -
(Charry-Restrepo, 2007), lo cual reafirma que las variantes en la composición
química de estas sustancias son consecuencia del proceso de síntesis proteica a nivel
glandular y los mecanismos que controlan dicho proceso molecular (Russell, 1983;
Yarlequé, 2000).
Por consiguiente, se ha demostrado que existen variaciones en la composición
química de los venenos, las cuales están sujetas a factores biogeográficos y
climáticos, además de los específicos, razón por la cual, por ejemplo, los sueros
antiofídicos norteamericanos son ineficaces frente al veneno de serpientes
suramericanas y viceversa (Charry-Restrepo, 2007). Silva-Haad (1981) y
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recientemente Otero, et al 2007 y (Charry-Restrepo 2007) reportan a las serpientes
del género Bothrops, como el agente agresor de mayor importancia médica, causante
del 95% de los accidentes ofídicos en la región amazónica.
Varios estudios sobre caracterización tóxica de venenos de serpientes se han
realizado en el mundo (Bush 1999, Health Organization, World 1981; Theakston &
Reid, 1983), sin embargo, solo se dispone de pocos estudios sobre actividades
enzimáticas y tóxicas del veneno de Bothrops atrox en Colombia (Núñez, 2005).
En la actualidad, los estudios de caracterización químico, molecular y de
actividades toxicas y electroforéticos en los venenos de serpientes, son necesarios
para el mejor entendimiento de los procesos bioquímico y fisiopatológicos que se
producen posterior a su mordedura, además de ayudar a evaluar el potencial
neutralizante de los sueros antiofídicos (Roodt, et al 2005).
Por lo antes mencionado se justifica la presente tesis, porque en la actualidad no
existen estudios relevantes que determinen la toxicidad de lotes de venenos ofídicos
en estado de caducidad, como es el caso de las serpientes del género Bothrops que
tengan más de un año de caducidad para la producción de sueros antiofídicos, y así
aportar de esta manera a dilucidar las interrogantes que se generan sobre la
efectividad de éste componente , ya que muchas veces el producto escasea y los
recursos para su fabricación no se encuentran disponibles con rapidez ante un tipo de
emergencia de ésta índole.
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I. OBJETIVOS
1.1. OBJETIVO GENERAL:
Establecer toxicidad de los lotes de venenos de serpientes Bothrops de más
de un año de almacenamiento.
1.1. OBJETIVOS ESPECÍFICOS:
Determinar las variaciones de la dosis letal media (DL 50) en lotes de
venenos de serpientes Bothrops de acuerdo al tiempo de almacenamiento.
Establecer la dosis letal media (DL 50) en lotes de venenos de serpientes
Bothrops de acuerdo a la especie.
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N DE LITERATURA
2.1. OFIDIOS DEL GÉNERO Bothrops
2.1.1. GENERALIDADES
Este género agrupa numerosas especies, distribuidas desde América del Sur,
toda América Central y el sur de América del Norte. Son todas serpientes
extremadamente agresivas y de un veneno muy potente. La mayoría de las especies
poseen veneno mixto (coagulante y proteolítico), cuya acción es muy rápida y el
accidentado siente los primeros síntomas a los pocos minutos.
Poseen una cola corta, generalmente roma. No poseen cascabel en la punta.
Subcaudales en una o dos hileras. Cabeza de forma triangular, hexagonal o
romboidal, bien diferenciada del cuello. Es achatada y ancha, con escamas carenadas.
Colmillos largos y huecos, que con la boca cerrada están paralelos al paladar.
El cuello es delgado al que le sigue un cuerpo grueso en su mitad, pesado y
rechoncho. A falta de cascabel, cuando están irritados, golpean la cola repetidamente,
de forma tan rápida que producen un ruido similar al de una varilla golpeando. Todas
las especies del género se caracterizan por tener todo su cuerpo revestido por
escamas lanceoladas y carenadas o aquilladas con o sin marca apical.
Se reproducen ovovivíparamente y suelen tener hasta 60 crías que apenas nacidas ya
tienen la agresividad y el potente veneno de los adultos.
Habitan zonas calurosas y húmedas, entre la leña, las hojas secas y los
matorrales. Son afectos a introducirse en las casas de los poblados que están situadas
en las zonas de ofidismo.
Se los considera como las verdaderas Víboras americanas. Reciben en
América varios nombres según el lugar donde habiten, Yararás, Víboras de fosa,
Cuatro narices, Yoperojobos, etc.
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También a cada especie se la denomina de diferentes maneras. Como ser a la
Bothrops alternatus se la llama de las siguientes formas: Yarará guazú, Yarará
grande, Víbora de la cruz, Crucera, Yarará real, Mboí cuatiá, Quiririog, Viririog
acacurussú, etc. Esto hace que a veces sea muy confuso distinguir de que serpiente se
trata o se está hablando.
Se encuentra validado por ITIS "Integrated Taxonomic Information System".
Presenta treinta y seis especies:
Bothrops alcatraz
Bothrops alternatus
Bothrops ammodytoides
Bothrops andianus
Bothrops asper
Bothrops atrox
Bothrops barnetti
Bothrops brazili
Bothrops caribbaeus
Bothrops colombianus
Bothrops colombiensis
Bothrops cotiara
Bothrops doporus
Bothrops erythromelas
Bothrops fonsecai
Bothrops iglesiasi
Bothrops insularis
Bothrops itapetiningae
Bothrops jararaca
Bothrops jararacussu
Bothrops jonathani
Bothrops lanceolatus
Bothrops leucurus
Bothrops lojanus
Bothrops lutzi
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Bothrops marajoensis
Bothrops mattogrossensis
Bothrops moojeni
Bothrops muriciensis
Bothrops neuwiedi
Bothrops pauloensis
Bothrops pictus
Bothrops pirajai
Bothrops pubescens
Bothrops sanctaecrucis
Bothrops venezuelensis
2.2. Bothrops asper
2.2.1. GENERALIDADES
Es una de las especies de serpientes con mayor dimorfismo sexual. Las
serpientes de ambos sexos nacen con el mismo tamaño, pero entre los 7 a 12 meses
de edad las hembras comienzan a crecer más rápidamente que los machos. En
general, los adultos miden entre 140-180 cm.
Los machos nunca alcanzan más de 195 cm de longitud, mientras que las
hembras tienen un tamaño promedio de 185 cm, con una longitud máxima
confirmada de 250 cm. Las hembras tienen cuerpos gruesos y las más grandes
pueden pesar hasta 6 kg, aunque se han reportado ejemplares de mayor peso. La
cabeza de las hembras es dos o tres veces más grandes que la de los machos en
proporción a su tamaño, y sus colmillos también son proporcionalmente más grandes
(típicamente 2,5 cm).
El patrón de color se asemeja al de B. atrox: rayas diagonales y diamantes de
varios tonos de marrón. La parte inferior de la cabeza es amarillo pálido. Las
serpientes recién nacidas son de color más brillante y los machos juveniles tienen la
punta de la cola amarilla.
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A cada lado de la cabeza tiene una foseta loreal ubicada entre el ojo y el
hocico, que sirve para detectar presas que emiten radiación infrarroja. La foseta
loreal es una característica compartida con las demás víboras de foseta.
2.2.2. DISTRIBUCIÓN GEOGRÁFICA
Se encuentra en las tierras bajas del Atlántico del este de México y América
Central, incluyendo Guatemala, Bélice, Honduras, Nicaragua, Costa Rica y Panamá.
Existe una población aislada en el sureste de Chiapas (México) y el suroeste de
Guatemala. En el norte de Sudamérica se encuentra en Colombia, Ecuador y
Venezuela. La localidad tipo dado es "Obispo", en el Istmo de Darién (Panamá).
Bothrops asper es una especie que vive principalmente en tierras bajas. En
México y América Central se encuentra desde el nivel del mar hasta una altitud de
1.200-1.300 m. En América del Sur, al parecer, su ocurrencia altitudional varía
considerablemente e incluye zonas más elevadas: hasta 2.500 m en Venezuela, y por
lo menos 2.640 m en Colombia. (Lancini, 1979).
2.2.3. HÁBITAT EN ECUADOR
De acuerdo con Campbell y Lamar (2004), su área de distribución en Ecuador
se extiende hasta la costa del Pacífico en provincia de El Oro, la zona de Vilcabamba
y el valle del río Catamayo (Lascano Freire y Kuch, 1994 Schätti, y Kramer, 1993).
Hay también algunos registros en la costa norte de Perú en la región de Tumbes.
También es conocida en la isla Gorgona en Colombia.
B. asper ocurre a lo largo de los valles interandinos de Colombia, la llanura
costera del Caribe por el centro norte de Venezuela del Orinoco, hacia el este hasta el
Delta Amacuro. Es la única especie de Bothrops que existe en la isla de Trinidad,
aunque la situación es complicada debido a la proximidad de Trinidad y la Delta del
Orinoco, que puede resultar en especiación simpátrica de B. atrox.
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2.2.4. VENENO
Esta especie es responsable de una parte importante de las mordeduras de
serpientes dentro de su área de distribución. Junto a la víbora de cascabel (Crotalus
durissus) es la principal causa de mordeduras de serpiente en Yucatán, México. En
Costa Rica es considerada la serpiente más peligrosa del país, responsable del 46%
de todas las mordeduras y el 30% de todos los casos hospitalizados; Antes de 1947 la
tasa de mortalidad fue del 7%, pero desde entonces se ha reducido a casi 0%
(Bolaños, 1984). En los departamentos Colombianos de Antioquia y Chocó causa un
50-70% de todas las mordeduras de serpientes con una tasa de secuelas de 6% y una
tasa de mortalidad de 5% (Otero et al., 1992).
En el estado de Lara, Venezuela, es responsable de 78% de todos los
envenenamientos y de todas las muertes por mordedura de serpiente. Una de las
razones porque tantas personas son mordidas por ésta especie es su asociación con
las habitaciones humanas donde viven sus presas comunes (ratas, ratones, lagartos).
Por lo tanto, muchas de las mordeduras ocurren en el interior de las casas.
Los accidentes ofídicos en el país registran una tendencia estable y que en
promedio es de 13.21 por 100.000 habitantes. Se reportan entre 1500 a 1600 casos
siendo las provincias del litoral como Los Ríos, Guayas, El Oro, Manabí y
Esmeraldas las que registran mayor número de casos y en la amazonía las provincias
con mayor problema epidemiológico son Morona Santiago, Orellana, Zamora
Chinchipe y Napo, cuyas tasa de incidencia son superiores a las observadas a nivel
nacional.
Esta especie es fácilmente irritable y tiene la reputación de ser agresiva. Es
considerada como más excitable e imprevisible que B. atrox. Su gran tamaño y su
hábito de levantar la parte superior de su cuerpo pueden dar lugar a mordeduras
arriba de las rodillas. También se ha observado que puede expulsar el veneno en
chorros finos desde las puntas de sus colmillos sobre una distancia de al menos 6 pies
(1,8 m).
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Los síntomas de mordedura incluyen dolor, supuración de las heridas
punzantes, inflamación local que puede aumentar durante 36 horas, moretones que se
extiende desde el lugar de la picadura, ampollas, entumecimiento, fiebre leve, dolor
de cabeza, sangrado de la nariz y las encías, hemoptisis, hemorragia gastrointestinal,
hematuria, hipotensión, náuseas, vómitos, alteración de la conciencia y sensibilidad
del bazo. En los casos no tratados, con frecuencia se produce necrosis local que
puede requerir la amputación. En 12 casos mortales la causa de la muerte fue
septicemia, hemorragia intracraneal, Insuficiencia renal aguda con hiperpotasemia y
acidosis metabólica y choque hemorrágico. (Nuñez, 2005)
2.3.1. ACCIDENTE BOTHRÓPICO:
Es causado por serpientes del género Bothrops, actualmente clasificado en
varios géneros. El veneno de estas serpientes por su alta concentración de factores
anti-coagulantes y mio-necrotizantes, tiene acción proteolítica, coagulante, citotóxica
y mio-necrotizante.
El cuadro clínico luego de 1 a 3 horas de la mordedura, dependiendo de la
cantidad de veneno inoculado, se caracteriza por presentar dolor intenso localizado,
edema firme progresivo, lesiones eritematosas con manchas rosáceas o cianóticas,
lesiones equimóticas y formación de flictenas en el sitio de la mordedura. Luego de
algunos días aparecen signos de necrosis superficial o profunda en la zona afectada y
en algunas ocasiones se puede apreciar necrosis total. Las manifestaciones
hemorrágicas son de diversa índole como: epistaxis, gingivorragias, hematemesis,
melenas, hemoptisis, hematuria y sangrado en otros órganos (hemorragia cerebral e
intraperitoneal), debido a la coagulación del fibrinógeno circulante lo cual depende
de la cantidad de veneno inoculado. (Charry-Restrepo, 2007).
2.3.2. DESCRIPCIÓN DEL VENENO
Durante los últimos años varios autores han hecho un aporte en cuanto a la
definición del veneno como es el caso de (Vidal 1976. Mebs 1989). Los venenos de
serpientes son las secreciones más ricas en enzimas y toxinas en la naturaleza y están
compuestos por múltiples moléculas tóxicas; los venenos de las serpientes que
10
pertenecen a la familia Viperidae tienen una composición química muy compleja,
con presencia de diversas toxinas y enzimas que afectan múltiples procesos
fisiológicos (Rojas et al. 2001).
Los envenenamientos provocados por estas serpientes se caracterizan por sus
efectos locales y manifestaciones sistémicas. Los primeros se caracterizan por la
aparición de edema, el cual constituye el efecto más común en envenenamientos por
serpientes de la familia Viperidae. (Lomonte 1994, Lomonte et al. 1993, Rojas et al.
2001).
Las investigaciones acerca de la composición química de los venenos de las
serpientes han demostrado que dichos fluidos biológicos son complejos
fundamentalmente proteicos cuya acción le permite al ofidio, inmovilizar a su presa,
causarle la muerte y producir la degradación de sus tejidos ( Yarlequé, 2000).
Los componentes de la ponzoña varían principalmente de acuerdo con la
especie pero existen otros factores que participan en la modificación del contenido
total, dando lugar a la producción masiva de uno o más tipos de proteína, a la
desaparición de alguno de ellos o a la aparición de un nuevo factor proteico (Russell,
1983), esto en base al estado fisiológico del animal, el nicho ecológico en el que
habita y el tipo de alimentación que tiene.
Un procedimiento idóneo para la caracterización de tales componentes, y por
lo tanto para el estudio de su acción biológica, es el uso de la técnica cromatográfica
en columna de filtración molecular y de intercambio iónico, lo cual permite separar
en base a la masa molecular o a la carga respectivamente, las proteínas contenidas en
el veneno. Así por ejemplo, la enzima similar a trombina del veneno de la serpiente
peruana Lachesis muta, “ husupe”, fue purificada mediante dos pasos sucesivos en
columna de filtración molecular Sephadex G-100 y una cromatografía de
intercambio aniónico en DEAE- celulosa (Yarlequé, 1989); en tanto que la
proteinasa 1 del mismo veneno fue aislada usando una cromatografía en Sephadex
G-100 y dos columnas sucesivas de intercambio iónico en DEAE-celulosa a pH 7.5
Y 8.2 respectivamente (Rodríguez, 1991).
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En el mismo sentido, la fosfatasa alcalina y la fosfolipasa A detectadas en el
veneno de la serpiente coral Micrurus spixii fueron separadas utilizando Sephadex
G-100 y DEAE- Sephadex A-50 (Tu, 1977).
De acuerdo con ello el empleo de la filtración molecular permite fraccionar el
veneno y agrupar a las proteínas del mismo por sus pesos moleculares, de manera
que se puedan evaluar en cada grupo los componentes más representativos, que en
muchos venenos son las enzimas. La concentración y potencia de ellas puede ser
entonces examinada.
En el presente trabajo se ha utilizado la técnica cromatográfica de filtración
para purificar parcialmente cinco proteínas enzimáticas detectadas previamente en
los venenos crudos de tres especies venenosas, una de ellas B. oligolepis, B. pictus y
B. rogengheri.
2.3.3. SUERO ANTIOFÍDICO Y SU PRODUCCIÓN
El suero antiofídico es el antídoto o antiveneno que se aplica para
contrarrestar el efecto de los venenos por mordeduras de serpientes.
La producción de antivenenos por ejemplo involucra las siguientes etapas:
1) Obtención de veneno
La producción del suero polivalente inicia con la extracción del veneno de los
ejemplares pertenecientes a las especies Bothrops asper (terciopelo), Crotalus
durissus (Cascabel) y Lachesis muta (cascabel muda). Por su parte, la producción de
suero anti-coral inicia con la extracción de veneno de ejemplares pertenecientes a la
especie Micrurus nigrocinctus (coral).
Para conservar la estructura y la actividad de los diferentes componentes del
veneno, este es estabilizado mediante un proceso llamado liofilización, en el cual el
agua es sublimada y el veneno es recuperado como un polvo seco que puede ser
12
almacenado durante años sin descomponerse y que al ser disuelto en agua recupera
las propiedades que tenía el día de su extracción.
2) Obtención de plasma hiperínmune
Una vez que el veneno es liofilizado se emplea para preparar una serie de
inyecciones que son administradas a caballos por vía subcutánea. El sistema
inmunológico de los caballos reconoce a las proteínas del veneno como extrañas y
responde de una forma compleja que se caracteriza entre otras cosas por la
producción de gran cantidad de anticuerpos dirigidos contra los elementos del
veneno.
Posteriormente los caballos son sometidos a un proceso en el cual se les
extrae sangre en una cantidad que no compromete su salud. Luego de que la sangre
es colectada asépticamente en bolsas estériles que contienen un anticoagulante, se
deja reposar en refrigeración hasta que las células sanguíneas sedimentan y es
posible separar de ellas el plasma donde se encuentran los anticuerpos que
constituyen el principio activo de los antivenenos.
Para evitar que este proceso de sangría produzca cuadros de anemia en los
animales empleados, cada paquete de glóbulos rojos es resuspendido en solución
salina y retransfundido al caballo respectivo. Finalmente los caballos son enviados al
campo, donde descansan y se recuperan antes de ser empleados nuevamente.
3) Purificación de los anticuerpos
Los anticuerpos son purificados adicionando ácido caprílico al plasma,
mediante una técnica que fue adaptado a la aplicación industrial por investigadores
de en 1994. En esta, la mayoría de las proteínas presentes en el plasma que no tienen
actividad neutralizante sobre la toxicidad del veneno, como son la albúmina y el
fibrinógeno, son precipitadas y posteriormente removidas por una serie de
filtraciones. El producto resultante es una solución estéril de anticuerpos equinos que
es formulada a pH fisiológico con preservantes y otros excipientes.
13
Dependiendo de las necesidades de los usuarios, los diferentes lotes de suero
pueden ser envasados para ser distribuidos en su forma líquida, o bien pueden ser
liofilizados para ser distribuidos en su forma seca, la cual es más estable en
condiciones de almacenamiento menos exigentes, pero requiere ser disuelto antes de
su uso, lo que retrasa algunos minutos su administración. Al Ecuador llegan una serie
de sueros antiofídicos entre los que se encuentran el polivalente, antibotrópico el p.
anticoral, el p. antibotrópico crotálico, el polivante antiobotrópico laquético,
producidos en Costa Rica; el antibotropico crotálico de México. El antibotrópico
laquético crotálico producido en Brasil y antibotrópico producido en Ecuador.
2.3.4. FRACCIONAMIENTO DEL VENENO:
Para los ensayos, el veneno cristalizado (disecado), fue reconstituido con una
solución de acetato de sodio 50mM pH 3, centrifugándolo por 10 minutos a 3000
r.p.m. antes de su uso. 100 mg de veneno cristalizado de B. hyoprorus fueron
diluidos en 1mL de solución de acetato de sodio 50mM pH 3, centrifugado por 10
minutos a 3000 r.p.m. y aplicado a una columna de 90 x 1.8 cm de gel Sephadex G-
100 Superfino (Pharmacia, Suecia), calibrada y eluída a temperatura ambiente con
buffer acetato de amonio 0.2M pH 8.4 a flujo constante de 6.3 mL/ hora. Las
fracciones diluidas (2.1mL/tubo) se colectaron en un colector de fracciones y la
absorbancia a 280nm fue registrada espectrofotométricamente.
La filtración en Sephadex G-50 Fino se realizó en una columna de 100 x 1.0
cm de gel Sephadex G-50 Fino (Pharmacia, Suecia), calibrada y eluida a temperatura
ambiente con buffer bicarbonato de amonio 200 mM pH 8.4 a flujo constante de 6.0
mL/ hora. Las fracciones eluidas (2.0 mL/tubo) se recogieron en un colector de
fracciones, registrándose su absorbancia a 280 nm.
2.3.5. DETERMINACIÓN DEL PESO MOLECULAR APARENTE:
El peso molecular aparente de las fracciones fue estimado mediante filtración
en gel Sephadex y electroforesis en gel de poliacrilamida:
14
a) Luego de la filtración en columna de gel Sephadex G-100 s.f. se grafica el
logaritmo del peso molecular de las fracciones eluídas versus la constante de
distribución (Kav=Vi/Vo) de las fracciones y estándares proteicos de peso
molecular conocido: Azul de dextrano (2000 Kd, Pharmacia), Albúmina Sérica
Bovina (66 Kd, Sigma), Anhidrasa Carbónica (29 Kd, Sigma), Citocromo C
(12.4Kd, Sigma) y Aprotinina (6.5 Kd, Sigma).
b) Electroforesis en gel de Poliacrilamida en condiciones desnaturalizante S26
(SDS-PAGE). Se empleó geles verticales de SDS-PAGE al 14% en buffer Tris-
Glicina (0.25M-1.92M, SDS 1%) bajo corriente constante de 13 mA durante 5
horas. Se utilizó estándares similares a los descritos para la técnica de filtración
en gel.
2.3.6. ISOELECTRO ENFOQUE:
Para la determinación del punto isoeléctrico de las fracciones se utilizó la
metodología empleada por Berheimer, Weinstein y Linder. Para detectar la presencia
de la actividad de Fosfolipasa y su punto isoeléctrico se vertió sobre el gel una
suspensión de agarosa-yema de huevo la cual se gelifica y luego se incuba la placa a
50°C. El aclaramiento de la suspensión de yema de huevo, confirma la presencia de
Fosfolipasa.
2.3.7. ACTIVIDAD HEMOLÍTICA:
La actividad hemolítica del veneno fue ensayada en eritrocitos humanos
lavados obtenidos de donadores O Rh positivos y mantenidos en suspensión con
tampón glicina -NaCl (glicina 0.1 M en cloruro de sodio al 0.6%) a pH 5.8. La
actividad hemolítica directa e indirecta fue evaluada en tubo y en placa
respectivamente, por los métodos siguientes:
a) Hemólisis en tubo
En forma similar al utilizado por Martínez, Bonilla & Zavaleta (1989) para
veneno de B. barnetti, determinando la cantidad de hemoglobina liberada mediante
15
la técnica de la cianometahemoglobina que emplea el reactivo de Drabkin. La
actividad hemolítica se expresó como Unidad Específica de Hemólisis Directa
(U.E.H.D,) o Indirecta (U.E.H.I.) según sea el caso:
UEHD = % de Hemólisis directa
mg Proteína
UEHI = % de Hemólisis indirecta
mg Proteína
% Hemólisis = __ HL___
HT x 100
Donde : HL = Hb liberada por tratamiento
HT = Hb Total (con Tritón X-100)
i. Hemólisis directa en tubos conteniendo 0.2 mL de eritrocitos lavados y 1.6 ml
de buffer glicina-NaCl a los que se adicionó en un ensayo típico, 0.2 ml de
solución de veneno (9.4-564 µg/ml), y se incubó por 20 minutos a 37°C, luego de
los cuales se procedió a centrifugar la suspensión a 1000 r.p.m. durante 20
minutos, cuantificándose la hemoglobina liberada en el sobrenadante. El efecto
del tiempo de incubación sobre la hemólisis directa fue estudiado para tiempos de
incubación de hasta 2 horas.
ii. Hemólisis indirecta (método de Grassmann y Hanning . Una mezcla de veneno
(0.5 mL, 18.8-94 µg/mL) y 0.5 mL de suspensión de yema de huevo al 6.4% en
buffer Tris-HCl 50 mM pH 7.5 se preincuban a 37°C durante 30 minutos, 0.2 mL
del hidrolizado obtenido es ensayado en el sistema de hemólisis indirecta
incubando la mezcla a 37°C por 1 hora, al cabo de los cuales se centrifuga la
mezcla y se mide la hemoglobina liberada en el sobrenadante. El efecto del
tiempo de incubación sobre la hemólisis indirecta fue estudiado para, tiempos de
incubación de 30 minutos a 2 horas.
16
b) Hemólisis en placa de agar
i. Hemólisis directa en placa: Las placas se preparan mezclando partes iguales de
agar SIGMA tipo I de baja electroendósmosis al 1% y agar DIFCO de alta
electroendósmosis al 1% preparados en buffer acetato de sodio 0.05 M a pH 7.5 y
adicionando 2 ml de eritrocitos lavados a 40°C.
Luego de homogenizar la mezcla, se reparte en placas de vidrio de 10 x 10 cm, y
luego de la gelificación se practican agujeros de 3 mm de diámetro en el gel para
adicionar el veneno (9.4-94 µg/ml). Las placas conteniendo veneno y control
salino, se incubaron a 37°C, por períodos variables de tiempo (0-120 minutos),
midiéndose a continuación el diámetro (mm) del halo producido con un Vernier.
ii. Hemólisis indirecta en placa: Se empleó el método de agar yema de huevo-
eritocitos modificado por Da Silva, preparada agregando 1ml de suspensión de
yema de huevo al 85% en acetato de amonio 100 mM pH 7.4 al agar base a 50°C,
y luego de llevar a temperatura de 45°C y se agregó 1 ml de eritrocitos lavados.
Procediéndose a homogenizar la mezcla, y repartirla en placas de vidrio de 10 x
10 cm. Se deja gelificar y se practicaron agujeros de 3 mm de diámetro en el gel,
para adicionar el veneno (9.4-94 µg/ml). Las placas conteniendo veneno y control
salino, se incubaron a 37°C, por períodos variables de tiempo (15-120 minutos),
midiéndose a continuación con un Vernier, el diámetro (mm) del halo.
La actividad hemolítica directa e indirecta en placa se expresa como Unidad
Hemolítica Directa (UHD) ó Indirecta (UHI) según sea el caso:
UHD = Diámetro de Hemólisis directa (mm)
hora x mg .de Proteína
UHI = Diámetro de Hemolisis indirecta (mm)
hora x mg .de Proteína
17
2.3.8. ACTIVIDAD DE FOSFOLIPASA A2:
La actividad es determinada por la disminución de la turbidez de una
suspensión de yema de huevo por acción de la Fosfolipasa sobre la lecitina de la
yema, cuantificada a 925 nm.
La actividad fosfolipásica se evaluó en dos sistemas: en tubo y en placa.
a) En tubo (método turbidimétrico de Marinetti) . Se incubó 100µL de veneno
(18.8-94 µg/mL) con 200 µl, de una suspensión de yema de huevo al 5% (60 a
70% de lecitina correspondientes a 0.6 unidades de absorbancia a 925 nm) en
buffer Tris-HCI 50 mM a pH 7.5 y 800 µL de NaCl 0.85%. Se estudió el efecto
del tiempo de incubación (0 a 2 horas), sobre la actividad fosfolipásica del
veneno. Una Unidad de actividad específica de Fosfolipasa (UEF), se expresa
como la cantidad de enzima capaz de producir la disminución de la turbidez de la
mezcla en una miliunidad de absorbancia a 925 nm, por minuto.
UEF = ___ UF ___
mg de Proteína
Siendo:
UR = (Abs. 0'-Abs. 10') x 1000
tiempo (10 minutos)
UF corresponde a unidades de Fosfolipasa
b) En placa, se empleó el método de Habermann y Hardt [30] que mide la
formación de un halo claro producto de la hidrólisis de la lecitina por la
Fosfolipasa. La placa de agar yema de huevo es preparada agregando 1mL de
suspensión de yema de huevo al 85% en acetato de amonio 100 mM pH 7.4, al
agar base a 50°C. Luego se homogeniza la mezcla y se reparte en las placas.
Después de la gelificación se practican agujeros de 3 mm de diámetro para
adicionar el veneno (9.4-94 µg/ml) o salino como control.
18
Las placas conteniendo veneno y control salino, se incubaron a 37°C, por
períodos variables de tiempo (15-120 minutos), midiéndose a continuación con un
Vernier, el diámetro (mm) del halo. La enzima Fosfolipasa A de Páncreas Porcino
(SIGMA P-6534) con actividad de 14500 unidades/mL (Una unidad hidroliza
1uM de L-a-fosfatidilcolina de soya hasta L-a-lisofosfatidilcolina y ácido graso
por minuto a pH 8.0 y 37°C fue empleada como estándar.
Para la evaluación de los resultados en placa se aplicó análisis de regresión
lineal, considerándose como válidas aquellas concentraciones en donde el
coeficiente de regresión r fue igual o superior a 0.99. Una unidad de actividad
fosfolipásica (UF) en placa se expresa como la cantidad de proteína capaz de lisar
1 mm. de gel en 1 hora de incubación y se determino mediante la fórmula:
UF = Diámetro de Hidrólisis (mm) x hora
mg de Proteína
2.3.9. CITOTOXICIDAD
La acción citotóxica del veneno de B. hyoprorus se estudió en macrófagos
peritoneales de ratón de la cepa BALB/c extraídos inoculando 3 ml de MEM (Medio
Esencial Mínimo) en la cavidad peritoneal. El líquido peritoneal es extraído y los
macrófagos se adhieren en laminillas cubreobjetos las que son posteriormente
mantenidas en MEM con Suero Fetal Bovino al 13% e incubadas en atmósfera
húmeda a 37°C y 5% de CO2 hasta su uso.
El efecto citotóxico, se determinó observando al microscopio de fluorescencia
las laminillas previamente tratadas con 3 ml de NaCl 0.85% conteniendo 10 ug/ml de
diacetato de Fluoresceina, 120 µg/ml de Bromuro de etidio y 20ug/ml de Naranja de
acridina, a 24°C. Las células vivas se colorean de verde y las muertas lo hacen de
color rojo, tomándose como parámetro cualitativo de observación: Leve (redondeo
celular, +), Moderado (desprendimiento celular, ++) y Severo, (muerte celular, +++).
Para la evaluación de la citotoxicidad directa, se incubaron durante 15 minutos
los macrófagos con MEM conteniendo veneno o fracción (50-100µg/mL), y para la
19
citotoxicidad mediada por sustrato, se incubaron por 15 minutos en MEM los
macrófagos, el veneno o fracción (50-100mg/mL) y 0.5mL de suspensión de yema
de huevo al 6% en NaCl 0.85%. Para la evaluación de la citotoxicidad indirecta, se
preincubó MEM conteniendo veneno o fracción (50-100 mg/mL) y 0.5 mL de
suspensión de yema de huevo al 6% en NaCl 0.85% por 30minutos a 50°C; Luego la
mezcla fue agregada a los macrófagos e incubados por 15 minutos.
2.4. INMUNIZACIÓN EN CONEJOS:
Se inmunizaron dos conejos Nueva Zelanda (machos de 1.5 Kg), empleando
dosis de 0.1 ml de veneno (10mg/ml), según el esquema mostrado en la Tabla 1.
TABLA N° 1 Esquema de inmunización para veneno de B. hyoprorus y sus
fracciones en conejos.
Dosis Día de
inmunización
Veneno o fracción
(ml)
NaCl 0.85%
(ml)
Adyuvante de
Freund (ml)
1
2
3
4
Sangría
1
5
9
13
22
0.1
0.1
0.1
0.1
tt
-----
-----
-----
0.5
tt
0.5 (completo)
0.5 (incompleto)
0.5 (completo)
----
tt
La presencia o ausencia de anticuerpos en el suero de conejo inoculado con
veneno fue evaluada empleando la técnica de inmunodifusión radial en gel de
Ouchterlony. Para la inmunodifusión se empleó Agarosa Tipo II-Low (Sigma) al 1%
en buffer barbital (Sigma) a pH 8.6 con un diseño de un pozo central y 6 periféricos
equidistantes. En el pozo central se colocó el suero obtenido experimentalmente ó el
suero comercial antibotrópico polivalente nacional (INS/MINSA, Perú) y en los
restantes, el veneno control y las fracciones obtenidas de la purificación dejándose
difundir las muestras durante 48 horas a 4°C. A continuación las placas se tiñeron
con 0.1% Coomassie Blue 250-R (Sigma), y se decoloró en una solución 5:5:2 (v/v)
de metanol, agua destilada y ácido acético glacial.
20
2.5. APLICACIÓN DE TRATAMIENTO
Una vez inoculado el veneno se dejará pasar de 2 a 3 horas, puesto que es el
tiempo aproximado mínimo en que el paciente recibe atención, ya que si se aplica
tratamiento inmediato, influenciará en los resultados, se necesita dejar tiempo para
que actúe el veneno.
2.5.1. SEGUIMIENTO DEL TRATAMIENTO
Se hace un seguimiento intensivo por 36 horas posteriores a la inoculación del
veneno, observando signos y síntomas.
2.5.2. RECOLECCIÓN DE DATOS
Se recogen en cartillas de apuntes y en las tablas respectivas y básicamente re
refiere a síntomas y signos clínicos.
2.5.3. EVALUACIÓN DE ENSAYOS Y DE CRITERIOS DE EVALUACIÓN
Se determinarán los parámetros y frecuencia de los criterios de evaluación, las
cuales no se presentan en el presente informe, se las reserva para una vez sustentada
la tesis y se obtengan todos los datos pertinentes para su comprobación. Los métodos
se refieren básicamente al estadístico en la representación de gráficos, tablas y
curvas.
21
III. HIPÓTESIS DE LA INVESTIGACIÓN
Hi.- los lotes de venenos de más de un año de almacenamiento no son aptos
para la elaboración de sueros antiofídicos.
Ho.- los lotes de venenos de más de un año de almacenamiento son aptos
para la elaboración de sueros antiofídicos.
22
IV TODOS
4.1. LOCALIZACIÓN DE LA INVESTIGACIÓN
Los ensayos se realizaron en el serpentario de los laboratorios de salud animal del
Instituto Nacional de Higiene y Medicina Tropical ´´Leopoldo Izquieta Pérez´´
Dirección: Av. De las Américas y Juan Tanca Marengo
Parroquia: Tarqui
Cantón: Guayaquil
Provincia: Guayas
Republica: Ecuador -Sur-América.
4.1.1. COORDENADAS:
Latitud Sur 02 ongitud este
4.2. CONDICIONES METEOROLÓGICAS
- Altura promedio: 4 m.s.n.m.
- Precipitación pluvial: 900 – 1000 mm / ano
- Características meteorológicas:
- Humedad atmosférica: 75%
- Temperatura máxima absoluta: 36 ºC
- Temperatura media anual: 25 ºC
- Temperatura mínima absoluta: 18 ºC
- Evaporación: 120 – 150 mm / mes.
Fuente: INOCAR
23
4.3. MATERIALES
4.3.1. MATERIALES BIOLÓGICOS
- Lotes de veneno Bothrópico desecado y cristalizado.
- Ratones blancos de 16 – 18 g.
4.3.2. MATERIALES QUÍMICOS
- Alcohol
- Solución salina fisiológica.
4.3.3. INTRUMENTAL Y EQUIPOS
- Balanza gramera
- Balanza de precisión de tres dígitos
- Cajas plásticas para ratones
- bebederos
- Aserrín o Viruta
- Alimento balanceado
- Algodón
- Espátula
- Mandil
- Guantes
- Mascarillas
- Gorros
- Jeringuillas descartables de 1 ml
4.3.4. MATERIALES DE VIDRIO
- Pipetas de 10 – 5 – 1 ml
- frasco de vidrio de 50 ml
- Campana al vacío
24
4.3.5. MATERIAL DE OFICINA.
- Computadora
- Cuaderno de Apunte
- Esferográficos
- Calculadora
- Regla transparente de 30 cm
- Hojas semi logarítmicas
4.4. TODOS
En esta investigación se utilizaron 15 lotes de venenos Bothrópicos de las
especies B. asper, B. atrox y B. xanthogramma con más de un ano de
almacenamiento y ratones albinos de 3 – 4 semanas de edad de un peso de 16 – 18 g,
para poder establecer la dosis letal media (DL 50), de acuerdo a la siguiente
metodología de trabajo, denominada prueba de titulación en ratones.
4.4.1. RECOLECCIÓN DEL VENENO
Se obtiene de lotes de veneno de más de un año de almacenamiento, los cuales
se encuentran desecados al vacío y almacenados al medio ambiente en el serpentario
de nstituto ion de Higiene y edi in ropi “ eopo do zquiet érez”
4.4.2. PESAJE DEL VENENO
El veneno se lo pesó en una balanza de precisión de tres dígitos y se lo
procedió a colocar en frasco de vidrio x 50 ml previamente identificado.
4.4.3. PESAJE DE LOS RATONES
Los ratones se los pesan en una balanza gramera, deben de tener un peso de 16-
18 g y se los coloca en una caja plástica con sus respectivos bebederos y balanceados
25
4.4.4. OBTENCIÓN DE LA DL 50
Para la determinación de la DL 50 se procede de la siguiente manera:
1. Al veneno seco se lo disuelve en una solución salina fisiológica al 0,89% que
contenga 1000 µg de veneno por cada ml.
2. Se prepara 5 ml de la solución que contiene la cantidad de veneno en µg
necesaria para inocular a 10 ratones.
3. Una vez que hemos realizado las diluciones con las diferentes concentraciones de
veneno, procederemos a la inoculación por vía intraperitoneal 0,5 ml.
4. Los ratones se los deja con suficiente agua y comida en sus cajas debidamente
identificadas y se observaron hasta 48 horas, anotando los muertos durante este
periodo.
5. Finalmente calculamos la DL 50 por método gráfico directo, en base a porcentaje
de mortalidad y próbito.
En los ensayos previos a la dosificación de la DL 50 de una toxina o veneno, debe
calcularse el porcentaje de mortalidad que corresponde a cada una de las dosis
empleadas en el experimento. Se empleó la tabla para obtener los próbitos con el fin
de transformar una curva sigmoide en una línea recta para cada porcentaje de
mortalidad, debiendo buscar el próbito correspondiente de acuerdo a la cantidad de
animales usados por dosis inoculadas.
Con estos datos trazamos un gráfico en una hoja semilogarítmica, colocando en la
escala logarítmica la dosis inoculada y en la escala milimétrica el próbito
correspondiente. Trazando la línea recta que se adapte lo mejor posible a los puntos
encontrados, debe calcularse la DL 50, proyectando la dosis que corresponde al
próbito 5 (50%) de mortalidad, que indica donde esta la DL 50 correspondiente.
4.5. ANÁLISIS ESTADÍSTICO
Para el análisis estadístico de los resultados obtenidos, se determinó la desviación
estándar de los lotes de venenos analizados, bajo la siguiente formula:
26
V. RESULTADOS
De los 15 lotes de venenos Bothrópicos analizados, se determinó las variaciones de
la dosis letal media (DL 50) de acuerdo al tiempo de almacenamiento; y se estableció
la dosis letal media (DL 50) de acuerdo al género de las serpientes bajo estudio.
5.1 VARIACIONES DE LA DOSIS LETAL MEDIA (DL 50) DE
ACUERDO AL TIEMPO DE ALMACENAMIENTO
Las variaciones de la dosis letal de acuerdo al tiempo de almacenamiento, están
representadas por la desviación estándar global, por género y por año
almacenamiento. De igual manera se específica el porcentaje de incremento anual de
cada uno de los lotes de venenos analizados.
5.1.1 DESVIACION ESTÁNDAR DE LA DOSIS LETAL (DL50)
Según el periodo de 7 años de almacenamiento de los lotes de venenos analizados, se
encontró una desviación estándar global de ±15,26 µg (Gráfico 1), para la dosis letal
(DL 50). De acuerdo a la especie la desviación estándar para el B. asper es de ±9,79
µg, para el B. atrox ±4,07 µg y para el B. xanthogramma ±21,42 µg. (Gráfico 1).
Las fluctuaciones de acuerdo a la especie de serpientes bajo estudio varían,
mostrándose así para el género Bothrops asper una desviación de ±9,79 µg (Gráfico
2), en el género Bothrops atrox ±4,07 µg (Gráfico 3), y para el género Bothrops
xanthogramma ±21,42 µg. Los resultados muestran claramente que el mayor
porcentaje de desviación se encuentra en la especie B. xanthogramma y el menor
corresponde a B. atrox (Gráfico 4).
Los valores más altos de desviación de acuerdo a los años de almacenamiento se
registran en el género B. xanthogramma con ±16,22 µg, ±16,78 µg y ±19,47 µg a
los 5, 4 y 3 años de almacenamiento respectivamente (Gráfico 2).
27
Consecuentemente la tendencia mínima de desviación para la dosis letal (DL 50) se
presenta el género B. atrox, con ±6,27 µg a los 5 años, ±7,83 µg a los 4 años y ±5,66
µg a los 3 años de almacenamiento. (Grafico 2). El cuadro 1 y 2 muestran la
desviación estándar en la dosis letal de los lotes de veneno por género y por años de
almacenamiento.
CUADRO 1. DESVIACIÓN ESTÁNDAR DE LA DOSIS LETAL EN LOTES
DE VENENOS DEL GÉNERO Bothrops
Especies N° de lotes Media Desviación Estándar
B. asper 5 98,00 µg ±9,79 µg
B. atrox 4 109,50 µg ±4,07 µg
B. xanthogramma 6 98,67 µg ±21,42 µg
Global 101,30 µg ±15,26 µg
GRÁFICO 1. DESVIACIÓN ESTÁNDAR DE LA DOSIS LETAL EN LOTES
DE VENENOS DEL GÉNERO Bothrops
28
CUADRO 2. DESVIA I N ESTÁNDAR DE LA DOSIS LETAL EN LOTES
DE VENENO DEL GÉNERO Bothrops POR AÑOS DE
ALMACENAMIENTO
Años de
almacenamiento
Desviación Estándar
B. asper B. atrox B. xanthogramma
5 años 10,91 µg 6,27 µg 16,22 µg
4 años 11,63 µg 7,83 µg 16,78 µg
3 años 14,09 µg 5,66 µg 19,47 µg
GRÁFI O . DESVIA I N ESTÁNDAR DE LA DOSIS LETAL EN LOTES
DE VENENO DEL GENERO Bothrops POR AÑOS DE
ALMACENAMIENTO
5.1.2 PORCENTAJE DE INCREMENTO DE LA DOSIS LETAL (DL 50)
POR AÑOS DE ALMACENAMIENTO
En el porcentaje de incremento de la dosis letal por año de almacenamiento, se puede
observar que los índices más altos a los 2 y 4 años, se presentan en B. asper con
82,5%, y 62,5% respectivamente. A los 3 y 7 años de almacenamiento los mayores
incrementos corresponden a B. xanthogramma con 53,7% y 144,3% en su orden. Y
29
a los 5 y 6 años los porcentajes más elevados se encuentran en B. atrox con 39,1% y
91,5% (Gráfico3). El cuadro 3 muestra los valores correspondientes al incremento de
dosis letal por año almacenamiento.
CUADRO 3. INCREMENTO DE LA DOSIS LETAL EN LOTES DE VENENO
DEL GÉNERO Bothrops POR AÑOS DE ALMACENAMIENTO
Género Años de almacenamiento
2 años 3 años 4 años 5 años 6 años 7 años
B. asper 82,5% 42,2% 62,5% 16,7%
112,2%
B. atrox
31,6% 49,3% 39,1% 91,5%
B. xanthogramma 4,4% 53,7% 41,7% 11,0% 58,3% 144,3%
30
GRÁFICO 3. INCREMENTO DE LA DOSIS LETAL EN LOTES DE VENENO DEL GÉNERO Bothrops POR AÑOS DE
ALMACENAMIENTO
31
5.2 DOSIS LETAL MEDIA (DL 50) EN LOTES DE VENENO DE
SERPIENTES Bothrops
Se determinó la dosis letal media en 15 lotes de veneno Bothrops, y a la vez se
calculó el incremento porcentual para B. asper, atrox y xanthogramma, de cada
dosis prestablecida para los resultados obtenidos en las dos pruebas bajo estudio. Las
tendencias de incremento varían de acuerdo a la especie y a la cantidad de veneno.
5.2.1 INCREMENTO PORCENTUAL DE LA DOSIS LETAL MEDIA (DL
50) PREESTABLECIDA EN LOTES DE VENENO Bothrops POR
ESPECIE
El incremento porcentual de la dosis letal media en los 5 lotes analizados de B.
asper, determinó que la DL 78 µg presenta el menor índice porcentual, con valores
de 17,95% y 15,38% en las 2 pruebas realizadas. Por otra parte el mayor aumento de
porcentajes se encontró en la DL 45 con el 117,78% y 106,67% en las pruebas
correspondientes, lo que demuestra una tendencia de duplicación de la frecuencia de
la dosis establecida. (Gráfico 4). El cuadro 4 muestra el incremento porcentual de las
dosis letales establecidas en los 5 lotes de veneno B. asper bajo estudio.
Para B. atrox se determinó que el mayor incremento porcentual en los 4 lotes
analizados se encuentra en la dosis letal (50) 59 µg con el 89,8% y 93,2%, donde la
dosis calculada supera la establecida por encima de la mitad de la misma. El menor
ascenso en cambio, se presentó en la DL (50) 76 µg con el 36,8% y 26,3% (Gráfico
5). El cuadro 5 presenta el incremento porcentual de las dosis letales establecidas en
los 4 lotes de veneno B. atrox.
En B. xanthogramma se encontró que en los 6 lotes de venenos analizados la dosis
letal (50) 53 µg mostró los mayores índices porcentuales con el 145,3% y 143,4%,
duplicando la frecuencia de la dosis establecida y bordeando una mitad adicional de
la misma. Los menores incrementos se presentaron en la DL (50) 68 µg con
porcentajes de 2,9% y 5,9%. (Gráfico 6). El cuadro 6 presenta el incremento
porcentual de las dosis letales establecidas en los 6 lotes de veneno B.
xanthogramma.
32
CUADRO 4. INCREMENTO PORCENTUAL DE LAS DOSIS LETALES ESTABLECIDAS EN LOTES DE VENENO B.
asper
CUADRO 5. INCREMENTO PORCENTUAL DE LAS DOSIS LETALES ESTABLECIDAS EN LOTES DE VENENO B. atrox
CUADRO 6. INCREMENTO PORCENTUAL DE LAS DOSIS LETALES ESTABLECIDAS EN LOTES DE VENENO B.
xanthogramma
# Prueba DL (50) - 63 µg DL (50) - 64 µg DL (50) - 60µg DL (50) - 78µg DL (50) - 45µg
DL (50) Incremt. % DL (50) Incremt. % DL (50) Incremt. % DL (50) Incremt. % DL (50) Incremt. %
Prueba 1 114 µg 80,95% 88 µg 37,50% 102 µg 70,00% 92 µg 17,95% 98 µg 117,78%
Prueba 2 116 µg 84,13% 94 µg 46,88% 93 µg 55,00% 90 µg 15,38% 93 µg 106,67%
Media 115 µg 82,54% 91 µg 42,19% 97,5 µg 62,50% 91 µg 16,67% 95,5 µg 112,22%
# Prueba DL (50) - 76µg DL (50) - 75µg DL (50) - 78µg DL (50) - 59µg
DL (50) Incremt. % DL (50) Incremt. % DL (50) Incremt. % DL (50) Incremt. %
Prueba 1 104 µg 36,84% 114 µg 52,00% 110 µg 41,03% 92 µg 89,83%
Prueba 2 96 µg 26,32% 110 µg 46,67% 107 µg 37,18% 90 µg 93,22%
Media 100 µg 31,58% 112 µg 49,33% 108,5 µg 39,10% 91 µg 91,53%
#
Prueba
DL (50) - 68µg DL (50) - 68µg DL (50) - 72µg DL (50) - 68µg DL (50) - 72µg DL (50) - 53µg
DL (50) Incremt. % DL (50) Incremt. % DL (50) Incremt. % DL (50) Incremt. % DL (50) Incremt. % DL (50) Incremt. %
Prueba 1 70 µg 2,94% 102 µg 50,00% 102 µg 41,67% 76 µg 11,76% 116 µg 61,11% 130 µg 145,28%
Prueba 2 72 µg 5,88% 107 µg 57,35% 102 µg 41,67% 75 µg 10,29% 112 µg 55,56% 129 µg 143,40%
Media 71 µg 4,41% 104,5 53,68% 102 µg 41,67% 75,5 µg 11,03% 114 µg 58,33% 129,5 µg 144,34%
33
GRÁFICO 4. INCREMENTO PORCENTUAL DE LAS DOSIS LETALES
ESTABLECIDAS EN LOTES DE VENENO B. asper
GRÁFICO 4. INCREMENTO PORCENTUAL DE LAS DOSIS LETALES
ESTABLECIDAS EN LOTES DE VENENO B. atrox
GRÁFICO 4. INCREMENTO PORCENTUAL DE LAS DOSIS LETALES
ESTABLECIDAS EN LOTES DE VENENO B. xanthogramma
34
En la determinación de la dosis letal media mediante el estudio de la toxicidad, se
encontró que los 15 lotes de veneno Bothrops en las 2 pruebas realizadas, ninguno
presentó efectividad bajo la dosis prestablecida para la elaboración de sueros
antiofídicos. El cuadro 7 muestra los valores correspondientes a la dosis letal (DL50)
CUADRO 7. DOSIS LETAL MEDIA EN LOTES DE VENENO Bothrops
Lote Género
DL (50)
Registrada
Año de
Almacen.
N°
Prueba DL (50)
1 - LSas160104 B. asper 45 2004 1 98 µg
2 93 µg
2 - LSxt200104 B. xanthogramma 53 2004 1 130 µg
2 129 µg
3 - LSat240505 B. atrox 59 2005 1 112 µg
2 114 µg
4 - LSxt130505 B. xanthogramma 72 2005 1 116 µg
2 112 µg
5 - LSas170106 B. asper 78 2006 1 92 µg
2 90 µg
6 - LSas170106 B. atrox 78 2006 1 110 µg
2 107 µg
7 - LSxt170106 B. xanthogramma 68 2006 1 76 µg
2 75 µg
8 - LSas280807 B. asper 60 2007 1 102 µg
2 93 µg
9 - LSat300807 B. atrox 75 2007 1 114 µg
2 110 µg
10 - LSxt300807 B. xanthogramma 72 2007 1 102 µg
2 102 µg
11 - LSas020908 B. asper 64 2008 1 88 µg
2 94 µg
12 - LSat210808 B. atrox 76 2008 1 104 µg
2 96 µg
13 - LSxt090908 B. xanthogramma 68 2008 1 102 µg
2 107 µg
14 - LSas080909 B. asper 63 2009 1 114 µg
2 116 µg
15 - LSxt100909 B. xanthogramma 68 2009 1 70 µg
2 72 µg
Media 101,3 µg
Desviación estándar 15,26 µg
35
VI. DISCUSIÓN
Actualmente no existen estudios relacionados con la Toxicidad en lotes de venenos
Bothrops con más de un año de almacenamiento. Sin embargo existen reportes en
Colombia donde se realizó un estudio químico y de toxicidad del veneno de serpientes
de la familia VIPERIDAE: Bothrops atrox mantenidas en cautiverio en el serpentario
de la Universidad de la Amazonía con lotes de veneno seco y fresco expulsado, donde
se registraron valores de 66,2 µg para B. asper y de 70,34 µg para B. atrox, cifras que
coinciden y se asemejan con las prestablecidas en los lotes de veneno analizados.
Similares reportes descritos en la misma investigación detallan desviaciones estándar en
B. asper ± 0.4, notablemente inferior a la encontrada en 3 años almacenamiento en los
lotes analizados de B. atrox con 5,66 µg.
En investigaciones realizadas en Perú reportan una dosis letal con una desviación ± 1,7
para B. atrox, igualmente inferior al reportado en la presente tesis. En México reportan
una desviación del ± 0,2 para B. asper la cual está muy por debajo a la establecida a 2
años de almacenamiento-
Por periodos de almacenamiento fue notorio que el menor alcance de desviación
correspondió a B. atrox, siendo la cifras reportadas un 30% de lo que presentaron B.
asper y B. xanthogramma.
Los porcentajes de incremento de la dosis letal por años de almacenamiento se
presentaron de forma irregular, probablemente debido al método de conservación y a la
cantidad de veneno utilizado en cada muestra, ya que las dosis preestablecidas fueron
diferentes para cada caso. La tendencia irregular de incremento porcentual fue similar
para las dosis establecidas para B. asper, atrox y xanthogramma. Los elevados desfases
en las muestras analizados, determinaron la ineficacia de los lotes de veneno
almacenados para la elaboración de sueros antiofídicos, y a pesar de ello, la especia de
B. xanthogramma presento el menor índice porcentual de incremento a partir de los 2
años de almacenamiento con una dosis letal prestablecida de 68 µg.
36
VII. CONCLUSIONES
En base a los resultados se plantean las siguientes conclusiones:
1. En 7 años de almacenamiento de lotes de venenos bothrops se encuentra una
desviación estándar global de ±15,26 µg
2. B. asper presenta una desviación estándar de ±9,79 µg, B. atrox una desviación de
±4,07 µg y B. xanthogramma de ±21,42 µg
3. Los valores más altos de desviación de acuerdo a los años de almacenamiento se
registran en el género B. xanthogramma con ±16,22 µg, ±16,78 µg y ±19,47 µg a
los 5, 4 y 3 años de almacenamiento respectivamente.
4. El porcentaje de incremento de la dosis letal por año de almacenamientose encuentra
a los 2 y 4 años, B. asper con 82,5%, y 62,5% respectivamente. A los 3 y 7 años de
almacenamiento en B. xanthogramma con 53,7% y 144,3%. Y a los 5 y 6 años en
B. atrox con 39,1% y 91,5%
5. El mayor incremento porcentual de la dosis letal prestablecida se encontró en DL
(50) 45 con el 117,78% y 106,67% en B. asper, en DL (50) 59 µg con el 89,8% y
93,2% en B. atrox, y en DL (50) 68 µg con porcentajes de 2,9% y 5,9% en B.
xanthogramma.
6. Los lotes de venenos de serpientes Bothrops no son efectivos para elaborar los
sueros antiofídicos con el mismo efecto potencial bajo la dosis letal prestablecida.
37
VIII. RECOMENDACIONES
Luego de la investigación efectuada se puede indicar las siguientes recomendaciones:
- Realizar un estudio comparativo de esquemas de inmunización con venenos
frescos y venenos con más de un año almacenamiento.
- Realizar investigaciones que profundicen en la determinación de dosis letal
media (DL 50) con la aplicación de diferentes métodos y pruebas que respalden
la información obtenida.
- Realizar análisis cada 6 meses para comprobar el estado de los lotes de veneno
y la efectividad de los mismos.
- Proponer protocolos de estandarización para métodos, pruebas, almacenamiento
y utilización de los lotes de venenos, para evitar el manejo incorrecto de los
productos ofídicos.
- Recomendamos el uso de los venenos con mas de una año de almacenamiento
para el iniciar el esquema de inmunización de los equinos a fin de evitar los
efectos tóxicos colaterales que producen los venenos frescos, posteriormente se
completaría la inmunización con venenos frescos.
38
IX. RESUMEN
n e serpent rio de os or torios de s ud nim de “ nstituto ion de Higiene
y edi in ropi “ eopo do zquierd érez” de iud d u y qui se re iz ron
os ens yos p r re iz r e “ studio de oxi id d en otes de enenos de erpientes
Bothrops de más de un ño de m en miento” proponiendo omo o jetivos:
determinar las variaciones de la dosis letal media (DL 50) en lotes de veneno de
serpientes Bothrops de acuerdo al tiempo de almacenamiento y, establecer la dosis letal
letal media (DL 50) en lotes de venenos serpientes Bothrops de acuerdo al género.
Tomando como variable independiente: las tres serpientes Bothrops bajo estudio (B.
asper, B. atrox y B. xanthogramma) , y como variable independiente: El estudio de la
dosis letal media (DL 50).
Al efectuar los análisis de toxicidad de los 15 lotes de venenos de serpientes Bothrops
se pudo determinar que en los 7 años de almacenamiento registrados de los lotes, se
encuentra un desviación estándar global de ±15,26 µg. B. asper presentó una desviación
estándar de ±9,79 µg, B. atrox una desviación de ±4,07 µg y B. xanthogramma de
±21,42 µg. Los valores más altos de desviación de acuerdo a los años de
almacenamiento se registran en el género B. xanthogramma con ±16,22 µg, ±16,78 µg
y ±19,47 µg a los 5, 4 y 3 años de almacenamiento respectivamente.
El porcentaje de incremento de la dosis letal por año de almacenamiento se encontró a
los 2 y 4 años, B. asper con 82,5%, y 62,5% respectivamente. A los 3 y 7 años de
almacenamiento en B. xanthogramma con 53,7% y 144,3%. Y a los 5 y 6 años en B.
atrox con 39,1% y 91,5%. El mayor incremento porcentual de la dosis letal
prestablecida se encontró en DL (50) 45 con el 117,78% y 106,67% en B. asper, en DL
(50) 59 µg con el 89,8% y 93,2% en B. atrox, y en DL (50) 68 µg con porcentajes de
2,9% y 5,9% en B. xanthogramma.
De los resultados obtenidos se pudo confirmar la hip tesis “los lotes de venenos de más
de un año de almacenamiento no son aptos para la elaboración de sueros antiofídicos”
Palabras clave: Bothrops, B. asper, b. atrox, b. xanthogramma, DL50.
X. SUMMARY
39
The snake of animal health laboratories "National Institute of Hygiene and Tropical
Medicine" Leopoldo Perez Left "city Guayaquil, trials were conducted for the" Lots
Toxicity Study in Bothrops snake venoms from more than one storage year ', proposing
objectives: determine variations of the median lethal dose (LD 50) in batches of
Bothrops snake venom according to storage time and establish the median lethal lethal
dose (LD 50) in lots of poisons Bothrops snakes by gender. Taking as an independent
variable: the three Bothrops snakes under study (B. asper, B. atrox and B.
xanthogramma), and as independent variables: The study of the median lethal dose (LD
50).
Upon analysis of cytotoxicity of the 15 batches of Bothrops snake venoms it was
determined that in the 7 years registered storage of lots, there is a global standard
deviation ± 15.26 mg. B. asper showed a standard deviation of ± 9.79 mg, B. atrox
deviation of ± 4.07 mg and B. xanthogramma of ± 21.42 g. Higher values of deviation
according to years of storage are recorded in the genus with ± 16.22 mg B.
xanthogramma, ± 16.78 ± 19.47 g and g at 5, 4 and 3 years of storage respectively.
The percentage increase of the dose lethal by year of storage was found at 2 and 4 years,
B. asper with 82.5% and 62.5% respectively. At 3 and 7 years of storage in B.
xanthogramma with 53.7% and 144.3%. And at 5 and 6 years in B. atrox with 39.1%
and 91.5%. The greatest percentage increase of the preset lethal dose was found in DL
(50) 45 to 106.67% 117.78% and in B. asper, in DL (50) 59 mg with 89.8% and 93.2%
in B. atrox, and DL (50) 68 mg with rates of 2.9% and 5.9% in B. xanthogramma.
The results obtained confirm the hypothesis could be "lots of poisons over a year of
storage are not suitable for the development of antivenom"
Keywords: Bothrops, B. asper, B. atrox, B. xanthogramma, DL50.
XI. BIBLIOGRAFÍA
40
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Rabia organización mundial de la salud. Serie de monografías No. 23 Pág.
57
44
CUADRO # 1/1
PROTOCOLO DE DL50
Fecha: 23 de agosto del 2011
Nombre científico: Bothrops asper
Nombre común: Equis, equis rabo de hueso.
Lote de veneno: LSas170106 Cantidad de veneno usado: 25 mg.
DL50 INHMT: 78 µg.
Método: Directo
DL50: no se obtuvo por que no hubo 100% mortalidad
Observaciones: Se realizó la inoculación de las diferentes dosis de
venenos a ratones machos con un peso que oscilaba entre 16 – 18 g.
Veneno
inoculado I.P
# de
ratones
Mortalidad
24 H 48 H
V M V M
% de
Mortalidad
48 H
Próbito
50 µg 6 6 0 6 0 0% 2,48
60 µg 6 6 0 6 0 0% 2,48
70 µg 6 6 0 6 0 0% 2,48
80 µg 6 6 0 6 0 0% 2,48
90 µg 6 4 2 4 2 33,33% 4,57
100 µg 6 4 2 4 2 33,33% 4,57
Control 6 6 0 6 0 ----- -----
45
GRÁFICO # 1/1
GRÁFICO PARA TRANSFORMAR UNA CURVA SIGMOIDE DE
MORTALIDAD EN LINEA RECTA.
NOMBRE CIENTÍFICO: Bothrops asper
NOMBRE COMÚN: Equis, equis rabo de hueso.
LOTE DE VENENO: LSas170106
FECHA DE INOCULACIÓN: 23 de agosto del 2011
CANTIDAD TOTAL: 25 mg.
DL50: no se obtuvo por que no hubo 100% de
mortalidad
46
CUADRO # 1/2
PROTOCOLO DE DL50
Fecha: 12 de septiembre del 2011
Nombre científico: Bothrops asper
Nombre común: Equis, equis rabo de hueso.
Lote de veneno: LSas170106 Cantidad de veneno usado: 25 mg.
DL50 INHMT: 78 µg.
Método: Directo
DL50: 92 µg.
Observaciones: Se realizó la inoculación de las diferentes dosis de
venenos a ratones machos con un peso que oscilaba entre 16 – 18 g. En este
cuadro se repitió la prueba del cuadro # 1 aumentando la dosis para obtener
la DL50.
Veneno
inoculado I.P
# de
ratones
Mortalidad
24 H 48 H
V M V M
% de
Mortalidad
48 H
Próbito
60 µg 6 5 1 5 1 16,66% 4,06
80 µg 6 3 3 3 3 50% 5,01
100 µg 6 5 1 5 1 16,66% 4,57
120 µg 6 2 4 2 4 66,66% 5,45
140 µg 6 0 6 0 0 100% 8,5
160 µg 6 0 6 0 0 100% 8,5
Control 6 6 0 6 0 ----- -----
47
GRÁFICO # 1/2
GRÁFICO PARA TRANSFORMAR UNA CURVA SIGMOIDE DE
MORTALIDAD EN LINEA RECTA.
NOMBRE CIENTÍFICO: Bothrops asper
NOMBRE COMÚN: Equis, equis rabo de hueso.
LOTE DE VENENO: LSas170106
FECHA DE INOCULACION: 12de septiembre del 2011
CANTIDAD TOTAL: 25 mg.
DL50: 92 µg.
48
CUADRO # 1/3
PROTOCOLO DE DL50
Fecha: 2 de abril del 2012
Nombre científico: Bothrops asper
Nombre común: Equis, equis rabo de hueso.
Lote de veneno: LSas170106 Cantidad de veneno usado: 25 mg.
DL50 INHMT: 78 µg.
Método: Directo
DL50: 90 µg.
Observaciones: Se realizó la inoculación de las diferentes dosis de
venenos a ratones machos con un peso que oscilaba entre 16 – 18 g. En este
cuadro se repitió la prueba del cuadro # 1 aumentando la dosis para obtener
la DL50.
Veneno
inoculado I.P
# de
ratones
Mortalidad
24 H 48 H
V M V M
% de
Mortalidad
48 H
Próbito
60 µg 6 6 0 6 0 0% 2,48
80 µg 6 3 3 3 3 50% 5,01
100 µg 6 3 3 3 3 50% 5,01
120 µg 6 2 4 2 4 66,66% 5,45
140 µg 6 0 6 0 6 100% 8,5
160 µg 6 0 6 0 6 100% 8,5
Control 6 6 0 6 0 ----- -----
49
GRÁFICO # 1/3
GRÁFICO PARA TRANSFORMAR UNA CURVA SIGMOIDE DE
MORTALIDAD EN LINEA RECTA.
NOMBRE CIENTÍFICO: Bothrops asper
NOMBRE COMÚN: Equis, equis rabo de hueso.
LOTE DE VENENO: LSas170106
FECHA DE INOCULACION: 2 de mayo del 2012
CANTIDAD TOTAL: 25 mg.
\
DL50: 90 µg.
50
CUADRO # 2/1
PROTOCOLO DE DL50
Fecha: 30 de agosto del 2011
Nombre científico: Bothrops atrox
Nombre común: Pitalala, macanche.
Lote de veneno: LSat170106 Cantidad de veneno usado: 30 mg.
DL50 INHMT: 78 µg.
Método: Directo
DL50: no se obtuvo por que no hubo 100% mortalidad
Observaciones: Se realizó la inoculación de las diferentes dosis de
venenos a ratones machos con un peso que oscilaba entre 16 – 18 g.
Veneno
inoculado I.P
# de
ratones
Mortalidad
24 H 48 H
V M V M
% de
Mortalidad
48 H
Próbito
50 µg 6 6 0 6 0 0% 2,48
60 µg 6 6 0 6 0 0% 2,48
70 µg 6 6 0 6 0 0% 2,48
80 µg 6 6 0 6 0 0% 2,48
90 µg 6 6 0 6 0 0% 2,48
100 µg 6 6 0 6 0 0% 2,48
Control 6 6 0 6 0 ----- -----
51
GRÁFICO # 2/1
GRÁFICO PARA TRANSFORMAR UNA CURVA SIGMOIDE DE
MORTALIDAD EN LINEA RECTA.
NOMBRE CIENTÍFICO: Bothrops atrox
NOMBRE COMÚN: Pitalala, macanche.
LOTE DE VENENO: LSat170106
FECHA DE INOCULACION: 30 de agosto del 2011
CANTIDAD TOTAL: 30 mg.
DL50: no se obtuvo por que no hubo 100% de
mortalidad
52
CUADRO # 2/2
PROTOCOLO DE DL50
Fecha: 19 de septiembre del 2011
Nombre científico: Bothrops atrox
Nombre común: Pitalala, macanche.
Lote de veneno: LSat170106 Cantidad de veneno usado: 25 mg.
DL50 INHMT: 78 µg.
Método: Directo
DL50: 110 µg.
Observaciones: Se realizó la inoculación de las diferentes dosis de
venenos a ratones machos con un peso que oscilaba entre 16 – 18 g. En este
cuadro se repitió la prueba del cuadro # 2 aumentando la dosis para obtener
la DL50.
Veneno
inoculado I.P
# de
ratones
Mortalidad
24 H 48 H
V M V M
% de
Mortalidad
48 H
Próbito
60 µg 6 6 0 6 0 0% 2,48
80 µg 6 6 0 5 1 16,66% 4,06
100 µg 6 4 2 4 2 33,33% 4,57
120 µg 6 1 5 1 5 83,33% 5,97
140 µg 6 0 6 0 6 100% 8,5
160 µg 6 3 3 3 3 50% 5,01
Control 6 6 0 6 0 ----- -----
53
GRÁFICO # 2/2
GRÁFICO PARA TRANSFORMAR UNA CURVA SIGMOIDE DE
MORTALIDAD EN LINEA RECTA.
NOMBRE CIENTÍFICO: Bothrops atrox
NOMBRE COMÚN: Pitalala, macanche.
LOTE DE VENENO: LSat170106
FECHA DE INOCULACION: 19 de septiembre del 2011
CANTIDAD TOTAL: 25 mg.
DL50: 110 µg.
54
CUADRO # 2/3
PROTOCOLO DE DL50
Fecha: 9 de abril del 2012
Nombre científico: Bothrops atrox
Nombre común: Pitalala, macanche.
Lote de veneno: LSat170106 Cantidad de veneno usado: 25 mg.
DL50 INHMT: 78 µg.
Método: Directo
DL50: 107 µg.
Observaciones: Se realizó la inoculación de las diferentes dosis de
venenos a ratones machos con un peso que oscilaba entre 16 – 18 g. En este
cuadro se repitió la prueba del cuadro # 2 aumentando la dosis para obtener
la DL50.
Veneno
inoculado I.P
# de
ratones
Mortalidad
24 H 48 H
V M V M
% de
Mortalidad
48 H
Próbito
60 µg 6 6 0 6 0 0% 2,48
80 µg 6 5 1 5 1 16,66% 4,06
100 µg 6 3 3 3 3 50% 5,01
120 µg 6 4 2 4 2 33,33% 4,57
140 µg 6 0 6 0 6 100% 8,5
160 µg 6 0 6 0 6 100% 8,5
Control 6 6 0 6 0 ----- -----
55
GRÁFICO # 2/3
GRÁFICO PARA TRANSFORMAR UNA CURVA SIGMOIDE DE
MORTALIDAD EN LINEA RECTA.
NOMBRE CIENTÍFICO: Bothrops atrox
NOMBRE COMÚN: Pitalala, macanche.
LOTE DE VENENO: LSat170106
FECHA DE INOCULACION: 9 de mayo del 2012
CANTIDAD TOTAL: 25 mg.
DL50: 107 µg.
56
CUADRO # 3/1
PROTOCOLO DE DL50
Fecha: 6 de septiembre del 2011
Nombre científico: Bothrops xanthogramma
Nombre común: Equis pachona.
Lote de veneno: LSxt170106 Cantidad de veneno usado: 26 mg.
DL50 INHMT: 68 µg.
Método: Directo
DL50: 76 µg.
Observaciones: Se realizó la inoculación de las diferentes dosis de
venenos a ratones machos con un peso que oscilaba entre 16 – 18 g.
Veneno
inoculado I.P
# de
ratones
Mortalidad
24 H 48 H
V M V M
% de
Mortalidad
48 H
Próbito
50 µg 6 6 0 6 0 0% 2,48
60 µg 6 6 0 6 0 0% 2,48
70 µg 6 4 2 4 2 33,33% 4,57
80 µg 6 2 4 2 4 66,66% 5,45
90 µg 6 0 6 0 6 100% 8,5
100 µg 6 3 3 3 3 50% 5,01
Control 6 6 0 6 0 ----- -----
57
GRÁFICO # 3/1
GRÁFICO PARA TRANSFORMAR UNA CURVA SIGMOIDE DE
MORTALIDAD EN LINEA RECTA.
NOMBRE CIENTÍFICO: Bothrops xanthogramma
NOMBRE COMÚN: Equis pachona.
LOTE DE VENENO: LSxt170106
FECHA DE INOCULACION: 06 de septiembre 2011
CANTIDAD TOTAL: 26 mg.
DL50: 76 µg.
58
CUADRO # 3/2
PROTOCOLO DE DL50
Fecha: 26 de abril del 2012
Nombre científico: Bothrops xanthogramma
Nombre común: Equis pachona.
Lote de veneno: LSxt170106 Cantidad de veneno usado: 25 mg.
DL50 INHMT: 68 µg.
Método: Directo
DL50: 75 µg.
Observaciones: Se realizó la inoculación de las diferentes dosis de
venenos a ratones machos con un peso que oscilaba entre 16 – 18 g.
Veneno
inoculado I.P
# de
ratones
Mortalidad
24 H 48 H
V M V M
% de
Mortalidad
48 H
Próbito
50 µg 6 6 0 6 0 0% 2,48
60 µg 6 6 0 6 0 0% 2,48
70 µg 6 4 2 4 2 33,33% 4,57
80 µg 6 2 4 2 4 66,66% 5,45
90 µg 6 0 6 0 6 100% 8,5
100 µg 6 0 6 0 6 100% 8,5
Control 6 6 0 6 0 ----- -----
59
GRÁFICO # 3/2
GRÁFICO PARA TRANSFORMAR UNA CURVA SIGMOIDE DE
MORTALIDAD EN LINEA RECTA.
NOMBRE CIENTÍFICO: Bothrops xanthogramma
NOMBRE COMÚN: Equis pachona.
LOTE DE VENENO: LSxt170106
FECHA DE INOCULACION: 26 de marzo del 2012
CANTIDAD TOTAL: 25 mg.
DL50: 75 µg.
60
CUADRO # 4/1
PROTOCOLO DE DL50
Fecha: 26 de septiembre del 2011
Nombre científico: Bothrops asper
Nombre común: Equis, equis rabo de hueso.
Lote de veneno: LSas280807 Cantidad de veneno usado: 27 mg.
DL50 INHMT: 60 µg.
Método: Directo
DL50: 102 µg.
Observaciones: Se realizó la inoculación de las diferentes dosis de
venenos a ratones machos con un peso que oscilaba entre 16 – 18 g.
Veneno
inoculado I.P
# de
ratones
Mortalidad
24 H 48 H
V M V M
% de
Mortalidad
48 H
Próbito
60 µg 6 6 0 6 0 0% 2,48
80 µg 6 6 0 6 0 0% 2,48
100 µg 6 1 5 1 5 83,33% 5,97
120 µg 6 0 6 0 6 100% 8,5
140 µg 6 0 6 0 6 100% 8,5
160 µg 6 0 6 0 6 100% 8,5
Control 6 6 0 6 0 ----- -----
61
GRÁFICO # 4/1
GRÁFICO PARA TRANSFORMAR UNA CURVA SIGMOIDE DE
MORTALIDAD EN LINEA RECTA.
NOMBRE CIENTÍFICO: Bothrops asper
NOMBRE COMÚN: Equis, equis rabo de hueso.
LOTE DE VENENO: LSas280807
FECHA DE INOCULACIÓN: 26 de septiembre del 2011
CANTIDAD TOTAL: 27 mg.
DL50: 102 µg.
62
CUADRO # 4/2
PROTOCOLO DE DL50
Fecha: 16 de abril del 2012
Nombre científico: Bothrops asper
Nombre común: Equis, equis rabo de hueso.
Lote de veneno: LSas280807 Cantidad de veneno usado: 25 mg.
DL50 INHMT: 60 µg.
Método: Directo
DL50: 93 µg.
Observaciones: Se realizó la inoculación de las diferentes dosis de
venenos a ratones machos con un peso que oscilaba entre 16 – 18 g.
Veneno
inoculado I.P
# de
ratones
Mortalidad
24 H 48 H
V M V M
% de
Mortalidad
48 H
Próbito
60 µg 6 6 0 6 0 0% 2,48
80 µg 6 6 0 5 1 16,66% 4,06
100 µg 6 1 5 1 5 83,33% 5,97
120 µg 6 0 6 0 6 100% 8,5
140 µg 6 0 6 0 6 100% 8,5
160 µg 6 0 6 0 6 100% 8,5
Control 6 6 0 6 0 ----- -----
63
GRÁFICO # 4/2
GRÁFICO PARA TRANSFORMAR UNA CURVA SIGMOIDE DE
MORTALIDAD EN LINEA RECTA.
NOMBRE CIENTÍFICO: Bothrops asper
NOMBRE COMÚN: Equis, equis rabo de hueso.
LOTE DE VENENO: LSas280807
FECHA DE INOCULACION: 16 de mayo del 2012
CANTIDAD TOTAL: 25 mg.
DL50: 93 µg.
64
CUADRO # 5/1
PROTOCOLO DE DL50
Fecha: 11 de octubre del 2011
Nombre científico: Bothrops atrox
Nombre común: Pitalala, macanche.
Lote de veneno: LSat300807 Cantidad de veneno usado: 25 mg.
DL50 INHMT: 75 µg.
Método: Directo
DL50: 114 µg.
Observaciones: Se realizó la inoculación de las diferentes dosis de
venenos a ratones machos con un peso que oscilaba entre 16 – 18 g.
Veneno
inoculado I.P
# de
ratones
Mortalidad
24 H 48 H
V M V M
% de
Mortalidad
48 H
Próbito
60 µg 6 6 0 6 0 0% 2,48
80 µg 6 6 0 6 0 0% 2,48
100 µg 6 2 4 2 4 66,66% 5,45
120 µg 6 5 1 4 2 33,33% 4,57
140 µg 6 2 4 2 4 66,66% 5,45
160 µg 6 2 4 0 6 100% 8,5
Control 6 6 0 6 0 ----- -----
65
GRÁFICO # 5/1
GRÁFICO PARA TRANSFORMAR UNA CURVA SIGMOIDE DE
MORTALIDAD EN LINEA RECTA.
NOMBRE CIENTÍFICO: Bothrops atrox
NOMBRE COMÚN: Pitalala, macanche.
LOTE DE VENENO: LSat300807
FECHA DE INOCULACION: 11 de octubre del 2011
CANTIDAD TOTAL: 25 mg.
DL50: 114 µg.
66
CUADRO # 5/2
PROTOCOLO DE DL50
Fecha: 23 de abril del 2012
Nombre científico: Bothrops atrox
Nombre común: Pitalala, macanche.
Lote de veneno: LSat300807 Cantidad de veneno usado: 25 mg.
DL50 INHMT: 75 µg.
Método: Directo
DL50: 110 µg.
Observaciones: Se realizó la inoculación de las diferentes dosis de
venenos a ratones machos con un peso que oscilaba entre 16 – 18 g.
Veneno
inoculado I.P
# de
ratones
Mortalidad
24 H 48 H
V M V M
% de
Mortalidad
48 H
Próbito
60 µg 6 5 1 5 1 16,66% 4,06
80 µg 6 6 0 6 0 0% 2,48
100 µg 6 3 3 3 3 50% 5,01
120 µg 6 5 1 4 2 33,33% 4,57
140 µg 6 2 4 2 4 66,66% 5,45
160 µg 6 0 6 0 6 100% 8,5
Control 6 6 0 6 0 ----- -----
67
GRÁFICO # 5/2
GRÁFICO PARA TRANSFORMAR UNA CURVA SIGMOIDE DE
MORTALIDAD EN LINEA RECTA.
NOMBRE CIENTÍFICO: Bothrops atrox
NOMBRE COMÚN: Pitalala, macanche.
LOTE DE VENENO: LSat300807
FECHA DE INOCULACIÓN: 23 de abril del 2012
CANTIDAD TOTAL: 25 mg.
DL50: 110 µg.
68
CUADRO # 6/1
PROTOCOLO DE DL50
Fecha: 17 de octubre del 2011
Nombre científico: Bothrops xanthogramma
Nombre común: Equis pachona.
Lote de veneno: LSxt300809 Cantidad de veneno usado: 26 mg.
DL50 INHMT: 72 µg.
Método: Directo
DL50: 102 µg.
Observaciones: Se realizó la inoculación de las diferentes dosis de
venenos a ratones machos con un peso que oscilaba entre 16 – 18 g.
Veneno
inoculado I.P
# de
ratones
Mortalidad
24 H 48 H
V M V M
% de
Mortalidad
48 H
Próbito
60 µg 6 6 0 6 0 0% 2,48
80 µg 6 5 1 5 1 16,,66% 4,06
100 µg 6 3 3 3 3 50% 5,01
120 µg 6 2 4 2 4 66,66% 5,45
140 µg 6 0 6 0 6 100% 8,5
160 µg 6 0 6 0 6 100% 8,5
Control 6 6 0 6 0 ----- -----
69
GRÁFICO # 6/1
GRÁFICO PARA TRANSFORMAR UNA CURVA SIGMOIDE DE
MORTALIDAD EN LINEA RECTA.
NOMBRE CIENTÍFICO: Bothrops xanthogramma
NOMBRE COMÚN: Equis pachona.
LOTE DE VENENO: LSxt300809
FECHA DE INOCULACIÓN: 17 de octubre 2011
CANTIDAD TOTAL: 26 mg.
DL50: 102 µg.
70
CUADRO # 6/2
PROTOCOLO DE DL50
Fecha: 30 de abril del 2012
Nombre científico: Bothrops xanthogramma
Nombre común: Equis pachona.
Lote de veneno: LSxt300809 Cantidad de veneno usado: 25 mg.
DL50 INHMT: 72 µg.
Método: Directo
DL50: 102 µg.
Observaciones: Se realizó la inoculación de las diferentes dosis de
venenos a ratones machos con un peso que oscilaba entre 16 – 18 g.
Veneno
inoculado I.P
# de
ratones
Mortalidad
24 H 48 H
V M V M
% de
Mortalidad
48 H
Próbito
60 µg 6 6 0 6 0 0% 2,48
80 µg 6 5 1 5 1 16,,66% 4,06
100 µg 6 3 3 3 3 50% 5,01
120 µg 6 2 4 2 4 66,66% 5,45
140 µg 6 0 6 0 6 100% 8,5
160 µg 6 0 6 0 6 100% 8,5
Control 6 6 0 6 0 ----- -----
71
GRÁFICO # 6/2
GRÁFICO PARA TRANSFORMAR UNA CURVA SIGMOIDE DE
MORTALIDAD EN LINEA RECTA.
NOMBRE CIENTÍFICO: Bothrops xanthogramma
NOMBRE COMÚN: Equis pachona.
LOTE DE VENENO: LSxt300809
FECHA DE INOCULACIÓN: 30 de abril del 2012
CANTIDAD TOTAL: 25 mg.
DL50: 102 µg.
72
CUADRO # 7/1
PROTOCOLO DE DL50
Fecha: 24 de octubre del 2011
Nombre científico: Bothrops atrox
Nombre común: Pitalala, macanche.
Lote de veneno: LSat240505 Cantidad de veneno usado: 28 mg.
DL50 INHMT: 59 µg.
Método: Directo
DL50: 112 µg.
Observaciones: Se realizó la inoculación de las diferentes dosis de
venenos a ratones machos con un peso que oscilaba entre 16 – 18 g.
Veneno
inoculado I.P
# de
ratones
Mortalidad
24 H 48 H
V M V M
% de
Mortalidad
48 H
Próbito
60 µg 6 6 0 6 0 0% 2,48
80 µg 6 6 0 6 0 0% 2,48
100 µg 6 5 1 5 1 16,66% 4,06
120 µg 6 5 1 5 1 16,66% 4,57
140 µg 6 2 4 2 4 66,66% 5,45
160 µg 6 2 4 0 6 100% 8,5
Control 6 6 0 6 0 ----- -----
73
GRÁFICO # 7/1
GRÁFICO PARA TRANSFORMAR UNA CURVA SIGMOIDE DE
MORTALIDAD EN LINEA RECTA.
NOMBRE CIENTÍFICO: Bothrops atrox
NOMBRE COMÚN: Pitalala, macanche.
LOTE DE VENENO: LSat240505
FECHA DE INOCULACIÓN: 24 de octubre del 2011
CANTIDAD TOTAL: 28 mg.
DL50: 112 µg.
74
CUADRO # 7/2
PROTOCOLO DE DL50
Fecha: 7 de mayo del 2012
Nombre científico: Bothrops atrox
Nombre común: Pitalala, macanche.
Lote de veneno: LSat240505 Cantidad de veneno usado: 25 mg.
DL50 INHMT: 59 µg.
Método: Directo
DL50: 114 µg.
Observaciones: Se realizó la inoculación de las diferentes dosis de
venenos a ratones machos con un peso que oscilaba entre 16 – 18 g.
Veneno
inoculado I.P
# de
ratones
Mortalidad
24 H 48 H
V M V M
% de
Mortalidad
48 H
Próbito
60 µg 6 6 0 5 1 16,66% 4,06
80 µg 6 6 0 6 0 0% 2,48
100 µg 6 4 2 4 2 33,33% 4,57
120 µg 6 5 1 5 1 16,66% 4,06
140 µg 6 2 4 2 4 66,66% 5,45
160 µg 6 0 6 0 6 100% 8,5
Control 6 6 0 6 0 ----- -----
75
GRÁFICO # 7/2
GRÁFICO PARA TRANSFORMAR UNA CURVA SIGMOIDE DE
MORTALIDAD EN LINEA RECTA.
NOMBRE CIENTÍFICO: Bothrops atrox
NOMBRE COMÚN: Pitalala, macanche.
LOTE DE VENENO: LSat240505
FECHA DE INOCULACION: 7 de mayo del 2012
CANTIDAD TOTAL: 25 mg.
DL50: 114 µg.
76
CUADRO # 8/1
PROTOCOLO DE DL50
Fecha: 7 de noviembre del 2011
Nombre científico: Bothrops xanthogramma
Nombre común: Equis pachona.
Lote de veneno: LSxt130505 Cantidad de veneno usado: 26 mg.
DL50 INHMT: 72 µg.
Método: Directo
DL50: 116 µg.
Observaciones: Se realizó la inoculación de las diferentes dosis de
venenos a ratones machos con un peso que oscilaba entre 16 – 18 g.
Veneno
inoculado I.P
# de
ratones
Mortalidad
24 H 48 H
V M V M
% de
Mortalidad
48 H
Próbito
60 µg 6 6 0 6 0 0% 2,48
80 µg 6 6 0 6 0 0% 2,48
100 µg 6 5 1 5 1 16,66% 4,06
120 µg 6 4 2 4 2 33,33% 4,57
140 µg 6 0 6 0 6 100% 8,5
160 µg 6 3 3 2 4 66,66% 5,45
Control 6 6 0 6 0 ----- -----
77
GRÁFICO # 8/1
GRÁFICO PARA TRANSFORMAR UNA CURVA SIGMOIDE DE
MORTALIDAD EN LINEA RECTA.
NOMBRE CIENTÍFICO: Bothrops xanthogramma
NOMBRE COMÚN: Equis pachona.
LOTE DE VENENO: LSxt130505
FECHA DE INOCULACIÓN: 7 de noviembre del 2011
CANTIDAD TOTAL: 26 mg.
DL50: 116 µg.
78
CUADRO # 8/2
PROTOCOLO DE DL50
Fecha: 14 de mayo del 2012
Nombre científico: Bothrops xanthogramma
Nombre común: Equis pachona.
Lote de veneno: LSxt130505 Cantidad de veneno usado: 25 mg.
DL50 INHMT: 72 µg.
Método: Directo
DL50: 112 µg.
Observaciones: Se realizó la inoculación de las diferentes dosis de
venenos a ratones machos con un peso que oscilaba entre 16 – 18 g.
Veneno
inoculado I.P
# de
ratones
Mortalidad
24 H 48 H
V M V M
% de
Mortalidad
48 H
Próbito
60 µg 6 6 0 6 0 0% 2,48
80 µg 6 6 0 6 0 0% 2,48
100 µg 6 4 2 4 2 33,33% 4,57
120 µg 6 4 2 4 2 33,33% 4,57
140 µg 6 0 6 0 6 100% 8,5
160 µg 6 1 5 1 5 83,33% 5,97
Control 6 6 0 6 0 ----- -----
79
GRÁFICO # 8/2
GRÁFICO PARA TRANSFORMAR UNA CURVA SIGMOIDE DE
MORTALIDAD EN LINEA RECTA.
NOMBRE CIENTÍFICO: Bothrops xanthogramma
NOMBRE COMÚN: Equis pachona.
LOTE DE VENENO: LSxt130505
FECHA DE INOCULACIÓN: 14 de mayo del 2012
CANTIDAD TOTAL: 25 mg.
DL50: 112 µg.
80
CUADRO # 9/1
PROTOCOLO DE DL50
Fecha: 14 de noviembre del 2011
Nombre científico: Bothrops asper
Nombre común: Equis, equis rabo de hueso.
Lote de veneno: LSas160104 Cantidad de veneno usado: 26 mg.
DL50 INHMT: 45 µg.
Método: Directo
DL50: 98 µg.
Observaciones: Se realizó la inoculación de las diferentes dosis de
venenos a ratones machos con un peso que oscilaba entre 16 – 18 g.
Veneno
inoculado I.P
# de
ratones
Mortalidad
24 H 48 H
V M V M
% de
Mortalidad
48 H
Próbito
60 µg 6 6 0 6 0 0% 2,48
80 µg 6 5 1 5 1 16,66% 4,06
100 µg 6 4 2 4 2 33,33% 4,57
120 µg 6 0 6 0 6 100% 8,5
140 µg 6 1 5 1 5 83,33% 5,97
160 µg 6 0 6 0 6 100% 8,5
Control 6 6 0 6 0 ----- -----
81
GRÁFICO # 9/1
GRÁFICO PARA TRANSFORMAR UNA CURVA SIGMOIDE DE
MORTALIDAD EN LINEA RECTA.
NOMBRE CIENTÍFICO: Bothrops asper
NOMBRE COMÚN: Equis, equis rabo de hueso.
LOTE DE VENENO: LSas160104
FECHA DE INOCULACIÓN: 14 de noviembre del 2011
CANTIDAD TOTAL: 26 mg.
DL50: 98 µg.
82
CUADRO # 9/2
PROTOCOLO DE DL50
Fecha: 25 de abril del 2012
Nombre científico: Bothrops asper
Nombre común: Equis, equis rabo de hueso.
Lote de veneno: LSas160104 Cantidad de veneno usado: 25 mg.
DL50 INHMT: 45 µg.
Método: Directo
DL50: 93 µg.
Observaciones: Se realizó la inoculación de las diferentes dosis de
venenos a ratones machos con un peso que oscilaba entre 16 – 18 g.
Veneno
inoculado I.P
# de
ratones
Mortalidad
24 H 48 H
V M V M
% de
Mortalidad
48 H
Próbito
60 µg 6 5 1 5 1 16,66% 4,06
80 µg 6 5 1 5 1 16,66% 4,06
100 µg 6 4 2 4 2 33,33% 4,57
120 µg 6 0 6 0 6 100% 8,5
140 µg 6 0 6 0 6 100% 8,5
160 µg 6 0 6 0 6 100% 8,5
Control 6 6 0 6 0 ----- -----
83
GRÁFICO # 9/2
GRÁFICO PARA TRANSFORMAR UNA CURVA SIGMOIDE DE
MORTALIDAD EN LINEA RECTA.
NOMBRE CIENTÍFICO: Bothrops asper
NOMBRE COMÚN: Equis, equis rabo de hueso.
LOTE DE VENENO: LSas160104
FECHA DE INOCULACIÓN: 21 de mayo del 2012
CANTIDAD TOTAL: 25 mg.
DL50: 93 µg.
84
CUADRO # 10/1
PROTOCOLO DE DL50
Fecha: 21 de noviembre del 2011
Nombre científico: Bothrops xanthogramma
Nombre común: Equis pachona.
Lote de veneno: LSxt200104 Cantidad de veneno usado: 25 mg.
DL50 INHMT: 53 µg.
Método: Directo
DL50: 130 µg.
Observaciones: Se realizó la inoculación de las diferentes dosis de
venenos a ratones machos con un peso que oscilaba entre 16 – 18 g.
Veneno
inoculado I.P
# de
ratones
Mortalidad
24 H 48 H
V M V M
% de
Mortalidad
48 H
Próbito
60 µg 6 6 0 6 0 0% 2,48
80 µg 6 6 0 6 0 0% 2,48
100 µg 6 6 0 6 0 0% 2,48
120 µg 6 4 2 4 2 33,33% 4,57
140 µg 6 2 4 2 4 66,66% 5,45
160 µg 6 0 6 0 6 100% 8,5
Control 6 6 0 6 0 ----- -----
85
GRÁFICO # 10/1
GRÁFICO PARA TRANSFORMAR UNA CURVA SIGMOIDE DE
MORTALIDAD EN LINEA RECTA.
NOMBRE CIENTÍFICO: Bothrops xanthogramma
NOMBRE COMÚN: Equis pachona.
LOTE DE VENENO: LSxt200104
FECHA DE INOCULACIÓN: 21 de noviembre del 2011
CANTIDAD TOTAL: 25 mg.
DL50: 130 µg.
86
CUADRO # 10/2
PROTOCOLO DE DL50
Fecha: 28 de abril del 2012
Nombre científico: Bothrops xanthogramma
Nombre común: Equis pachona.
Lote de veneno: LSxt200104 Cantidad de veneno usado: 25 mg.
DL50 INHMT: 53 µg.
Método: Directo
DL50: 129 µg.
Observaciones: Se realizó la inoculación de las diferentes dosis de
venenos a ratones machos con un peso que oscilaba entre 16 – 18 g.
Veneno
inoculado I.P
# de
ratones
Mortalidad
24 H 48 H
V M V M
% de
Mortalidad
48 H
Próbito
60 µg 6 6 0 6 0 0% 2,48
80 µg 6 5 1 5 1 16,66% 4,06
100 µg 6 6 0 6 0 0% 2,48
120 µg 6 4 2 4 2 33,33% 4,57
140 µg 6 1 5 1 5 83,33% 5,97
160 µg 6 0 6 0 6 100% 8,5
Control 6 6 0 6 0 ----- -----
87
GRÁFICO # 10/2
GRÁFICO PARA TRANSFORMAR UNA CURVA SIGMOIDE DE
MORTALIDAD EN LINEA RECTA.
NOMBRE CIENTÍFICO: Bothrops xanthogramma
NOMBRE COMÚN: Equis pachona.
LOTE DE VENENO: LSxt200104
FECHA DE INOCULACIÓN: 28 de mayo del 2012
CANTIDAD TOTAL: 25 mg.
DL50: 129 µg.
88
CUADRO # 11/1
PROTOCOLO DE DL50
Fecha: 29 de noviembre del 2011
Nombre científico: Bothrops asper
Nombre común: Equis, equis rabo de hueso.
Lote de veneno: LSas020908 Cantidad de veneno usado: 25 mg.
DL50 INHMT: 64 µg.
Método: Directo
DL50: 88 µg.
Observaciones: Se realizó la inoculación de las diferentes dosis de
venenos a ratones machos con un peso que oscilaba entre 16 – 18 g.
Veneno
inoculado I.P
# de
ratones
Mortalidad
24 H 48 H
V M V M
% de
Mortalidad
48 H
Próbito
60 µg 6 6 0 6 0 0% 2,48
80 µg 6 4 2 4 2 33,33% 4,57
100 µg 6 3 3 3 3 50% 5,01
120 µg 6 0 6 0 6 100% 8,5
140 µg 6 0 6 0 6 100% 8,5
160 µg 6 0 6 0 6 100% 8,5
Control 6 6 0 6 0 ----- -----
89
GRÁFICO # 11/1
GRÁFICO PARA TRANSFORMAR UNA CURVA SIGMOIDE DE
MORTALIDAD EN LINEA RECTA.
NOMBRE CIENTÍFICO: Bothrops asper
NOMBRE COMÚN: Equis, equis rabo de hueso.
LOTE DE VENENO: LSas020908
FECHA DE INOCULACION: 29 de noviembre del 2011
CANTIDAD TOTAL: 25 mg.
DL50: 88 µg.
90
CUADRO # 11/2
PROTOCOLO DE DL50
Fecha: 4 de junio del 2012
Nombre científico: Bothrops asper
Nombre común: Equis, equis rabo de hueso.
Lote de veneno: LSas020908 Cantidad de veneno usado: 25 mg.
DL50 INHMT: 64 µg.
Método: Directo
DL50: 94 µg.
Observaciones: Se realizó la inoculación de las diferentes dosis de
venenos a ratones machos con un peso que oscilaba entre 16 – 18 g.
Veneno
inoculado I.P
# de
ratones
Mortalidad
24 H 48 H
V M V M
% de
Mortalidad
48 H
Próbito
60 µg 6 6 0 6 0 16,66% 4,06
80 µg 6 4 2 4 2 50% 5,01
100 µg 6 3 3 3 3 33,33% 4,57
120 µg 6 0 6 0 6 83,33% 5,97
140 µg 6 0 6 0 6 100% 8,5
160 µg 6 0 6 0 6 100% 8,5
Control 6 6 0 6 0 ----- -----
91
GRÁFICO # 11/2
GRÁFICO PARA TRANSFORMAR UNA CURVA SIGMOIDE DE
MORTALIDAD EN LINEA RECTA.
NOMBRE CIENTÍFICO: Bothrops asper
NOMBRE COMÚN: Equis, equis rabo de hueso.
LOTE DE VENENO: LSas020908
FECHA DE INOCULACION: 4 de junio del 2012
CANTIDAD TOTAL: 25 mg.
DL50: 94 µg.
92
CUADRO # 12/1
PROTOCOLO DE DL50
Fecha: 6 de diciembre del 2011
Nombre científico: Bothrops atrox
Nombre común: Pitalala, macanche.
Lote de veneno: LSat210808 Cantidad de veneno usado: 25 mg.
DL50 INHMT: 76 µg.
Método: Directo
DL50: 104 µg.
Observaciones: Se realizó la inoculación de las diferentes dosis de
venenos a ratones machos con un peso que oscilaba entre 16 – 18 g.
Veneno
inoculado I.P
# de
ratones
Mortalidad
24 H 48 H
V M V M
% de
Mortalidad
48 H
Próbito
60 µg 6 5 1 5 1 16,66% 4,06
80 µg 6 5 1 5 1 16,66% 4,06
100 µg 6 5 1 5 1 16,66% 4,06
120 µg 6 3 3 3 3 50% 5,01
140 µg 6 1 5 1 5 83,33% 5,97
160 µg 6 0 6 0 6 100% 8,5
Control 6 6 0 6 0 ----- -----
93
GRÁFICO # 12/1
GRÁFICO PARA TRANSFORMAR UNA CURVA SIGMOIDE DE
MORTALIDAD EN LINEA RECTA.
NOMBRE CIENTÍFICO: Bothrops atrox
NOMBRE COMÚN: Pitalala, macanche.
LOTE DE VENENO: LSat210808
FECHA DE INOCULACION: 06 de diciembre del 2011
CANTIDAD TOTAL: 25 mg.
DL50: 104 µg.
94
CUADRO # 12/2
PROTOCOLO DE DL50
Fecha: 11 de junio del 2012
Nombre científico: Bothrops atrox
Nombre común: Pitalala, macanche.
Lote de veneno: LSat210808 Cantidad de veneno usado: 25 mg.
DL50 INHMT: 76 µg.
Método: Directo
DL50: 96 µg.
Observaciones: Se realizó la inoculación de las diferentes dosis de
venenos a ratones machos con un peso que oscilaba entre 16 – 18 g.
Veneno
inoculado I.P
# de
ratones
Mortalidad
24 H 48 H
V M V M
% de
Mortalidad
48 H
Próbito
60 µg 6 6 0 6 0 0% 2,48
80 µg 6 5 1 5 1 16,66% 4,06
100 µg 6 5 1 5 1 16,66% 4,06
120 µg 6 2 4 2 4 66,66% 5,45
140 µg 6 0 6 0 6 100% 8,5
160 µg 6 0 6 0 6 100% 8,5
Control 6 6 0 6 0 ----- -----
95
GRÁFICO # 12/2
GRÁFICO PARA TRANSFORMAR UNA CURVA SIGMOIDE DE
MORTALIDAD EN LINEA RECTA.
NOMBRE CIENTÍFICO: Bothrops atrox
NOMBRE COMÚN: Pitalala, macanche.
LOTE DE VENENO: LSat210808
FECHA DE INOCULACION: 11 de junio del 2012
CANTIDAD TOTAL: 25 mg.
DL50: 96 µg.
96
CUADRO # 13/1
PROTOCOLO DE DL50
Fecha: 12 de diciembre del 2011
Nombre científico: Bothrops xanthogramma
Nombre común: Equis pachona.
Lote de veneno: LSxt090908 Cantidad de veneno usado: 25 mg.
DL50 INHMT: 68 µg.
Método: Directo
DL50: 102 µg.
Observaciones: Se realizó la inoculación de las diferentes dosis de
venenos a ratones machos con un peso que oscilaba entre 16 – 18 g.
Veneno
inoculado I.P
# de
ratones
Mortalidad
24 H 48 H
V M V M
% de
Mortalidad
48 H
Próbito
60 µg 6 6 0 6 0 0% 2,48
80 µg 6 4 2 4 2 33,33% 4,57
100 µg 6 2 4 2 4 66,66% 5,45
120 µg 6 2 4 2 4 66,66% 5,45
140 µg 6 1 5 1 5 83,33% 5,97
160 µg 6 0 6 0 6 100% 8,5
Control 6 6 0 6 0 ----- -----
97
GRÁFICO # 13/1
GRÁFICO PARA TRANSFORMAR UNA CURVA SIGMOIDE DE
MORTALIDAD EN LINEA RECTA.
NOMBRE CIENTÍFICO: Bothrops xanthogramma
NOMBRE COMÚN: Equis pachona.
LOTE DE VENENO: LSxt090908
FECHA DE INOCULACIÓN: 12 de diciembre del 2011
CANTIDAD TOTAL: 25 mg.
DL50: 102 µg.
98
CUADRO # 13/2
PROTOCOLO DE DL50
Fecha: 18 de junio del 2012
Nombre científico: Bothrops xanthogramma
Nombre común: Equis pachona.
Lote de veneno: LSxt090908 Cantidad de veneno usado: 25 mg.
DL50 INHMT: 68 µg.
Método: Directo
DL50: 107 µg.
Observaciones: Se realizó la inoculación de las diferentes dosis de
venenos a ratones machos con un peso que oscilaba entre 16 – 18 g.
Veneno
inoculado I.P
# de
ratones
Mortalidad
24 H 48 H
V M V M
% de
Mortalidad
48 H
Próbito
60 µg 6 6 0 6 0 0% 2,48
80 µg 6 6 0 6 0 0% 2,48
100 µg 6 2 4 2 4 66,66% 5,45
120 µg 6 2 4 2 4 66,66% 5,45
140 µg 6 0 6 0 6 100% 8,5
160 µg 6 0 6 0 6 100% 8,5
Control 6 6 0 6 0 ----- -----
99
GRÁFICO # 13/2
GRÁFICO PARA TRANSFORMAR UNA CURVA SIGMOIDE DE
MORTALIDAD EN LINEA RECTA.
NOMBRE CIENTÍFICO: Bothrops xanthogramma
NOMBRE COMÚN: Equis pachona.
LOTE DE VENENO: LSxt090908
FECHA DE INOCULACIÓN: 18 de junio del 2012
CANTIDAD TOTAL: 25 mg.
DL50: 107 µg.
100
CUADRO # 14/1
PROTOCOLO DE DL50
Fecha: 19 de diciembre del 2011
Nombre científico: Bothrops asper
Nombre común: Equis, equis rabo de hueso.
Lote de veneno: LSas080909 Cantidad de veneno usado: 25 mg.
DL50 INHMT: 63 µg.
Método: Directo
DL50: 114 µg.
Observaciones: Se realizó la inoculación de las diferentes dosis de
venenos a ratones machos con un peso que oscilaba entre 16 – 18 g.
Veneno
inoculado I.P
# de
ratones
Mortalidad
24 H 48 H
V M V M
% de
Mortalidad
48 H
Próbito
60 µg 6 6 0 6 0 0% 2,48
80 µg 6 6 0 6 0 0% 2,48
100 µg 6 5 1 5 1 16,66% 4,06
120 µg 6 3 3 3 3 50% 5,01
140 µg 6 1 5 1 5 83,33% 5,97
160 µg 6 0 6 0 6 100% 8,5
Control 6 6 0 6 0 ----- -----
101
GRÁFICO # 14/1
GRÁFICO PARA TRANSFORMAR UNA CURVA SIGMOIDE DE
MORTALIDAD EN LINEA RECTA.
NOMBRE CIENTÍFICO: Bothrops asper
NOMBRE COMÚN: Equis, equis rabo de hueso.
LOTE DE VENENO: LSas080909
FECHA DE INOCULACIÓN: 19 de diciembre del 2011
CANTIDAD TOTAL: 25 mg.
DL50: 114 µg.
102
CUADRO # 14/2
PROTOCOLO DE DL50
Fecha: 25 de junio del 2012
Nombre científico: Bothrops asper
Nombre común: Equis, equis rabo de hueso.
Lote de veneno: LSas080909 Cantidad de veneno usado: 25 mg.
DL50 INHMT: 63 µg.
Método: Directo
DL50: 116 µg.
Observaciones: Se realizó la inoculación de las diferentes dosis de
venenos a ratones machos con un peso que oscilaba entre 16 – 18 g.
Veneno
inoculado I.P
# de
ratones
Mortalidad
24 H 48 H
V M V M
% de
Mortalidad
48 H
Próbito
60 µg 6 6 0 6 0 0% 2,48
80 µg 6 6 0 6 0 0% 2,48
100 µg 6 6 0 6 0 0% 2,48
120 µg 6 3 3 3 3 50% 5,01
140 µg 6 0 6 0 6 100% 8,5
160 µg 6 0 6 0 6 100% 8,5
Control 6 6 0 6 0 ----- -----
103
GRÁFICO # 14/2
GRÁFICO PARA TRANSFORMAR UNA CURVA SIGMOIDE DE
MORTALIDAD EN LINEA RECTA.
NOMBRE CIENTÍFICO: Bothrops asper
NOMBRE COMÚN: Equis, equis rabo de hueso.
LOTE DE VENENO: LSas080909
FECHA DE INOCULACIÓN: 25 de junio del 2012
CANTIDAD TOTAL: 25 mg.
DL50: 116 µg.
104
CUADRO # 15/1
PROTOCOLO DE DL50
Fecha: 27 de diciembre del 2011
Nombre científico: Bothrops xanthogramma
Nombre común: Equis pachona.
Lote de veneno: LSxt100909 Cantidad de veneno usado: 25 mg.
DL50 INHMT: 68 µg.
Método: Directo
DL50: 70 µg.
Observaciones: Se realizó la inoculación de las diferentes dosis de
venenos a ratones machos con un peso que oscilaba entre 16 – 18 g.
Veneno
inoculado I.P
# de
ratones
Mortalidad
24 H 48 H
V M V M
% de
Mortalidad
48 H
Próbito
60 µg 6 4 2 4 2 33,33% 4,57
80 µg 6 2 4 2 4 66,66% 5,45
100 µg 6 0 6 0 6 100% 8,5
120 µg 6 0 6 0 6 100% 8,5
140 µg 6 0 6 0 6 100% 8,5
160 µg 6 0 6 0 6 100% 8,5
Control 6 6 0 6 0 ----- -----
105
GRÁFICO # 15/1
GRÁFICO PARA TRANSFORMAR UNA CURVA SIGMOIDE DE
MORTALIDAD EN LINEA RECTA.
NOMBRE CIENTÍFICO: Bothrops xanthogramma
NOMBRE COMÚN: Equis pachona.
LOTE DE VENENO: LSxt100909
FECHA DE INOCULACION: 27 de diciembre del 2011
CANTIDAD TOTAL: 25 mg.
DL50: 70 µg.
106
CUADRO # 15/2
PROTOCOLO DE DL50
Fecha: 27 de diciembre del 2011
Nombre científico: Bothrops xanthogramma
Nombre común: Equis pachona.
Lote de veneno: LSxt100909 Cantidad de veneno usado: 25 mg.
DL50 INHMT: 68 µg.
Método: Directo
DL50: 72 µg.
Observaciones: Se realizó la inoculación de las diferentes dosis de
venenos a ratones machos con un peso que oscilaba entre 16 – 18 g.
Veneno
inoculado I.P
# de
ratones
Mortalidad
24 H 48 H
V M V M
% de
Mortalidad
48 H
Próbito
60 µg 6 3 3 3 3 50% 5,01
80 µg 6 2 4 2 4 66,66% 5,45
100 µg 6 1 5 1 5 83,33% 5,97
120 µg 6 0 6 0 6 100% 8,5
140 µg 6 0 6 0 6 100% 8,5
160 µg 6 0 6 0 6 100% 8,5
Control 6 6 0 6 0 ----- -----
107
GRÁFICO # 15/2
GRÁFICO PARA TRANSFORMAR UNA CURVA SIGMOIDE DE
MORTALIDAD EN LINEA RECTA.
NOMBRE CIENTÍFICO: Bothrops xanthogramma
NOMBRE COMÚN: Equis pachona.
LOTE DE VENENO: LSxt100909
FECHA DE INOCULACIÓN: 2 de julio del 2012
CANTIDAD TOTAL: 25 mg.
DL50: 72 µg.
108
LUIS VERA ARTEAGA - TESIS DE GRADO 2012
FIGURA #2 PESANDO EL VENENO Bothrops asper.
LUIS VERA ARTEAGA – TESIS DE GRADO 2012
109
LUIS VERA ARTEAGA – TESIS DE GRADO 2012
FIGURA #4 CAJAS PARA COLOCAR RATONES INOCULADOS
LUIS VERA ARTEAGA – TESIS DE GRADO 2012
110
B. asper.
LUIS VERA ARTEAGA – TESIS DE GRADO 2012
B. atrox.
LUIS VERA ARTEAGA – TESIS DE GRADO 2012